專利名稱：液體酶組合物的穩(wěn)定化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及液體酶組合物，其含有(i)一種或幾種從較高到極高濃度的酶，和(ii)一種或幾種合適的酶抑制劑，特別是可逆抑制劑，該抑制劑具有很強(qiáng)的酶抑制特性和/或以能引起強(qiáng)的酶抑制作用的濃度存在。
本發(fā)明還涉及
一種含酶地多成分組合物，例如，以本發(fā)明的由抑制劑穩(wěn)定的液體酶組合物為酶源制備的諸如洗滌組合物之類的清洗組合物的液體組合物；
一種制備諸如清洗組合物，如洗滌組合物之類的含酶多成分組合物的方法，其中，所述的酶是以本發(fā)明的由抑制劑穩(wěn)定的液體酶組合物的形式混入，即當(dāng)所述的酶被摻入所述多成分組合物中時(shí)，為一種由抑制劑穩(wěn)定的組合物形式；和
一種通過后一種方法制備的諸如清洗組合物之類的多成分組合物，如洗滌組合物。
本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的液體酶組合物用于制備或生產(chǎn)諸如清潔組合物的含酶多成分組合物的方法，如洗滌組合物。
就含酶的組合物來說，貯存穩(wěn)定性問題是眾所周知的問題。因此，舉例來說，含酶液體洗滌劑，如含蛋白酶(肽酶)的液體洗滌劑的主要問題是在貯存期間確保保留適當(dāng)?shù)拿富钚?。為了尋找改善含酶組合物，如諸如液體洗滌劑之類的含酶組合物的貯存穩(wěn)定性的方法，已付出了相當(dāng)大的努力，例如，向含蛋白酶的組合物中添加蛋白酶抑制劑。
舉例而言，該部分的其余內(nèi)容主要涉及抑制蛋白酶，但這一原理同樣可應(yīng)用于其它類型的酶，如脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶和氧化還原酶(如過氧化物酶和氧化酶)，而且本發(fā)明的各方面并不局限于與用(可逆)蛋白酶抑制劑穩(wěn)定蛋白酶有關(guān)的問題。
舉例來說，已知硼酸和一取代含硼酸(boronic acid)能可逆地抑制蛋白酶。在Molecular & Cellular Biochemistry 51，1983，PP.5-32中討論了用含硼酸抑制絲氨酸蛋白酶、枯草蛋白酶的問題。
作為枯草蛋白酶抑制劑，各種一取代含硼酸具有極不相同的能力。僅含有諸如甲基、丁基或2-環(huán)己基乙基之類的烷基是不良抑制劑，以甲基含硼酸為最差抑制劑。然而，據(jù)報(bào)導(dǎo)，具有諸如苯基、4-甲氧基苯基或3，5-二氯苯基之類的芳基的一取代含硼酸是極佳的抑制劑，其中，3，5-二氯苯基一取代含硼酸為特別有效的一種(參見Keller等，Biochem，Biophys.Res.Comm.176，1991，PP.401-405)。
在WO 92/19707中還指出，在芳基上相對(duì)于硼的3-位上被取代的芳基含硼酸是出人意料的良好可逆蛋白酶抑制劑。因此，例如，在以下的文獻(xiàn)中提到的“乙酰氨基苯一取代含硼酸”是蛋白酶的特別有效的抑制劑。
在對(duì)可逆酶抑制劑的抑制效果進(jìn)行定量時(shí)，通常把“抑制常數(shù)”(Ki)作為衡量抑制酶活性能力的指標(biāo)，通常，Ki的定義如下
Ki＝[E]·[l]/[El]
其中〔E〕、〔l〕和〔El〕分別表示在所述條件下酶的平衡濃度(通常為摩爾濃度)、抑制劑平衡濃度和酶-抑制劑復(fù)合體平衡濃度。在本說明書及權(quán)利要求書中采用Ki的后一種定義。因此，較低的Ki值表示較有效的抑制劑。
在制備或生產(chǎn)多成分含酶組合物時(shí)，理想的是將預(yù)先制備的含有酶和適當(dāng)(可逆的)酶抑制劑的酶組合物用作酶源。尤其常見和有利的是，預(yù)先制備的酶組合物中含有極高濃度的至少一種酶，以及可能含有上述類型的幾種酶，因?yàn)檫@樣一來，可使得大體積或大量的含酶多成分組合物能使用較小體積或較小量的預(yù)先制備的酶/抑制劑組合物來制備，而且還具有其它優(yōu)點(diǎn)。
另外，如果能由以原始預(yù)先制備的酶/抑制劑組合物形式和摻入該組合物中的量的用量添加酶的抑制劑就能保證在成品多成分組合物的貯存期間所述酶具有令人滿意的穩(wěn)定性的話，顯然是有利的，即在該多成分組合物(例如，洗滌組合物)中不必含有其它穩(wěn)定劑(不過，必要時(shí)也可加入其它穩(wěn)定劑)。
而且，在這種預(yù)先制備的酶/抑制劑組合物中，在存在其抑制劑的條件下所述酶的穩(wěn)定性預(yù)計(jì)很高。因此，預(yù)計(jì)這種類型的各種預(yù)先制備的組合物在生產(chǎn)出來以后能夠貯存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，而其酶促活性不會(huì)明顯-或至少?zèng)]有不可接受的損失。
因此，本發(fā)明涉及一種液體組合物，其包括(i)一種用量超過40μM的酶；和(ii)一種可逆酶抑制劑，其用量為當(dāng)該液體組合物隨后被摻入一種多成分組合物(如洗滌組合物，象液體洗滌組合物)時(shí)能有效提高該酶的貯存穩(wěn)定性。
舉例來說，本發(fā)明的液體組合物可以主要是含水組合物，或主要是無水組合物(例如，含有高比例的一種或幾種無水、但通常水可混溶的溶劑的組合物，該溶劑一般為有機(jī)液體，如醇或二醇等)。本發(fā)明的液體組合物本身通常是非洗滌組合物。
除洗滌組合物(如洗衣和洗碟用組合物)之外，與本發(fā)明內(nèi)容相關(guān)的，液體組合物形式的其它類型含酶多成分組合物包括用于清洗牙齒、隱形眼鏡或硬表面(如屠宰場(chǎng)或食品加工廠)的組合物；用于皮革工業(yè)的組合物(如用于動(dòng)物生皮的脫毛和/或脫脂)；用于織物退漿的組合物；和用于洗粗斜布織物以獲得“石洗”外觀的組合物。將這種組合物用于此類目的的用途屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
酶
本發(fā)明說明書及權(quán)利要求書中所采用的酶分類號(hào)(EC號(hào))符合國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)委員會(huì)推薦的命名法(Recommendation(1992)of the Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology，Academic Press Inc.，1992)。
本發(fā)明的液體組合物至少含有一種酶。適用的酶包括所有可商購的酶。特別相關(guān)的酶包括選自蛋白酶(即肽酶，EC3.4)、淀粉酶(分入EC3.2.1下)、脂肪酸(包括在EC3.1.1.3下面的酶)、纖維素酶(包括EC3.2.1.4)和氧化還原酶(EC1)，如過氧化物酶(EC1.11)和氧化酶〔包括EC1.10.3下面的酶，如漆酶(EC1.10.3.2)〕的酶，以及上述酶的任意組合物。還包括來自同一分類的酶的混合物(如不同蛋白酶，不同脂肪酶的混合物等)。
液體組合物中酶的量因酶的類型和該液體組合物將來的用途而異。一般，所具有的所有酶的用量都以占液體組合物重量0.2-50％(W/W)為宜(基于純酶蛋白計(jì)算而來)，通常為0.5-25％W/W，如1-10％W/W，例如，占液體組合物的2-8％(W/W)。以濃度單位表示，本發(fā)明液體組合物中酶的優(yōu)選濃度范圍為約50μM-約20mM，通常為100μM-10mM，如500μM-5mM，例如，750μM-3mM(以純酶蛋白的摩爾數(shù)計(jì))。
蛋白酶。任何適用于液體組合物中的蛋白酶(蛋白水解酶)均可采用。合適的蛋白酶包括源于動(dòng)物、植物或微生物的蛋白酶，特別是源于微生物的及化學(xué)生產(chǎn)的或蛋白質(zhì)工程(遺傳工程)的突變體(變型)，相對(duì)這種類型的一種酶的氨基酸序列而言，該突變型中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換，插入和/或缺失，而且具有蛋白水解活性。例如，該蛋白酶可以是絲氨酸肽酶，優(yōu)選為堿性微生物蛋白酶或類胰蛋白酶。堿性蛋白酶的例子為枯草蛋白酶，特別是源于芽胞桿菌屬(Bacillus)的枯草蛋白酶，如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(披露于WO 89/06279中)。商品化芽胞桿菌屬枯草蛋白酶的例子有AlcalaseTM、SavinaseTM、EsperaseTM和DurazymTM制品，均可自Novo Nordisk A/S購買。若干上述蛋白酶制品如AlcalaseTM、EsperaseTM和SavinaseTM可以液體形式提供(如，SavinaseTM 16.0L，Type DX和Type EX)，這種形式極適合(見下文)于制備本發(fā)明的含蛋白酶液體組合物。
類胰蛋白酶蛋白酶的例子包括胰蛋白酶(如來源于豬或牛的胰蛋白酶)和披露于WO 89/06270中的鏈孢霉屬(Fusarium)蛋白酶。
淀粉酶。任何適用于液體組合物的淀粉酶(淀粉分解酶)均可采用。合適的淀粉酶包括源于細(xì)菌和真菌的淀粉酶，以及化學(xué)方法生產(chǎn)的或蛋白質(zhì)工程(遺傳工程)的突變體(變型)，與這種類型的一種酶的氨基酸序列相比，所述變型中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換、插入和/或缺失，而且具有淀粉分解活性。例如，淀粉酶包括α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，如由地衣型芽胞桿菌(B.Licheniformis)的一個(gè)株中獲得的α-淀粉酶，詳見英國專利說明書No.1,296,839。一種極為合適的α-淀粉酶是TermamylTM，這種酶(尤其是液體產(chǎn)品)可購自Novo Nordisk A/S。
脂肪酶。任何適用于液體組合物的脂肪酶均可采用。合適的脂肪酶包括源于細(xì)菌和真菌的脂肪酶，以及通過化學(xué)方法生產(chǎn)的或蛋白質(zhì)工程(遺傳工程)的突變體(變型)，相對(duì)這種類型的一種酶的氨基酸序列而言，該突變體中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換、插入和/或缺失。一種極為適用的脂肪酶是通過克隆源于疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)的基因，并在米曲霉(Aspergillus oryzae)中表達(dá)該基因而獲得的，如在EP 0258 068中所述，這種酶(特別是液體產(chǎn)品)可自Novo Nordisk A/S獲得，商品名為L(zhǎng)ipolaseTM。
纖維素酶。任何適用于液體組合物的纖維素酶(纖維素分解酶)均可采用。合適的纖維素酶包拓源于細(xì)菌和真菌的纖維素酶，以及化學(xué)方法生產(chǎn)的或蛋白質(zhì)工程(遺傳工程)的突變體(變型)，相對(duì)這種類型的一種酶的氨基酸序列而言，所述突變體中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換、插入和/或缺失，而且具有纖維素分解活性。例如，合適的纖維素酶披露于US 4,435,307中。一種極為合適的纖維素酶是由Humicolainsolens的一個(gè)菌株產(chǎn)生，可自Novo Nordisk A/S購買，其商品名為CelluzymeTM。
過氧化物酶。任何適用于液體組合物，如液體洗滌組合物的過氧化物酶均可采用。在此，合適的過氧化物酶包括源于植物、細(xì)菌和真菌的過氧化物酶，以及化學(xué)方法生產(chǎn)的或蛋白質(zhì)工程(遺傳工程)的突變體(變型)，相對(duì)這種類型的一種酶的氨基酸序列而言，所述突變體中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換、插入和/或缺失，并具有過氧化物酶活性。合適的過氧化物酶的例子為源于鬼傘屬(Coprinus)(如灰蓋鬼傘(C.cinerius)或長(zhǎng)根鬼傘(C.macrorhizus))的一個(gè)菌株或源于芽胞桿菌屬(短小芽胞桿菌(B.pumilus))的一個(gè)菌株的過氧化物酶，特別是如PCT/DK90/00260所述的一種過氧化物酶。
氧化酶。任何適用于液體組合物，如液體洗滌組合物的氧化酶均可采用。這里，合適的氧化酶包括源于細(xì)菌和真菌的氧化酶，以及用化學(xué)方法生產(chǎn)的或蛋白質(zhì)工程(遺傳工程)的突變體(變型)，相對(duì)這種類型的一種酶的氨基酸序列而言，所述突變體上的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換、插入和/或缺失，而且具有氧化酶活性。合適的氧化酶的例子為源于曲霉屬、脈孢霉屬(如粗糙脈孢霉(Neurospore crassa))、栓菌屬(如絨毛狀栓菌(Tramete villosa))或毀絲霉屬(Myceliophthora)(如嗜熱毀絲霉(M.thermophila))的漆酶。
酶抑制劑(酶穩(wěn)定劑)
本發(fā)明的液體組合物至少含有一種可逆酶抑制劑，通常，這種抑制劑至少是存在于液體組合物中的一種酶的抑制劑。因此，舉例來說，本發(fā)明的液體組合物除含有一種第一種類型的酶和這種酶的可逆抑制劑之外，還含有第二、第三種…等類型的酶(如上述類型的酶中的一種)，其中的一種或幾種并不伴隨有其相應(yīng)的可逆抑制劑。
在此應(yīng)當(dāng)指出的是，要制備一種含有一種或幾種酶的液體酶組合物是完全可行的，其用量如本文所述，但該組合物不是含有上述一種或幾種酶的抑制劑，而是含有另一種類型的酶的抑制劑，該液體組合物隨后將接觸這種類型的酶。其例子之一是含有脂肪酶為唯一酶以及一種蛋白酶抑制劑的液體組合物；該蛋白酶抑制劑可保護(hù)所述脂肪酶免受隨后將有意或無意間接觸到的蛋白酶的降解。
所用抑制劑的性質(zhì)和用量尤其取決于存在于組合物中的酶的性質(zhì)和濃度，并取決于設(shè)想的該組合物的用途。下面將對(duì)此作進(jìn)一步說明。
關(guān)于可與本發(fā)明液體組合物中的各種類/型的酶一起使用的可逆抑制劑(及其相關(guān)的Ki值)，可參考以下文獻(xiàn)H.Zollner，Handbook ofEnzyme Inhibitors(A部分和B部分)，第2版，VCHVerlagsgesellschaft mbH，Weinheim，德國，1993，其中列舉了大量的抑制劑。其它相關(guān)文獻(xiàn)包括S.Patkar和F.Bjokling，Lipase inhibitors，見Lipases-their Structure，Biochemistry and Application，P.Woolley和S.B.Petersen著，Cambridge University Press，Cambridge 1994。所選擇的相關(guān)類型的可逆抑制劑的例子如下
蛋白酶抑制劑。一種特別感興趣的類型的可逆蛋白酶抑制劑由一取代含硼酸〔R′B(OH)2〕和二取代含硼酸[R′R″B(OH)]組成(其中，R′和R″為有機(jī)取代基，如被選擇性取代過的芳基或雜環(huán)取代基)，其中的一些例子已在上文中提及。有關(guān)這一類型的化合物的其它例子可以選自在WO 92/19707、EP0478050A1和EP0511 456A1中提到過的化合物。
感興趣的此類化合物可參見披露于WO 95/02046(該專利在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日時(shí)尚未公開)中的化合物，而且包括下列通式的化合物
其中，R1是一個(gè)選擇性取代的稠合芳族環(huán)結(jié)構(gòu)，在該環(huán)上含有14或18個(gè)碳原子；或一個(gè)選擇性取代的單環(huán)或稠合芳族雜環(huán)結(jié)構(gòu)，在該環(huán)上最多含有17個(gè)碳原子；或一個(gè)選擇性取代的單環(huán)或稠合醌型環(huán)結(jié)構(gòu)，在該環(huán)上最多含有18個(gè)碳原子；
R2的結(jié)構(gòu)式為
其中的X相同或不同，并選自氫、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、芳基、取代芳基、羥基、羥基衍生物、鹵素、胺、烷基化胺、胺的衍生物、硝基、硫羥基、硫羥基衍生物、醛、酸、酸式鹽、酯、磺酸酯或磷酸酯，而o、p和q可以相同或不同，并可各自為0、1或2；m和n可以相同或不同，并可各自為0或1；R3和R1相同或不同，并可選自R1，或R3是羥基，或R1和R3均為選擇性取代的單環(huán)或二環(huán)芳族環(huán)結(jié)構(gòu)。
在上文中，選擇性地取代的環(huán)結(jié)構(gòu)是這樣的環(huán)結(jié)構(gòu)上的取代基可隨意選擇，但最好選自氫、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、芳基、取代芳基、羥基、羥基衍生物、鹵素、胺、烷基化胺、胺的衍生物、硝基、硫羥基、硫羥基衍生物、醛、酸、酸式鹽、酯、磺酸酯和磷酸酯。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備一取代含硼酸和二取代含硼酸衍生物，例如，采用下述方法之一
a)以兒茶酚硼烷(1，3，2-benzodioxaborole)或二氯甲硼烷-二甲硫配合物為硼氫化反應(yīng)劑對(duì)不飽和材料，即烯烴和炔烴進(jìn)行的硼氫化反應(yīng)；參見H.C.Brown，S.K.Gupta，JACS 97，1975，pp.5249-5255和H.C.Brown，N.Ravindran，S.U.Kuikarni，J.Org.Chem.45，(1980)，p.384。
b)Grignard試劑與硼酸三正丁酯或硼酸三甲酯反應(yīng)，然后水解由此所產(chǎn)生的一取代含硼酸酯；參見F.R.Bean，J.R.Johnson，Jaces 54，1932，pp 4415-4425；和S.H.Dandegaonher，S.P.Ingleshwar，Journal of ShivasiUniversity6，1932，pp.11-13。溴取代的原料不是商購的，可以用兩個(gè)步驟方便地合成用LiAlH4還原相應(yīng)的羧酸，然后再用CBr4處理。
c)有機(jī)鋰試劑與硼酸丁酯反應(yīng)；參見S.O.Lauessen，pp.387-395，Thiophene Chemistry，Part 7；和D.Florentin，B.Roques，C.R.Acad.Sci.Paris，t.270(1970年5月11日)，PP.1608-1610。
d)按照上述b的方法制備二取代含硼酸衍生物，不同的是，所采用的Grignard試劑與硼酸酯的比例為2∶1。
e)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法可獲得環(huán)上取代或官能團(tuán)的保護(hù)作用。
這種類型的其它感興趣的化合物可選自披露于WO 95/29223(在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日時(shí)尚未公開)中的萘一取代含硼酸，而且包括具有以下通式的化合物
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7相同或不同，并且選自氫、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、芳基、取代芳基、羥基、羥基衍生物、鹵素、胺、烷基化胺、胺的衍生物、硝基、硫基、硫基衍生物、醛、酸、酸式鹽、酯、磺酸酯和磷酸酯。
萘一取代含硼酸衍生物同樣可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備，例如，采用如下所述的Grignard制劑
通過將溶于鈉干燥的醚中的合適溴萘原料緩慢滴加到在鈉干燥的醚中轉(zhuǎn)動(dòng)的鎂中制備Grignard試劑。加入小碘結(jié)晶促進(jìn)上述反應(yīng)。
將溶于鈉干燥的醚中的硼酸三甲酯或硼酸三正丁酯冷卻至-70℃，用2小時(shí)時(shí)間將Grignard試劑滴加到上述溶液中，同時(shí)將該有機(jī)硼溶液保持在-70℃，并持續(xù)攪拌。讓反應(yīng)混合物回溫至室溫，過夜，同時(shí)通過滴加冷的稀硫酸進(jìn)行水解。分離醚層，并用醚萃取水層。合并含醚的部分，除去溶劑。使殘余物是強(qiáng)堿性，并除去由此所產(chǎn)生的一切甲醇或丁醇。將該堿性溶液冷卻，并通過過濾除去所得到的目的一取代含硼酸結(jié)晶。最好將所有產(chǎn)物從蒸餾水中再結(jié)晶出來。
可以通過萘的直接鋰化和/或溴化物的鋰化制備萘一取代含硼酸。
任何環(huán)取代或官能團(tuán)的保護(hù)均可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法實(shí)現(xiàn)。
在上述類型的化合物中，本發(fā)明的內(nèi)容所涉及的具體一取代含硼酸包括苯并呋喃-2-一取代含硼酸；苯基一取代含硼酸；4-溴苯基一取代含硼酸；4-甲酰苯基一取代含硼酸；3-乙酰氨基苯基-一取代含硼酸；3，5-二氯苯基-一取代含硼酸；5-氯硫代苯-2-一取代含硼酸；萘-1-一取代含硼酸；萘-2-一取代含硼酸；和6-羥基萘-2-一取代含硼酸。在本文的例2中給出的表(見下文)中，列出了可用于本發(fā)明的，這種類型的其它具體化合物。
可以其酸的形式(如溶于適當(dāng)?shù)乃烊苄杂袡C(jī)溶劑中，如單丙二醇中)，或者，必要的話(如由于可溶性的原因)以鹽的形式(如堿金屬鹽，例如鈉鹽或鉀鹽)，將一取代含硼酸或二取代含硼酸類型的抑制劑加入或摻入本發(fā)明的液體組合物中。
可逆淀粉酶抑制劑?？捎糜诒景l(fā)明的有關(guān)可逆淀粉酶抑制劑，可在被稱為“阿卡波糖(acarbose)”型的化合物中尋找(即含有一個(gè)acarviosine部分和一個(gè)或幾個(gè)麥芽糖單元的假寡糖)。作為抑制劑，特別是α-淀粉酶抑制劑的其它化合物包括麥芽糖和麥芽三糖。諸如甲基-α-葡糖苷及環(huán)化淀粉的其它化合物，如環(huán)己烷和/或環(huán)庚烷直鏈淀粉可用作β-淀粉酶的可逆抑制劑。
可逆纖維素酶抑制劑?？捎糜诒景l(fā)明的潛在可逆纖維素酶抑制劑包括4-巰基-纖維寡糖〔例如，參見C.Schou等，Journal ofCarbohydrate Chemistry 12(1993)PP.743-752〕。
可逆脂肪酶抑制劑。可用于本發(fā)明的可逆脂肪酶抑制劑包括選自上述和/或下述的一取代含硼酸和二取代含硼酸(如選擇性取代的苯基一取代含硼酸)。
酶抑制程度
存在于本發(fā)明液體組合物中的酶的理想抑制程度(強(qiáng)度、程度)，除其它因素外還取決于該組合物將要應(yīng)用的目的。一般，對(duì)可逆抑制劑與酶的摩爾比的選擇是這樣的在相關(guān)酶的每個(gè)活性位點(diǎn)上至少有一個(gè)抑制劑分子，因此，理所當(dāng)然地要求抑制劑(I)與酶(E)的摩爾比至少為1∶1。不過，為了某種目的，也可以采用較低的I∶E摩爾比，如約0.8∶1，約0.7∶1，約0.6∶1，甚至約0.5∶1。然而，在本發(fā)明中，通常要采用的抑制劑與酶的摩爾比至少為5，如至少為15。在某些場(chǎng)合，I∶E摩爾比可能至少為50或至少為100，甚至采用更高的摩爾比。
抑制劑與酶的摩爾比可以選擇，特別是考慮在基于本發(fā)明的液體組合物的多成分含酶組合物的實(shí)際應(yīng)用中所需要的游離(未被抑制)酶的百分比。因此，舉例來說，當(dāng)把一種衣物洗滌組合物用于洗衣時(shí)，顯然需要在洗滌介質(zhì)(通常為加入了相關(guān)洗滌組合物的水)中有足夠高含量的游離酶(如蛋白酶或脂肪酶)。
就此而言，一個(gè)重要的參數(shù)是一種酶的可逆抑制的抑制常數(shù)(定義如上文所述)。因此，舉例來說，當(dāng)本發(fā)明的液體組合物被用于洗滌組合物中時(shí)，一種酶的可逆抑制劑的抑制常數(shù)(Ki)在以常規(guī)方式mol/l(M)表示時(shí)，通常以3×10-8M≤Ki≤1.2×10-2M為宜，如3×10-8M≤Ki≤1×10-2M。不過，有關(guān)洗滌酶的更理想的“抑制窗(window of inhibition)”通常是這樣的與一種具體酶相關(guān)的抑制劑能產(chǎn)生相當(dāng)于3×10-7M≤Ki≤1×10-3M的抑制度，如4.3×10-7M≤Ki≤4.5×10-4M。
通常，優(yōu)選的本發(fā)明含酶液體組合物是這樣的
(a)存在于該組合物中的可逆酶抑制劑I的總摩爾濃度(可表示為〔I〕t)；和
(b)能由上述抑制劑可逆地抑制的存在于該組合物中的酶的抑制常數(shù)(Ki；以mol/l表示)之間的比例至少為50(即[I]t/Ki≥50)，如，至少為100，或通常至少為250。在本發(fā)明的液體組合物中，[I]t/Ki比的實(shí)際上限通常約為10000(即104)。在很多場(chǎng)合，[I]t/Ki比值在250-5000范圍內(nèi)，通常在250-2500范圍內(nèi)為宜。
可以把[I]t/Ki比的值視為本發(fā)明液體組合物“抑制能力”的一個(gè)指標(biāo)。例如，通過向液體組合物中加入中等至低濃度的強(qiáng)抑制劑，或加入較高濃度的更弱的抑制劑，可以獲得高比值，即高“抑制能力”。
當(dāng)抑制劑I的摩爾數(shù)相對(duì)被抑制的酶E的摩爾數(shù)超出較多時(shí)，大部分抑制劑通常為游離形式，即不與酶結(jié)合。用〔I〕表示游離(非結(jié)合)抑制劑(與Ki相關(guān)；見上文)，在這種條件下[I]t/Ki比大約等于[I]/Ki比，即[I]t/Ki≈[I]/Ki。
這里要指出的是，本發(fā)明的含有酶和可逆酶抑制劑的液體組合物可用適當(dāng)方法干燥(如冷凍干燥或噴霧干燥)。然后可將干燥的酶/抑制劑產(chǎn)物粉碎(如通過研磨)，并以適當(dāng)濃度懸浮或拌漿于一種非水液體媒介物，如非離子表面活性劑(如購自BP的SoftanolTM)中，以形成一種漿狀產(chǎn)物。
洗滌劑
對(duì)于洗滌組合物來說，通常的目標(biāo)是獲得對(duì)洗滌組合物中選定酶(如蛋白酶)的至少50％的抑制，而且，洗滌介質(zhì)中游離酶的量相當(dāng)于總酶量的至少50％。
加入了本發(fā)明液體組合物的洗滌組合物，除酶和抑制劑外，還包括表面活性劑，而且通常為液體洗滌組合物。例如，該洗滌組合物可以是洗衣洗滌組合物或洗碟洗滌組合物。
液體洗滌組合物可以是含水的，例如通常含有高達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或是基本上無水。
所述洗滌組合物將含有一種或幾種表面活性劑，每種表面活性劑可以是陰離子型、非離子型、陽離子型或兩性離子型的。該洗滌劑通常含有0-50％的陰離子表面活性劑，如直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)、α-烯屬磺酸鹽(AOS)、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)(AS)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽(AEOS或AES)、仲鏈烷磺酸鹽(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。還可以含有0-40％的非離子型表面活性劑，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)、脂肪醇丙氧基化物、羧基化脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚糖苷、烷基氧化二甲胺、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、或多羥基烷基脂肪酸酰胺(例如，在WO 92/06154中所述)。
通常，該洗滌劑中含有1-65％的洗滌助劑，但某些洗碟洗滌劑甚至可含有高達(dá)90％的洗滌助劑或配位劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(如SKS-6，購自Hoechst)。
洗滌助劑可分成含磷型和非含磷型。含磷無機(jī)堿性洗滌助劑的例子包括水溶性鹽特別是堿金屬焦磷酸鹽、正磷酸鹽、多磷酸鹽和膦酸鹽。非含磷無機(jī)助劑的例子包括水溶性堿金屬碳酸鹽、硼酸鹽和硅酸鹽，以及層狀二聚硅酸鹽和各種類型水不溶性結(jié)晶型或非晶型硅鋁酸鹽，其中以沸石為最著名的代表。
合適有機(jī)助劑的例子包括以下酸的堿金屬鹽、銨鹽或取代銨鹽琥珀酸、丙二酸、脂肪酸丙二酸、脂肪酸磺酸、羧基甲氧基琥珀酸、聚乙酸、羧酸、聚羧酸、氨基聚羧酸和聚乙?；人帷Ｔ撓礈靹┮部梢允俏磸?fù)配的，即基本上無洗滌助劑。
該洗滌劑可以含有一種或幾種聚合物。其例子有羧甲基纖維素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、聚馬來酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。
所述洗滌組合物可含有氯/溴型或加氧型漂白劑。漂白劑可以是包衣或包封的。無機(jī)氯/溴型漂白劑的例子有次氯酸或次溴酸的鋰鹽、鈉鹽或鈣鹽，以及氯化磷酸三鈉。
所述漂白系統(tǒng)還可以含有H2O2源，如能與諸如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸酯(NOBS)之類的過酸生成漂白活化劑混合的過硼酸鹽或過碳酸鹽。
有機(jī)氯/溴型漂白劑的例子有雜環(huán)N-溴和N-氯酰亞胺，如三氯異氰尿酸、三溴異氰尿酸、二溴異氰尿酸和二氯異氰尿酸，及其與水溶性陽離子，如鉀和鈉的鹽。乙內(nèi)酰脲同樣適用。所述漂白系統(tǒng)還可含有如酰胺、酰亞胺或砜類的過氧酸。
在洗碟洗滌劑中，優(yōu)選含氧漂白劑，如無機(jī)過酸鹽型的漂白劑，最好具有漂白劑前體或?yàn)檫^氧酸化合物。過氧漂白化合物的典型例子為堿金屬過硼酸鹽的四水合物和一水合物，堿金屬過碳酸鹽、過硅酸鹽和過磷酸鹽。優(yōu)選的活性材料為TAED或NOBS。
如上所述，本發(fā)明洗滌組合物的酶是以本發(fā)明的液體酶/抑制劑組合物的形式加入所述洗滌組合物中。
如果必要，還可加入其它常見的酶穩(wěn)定物質(zhì)，如多元醇，像丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸酯(例如，參見WO 92/19709和92/19708)。
該洗滌劑還可含有其它常見洗滌成分，如織物調(diào)理劑，包括粘土、抗絮凝材料、泡沫促進(jìn)劑/抑泡劑(在洗碟用洗滌劑中為抑泡劑)、抑泡劑、抗腐蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染料、脫水劑、殺菌劑、熒光增白劑或香料。
其pH(在使用濃度下在水溶液中測(cè)得)通常為中性或堿性，如在7-11的范圍內(nèi)。
本發(fā)明范圍內(nèi)的洗衣洗滌組合物的具體形式包括
1)含水液體洗滌組合物，含有
2)水結(jié)構(gòu)的液體洗滌組合物，含有
3.含水液體洗滌組合物，含有
4.含水液體洗滌組合物，含有
5)如1)-4)所述的洗滌組合物，其中，全部或部分直鏈烷基苯磺酸鹽被(C12-C18)烷基硫酸鹽所取代。
6)如1)-5)所述的洗滌組合物，其含有穩(wěn)定化的或包膜的過酸，或作為另外一種成分或用于代替上述漂白系統(tǒng)。
7)一種被配制成無水洗滌液體的洗滌組合物，含有一種液態(tài)非離子表面活性劑，如直鏈烷氧基化伯醇、一個(gè)助劑系統(tǒng)(如磷酸鹽)、酶和堿。該洗滌劑還可以含有陰離子表面活性劑和/或漂白系統(tǒng)。
洗碟用和其它多成分含酶組合物
這種類型組合物的有關(guān)例子包括
1)具有洗滌表面活性劑系統(tǒng)的液體洗碟組合物，含有
2)無水液體自動(dòng)洗碟組合物，包括
3)無水液體洗碟組合物，含有
4)觸變性液體自動(dòng)洗碟組合物，包括
5)液體自動(dòng)洗碟組合物，包括
6)含保護(hù)漂白顆粒的液體自動(dòng)洗碟組合物，含有
7)如1)和5)所述的自動(dòng)洗碟組合物，其中，過硼酸被過碳酸取代。
8)如1)的自動(dòng)洗碟組合物，其還含有一種錳催化劑。例如，錳催化劑可以是披露于“Efficient manganese catalysts for low-temperaturebleaching”(Nature 369，1994，pp.637-639)中的化合物之一。
上述組合物的“酶”含量可以包括所存在的酶抑制劑含量。如果必要，屬于上述類型之一的一種具體組合物可以含有一種并非針對(duì)上述類型配方的有機(jī)溶劑，但它可以作為被加入所述特定組合物中的本發(fā)明液體酶/抑制劑組合物中抑制劑的溶劑。
可將本發(fā)明的液體酶/抑制劑組合物加入洗滌組合物中，以產(chǎn)生一種常采用于洗滌劑中的酶濃度。對(duì)于本發(fā)明的洗滌組合物來說，可以加入本發(fā)明的液體酶/抑制劑組合物，例如，其加入量相對(duì)存在于該酶/抑制劑組合物中的特定酶來說，相當(dāng)于每升洗滌液中有0.00001-1mg(以純酶蛋白計(jì))酶。
穩(wěn)定劑檢驗(yàn)
可以各種方式檢驗(yàn)抑制劑的抑制效果，通過以下兩種用于檢驗(yàn)蛋白酶/蛋白酶抑制劑的方法加以說明
a)在液體洗滌劑中進(jìn)行貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)將液體酶/抑制劑組合物加入在明確限定條件下貯存的液體洗滌組合物中。以時(shí)間的函數(shù)形式測(cè)定每種酶的酶活性(例如，在1，3和7天后測(cè)定)。
為了由貯存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)計(jì)算抑制效率，提出了一種反應(yīng)機(jī)制。以下反應(yīng)提出了一種較簡(jiǎn)單、合理的用于含有蛋白酶(P)、脂肪酶(L)和抑制劑(I)的液體洗滌劑的機(jī)理
I)蛋白酶的自身消化
P+P→DP+P
II)蛋白酶的變性
P→DP
III)蛋白酶的抑制
P+I PI
IV)受抑制酶的蛋白酶消化
P+PI→P+DP+I
V)受抑制酶的變性
PI→DP+I
VI)脂肪酶的蛋白酶消化
P+L→P+DL
VII)脂肪酶的變性
L→DL
其中DP和DL為變性(即無活性的)的蛋白酶和脂肪酶。
由以上反應(yīng)得到3個(gè)表示D、L和PI失活的偶合微分方程。用參數(shù)估算法(由Levenberg改進(jìn)的Gauss Newton法)由貯存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)計(jì)算反應(yīng)速度常數(shù)。貯存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)以時(shí)間的函數(shù)形式給出(P+PI)和L的濃度。
反應(yīng)III遠(yuǎn)快于其它反應(yīng)，并在計(jì)算中假定平衡。反應(yīng)IV被排除在該反應(yīng)之外，以減少參數(shù)數(shù)目，以便僅用一個(gè)反應(yīng)速度常數(shù)(獲自方程V)描述受抑制酶的穩(wěn)定性。
當(dāng)存在大量剩余抑制劑分子(相對(duì)于蛋白酶分子)時(shí)，可以假定抑制劑的濃度接近一個(gè)合理的常數(shù)。
反應(yīng)速度常數(shù)的具體值在一定程度上對(duì)數(shù)據(jù)微小的變化敏感，但相對(duì)于硼酸的結(jié)果來說，這種敏感性顯著下降。將硼酸(以及密切相關(guān)的物質(zhì)或等同物，如堿金屬硼酸鹽(如硼砂)和氧化硼)用于抑制目的，特別是抑制蛋白酶是眾所周知的(例如，參見EP 0451 924 A2)，但這種物質(zhì)的低抑制強(qiáng)度及總體上相當(dāng)差的可溶性(在以下的實(shí)施例中將結(jié)合硼酸對(duì)其做進(jìn)一步說明；見下文)，使其基本上不適合用于本發(fā)明中(其中，存在于本發(fā)明液體組合物中的抑制劑和/或其用量應(yīng)當(dāng)為當(dāng)以一種多成分組合物的一種成分形式加入所述液體組合物時(shí)，仍然能產(chǎn)生良好的酶穩(wěn)定性)。因此，諸如硼酸、堿金屬硼酸鹽(如硼砂)和氧化硼之類的化合物基本上不能作為本發(fā)明的抑制劑。
“改善系數(shù)”的定義如下
以上述方法定義IFi，可以提供衡量一種特定抑制劑相對(duì)硼酸的抑制效果的參數(shù)。
b)測(cè)定Ki可以用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定抑制常數(shù)Ki；參見Keller等，Biochem.Biophys.Res.Comm.176，1991，PP.401-405；J.Bieth，Bayer-Symposium“Proteinase Inhibitors”，PP.463-469，Springer-Verlag，1974，和Lone kierstein Hansen，“Determination of Specific Activities ofSelected Detergent Protease Using Protease Activity，Molecular Weight，Kinetic Parameters and Inhibition Kinetics”，博士論文，Novo NovdiskA/S and University of Copenhagen，1991。如果需要的話，該測(cè)定可以在存在洗滌組合物的非酶成分(表面活性劑等)的條件下進(jìn)行。
通常用一個(gè)緩沖系統(tǒng)獲得適于測(cè)定酶抑制的Ki值的條件，所述緩沖系統(tǒng)能產(chǎn)生合適的pH并且不會(huì)與相關(guān)的酶或抑制劑反應(yīng)或形成配合物。例如，用于許多酶/抑制劑相互作用的緩沖系統(tǒng)是甘氨酰-甘氨酸緩沖液，其pH為弱堿性，如pH8.6，溫度為環(huán)境溫度(一般為25℃)。
實(shí)驗(yàn)部分
以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明和驗(yàn)證，但這些實(shí)施例并不是要從任何角度來限定如權(quán)利要求書所述的本發(fā)明的范圍。
例1
以下方法是對(duì)合成多種類型一取代含硼酸和二取代含硼酸的合適方法的典范
制備噻吩-3-一取代含硼酸將溶于鈉干燥的醚(100ml)中的3-溴噻吩(0.043m)冷卻至-60℃。迅速加入丁鋰(30ml，濃度1M)。然后攪拌該混合物3分鐘，再加入溶于鈉干燥的醚(25ml)中的硼酸三正丁酯(0.043m)或硼酸三甲酯(0.043m)。攪拌該混合物4小時(shí)，并使其升溫至室溫。然后用氫氯酸(1M)處理反應(yīng)混合物，并分離醚層。用乙醚萃取水層(2次，25ml)。用氫氧化鈉(1M)萃取合并的醚層。用氫氯酸(10％)酸化堿性溶液，從而使想要的一取代含硼酸沉淀。分離一取代含硼酸，然后再從水/乙醇中再結(jié)晶，并讓其在空氣中干燥。
C4H5BO2S，mpt.163-164℃。
制備二苯基二取代含硼酸用上述方法制備這種物質(zhì)。由溴代苯和鎂碎片制備Grignard試劑。不過，每摩爾硼酸三正丁酯使用2摩爾Grignard試劑。通過與乙醇胺反應(yīng)分離由此所形成的二取代含硼酸，由此產(chǎn)生二苯基二取代含硼酸和乙醇胺配合物((C6-H5)2BO·CH2CH2NH2)，這種產(chǎn)物更易于處理。Mpt.192-194℃。
制備4-甲酰苯基一取代含硼酸可以用披露于Chem.Ber.123(1990)，PP.1841-1843中的方法制備這種化合物。讓4-溴代苯醛二乙基乙縮醛與鎂碎片在四氫呋喃中反應(yīng)，然后加入溶于乙醚中的硼酸三丁酯，并用硫酸處理該混合物。
例2
測(cè)定Ki
用標(biāo)準(zhǔn)方法，在以下條件下測(cè)定抑制蛋白酶SavinaseTM的抑制常數(shù)Ki。
底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對(duì)-硝基-酰苯胺＝SAAPFPNA(購自Sigma公司，分類號(hào)S-7388)。
緩沖液0.1M甘氨酰-甘氨酸pH 8.6；每升1.5ml 15％BrigTM35；25℃(甘氨酰甘氨酸購自Sigma公司，分類號(hào)G-3028)。
試驗(yàn)中酶的濃度
SavinaseTM1×10-10-3×10-10M
用一臺(tái)Cobas Fara自動(dòng)分光光度計(jì)測(cè)0.01-2mM范圍內(nèi)的9種底物濃度的底物水解起始速度。用ENZFITTER(一種非線性回歸數(shù)據(jù)分析程序)測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km。由方程Vmax＝kcat×[Eo]計(jì)算kcat。通過用極強(qiáng)的結(jié)合蛋白類蛋白酶抑制劑進(jìn)行活性位點(diǎn)滴定測(cè)定活性酶〔Eo〕的濃度。由Km/kcat曲線以抑制劑濃度函數(shù)的形式計(jì)算抑制常數(shù)Ki。假定抑制劑的純度為100％，由稱得的重量和分子量測(cè)定摩爾濃度。
下面列出了一系列試驗(yàn)過的一取代含硼酸酶穩(wěn)定劑(抑制劑)的抑制常數(shù)，以及上述某些抑制劑的[I]t/Ki值。
表1
用不同的一取代含硼酸衍生物抑制SavinaseTM的抑制常數(shù)和[I]t/Ki值。為了比較，也包括硼酸。
*在溶液中抑制劑的％W/W。
例3
在液體洗滌劑里的貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)
以下內(nèi)容涉及KNPU(“Kilo Novo Protease Units”)與SavinaseTM制劑相關(guān))，和KLU(“Kilo Lipase Units”)與LipolaseTM制劑相關(guān)。1個(gè)KNPU相當(dāng)于2.53mg(約9.4×10-5mmol)純酶蛋白。關(guān)于SavinaseTM活性的測(cè)定參見一本小冊(cè)子，AF 220/1-GB(可以向NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark索取)。
一個(gè)脂肪酶單位(LU)被定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(30.0℃，pH7.0；以Gum Arabic為乳化劑，以三丁精為底物)每分鐘釋放出1μmol可滴定的丁酸的酶量。一本更詳細(xì)地講述該分析方法的小冊(cè)子(AF 95/5)可以向Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark索取。1 KLU相當(dāng)于0.2mg(約6.7×10-6mmol)純酶蛋白。
用上述方法，在下面歸納的條件下，在液體洗滌劑中的貯存穩(wěn)定性(保留的酶活性)檢驗(yàn)中檢驗(yàn)各種蛋白酶抑制劑。在單丙二醇(MPG)中制備多種抑制劑(除硼酸外)的4％W/W溶液。硼酸在相關(guān)介質(zhì)中的可溶性較差，因此被溶于成品洗滌組合物中(產(chǎn)生1％W/W的硼酸濃度)，而不是液體酶/抑制劑組合物中。
第一檢驗(yàn)系列在第一檢驗(yàn)系列中，將等重量份的抑制劑溶液和SavinaseTM 16.0L，Type EX(每克中含有16KNPU蛋白酶的液體蛋白酶制劑；Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)混合，得到各自含有2％W/W抑制劑的SavinaseTM 8L EX制劑。各自含有1％W/W這種SavinaseTM/抑制劑制劑、98％W/W“洗滌劑基1”(見下文)和1％W/W LipolaseTM 100L，Type EX(每克中含有100KLU脂肪酶的液體脂肪酶制劑；Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)的洗滌組合物的貯存穩(wěn)定性結(jié)果如下％殘余LipolasteTM活性(在30℃下貯存)抑制劑 貯存時(shí)間(天)
1 3 7
34 6 01％硼酸 82 52 21苯基一取代含硼酸79 46 17苯并呋喃-2一取代含硼酸 83 54 244-甲酰苯基一取代含硼酸 86 64 41無SavinaseTM或抑制劑 88 72 55％殘余SavinaseTM活性(在30℃下貯存7天)抑制劑 活性％無 101％硼酸74苯基一取代含硼酸 67苯并呋喃-2一取代含硼酸 764-甲酰苯基一取代含硼酸 85
以上結(jié)果特別表明，所述抑制劑的存在能明顯改善洗滌組合物中LipolaseTM和SavinaseTM活性的保存。
第二檢驗(yàn)系列在第二檢驗(yàn)系列中，分別以5037.5∶12.5的重量比混合SavinaseTM 16.0 L EX，4％W/W溶于MPG中的抑制劑和純MPG，得到各自含有1.5％W/W抑制劑的SavinaseTM8L EX制劑。各自含有1％W/W這種SavinaseTM/抑制劑制劑、98％W/W “洗滌劑基II”(見下文)和1％W/W LipolaseTM 100L，Type EX的洗滌組合物的貯存穩(wěn)定性結(jié)果如下％殘余LipolaseTM活性(在30℃下貯存)抑制劑貯存時(shí)間(天)
1 5 9 12無53 8 04-甲酰苯基一取代含硼酸 58 41 283-乙酰氨基苯基一取代含硼酸 24 9 5無SavinaseTM或抑制劑76 67 55
第三檢驗(yàn)系列以與上述第二檢驗(yàn)系列相同的方式制備各自含有1.5％W/W抑制劑的SavinaseTM 8L EX制劑。各自含有1％W/W這種SavinaseTM/抑制劑制劑、98％W/W“失活”O(jiān)MOTM Micro(見下文)和1％W/W LipolaseTM 100L，Type EX的洗滌組合物的貯存穩(wěn)定性結(jié)果如下％殘余LipolaseTM活性(在35℃下貯存)抑制劑 貯存時(shí)間(天)
5714無 9088854-甲酰苯基一取代含硼酸 989999無SavinaseTM或抑制劑999999
第四檢驗(yàn)系列基本上與上述第三系列相同，所不同的是采用的貯存溫度為30℃，并用“洗滌劑基III”(見下文)代替失活的OMOTMMicro。％殘余LipolaseTM活性(在30℃下儲(chǔ)存)抑制劑 貯存時(shí)間(天)
15912無45 194-甲酰苯基一取代含硼酸 32 20 17無SavinaseTM或抑制劑 39 28 24
以上結(jié)果表明，上述抑制劑的存在能顯著改善在各種洗滌組合物中LipolaseTM活性的保存。洗滌劑基I配方(美國型)成分 ％W/W(純成分)NansaTM 1169/p10.3(直鏈烷基苯磺酸鹽，LAS)BerolTM 452 3.5(烷基醚硫酸鹽，AES)油酸 0.5花生脂肪酸 0.5DobanolTM 25-76.4(脂肪醇乙氧基化物，AEO)二甲苯磺酸鈉 5.1乙醇 0.7MPG2.7甘油 0.5硫酸鈉 0.4碳酸鈉 2.7檸檬酸鈉 4.4檸檬酸 1.5用水平衡洗滌劑基II配方成分％W/WNansaTM 1169/p 10.30SulfatolTM NA/25 1.40油酸7.05花生脂肪酸 7.05DobanolTM 25-7 13.10三乙醇胺5.50NaOH，40％ 2.00二甲苯磺酸鈉1.00乙醇4.90MPG 2.70硫酸鈉 0.20檸檬酸鈉1.40DequestTM 2060 S 0.40用水平衡洗滌劑基III配方成分 ％W/W(純成分)NansaTM 1169/p7.00油酸 0.45花生脂肪酸 0.45LutensolTM A043.80MPG0.50甘油 4.60Na5P3O10·H2O 22.60Na2SiO3·5H2O 1.70碳酸鈉 1.43用水平衡
OMOTM Micro是可從丹麥的超市上購得的零售商品。通過在微波爐中處理(85℃，5分鐘)使其中的酶成分失活。
例4
液體酶/抑制劑組合物的例子
本發(fā)明液體酶/抑制劑組合物的例子如下(所有組合物均為具有可接受外觀的溶液)
1)0.1g 4-溴苯基一取代含硼酸+10g Savinase 16.0L，Type EX該組合物的抑制劑酶(I∶E)摩爾比約為33。
2)0.2g 3，5-二氯苯基一取代含硼酸+40g Savinase 16.0L，TypeEX該組合物的I∶E摩爾比約為17。
3)0.1g 5-氯代噻吩-2-一取代含硼酸+10g Savinase 16.0L，TypeEX該組合物的I∶E摩爾比約為40。
4)0.1g苯基一取代含硼酸+10g Savinase 16.0L，Type EX該組合物的I∶E摩爾比約為54。
5)0.2g苯基一取代含硼酸+10g Savinase 16.0L，Type EX該組合物的I∶E摩爾比約為108。
權(quán)利要求
1.一種液體組合物，含有
(i)一種含量超過40μM的酶；和
(ii)上述酶的一種可逆抑制劑，其用量能有效提高隨后加入這種液體組合物的多成分組合物中所述酶的貯存穩(wěn)定性。
2.如權(quán)利要求1的組合物，其中，所述酶的用量為500μM-5mM。
3.如權(quán)利要求1或2的組合物，其中，所述抑制劑與所述酶的摩爾比至少為5。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中，所述[I]t/Ki(如本文所定義的)比至少為50。
5.如權(quán)利要求4的組合物，其中[I]t/Ki之比在250-5000范圍內(nèi)。
6.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中，所述酶選自蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和氧化還原酶。
7.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中，所述酶是蛋白酶。
8.如權(quán)利要求7的組合物，其中，所述抑制劑選自一取代含硼酸、二取代含硼酸及其鹽。
9.一種用于制備一種含酶和酶抑制劑的洗滌組合物的方法，其中，將權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的液體組合物與該洗滌組合物的其余成分混合。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述洗滌組合物是一種液體組合物。
11.一種用權(quán)利要求9或10的方法制備的洗滌組合物。
12.將權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的液體組合物用于生產(chǎn)洗衣用或洗碟用洗滌組合物的用途。
13.如權(quán)利要求12的用途，用于生產(chǎn)一種液體洗滌組合物。
全文摘要
一種液體含酶組合物，它極適于隨后摻入諸如洗衣或洗碟用液體洗滌組合物的多成分組合物中，其包括(i)一種用量超過40μm的酶；和(ii)這種酶的一種可逆抑制劑，其用量能有效提高該酶在多成分組合物中的貯存穩(wěn)定性，所述液體組合物隨后就是被摻入該多成分組合物中。
文檔編號(hào)C11D3/38GK1168155SQ9619138
公開日1997年12月17日 申請(qǐng)日期1996年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月9日
發(fā)明者M·利克, O·希蒙森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司