用于間充質(zhì)干細(xì)胞的處理方法及其在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首先涉及一種處理優(yōu)選地來自脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，主要包括兩個(gè)步驟，即，制備和分離間充質(zhì)干細(xì)胞，接著使細(xì)胞在含有氧化劑的調(diào)理或處理介質(zhì)中進(jìn)行生長(zhǎng)和特定處理一段時(shí)期。本發(fā)明還包括直接通過所述方法獲得的細(xì)胞及其在治療由氧化應(yīng)激引起的或與其相關(guān)的疾病中的用途。
【專利說明】用于間充質(zhì)干細(xì)胞的處理方法及其在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治
療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于間充質(zhì)干細(xì)胞的治療方法，由該方法直接獲得的細(xì)胞及其在治療由氧化應(yīng)激引起的或與其相關(guān)的疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞的潛能依靠其在限定的細(xì)胞類型中分化和整合到相應(yīng)組織和器官中的能力。干細(xì)胞的另一個(gè)有益的特征是其旁分泌釋放細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子。
[0003]當(dāng)前研究和臨床試驗(yàn)的目的是用來探究干細(xì)胞在一些病理學(xué)中的治療效果，并且對(duì)于基于干細(xì)胞治療存在日益增長(zhǎng)的需要。
[0004]呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)/功能、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的一些退行性疾病，脊髓損傷，缺血/再灌注損傷和脫髓鞘疾病都具有活性氧類(ROS)介導(dǎo)的炎性成分，稱為氧化應(yīng)激。
[0005]活性氧類，主要是過氧陰離子基團(tuán)(02_)及其歧化產(chǎn)物H2O2，其為細(xì)胞線粒體參與呼吸鏈的天然廢物副產(chǎn)物，呼吸鏈?zhǔn)且环N由于其在能量分子(ATP)生成中的功能而對(duì)細(xì)胞壽命至關(guān)重要的現(xiàn)象。
[0006]線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最主要的氧化還原-活性代謝區(qū)，超過90%的電子傳遞至呈最終電子受體O2上。主要的電子傳遞經(jīng)由中央氧化還原循環(huán)發(fā)生，所述中央氧化還原循環(huán)使用從各種代謝底物(例如丙酮酸鹽、脂肪酸)的氧化獲得的勢(shì)能產(chǎn)生ATP。該過程的調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞功能很重要，因?yàn)樵谔峁┓潜匦璋被?、消除過量的氨基酸、提供葡萄糖和面對(duì)可變的和間歇性的進(jìn)食時(shí)能夠長(zhǎng)期提供能量的互變能量前體，細(xì)胞必須產(chǎn)生ATP，而同時(shí)保持合適的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。部分調(diào)控似乎經(jīng)由持續(xù)低的ROS生成速率和和分子傳感器而發(fā)生。對(duì)于該調(diào)控的相關(guān)氧化還原循環(huán)，盡管缺乏界定，但是已知其需要特定的氧化還原環(huán)境。
[0007]在過度的氧化應(yīng)激下，同時(shí)發(fā)生的線粒體ATP-生成潛能的破壞和電子傳遞鏈引起的ROS生成的瞬時(shí)增加可引起線粒體將ROS釋放到細(xì)胞溶質(zhì)。這可觸發(fā)相鄰線粒體中“R0S-誘發(fā)的ROS釋放”。因此，雖然低的ROS生成速率是線粒體中的正常過程，但是過度的ROS生成對(duì)電子流的破壞可引起衰老、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。Go和Jones，2008.Redox compartmentalization in eukaryotic celIs.Biochimica et BiophysicaActal780 (1273 - 1290);Zorovj Juhaszova Sollott.2006.Mitochondrial ROS-1nducedROS release:an update and review.Biochim Biophys Actal757 (509 - 517)。
[0008]實(shí)際上，這些過程與線粒體氧化應(yīng)激-相關(guān)疾病比如帕金森癥、弗里德希氏共濟(jì)失調(diào)、亨廷頓病和糖尿病直接相關(guān)。Go和Jones，2008.Redox compartmental izationin eukaryotic cells.Biochimica et Biophysica Acta I 780 (I 273 -1290);Dringen，Gutterer 和 Hirrlinger，2000.Glutathione metabolism in brain.Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defenseagainst reactive oxygen species.Eur J Biochem267(4912-4916);Chinta 和Andersen, 2008.Redox imbalance in Parkinson’s disease.Biochimica et BiophysicaActal780 (1362 - 1367);Cohen, 2000.0xidative stress, mitochondrial respiration, andParkinson’s disease.Ann N Y Acad Sci899 (112 - 120);Lodi, Tonon, Calabrese 和Schapira，2006.Friedreich’s ataxia: from disease mechanisms to therapeuticinterventions.Antioxid Redox Signal8(438 - 443) ;McGill和Beal，2006.PGC-lalpha，anew therapeutic target in Huntington’s disease?Celll27(465 - 468);Donath, Ehses，Maedler，Schumann, Ellingsgaard，Eppler 和 Reinecke，2005.Mechanisms of beta-celldeath in type2diabetes.Diabetes54 (Suppl2) (S108-S113)。
[0009]過氧化物，包括過氧化氫(H202)，是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要活性氧類(R0S)之一。H202是由一些酶(包括過氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶和單胺氧化酶)連續(xù)產(chǎn)生的，為了防止氧化性損傷其必須被降解。h202的細(xì)胞毒性作用被認(rèn)為是由鐵催化反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基引起的，其引起對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和膜脂的繼發(fā)性破壞。H202在高濃度Ο?ΟΟμΜ)下充當(dāng)“自殺底物”，引起過氧化氫酶不可逆地滅活。Hyslop，Zhang, Pearson&Phebus, 1995.Measurementof striatal H202by microdyalysis following global forebrain ischemia andreperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H202in vitr0.Brain Res671 (181-186).H202引起細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽，一種從細(xì)胞中消除H202的分子，的耗盡，表明H202進(jìn)入細(xì)胞，因此可在細(xì)胞中啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)毒性通路。Dringen，Pawlowski和Hirrlinger, 2005.Peroxide Detoxification by Brain Cells.J Neurosci Res79(157 -165) ;Halliwell和Whiteman，2004.Measuring reactive species and oxidative damagein vivo and in cell culture:how should you do it and what do the resultsmean?British Journal of Pharmacologyl42(231 - 255);Baud，Greene，Li，Wang，Volpe和 Rosenberg，2004.Glutathione Peroxidase - Catalase Cooperativity Is Requiredfor Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes.JNeurosci24(1531 - 1540)。
`[0010]細(xì)胞也合成抗氧化分子，并具有使其重復(fù)利用的機(jī)制。谷胱甘肽(GSH)是參與消除H202的抗氧化機(jī)構(gòu)的主要蛋白質(zhì)之一，谷胱甘肽與氧化形式GSSG及相關(guān)酶谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷氧還蛋白和乳醛還原酶/葡萄糖1-脫氫酶(NADPH/NADP+) —起起作用。使用細(xì)胞培養(yǎng)模型的各種研究都支持線粒體中的GSH所起的關(guān)鍵作用，如在細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡中的保護(hù)作用。在細(xì)胞凋亡性、編程性細(xì)胞死亡中，線粒體GSH/GSSG的氧化剌激GSH耗盡，導(dǎo)致R0S增加，表明GSH在控制線粒體R0S生成中的作用。Dringen, Pawlowski 和 Hirrlinger，2005.Peroxide Detoxification by Brain Cells.J Neurosci Res79 (157 - 165);Dringen, Gutterer 和 Hirrlinger，2000.Glutathionemetabolism in brain.Metabolic interaction between astrocytes and neurons in thedefense against reactive oxygen species.Eur J Biochem267 (4912-4916)。
[0011]在消除過氧化氫的抗氧化機(jī)制中的另一種酶是過氧化氫酶。當(dāng)需要清除高濃度的H202時(shí)，過氧化氫酶是一種特別相關(guān)的胞質(zhì)酶。Baud，Greene，Li，Wang，Volpe&Rosenberg,2004.Glutathione Peroxidase - Catalase Cooperativity Is Requiredfor Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes.JNeurosci24(1531 - 1540)。
[0012]還被探明的是人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞控制使活性物種解毒和糾正蛋白質(zhì)組和基因組的氧化性損害的主要酶的和非酶的機(jī)制，所述蛋白質(zhì)組和基因組確保能有效地控制ROS0Valle-Prieto和Conget, 2010.Human Mesenchymal Stem Cells efficiently manageoxidative stress.Stem Cell Devl9 (1885-1893)。如果在體內(nèi)保持該潛能,人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也可有助于組織再生，抑制ROS-誘發(fā)的組織損傷。
[0013]用于修飾參與消除ROS的酶合成的一些成功的嘗試描述了在抗壞血酸的存在下培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較高水平的過氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽(Stolzing and Scutt, 2006.Effect of reduced culture temperature on antioxidantdefenses of mesenchymal stem cells.Free Radic Biol Med41 (326-338)。而且，在論文Ebert, Ulmer, Zeck, Meissner-ffeigl, Schneider, Stopper, Schupp, Kassem 和 Jacob, 2006.Selenium supplementation restores the antioxidative capacity and prevents celldamage in bone marrow stromal cells in vitr0.Stem Cells24(1226-1235)中，作者描述了通過補(bǔ)充硒或降低溫度調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)條件來上調(diào)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)抗氧化能力。Stolzing和Scutt (2006)公開了在這些骨髓基質(zhì)細(xì)胞中溫度降低不會(huì)影響它們的生存力，但是會(huì)增加它們的分化。另一方面，通過本發(fā)明的處理方法直接獲得的干細(xì)胞，稱為HC016的細(xì)胞，沒有顯示出分化的任何證據(jù)，保持其未分化表型及其生存力。
[0014]此外，Ebert等人，2006年證實(shí)了用IOOnM的亞硒酸鈉對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基補(bǔ)充硒唯一地增加細(xì)胞內(nèi)硒-依賴性酶如谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和硫氧還蛋白還原酶(TrxRs)的活性。另一方面，HC016細(xì)胞保持其生存力、增殖能力和未分化表型，以及活化編碼ROS解毒的關(guān)鍵硒-非依賴性酶的基因，所述硒-非依賴性酶如過氧化物歧化酶(SODs)和過氧化氫酶(Cat)，其對(duì)ROS解毒很重要。而且，HCO16細(xì)胞提高了 GSH的水平。
[0015]最后，用本發(fā)明描述的處理方法直接得到的HC016細(xì)胞相對(duì)于目前技術(shù)水準(zhǔn)使用的干細(xì)胞顯示出一系列優(yōu)點(diǎn)，`其使HC016細(xì)胞特別適于在氧化應(yīng)激條件下起作用。這些優(yōu)點(diǎn)主要是I)產(chǎn)生較多的解毒分子GSH的細(xì)胞內(nèi)池，2)較高且增加的編碼參與活性氧類消除的酶的基因的表達(dá)，3)新的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，因此，朝向受損區(qū)域的遷移能力必然更高，和4)更高的與組織再生過程相關(guān)的生長(zhǎng)因子的表達(dá)。
[0016]得自HC016細(xì)胞的這些作用增加了其細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外抗ROS防御，而不會(huì)對(duì)其生存力和分化狀態(tài)產(chǎn)生任何修飾。
[0017]W02010/150094描述了一種間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分化成脂肪細(xì)胞的方法及其作為細(xì)胞治療的用途。所描述的方法包括在缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)那些細(xì)胞。
[0018]W02007/030870提供了一種用于干細(xì)胞分化的方法，更具體而言，來自人胚胎的細(xì)胞(人類胚胎干細(xì)胞(hES))分化成心肌細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，其包括在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hES細(xì)胞，所述培養(yǎng)基還包含前列腺素或P38MAP激酶抑制分子。
[0019]因此，目前技術(shù)水準(zhǔn)迫切需要產(chǎn)生用于獲得具有改善的或增加的自身酶的和非酶的機(jī)制的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述機(jī)制集中于消除活性氧類，因此，產(chǎn)生在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的細(xì)胞治療中可更有效的細(xì)胞。
[0020]發(fā)明目的
[0021]本發(fā)明涉及一種處理間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以及這些預(yù)先處理的細(xì)胞在治療由氧化應(yīng)激引起的或與其相關(guān)的疾病中的用途。
[0022]本發(fā)明的干細(xì)胞可以得自不同的來源，其中包括脂肪組織、骨髓、臍帶和/或胎盤，但是優(yōu)選地，本發(fā)明是由源自人脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASC)產(chǎn)生的。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)方面，認(rèn)為與氧化應(yīng)激有關(guān)和由其引起的疾病或由于活性氧類介導(dǎo)的組分引起的退行性應(yīng)激的病癥是選自下述的那些:關(guān)節(jié)周炎、糖尿病、慢性肉芽腫疾病、動(dòng)脈硬化、肺纖維化(慢性阻塞性肺病、C0PD、特發(fā)性肺纖維化)、缺血/再灌注綜合征、阿爾茨海默病、帕金森病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腸炎性疾病:潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病、成人呼吸窘迫綜合征、中風(fēng)、脊髓損傷、周圍神經(jīng)損傷、肌萎縮性脊髓側(cè)索綜合征、亨廷頓氏疾病、多發(fā)性硬化癥、弗里德希氏共濟(jì)失調(diào)、牙周炎、粘膜疾病、與炎癥組分共存的疾病和損傷、急性和慢性潰瘍及創(chuàng)傷。
[0024]這些病理中存在的氧化環(huán)境引起受損區(qū)域中炎性過程的維持和甚至加劇。該現(xiàn)象是損害組織再生的因素之一，由于產(chǎn)生大量的R0S引起組織再生損害不能得到恢復(fù)。用本發(fā)明的方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞在上述病理中產(chǎn)生的氧化環(huán)境中獲得了較高的存活能力。這一事實(shí)產(chǎn)生來自活細(xì)胞可利用的可溶性因子增加，其促進(jìn)受損組織恢復(fù)。
[0025]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是間充質(zhì)干細(xì)胞的處理方法，其包括從人供體獲得和分離間充質(zhì)干細(xì)胞，并在限定的處理培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是上述從脂肪組織獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的處理方法的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明的還一個(gè)方面是一種用于間充質(zhì)干細(xì)胞的功能修飾的方法，以促進(jìn)其存活和提高其產(chǎn)生參與活性氧類解毒的分子的能力。
[0028]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及由本發(fā)明的處理方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，與未采用本發(fā)明的預(yù)處理方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞相`比，其具有較高且增加的參與活性氧類解毒的基因的表達(dá)，和/或較高的細(xì)胞內(nèi)GSH水平和/或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化，和/或增加的其細(xì)胞遷移能力。
[0029]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及根據(jù)本發(fā)明處理的間充質(zhì)干細(xì)胞作為在治療由氧化應(yīng)激引起的或與其相關(guān)的疾病的細(xì)胞治療中的治療組分/試劑的用途，所述間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的細(xì)胞內(nèi)GSH水平，更優(yōu)選地，具有較多且增加的參與活性氧類消除的基因的表達(dá)，選自:S0D1細(xì)胞質(zhì)過氧化物歧化酶、S0D2線粒體過氧化物歧化酶2、S0D3細(xì)胞外過氧化物歧化酶3、Cat過氧化氫酶、GPx谷胱甘肽過氧化物酶和GR谷胱甘肽還原酶，更優(yōu)選地，具有不同細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和較多的編碼肌動(dòng)蛋白以及生長(zhǎng)因子IGF-1的基因的表達(dá)。
[0030]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的間充質(zhì)細(xì)胞施用于受損組織鄰近的區(qū)域和/或損傷中心的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1.通過ΜΤΤ方法測(cè)量且受到氧化環(huán)境(lOOmM)應(yīng)激的ASC，HC016 (A)，HOG和本發(fā)明的方法處理的HOG(B)的增殖能力?？梢杂^察到當(dāng)受到氧化環(huán)境應(yīng)激時(shí)，HC016細(xì)胞具有的細(xì)胞增殖顯著增加。當(dāng)對(duì)其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞類型如H0G細(xì)胞應(yīng)用相同處理時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)該作用。星號(hào)指示在t檢驗(yàn)中p〈0，05 (實(shí)施例3)。
[0032]圖2.在ASC，HC016，HOG和本發(fā)明的方法處理的H0G中，細(xì)胞內(nèi)活性氧類水平的動(dòng)力學(xué)分析。該分析表明僅僅HC016細(xì)胞顯著地降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，主要在當(dāng)其暴露于高濃度的氧化應(yīng)激時(shí)。星號(hào)指示根據(jù)雙向方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(*，P<0, 05;**，P<0, 01)(實(shí)施例4)。[0033]圖3.在ASC和HC016細(xì)胞中總谷胱甘肽(GSH總)的細(xì)胞內(nèi)水平(實(shí)施例5)。在非應(yīng)激的對(duì)照條件下，該處理誘發(fā)HC016基礎(chǔ)GSH水平比ASC提高10%。
[0034]圖4A.在ASC和HC016細(xì)胞中參與活性氧類解毒的基因的表達(dá)水平(實(shí)施例6)。
[0035]圖4B.在ASC和HC016細(xì)胞中參與活性氧類解毒的基因(S0D1、S0D2、S0D3、Cat、GR、GPx)的表達(dá)的定量。值表示為HC016/ASC的比例(實(shí)施例6)。
[0036]圖5A.在ASC和HC016細(xì)胞中參與細(xì)胞骨架組成的基因(β-肌動(dòng)蛋白)的表達(dá)水平(實(shí)施例7)。
[0037]圖5Β.在ASC和HC016細(xì)胞中參與細(xì)胞骨架組成的基因(β-肌動(dòng)蛋白)的表達(dá)的定量(實(shí)施例7)。值表示為比例HC016/ASC(實(shí)施例7)。圖5C.在ASC和HCO16細(xì)胞中編碼生長(zhǎng)因子IGF-1的基因的表達(dá)水平(實(shí)施例7)。
[0038]圖5D.在ASC和HC016細(xì)胞中編碼生長(zhǎng)因子IGF-1的基因的表達(dá)的定量(實(shí)施例7)。值表示為比例HC016/ASC(實(shí)施例7)。
[0039]圖6.免疫染色中F-肌動(dòng)蛋白的熒光顯微鏡圖像?？梢杂^察到相對(duì)于ASC，HC016細(xì)胞中存在的F-肌動(dòng)蛋白及其在應(yīng)力纖維中的分布增加，其意味著HC016的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化與其遷移和趨化能力較高有關(guān)(實(shí)施例8)。
[0040]圖7.在氧化應(yīng)激攻擊之后神經(jīng)譜系HOG細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，及應(yīng)用ASC和HC016對(duì)該生長(zhǎng)速率的影響。受氧化環(huán)境應(yīng)激的HOG細(xì)胞與ASC和HC016 —起的共培養(yǎng)提高了 HOG細(xì)胞存活率。然后，在將HOG細(xì)胞暴露于氧化環(huán)境之后，僅與HCO16共培養(yǎng)延緩該保護(hù)效應(yīng)48小時(shí)。星號(hào)指示根據(jù)t-檢驗(yàn)的顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p〈0，05)(實(shí)施例9)。
[0041]圖8.顯示相對(duì)于ASC細(xì)胞而言，HC016細(xì)胞朝向遭受氧化應(yīng)激攻擊的細(xì)胞的顯著較高遷移能力的代表性圖和定量柱形圖(實(shí)施例10)。圖9.三個(gè)具有脊髓損傷的大鼠的實(shí)驗(yàn)組(非處理的大鼠、用ASC處理的大鼠和用HC016處理的大鼠)的BBB得分(Basso-Beattie-Bresnahan)的變化的表。
[0042]發(fā)明詳述
[0043]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種處理間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選地來自脂肪組織，指由成年動(dòng)物的脂肪組織獲得和/或分離而得的，更具體地來自動(dòng)物來源，優(yōu)選人類。該方法主要需要兩個(gè)限定的步驟，第一步，獲得和分離間充質(zhì)干細(xì)胞，和第二步，細(xì)胞在包括氧化劑的限定的處理培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)和特定處理一段時(shí)期。
[0044]ASC細(xì)胞的獲取:
[0045]關(guān)于該步驟，所述方法包括首先獲取和分離間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0046]間充質(zhì)干細(xì)胞的來源可以選自:脂肪組織、骨髓、臍帶和/或胎盤，優(yōu)選地，本發(fā)明是源自人脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASC)。
[0047]因此，優(yōu)選地，在本發(fā)明中，源自脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的部分是從處于麻醉下的健康人患者的脂肪組織中提取的。所述脂肪組織提取物是由患者在簽署知情同意書之后捐獻(xiàn)的。然后，將脂肪組織提取物用Ix PBS洗滌，并在37°C下用I型膠原酶消化30分鐘，接著離心，獲得細(xì)胞團(tuán)塊。將該團(tuán)塊再懸浮在紅細(xì)胞裂解緩沖液中，經(jīng)由IOOym尼龍網(wǎng)過濾提純的細(xì)胞懸浮液，并再次離心。在再懸浮所述細(xì)胞之后，將這些細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞集落擴(kuò)增。
[0048]在本發(fā)明中使用的細(xì)胞集落擴(kuò)增或繼代培養(yǎng)方法包括從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液孵育，離心所收獲的細(xì)胞懸浮液，測(cè)定細(xì)胞密度和生存力，并將這些細(xì)胞接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)容器中。
[0049]在本發(fā)明中的細(xì)胞收獲是基于現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法，如下述出版物中指出的:Yoshimura, Shigeura, Matsumoto, Sato, Takaki, Aiba-Kojima, Sato, Inoue, Nagase，Koshima&Gonda，2006.Characterization of Freshly Isolated and CulturedCells Derived From the Fatty and Fluid Portions of Liposuction Aspirates.JCell Physiol208(64 - 76);Almeida, Campa，Alonso-Vale，Lima,Daud&Stocchero,2008.Fraccion vascular estromal de tejido adipos0.Cir.plast.1berolatinoam.34(71-79);Wagner,Wein, Seckinger，F(xiàn)rankhauser，Wirkner, Krause, Blake, Schwager, Eckstein，Ansorge and Ho, 2005.Comparative characteristics of mesenchymal stem cellsfrom human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood.ExperimentalHematology33(1402 - 1416)。
[0050]細(xì)胞處理方法。HC016細(xì)胞的獲取:
[0051]一旦獲得合適的細(xì)胞數(shù)量在300.000-2.000.000之間，對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行如下處
理:需要按照特定處理周期，使細(xì)胞接觸定義濃度的氧化劑。
[0052]氧化劑為例如氧化物和/或過氧化物，其中包括過氧化氫(H202)、過氧化鈣(Ca02)、過氧化鎂(Mg02)、過氧化鋅(Ζη0`2)、二氧化猛(Μη02)、過氧化鉛(Pb02)和一氧化氮(N0)、一氧化二氮(N20)、臭氧(03)、過硼酸鈉(NaB03)、二氧化硒(Se02)、氧化銀(Ag20)、鐵鹽比如氯化鐵(FeCl3)、銅鹽比如氫氧化銅(CuOH、Cu (OH) 2)、過碳酸鹽比如過碳酸鈉(2Na2C03)、高錳酸鹽比如高錳酸鉀(Κ2Μη208)、重鉻酸鹽比如重鉻酸鉀(K2Cr207)、次氯酸(HC10-)的鋰鹽、次氯酸鈉鹽和次氯酸鈣鹽、亞氯酸鈉(NaC102)、氯酸(HC103)、氯酸鉀(KC103)、氫氧化鋁(A1203)、與碳酸鎂(MgC03)共沉淀的氫氧化鋁、三氧化二砷(As(0H)3)、過氧化苯甲酰((C6H5C0)202)、氫氧化|丐(Ca(0H)2)、鹽酸氯氮卓、銅酸(CuO)、鐵氧化物、氧化鎂(MgO)、二氧化鎂、氫氧化鎂(Mg(0H)2)、氫氧化鉀(Κ0Η)、氫氧化鈉(NaOH)、氧化鈦(Ti02)、氧化鋅(ZnO)及其它氧化劑，優(yōu)選屬于活性氧類(R0S)組的過氧化氫(H202)，所述活性氧類是線粒體呼吸鏈的廢產(chǎn)物和炎性過程的信號(hào)分子。H202增加高于某一耐受值會(huì)誘發(fā)細(xì)胞死亡。然而，本發(fā)明的處理方法包括以受控方式用H202培養(yǎng)細(xì)胞；這意味著具有受控的時(shí)期和方法及限定的濃度，其能夠在直接由該處理得到的間充質(zhì)干細(xì)胞中觸發(fā)新的功能和特征。
[0053]更具體而言，在本發(fā)明中研究的處理方法包括按照限定的處理周期，在中等氧化環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞。一般而言，所述處理方法包括在試驗(yàn)性容器中兩個(gè)連續(xù)處理周期，間隔48-72小時(shí)，接著是24-48小時(shí)的第三個(gè)處理周期。
[0054]詳細(xì)地，所述處理周期包括下述步驟:
[0055]a)第一周期:將細(xì)胞接種在培養(yǎng)基容器中，并等待4至8小時(shí)的細(xì)胞適應(yīng)期，以使細(xì)胞粘附和獲得其典型的形態(tài)學(xué)。
[0056]b)加入其由DMEM加10%FBS和H202溶液(直到達(dá)到最終濃度的范圍為0.01至0.05mM)組成的處理介質(zhì)。[0057]c)在37 °C和5%C02氣氛的孵育箱內(nèi)保持48_72小時(shí)。
[0058]d)第二周期:通過用DMEM加10%FBS和H2O2溶液(直到達(dá)到最終濃度的范圍為0，01至0，05mM)替代來更換所述處理介質(zhì)。
[0059]e)在37°C和5%C02氣氛下，孵育這些細(xì)胞48_72小時(shí)。
[0060]f)第三周期:通過用DMEM加10%FBS和H2O2溶液(直到達(dá)到最終濃度的范圍為
0.01至0.05mM)替代來更換所述處理介質(zhì)。
[0061]g)在37°C和5%C02氣氛下，孵育這些細(xì)胞48-72小時(shí)。
[0062]在該處理周期之后，細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)特征得到修飾。從此開始，縮寫HC016指代這些細(xì)胞。
[0063]培養(yǎng)基或生長(zhǎng)介質(zhì)包括目前技術(shù)水準(zhǔn)中常見的已知組分，因此，這些培養(yǎng)基含有總體積的85-95%的高濃度葡萄糖(DMEM, Invitrogen),濃度為總體積的5-15%的胎牛血清(Biochrom)和濃度為總體積的1%的抗生素溶液PSA (Invitrogen)。
[0064]而且，在上述本發(fā)明的方法中使用的處理介質(zhì)包括總體積的85-95%的高濃度葡萄糖(DMEM, Invitrogen)、濃度為總體積的5-15%的胎牛血清(Biochrom)、濃度為總體積的1%的抗生素溶液PSA(Invitrogen)和濃度為總體積的0.01至0.05mM的過氧化氫(H2O2)(Panreac)。
[0065]相對(duì)于沒有用本發(fā)明方法處理的ASC表征HC016細(xì)胞作為本發(fā)明的處理方法的結(jié)果，與未用本發(fā)明的方法處理的ASC相比，本發(fā)明的HC016細(xì)胞已經(jīng)獲得和顯示了較高且提高的參與活性氧類消除的所定義基因的表達(dá)，比如編碼下述蛋白質(zhì)的基因:SODl過氧化物歧化酶I細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)、S0D2過氧化物歧化酶2線粒體蛋白質(zhì)、S0D3過氧化物歧化酶3細(xì)胞外蛋白質(zhì)、GPx谷胱甘肽過氧化物酶、GR谷胱甘肽還原酶和Cat過氧化氫酶。
[0066]SODl:過氧化物歧化酶I是一種包含銅(Cu)和鋅(Zn)作為輔因子的二聚蛋白質(zhì)。SODl位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，催化過氧化物(呼吸鏈和黃嘌呤氧化酶的產(chǎn)物)的歧化反應(yīng)，經(jīng)由下述反應(yīng)產(chǎn)生氧氣和過氧化氫:
[0067].Cu-Zn (n+1)+_S0D+02 — Cu-Zn n+_S0D+02
[0068].Cu-Znn+-S0D+02>2H+ — Cu-Zn (n+1)+-S0D+H202
[0069]S0D2:過氧化物歧化酶2是一種包含錳(Mn)作為輔因子的四聚蛋白質(zhì)。S0D2位于細(xì)胞的線粒體內(nèi)，催化過氧化物(呼吸鏈和黃嘌呤氧化酶的產(chǎn)物)的歧化反應(yīng)，經(jīng)由下述反應(yīng)，產(chǎn)生氧氣和過氧化氫:
[0070].Mn(n+1)+-S0D+(V — Mn n+_S0D+02[0071 ].Mnn+-S0D+02>2H+ — Mn(n+1)+-S0D+H202
[0072]S0D3:過氧化物歧化酶3是包含銅(Cu)和鋅(Zn)作為輔因子的均四聚物蛋白質(zhì)。S0D3釋放到細(xì)胞外介質(zhì)中，其中其經(jīng)由硫酸乙酰肝素蛋白多糖和I型膠原蛋白結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)，以催化介質(zhì)中存在的過氧化物的歧化反應(yīng)，經(jīng)由下述反應(yīng)產(chǎn)生氧氣和過氧化氫。
[0073].Cu-Zn (n+1)+_S0D+02 — Cu-Zn n+_S0D+02
[0074].Cu-Znn+-S0D+02_+2H+ — Cu-Zn (n+1)+-S0D+H202
[0075]Cat:過氧化氫酶是一種具有四個(gè)肽鏈和四個(gè)卟啉血紅素基團(tuán)(鐵，F(xiàn)e)的四聚物蛋白質(zhì)，其作為氧化應(yīng)激的防御中的關(guān)鍵酶存在于幾乎所有需氧細(xì)胞的過氧化物酶體中。過氧化氫酶與過氧化氫反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化成水。盡管其反應(yīng)機(jī)理沒有被完全理解，但是已經(jīng)按照下述反應(yīng)描述了其活性。
[0076].H202+Fe (III) -E — H20+0=Fe (IV) _E (.+)
[0077].H202+0=Fe (IV) _E (.+) — H20+Fe (III) _E+02
[0078]Chelikani, Fita&Loewen, 2004.Diversity of structures and propertiesamong catalases.Cell Mol Life Sci61 (192 - 208)。
[0079]GPx:谷胱甘肽過氧化物酶是高級(jí)脊椎動(dòng)物中已知的小蛋白質(zhì)的一種，其包含硒代半胱氨酸。GPx主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過催化H202結(jié)合還原的谷胱甘肽(GSH)分子參與到過氧化物歧化酶和單胺氧化酶所產(chǎn)生的過氧化氫的解毒。
[0080]GR:谷胱甘肽還原酶是一種均二聚黃素蛋白。GR屬于I類吡啶核苷酸-二亞硫酸酯氧化還原酶家族。該酶參與抗氧劑防御的基本循環(huán)。其活性包括將氧化的谷胱甘肽(GSSG)還原為其巰基形式(GSH)，所述其巰基形式為抗氧劑防御中的關(guān)鍵分子。
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種處理間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其包括獲得和分離間充質(zhì)干細(xì)胞，并在處理介質(zhì)中培養(yǎng)所述細(xì)胞，其特征在于所述處理介質(zhì)包括氧化劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述間充質(zhì)細(xì)胞是從脂肪組織、骨髓、臍帶和/或胎盤分離出來的。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述間充質(zhì)細(xì)胞是從人類脂肪組織分離出來的。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述氧化劑選自:過氧化氫(H2O2)、過氧化韓(CaO2)、過氧化鎂(MgO2)、過氧化鋅(ZnO2)、二氧化猛(MnO2)、過氧化鉛(PbO2)和一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)'臭氧(O3)、過硼酸鈉(NaBO3)、二氧化硒(SeO2)、氧化銀(Ag2O)、鐵鹽比如氯化鐵(FeCl3)、銅鹽比如過碳酸鈉(2Na2C03)、高錳酸鹽比如高錳酸鉀(K2Mn2O8)、重鉻酸鹽比如重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、次氯酸(HC10_)鋰鹽、次氯酸(HC10—)鈉鹽和次氯酸(HC10—)鈣鹽、亞氯酸鈉(NaClO2)、氯酸(HClO3)、氯酸鉀(KClO3)、氫氧化鋁(Al2O3)、與碳酸鎂(MgC)共沉淀的氫氧化鋁、三氧化二砷(As(OH)3)、過氧化苯甲酰((C6H5CO)2O2)、氫氧化鈣(Ca(OH)2)、鹽酸氯氮卓、氧化銅(CuO)、鐵氧化物、氧化鎂(MgO)、二氧化鎂、氫氧化鎂(Mg(OH)2)、氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈉(NaOH)、氧化鈦(TiO2)和/或氧化鋅(ZnO)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述在處理介質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞包括具有48-72小時(shí)間隔的兩個(gè)連續(xù)處理周期，接著是在試驗(yàn)載體中24-48小時(shí)的第三個(gè)預(yù)處理周期。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述在處理介質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞包括下述步驟: a)第一周期:將細(xì)胞接種在培養(yǎng)基表面，并且使該細(xì)胞進(jìn)行4至8小時(shí)的處理時(shí)間，包括端值，以粘附和獲得其典型的形態(tài)學(xué)； b)加入處理介質(zhì)，直到最終H2O2濃度達(dá)到0，01-0,05mM ； c)在37°C和5%C02氣氛的孵育箱內(nèi)保持48-72小時(shí)； d)第二周期:更新所述處理介質(zhì)，直到最終H2O2濃度再次達(dá)到0，01-0，05mM； e)在37°C與5%C02下，孵育這些細(xì)胞48-72小時(shí)； f)第三周期:通過再次應(yīng)用所述介質(zhì)更新所述處理介質(zhì)，直到最終H2O2濃度再一次達(dá)到 O, 01-0，05mM ； g)在37°C與5%C02下，孵育這些細(xì)胞24-48小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在步驟b)、d)和f)中使用的處理介質(zhì)包括85-95%的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基、5-15%的胎牛血清、0.5-5%的抗生素和0.01-0.05mM的過氧化氫。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的方法直接獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過PCR方法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈現(xiàn)SODl基因表達(dá)增加至少30%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過PCR方法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈現(xiàn)S0D2基因表達(dá)增加至少25%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過PCR方法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈 現(xiàn)S0D3基因表達(dá)增加至少50%。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過PCR方法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈現(xiàn)Cat基因表達(dá)增加至少50%。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過Tietze酶法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)GSH增加至少8%。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過采用DCFA探針的熒光定量法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝物的水平降低至少10%。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過PCR方法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈現(xiàn)β -肌動(dòng)蛋白增加至少40%。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于通過PCR方法測(cè)量，相對(duì)于未處理的ASC，所述細(xì)胞呈現(xiàn)IGF-1增加至少40%。
16.根據(jù)權(quán)利要求8-15所述的細(xì)胞在制備用于治療與氧化應(yīng)激相關(guān)的或由其引起的疾病和/或由活性氧類-介導(dǎo)的化合物引起的退行性病癥的藥物中的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的所述細(xì)胞的用途，用于治療選自下述的疾病:結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎、糖尿病、慢性肉芽腫性疾病、動(dòng)脈硬化、中風(fēng)、肺纖維化(慢性阻塞性肺病(COPD)、特發(fā)性肺纖維化)、缺血再灌注綜合征、阿爾茨海默病、帕金森病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎性腸病:潰瘍性結(jié)腸炎和克隆病、成人呼吸窘迫綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、脊髓損傷、周圍神經(jīng)損傷、肌萎縮側(cè)索硬化、亨廷頓病、弗里德希氏共濟(jì)失調(diào)、牙周炎、粘膜疾病及伴隨炎性成分的疾病和損傷、急`性和慢性潰瘍及創(chuàng)傷。
【文檔編號(hào)】C11D3/39GK103687940SQ201180072115
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月6日
【發(fā)明者】瑪利亞·貝戈尼亞·卡斯特羅, 賈維爾·迪茨·加西亞 申請(qǐng)人:希司托賽爾有限公司