專利名稱：從微藻制備與提取角鯊烯的工藝方法
從微藻制備與提取角鯊烯的工藝方法本發(fā)明是關(guān)于一種從破囊壺菌微藻通過發(fā)酵作用制成角鯊烯的優(yōu)化生產(chǎn)工藝方法。從發(fā)明的意義上來說,“破囊壺菌微藻”屬于裂殖弧菌，Aurantiochytrium和破囊壺菌下物種。角鯊烯是一種三萜類化合物，分子結(jié)構(gòu)為三十碳五十氫的異戊二烯，其分子式為2,6,10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22 二十四碳六烯。
這是一種所有高等生物，包括在人類身上(皮脂中可以找到)自然分泌的脂質(zhì)。角鯊烯實際是膽固醇、類固醇激素和維生素D的一種生物合成的基礎(chǔ)中間體(一種膽固醇代謝酶，角鯊烯單加氧酶，在氧化角鯊烯分子的其中一個鏈的同時，誘導(dǎo)環(huán)化作用并產(chǎn)生羊毛固醇，后者將轉(zhuǎn)化為膽固醇和其他類固醇)。在工業(yè)中，角鯊烯主要用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)。作為食用添加，通常是被制成為角鯊烯膠囊或油制品。在化妝品領(lǐng)域，其分子可作為保濕霜里面的一種抗氧化劑，抗靜電劑和潤膚保濕齊U，迅速滲透進入皮膚，不留下痕跡，沒有油膩感，與其它油和維生素混合使用效果良好。在這個領(lǐng)域使用的時候，請注意，由于角鯊烯性質(zhì)極不穩(wěn)定出個不飽和烴)，飽和形式的角鯊?fù)?加氫反應(yīng)制得)是最佳的抗氧化劑，現(xiàn)在市場上售賣的也是這種，一般來說其純度水平非常高(99% )。毒理學(xué)研究表明，按照目前在化妝品中使用的濃度，角鯊烯和角鯊?fù)椴]有毒性，對人體皮膚無刺激，不致敏。在制藥領(lǐng)域，角鯊烯可以用作疫苗輔助佐劑。這些佐劑物質(zhì)能夠刺激免疫系統(tǒng)，增加對疫苗的反應(yīng)。以乳液形式添加到疫苗物質(zhì)里，使疫苗具有更強免疫力，自1977年以來，角鯊烯已用于流感疫苗(FLUAD復(fù)立達，奇龍公司[CHIRON]，預(yù)防季節(jié)性流感的疫苗)，每劑加入10毫克的角鯊烯。由于所有的疫苗都含有角鯊烯，其乳液呈乳白色。角鯊烯也用作疫苗佐劑，尤其是實驗性疫苗，抗瘧疾藥物或針對H5N1和2009年HlNl新型病毒的抗流感疫苗，如下-葛蘭素史克公司所使用的佐劑系統(tǒng)AS03里用于對抗2009年流感大流行的Pandemrix和Arepanrix疫苗的專利成分，-諾華公司所使用的佐劑系統(tǒng)MF59里面的專利成分。角鯊烯也被用于添加到抗流感疫苗，通過產(chǎn)生記憶⑶4細胞刺激人體免疫反應(yīng)。在銷售中的產(chǎn)品中，這是對抗季節(jié)性流感的和病毒抗原聯(lián)合制成的抗流感疫苗的第一種水包油助劑。角鯊烯的純度在這一應(yīng)用領(lǐng)域至關(guān)重要。事實上，如果內(nèi)服，角鯊烯被視為完全安全的；但是作為注射劑，則備受質(zhì)疑。事實上，在醫(yī)療領(lǐng)域，對服用人群的傷害風(fēng)險將會劇增，如果角鯊烯含有雜質(zhì)，因為根據(jù)其定義，這種助劑將會誘導(dǎo)人體對其雜質(zhì)產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)。因此，必須獲得高品質(zhì)的、無雜質(zhì)(雜質(zhì)指極微量的金屬，尤其是汞和其它有毒物質(zhì))的角鯊烯。文獻中提出了幾種制備角鯊烯的途徑。人們常常在軟骨魚類的肝臟中發(fā)現(xiàn)這種化合物，如深海鯊魚(角鯊烯因此得名)。因此,這成為鯊魚被過度捕撈的原因之一，,鯊魚已經(jīng)因其珍貴的鰭而成為被獵殺的對象。此后，鯊魚的肝臟也被用于出售，以生產(chǎn)出“有益健康”的優(yōu)質(zhì)膠囊。但是，即使售賣的角鯊烯主要是從鯊魚肝臟中提取，也不能完全排除衛(wèi)生問題。事實上，鯊魚可能被病原體感染，可能產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)。此外，其肝臟這樣一個消除毒素和凈化身體機能的器官，也可能含有對人體有害的毒素，例如CarChat0Xin。 這些令人憂慮的環(huán)境問題(鯊魚的強烈嚴重退化)和衛(wèi)生問題(魚肝也儲存著令人擔(dān)憂的、對健康有害的毒素)，促使人們從植物提取角鯊烯。因此，從橄欖油、棕櫚油、其他油類作物，或者從莧屬植物、種籽、米糠、小麥胚芽中將其分離出來是有可能的。然而，這種方法存在一個重大缺點，角鯊烯在植物中含量極低，大約以重量計算占比為O. I到O. 7%。作為從鯊魚肝臟或者植物中提取工藝的第一替代方法，往往由于需要實施大型的濃縮和凈化工藝而成本高企，因此人們提出了第一種從微生物入手進行角鯊烯生產(chǎn)的工藝方法天然酵母或重組酵母，尤其是啤酒酵母(Saccharomyces)類型的。因此，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生產(chǎn)角S烯的能力已被熟知，但是其產(chǎn)出物含量仍然非常低大概是O. 041毫克/克生物量(保羅·巴塔查爾吉BHATTACHARJEE等人，2001年，《世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》，第17期，第811-816頁)。通過遺傳重組，研究人員已經(jīng)將其生產(chǎn)性能進行了優(yōu)化處理。因此，重組酵母生產(chǎn)角鯊烯具有如下優(yōu)勢-享受和宿主細胞同等的GRAS(公認安全使用物質(zhì))地位，-無病原體，無傳染性蛋白微粒，無毒素，和宿主細胞一樣，并且-已經(jīng)被用于疫苗領(lǐng)域(如這些酵母的表達載體含有乙肝抗原)。然而，正如第WO 2010/023551號醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用專利申請所指出的那樣(生產(chǎn)的角鯊烯達到97%以上的純度，可以用作疫苗佐劑)，在人們研制出超高產(chǎn)量的角鯊烯重組酵母以前(超過15%細胞干重)，這種第一替代方案還不能被工業(yè)化。然而，獲取這些重組細胞需要通過分子生物學(xué)手段，實施許多重大、漫長而又復(fù)雜的代謝工程步驟，誘導(dǎo)產(chǎn)生角鯊烯的生物合成作用和抑制角鯊烯的分解代謝作用。的確是的，此外，正如在第WO 2010/023551號專利申請?zhí)岢龅哪菢?，角鯊烯合成的相關(guān)基因有很多包括甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，焦磷酸鹽脫羧酶，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶，HMGR(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶)和角鯊烯合成酶。分解代謝作用后，轉(zhuǎn)化為含有角鯊烯環(huán)氧化酶(ERGl)的麥角留醇，羊毛留醇合成酶，C-14位脫甲基酶，dl4-還原酶，C4-甲基氧化酶和C4脫羧酶(ERG26)，3-酮還原酶，C24-甲基轉(zhuǎn)移酶，C8-異構(gòu)酶，C5-去飽和酶，d22-脫氫酶和d24_還原酶的過程中，牽涉到為數(shù)眾多的酶密碼基因。
此外，其他代謝酶也必須加以考慮LEU2基因([測試]-異丙基蘋果酸脫氫酶)，環(huán)氧化鯊烯環(huán)化酶，酵母固醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶和麥角留醇_5，7. 24 (28)-三烯酚-22-脫氫酶。第二替代方案鯊魚肝臟或植物提取工藝方面，人們已經(jīng)提出了從破囊壺菌目科里提取微藻的角S烯制備工藝方法，這種方法頗具前景(包括破囊壺菌，Aurantiochytrium和裂殖弧菌)，尤其是Schizochytrium mangrovei或裂殖弧菌。這些微藻在異養(yǎng)條件下生產(chǎn)出角鯊烯(暗室；提供葡萄糖作為碳源)，并且行內(nèi)的微生物發(fā)酵技師很容易操作。
0045]因此，通過控制發(fā)酵條件，這些工藝提供容易實現(xiàn)的提純步驟，使角鯊烯的品質(zhì)能夠滿足食品、化妝品和醫(yī)療領(lǐng)域的需求。從破囊壺菌科微藻身上產(chǎn)出的角鯊烯不過是和其它相關(guān)脂類化合物伴生的副產(chǎn)物，脂類舉例如二十二碳六烯酸(或者DHA)，ω3多不飽和脂肪酸。因此，角鯊烯通常被描述為DHA商業(yè)用油不可皂化部分的其中一個成分(和類胡蘿卜素和類固醇做比較)。在比較過程中，Schizochytrium mangrovei FBI的菌株生產(chǎn)出的DHA細胞干重大約為6. 2%，角鯊烯為0.017%。結(jié)論是，能夠自然生產(chǎn)角鯊烯的這些微生物，其產(chǎn)量是非常低的-大約為O.I毫克/克生物量，破囊壺菌ACEM 6063 (參見勒維斯等人《新生物技術(shù)》，2001年，第439-447頁。)-大約O. 162 毫克 / 克生物量，Schizochytrium mangrovei FBI (參見江等人，《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》，2004年，第52期，頁數(shù)1196至1200)為了提高產(chǎn)量，看來優(yōu)化發(fā)酵條件是勢在必行。在錢李等人發(fā)表在《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》2009年，第57期，第4267-4272頁的文章指出，角鯊烯是在留醇生物合成的關(guān)鍵中間體，角鯊烯轉(zhuǎn)化為類固醇的第一步關(guān)鍵步驟是加氧對角鯊烯進行環(huán)氧酶催化。然而，如果人們希望實現(xiàn)細胞內(nèi)角鯊烯的蓄積，應(yīng)當(dāng)避免高溶氧水平。因此，在低溶氧水平(0-5%飽和度)條件下，培養(yǎng)破囊壺菌ACEM6063可以使角鯊烯累積到超過I毫克/克生物量，而溶氧水平的升高(40-60% )，角鯊烯的含量也不過只達到0.01毫克/克。同樣,培養(yǎng)溫度為15°C,通過破囊壺菌ACEM 6063進行角鯊烯生產(chǎn)，產(chǎn)量可以達到
I.2毫克/克，而在20°C的時候只有0.7毫克/克(參見勒維斯等人，《新生物技術(shù)》，2001年，第3期，第439-447頁)。在G.陳等人發(fā)表在《新生物技術(shù)》2010年，第27-4期，第382-389頁的文章中，回顧了裂殖壺菌主要產(chǎn)自DHA，其途徑為聚酮合成方法(簡稱PKS)，然而角鯊烯是通過膽固醇生物合成途徑合成的，這意味著生產(chǎn)這兩種化合物的時候，破囊壺菌的營養(yǎng)需求是不同的。他們的工作目的是系統(tǒng)地尋找不同氮源對角鯊烯產(chǎn)量的影響。G.陳等人發(fā)現(xiàn)，在含有谷氨酸鈉、酵母提取物和蛋白胨氮源混合物培養(yǎng)基中，裂殖壺菌可以快速生長，并且蓄積“高”含量的角鯊烯。
盡管這樣，所謂的“高”含量角鯊烯是相對而言。事實上，和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的產(chǎn)出值相比較，如果這個方法的設(shè)計人能夠顯著提高角鯊烯含量及產(chǎn)量，其提升比例分別為26. 3%和10. 1%，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件實際上可以提供含量為O. 72毫克/克和滴定濃度為5. 90毫克/升的角鯊烯。懷著同樣的優(yōu)化角鯊烯產(chǎn)量的目標(biāo)，K. W.范等人，在《世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》2010年第26-3期第1303至1309頁，使用了單加氧酶角鯊烯抑制劑(留醇生物合成的關(guān)鍵酶)特比萘芬(氫氧基氯化物)。行內(nèi)人都了解，角鯊烯的含量和產(chǎn)出率和微生物培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間相關(guān)。細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間越久，可以蓄積的角鯊烯就越少；實際上，培養(yǎng)基通過甾醇生物合成作用消耗更多角鯊烯。
特比萘芬的作用是，防止通過固醇途徑消耗角鯊烯，并刺激了角鯊烯在細胞內(nèi)的蓄積，較試驗組其增量達到36至40%。但是,在本文中使用的Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株制得的角藍烯產(chǎn)量是最高的，甚至遠高于釀酒酵母(O. 041毫克/克生物量),甚至高于鮑圓酵母Torulasporadebrueckii (O. 24毫克/克生物量)，即使這樣，這種方法也不過是O. 53毫克/克的生物量。此外，即使這種代謝作用衍生方法能夠生產(chǎn)出相對而言更高產(chǎn)量的角鯊烯，由于同時限制了對于同樣的細胞脂膜產(chǎn)生來說不可缺少的甾醇，它可能會使細胞變得脆弱。在文獻中報告，使用微藻生產(chǎn)角鯊烯的產(chǎn)量最高的結(jié)果中，C-JYUE和Y.姜在《生化反應(yīng)》2009年第44期第923-927頁，角鯊烯最大含量為I. 17±0. 6毫克/克生物量Schizochytrium mangrovei,使用的是甲基茉莉酸,通過直接作用于角S烯合成酶-代謝作用的關(guān)鍵酶，這種酸被用于調(diào)節(jié)角鯊烯合成代謝作用。因此，盡管人們所作的一切努力，這些值仍然遠遠低于橄欖油的參考值(大約為
4.24毫克/克)，離工業(yè)規(guī)模所需要的數(shù)值差距甚遠。為了研制出一種比現(xiàn)存技術(shù)更有效和更廉宜的方法，申請人自身已經(jīng)進行了開發(fā)，其研究主要集中在優(yōu)化破囊壺菌微藻發(fā)酵條件。本發(fā)明是一種能夠從一百克生物量(干重)中提取以克計算重量的角鯊烯的工藝方法，也就是說，比該領(lǐng)域的文獻中通常描述的含量高出一千倍。本發(fā)明還涉及這種方法制備發(fā)酵培養(yǎng)基，并從中提取和提純角鯊烯的工藝方法。通過裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯首先，申請人的功績在于它發(fā)現(xiàn)在所有的發(fā)酵控制參數(shù)，僅僅其中兩個參數(shù)能夠顯著增加微藻的角鯊烯產(chǎn)出率。這兩個關(guān)鍵參數(shù)是培養(yǎng)基溫度和維生素添加劑，更明確地說，是維生素BI，B6和尤其是維生素B12。本發(fā)明是關(guān)于一種從破囊壺菌微藻通過發(fā)酵取得角鯊烯的生產(chǎn)工藝方法，其特點是包括以下步驟-在25_35°C之間，在28_32°C之間更好，最好是在大約30°C左右，培養(yǎng)破囊壺菌微藻，并且-按每升培養(yǎng)基1-1000微克的比例向培養(yǎng)基添加維生素B12。
更好的做法是，正如下面所述，申請人建議添加〇每升培養(yǎng)液O. I毫克至200毫克的維生素BI，和/或〇每升培養(yǎng)液O. I毫克至200毫克的維生素B6。當(dāng)然，該方法還包含一個高角鯊烯生物量回收步驟和/或者角鯊烯的回收和提取步驟。具體來說，下列市面上銷售的菌株經(jīng)過我們的測試-裂殖壺菌。參考號ATCC20888，-Aurantiochytrium。參考號 ATCC PRA 276， 此外，申請人還擁有自己的生產(chǎn)菌株，裂殖壺菌菌株，裂殖壺菌，2011年4月14日于法國向法國國家微生物保藏中心提交的第CNCMI-4469號菌種(裂殖壺菌R0Q425 (Schizochytrium sp. R0Q425)),以及于2009年6月2日向武漢大學(xué)(中華人民共和國武漢，郵政編碼430072)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心提交的號碼為M 209118的菌種(裂殖壺菌 080129 (Schizochytrium sp. 080129))。還有一種Schizochytrium mangrovei菌株進行了試樣測試,例證如下。特別值得一提的是，本發(fā)明使用的工藝方法，可以使每100克生物量干重生產(chǎn)出含量大于或等于2克的角鯊烯，傾向于每100克干重產(chǎn)出介于2和12g之間的角鯊烯。特別是，根據(jù)詳細的實驗方法，可以實現(xiàn)角鯊烯量化生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明，該工藝的首要基本特點是溫度的選擇，溫度的選擇將根據(jù)微藻的培養(yǎng)和角鯊烯的產(chǎn)量一并決定。溫度范圍為25至35°C，28至32°C時更好，最好是維持在大約30°C左右。申請人:首先克服了技術(shù)偏見，這種偏見認為微藻培養(yǎng)基不應(yīng)超過25°C。事實上，在大部分上面引用的使用破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯的文章中，生產(chǎn)溫度被設(shè)定為先前的研究微藻生長溫度，即15°C，22°C或25°C的溫度。根據(jù)本發(fā)明的工藝方法，申請人提出了相反的建議，在28_32°C之間培養(yǎng)這些微藻，因為申請人注意到-如果產(chǎn)出的角鯊烯細胞生物量濃度隨溫度增加到33°C而增加，超過30°C時的生物量顯著降低，從而限制了角鯊烯的滴定濃度，-在25°C的溫度，角鯊烯的濃度檢測不到或非常低。這個溫度范圍是微藻培養(yǎng)的最佳溫度和角鯊烯有效生產(chǎn)的最佳溫度之間的一個折中范圍。因此，高于25°C的溫度并不和目前普遍實施的技術(shù)背道而馳，這個溫度是有利于
角鯊烯產(chǎn)量的最佳溫度。根據(jù)本發(fā)明，其工藝方法的第二個基本特征是，為了生產(chǎn)角鯊烯而添加到裂殖弧菌的維生素B12的數(shù)量，每公升培養(yǎng)基添加大約1-1000微克的維生素B12。更好的做法是，除了添加維生素B12以外，還補充添加〇每升培養(yǎng)液0. I毫克至200毫克的維生素B 1，和/或〇每升培養(yǎng)液0. I毫克至200毫克的維生素B6。在上述有關(guān)通過微藻生產(chǎn)角鯊烯的文獻中，維生素的作用未被考慮在內(nèi)。供給維生素的傳統(tǒng)做法是添加酵母提取物。
實際上這早已經(jīng)是業(yè)內(nèi)人士所熟知的，維生素在酵母提取物中自然存在，其比例如下-50至120毫克/公斤的維生素BI (硫胺素)-40至80毫克/公斤的維生素B6 (吡哆醇)-I至5. 5毫克/公斤的維生素B12 (氰基鈷胺素cyanocobalamin)這里僅列出這三種B族維生素。然而，放入培養(yǎng)基作為營養(yǎng)物的酵母提取物，其比例每100毫升培養(yǎng)基只有I到2克(參見上述科學(xué)論文)，對應(yīng)的維生素劑量極其低(例如，維生素B12，通過酵母提取物提供的維生素B12含量僅相當(dāng)于O. 07毫克/升)?？偠灾?，所有這些文件既未描述也未建議在使用微藻進行角鯊烯生產(chǎn)的時候， 控制維生素BI，維生素B6和B12的含量。由于未受任何理論的約束，申請人發(fā)現(xiàn)，在角鯊烯生產(chǎn)中維生素B12決定性作用(如下面舉例所示)，顯示其是參與角鯊烯生物合成的某些關(guān)鍵酶的輔助因子。至于維生素BI，它會促進亮氨酸降解作用，這會增加細胞內(nèi)的角鯊烯前驅(qū)物數(shù)量，而維生素B6，會改變細胞色素的作用，避免角鯊烯降解。申請人:發(fā)現(xiàn)，供給維生素B12，并且將溫度調(diào)整到28-30°C，是大幅提高角鯊烯產(chǎn)量的關(guān)鍵(達到每一百克干重制取出克重級的規(guī)模)，并且供給維生素BI和B6，實際上可以增加角鯊烯的生產(chǎn)效率，如下顯示。根據(jù)本發(fā)明，其工藝方法的另外一個特點是，供給維生素是在整個發(fā)酵過程實施的，或者在某些階段，而不僅僅是在生產(chǎn)階段。但是，在整個發(fā)酵工藝過程中，應(yīng)該遵守介于I和1000毫克/升的維生素B12的
添加量。傳統(tǒng)上來說，在使用微藻進行角鯊烯生產(chǎn)的實驗室條件優(yōu)化工作相關(guān)的文獻里，研究人員是在接種程序和傳統(tǒng)微生物生產(chǎn)的基礎(chǔ)上進行發(fā)酵，這些生產(chǎn)條件也是最普遍研究的方向。使用破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯實際上分為三個連續(xù)的階段從瓊脂平板上將菌落分離出來，預(yù)培養(yǎng)使菌株成活，最后是真正意義上的培養(yǎng)(=生產(chǎn))。舉例說，在上述G.陳的文章中，我們發(fā)現(xiàn)他的方法包括以下連續(xù)的步驟-在含有葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母提取物和各種微量兀素的瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌株，-在放置在軌道式振蕩器的錐形燒瓶里進行預(yù)培養(yǎng)，pH值6，溫度為25°C，以獲得成活的生物量。-從培養(yǎng)中的錐形燒瓶里接種另外一個系列，使用和預(yù)培養(yǎng)基同樣的培養(yǎng)基，拿取約O. 5% (v/v)的上一個步驟得到的生物量，維持溫度為25°C。但是，正如人們可以從這篇文章中讀到的那樣(可以通過本領(lǐng)域其他文章證實)，在培養(yǎng)的最后階段，專家們采取行動，優(yōu)化發(fā)酵條件。換句話說，現(xiàn)有技術(shù)下的優(yōu)化研究，主要變換一個或者多個培養(yǎng)基養(yǎng)分，以此研究其對角鯊烯產(chǎn)量的影響。然而，正如下面將要討論的，申請人提出了相反的建議，即從最早期階段的發(fā)酵條件就開始進行控制，即使這樣做似乎會使實施工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)更復(fù)雜。在這個規(guī)模上，實事求是地說，接種程序可以由生產(chǎn)本身步驟之前的數(shù)個預(yù)培養(yǎng)系列步驟組成。本發(fā)明使用的工藝方法的最佳實施方式可以包括以下的步驟序列-破囊壺菌科屬微藻在錐形燒瓶里面預(yù)培養(yǎng)大約24至36小時，溫度為28°C，使用瓊脂平板上分離出來的菌落，-在錐形燒瓶里面的第二個預(yù)培養(yǎng)階段為時24至36小時，溫度為28°C，接種體濃度1% (v/v)，從第一預(yù)培養(yǎng)基里接種，-在30°C下培養(yǎng)60至150小時，在空氣調(diào)節(jié)發(fā)酵裝置里面，以滿足最大為45毫摩爾/升/小時氧氣傳輸，接種濃度為O. 5至2% (v/v選擇)，從第二預(yù)培養(yǎng)基里接種。 在這個程序鏈中，根據(jù)作業(yè)條件，如下所述，添加維生素在預(yù)培養(yǎng)階段一次性完成，或者在兩步預(yù)培養(yǎng)程序中完成，或者整個培養(yǎng)程序中一直添加。正如下文將顯示；在預(yù)培養(yǎng)步驟里面一次性添加維生素已經(jīng)取得了顯著的效果，優(yōu)化后的模式要求在所有步驟里實施添加。 微藻生長所必需的碳源最好是葡萄糖。申請人:則建議，控制葡萄糖的添加量，使得所提供的葡萄糖總量大約相當(dāng)于重量的 15 到 22. 5%0不管怎么說，正如下文舉例說明的那樣，針對選擇出來的裂殖弧菌菌株，首要的工作是使殘?zhí)呛糠橇?，以重量計最多可以達到8%。至于氮源性質(zhì)，申請人發(fā)現(xiàn)它是可以選擇的，從酵母提取物，尿素，谷氨酸鈉，硫酸銨這個組合里面選擇單獨一項或者選擇組合?？赡苣銉A向于選擇酵母提取物，傳統(tǒng)上現(xiàn)有技術(shù)所實施的工藝方法，尿素+維生素混合物，例如由西格瑪公司銷售的BME混合物試劑(β -巰基乙醇)，用量比例為5毫升/升。同樣地，可以全部或者部分使用谷氨酸鈉取代尿素，或使用谷氨酸鈉和硫酸銨的混合物。申請人:建議切勿使用硝酸鹽形式的碳源。至于培養(yǎng)基pH值，如下例所述，將保持在5. 5和6. 5，最好是固定在pH值6。pH值的調(diào)節(jié)可以使用業(yè)內(nèi)人士所了解的任何方式，例如，通過添加2N的硫酸，然后添加8N氫氧化鈉最后，溶氧率可以調(diào)節(jié)到20和0%之間的值，最好保持在5%作用，最初的階段維持24至48小時，最好是36小時，然后任其下降到0%。關(guān)于氧的傳輸，可以使用業(yè)內(nèi)人士所了解的任何方式調(diào)節(jié)使之不超過45毫摩爾/
升/小時。正如下文所舉例證，這些作業(yè)條件下發(fā)酵后，生物量超過50克/升，最好是50至100克/升，約80克/升。每100克生物量干重的角鯊烯含量大于I克，更好的是每100克生物量干重2至15克，最好是每100克生物量干重5至10克。發(fā)酵培養(yǎng)基上提取和提純角鯊烯
生物量的回收是使用行內(nèi)人士了解的任何方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收的，例如，生物量可以從發(fā)酵裝置中提取，僅僅需要微濾濃縮或離心濃縮，連續(xù)地使用水溶劑濃縮-稀釋法清洗。提取脂類進行細胞破碎可以通過各種不同的途徑，這些途徑包括機械、化工、酶作用。通過幾個連續(xù)的提取過程，向細胞裂解液添加正己烷/乙醇提取。正己烷餾分是單獨的步驟，等正己烷蒸發(fā)后，將原油分離出來。最后，本發(fā)明還涉及到使用本發(fā)明的其中任意一個工業(yè)方法生產(chǎn)出來的角鯊烯的利用，如何將其用于醫(yī)療、化妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品組成成分的制備。這樣，本發(fā)明還涉及到使用本發(fā)明的任意一種工藝方法，應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品組成成分的角鯊烯制備方法，這種方法包含應(yīng)用本發(fā)明的任意一種工藝進行角鯊烯生產(chǎn)，以及應(yīng)用于醫(yī)療、化 妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品的組成成分的制備。為了更好的理解本發(fā)明，以下舉例其性質(zhì)是說明性的，而不是限定性的。例I :研究添加維生素BI，B6和B12及溫度對角鯊烯產(chǎn)量的影響預(yù)培養(yǎng)某和培養(yǎng)某這里所說的微藻發(fā)酵分為兩個連續(xù)預(yù)培養(yǎng)階段，之后是培養(yǎng)/生產(chǎn)本身的階段。在這個實驗中，在第一個預(yù)培養(yǎng)階段必須添加維生素，但在第二個預(yù)培養(yǎng)階段和生產(chǎn)階段中是可選的。預(yù)培養(yǎng)基的組成成分如下表一和下表二所示表一
第一個預(yù)培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基％
葡萄糖__3_
—酵母提取物O. 4
谷氨酸鈉__6.42
'氯化鈉1.25
1 酸鎂O. 4
氯化鉀__O. 05
—氯化鈣O. 01
I氫酸鈉O. 05
磷酸二氫鉀__O. 4
維生素混合物^ O. 14
微量元素I 0.8 '表二
第二個預(yù)培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基％
葡萄糖__8.57
I母提取物6. 42
'谷氨酸鈉O. 64
^氯化鈉2
_硫酸鎂O. 64
氯化鉀__2. 29
—氯化鈣O. 03
I氫酸鈉O. 03
_硫酸鈉O. 03
添加維生素混合物^ O. 14
微量元素I 0.2 —
通常使用Clerol消泡劑“FBA3107”，濃度為I毫升/升。最后，使用50毫克/升的青霉素G “鈉鹽“，防止細菌生長，防止污染。葡萄糖與磷酸二氫鉀一起消毒，和剩余培養(yǎng)基的消毒分開，這樣可以避免沉淀物(磷酸鎂銨)的形成。維生素混合物和微量元素進行無菌過濾后添加。培養(yǎng)基/生產(chǎn)成分如表三所不。表三
權(quán)利要求
1.從屬于破囊壺菌目的微藻生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于所述方法包含以下步驟-在25至35°C，優(yōu)選在28至32°C，更優(yōu)選在大約30°C的溫度，培養(yǎng)屬于破囊壺菌目的微藻，以及 -在預(yù)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中添加每升預(yù)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基I到1000微克的維生素B12。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征在于添加 〇每升培養(yǎng)基中O. I毫克至200毫克的維生素BI，和/或 〇每升培養(yǎng)基中O. I毫克至200毫克的維生素B6。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于破囊壺菌目的微藻選自裂殖弧菌(Schizochytrium sp.), Aurantiochytrium sp·，和破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I到3任一項的方法，其特征在于破囊壺菌目的微藻選自保藏編號為ATCC 20888的裂殖弧菌，保藏編號為ATCC PRA276的Aurantiochytrium sp.和在法國國家微生物保藏中心保藏的保藏編號為CNCM 1-4469的裂殖弧菌菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求I到4任一項的方法，其特征在于所獲得的角鯊烯含量為每100克干重的生物質(zhì)大于或者等于2克，優(yōu)選為每100克干重的生物質(zhì)2至12克。
6.根據(jù)權(quán)利要求I到5任一項的方法，其特征在于屬于破囊壺菌目的微藻經(jīng)以下連續(xù)的步驟進行培養(yǎng) -使用錐形燒瓶從瓊脂平板上分離出來的菌落在28°C的溫度下進行24至36小時的第一預(yù)培養(yǎng)， -使用錐形燒瓶用第一預(yù)培養(yǎng)物的I % (v/v)接種物，在28°C的溫度下進行24至36小時的第二預(yù)培養(yǎng)， -用第二預(yù)培養(yǎng)物的O. 5至2% (v/v)接種物在調(diào)節(jié)到維持至多45毫摩爾/升/小時氧氣傳輸?shù)陌l(fā)酵器中，在30°C下進行60至150小時的培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于維生素B12的添加是在兩個預(yù)培養(yǎng)步驟期間進行的，使維生素的總含量為I至10微克/升培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于也在兩個預(yù)培養(yǎng)步驟期間添加維生素BI和維生素B6，使維生素總含量為100至200微克/升培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于維生素B12的添加如下進行 -在兩個預(yù)培養(yǎng)步驟期間，使維生素的總含量為I至10微克/升培養(yǎng)基， -在生產(chǎn)步驟期間，使維生素的總含量為大約1000微克/升培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于也添加維生素BI和B6 -在兩個預(yù)培養(yǎng)步驟期間，使維生素的總含量為100至200微克/升培養(yǎng)基， -在生產(chǎn)步驟期間，使維生素的總含量為150至200毫克/升培養(yǎng)基。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10任一項的方法生產(chǎn)的角鯊烯在制備用于醫(yī)療、化妝品或食品工業(yè)的組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于應(yīng)用破囊壺菌微藻生產(chǎn)角鯊烯的工藝方法，每100克生物量干重產(chǎn)出的最佳角鯊烯含量為2-12克，其特點包含了以下步驟在25至35℃溫度之間，培養(yǎng)破囊壺菌微藻，28至32℃之間更佳，大約30℃最佳，在每升預(yù)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中添加1到1000微克維生素B12。
文檔編號A61Q19/00GK102787140SQ20111014705
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者伯納德·波拉, 伯納德·考利爾, 勞倫特·塞蓋拉, 塞吉·科米尼, 菲利皮·盧騰, 錢云 申請人:羅蓋特兄弟公司