專利名稱：邁卡提取物和含有該提取物的化妝品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提取邁卡(maca)的方法、所獲得的提取物及含有所述提取物的化妝品和藥物組合物，以及其作為抗老化化妝劑的用途。
背景技術(shù)：
邁卡的植物學名稱為Lepidium meyenli walp.(獨行菜屬)。在其俗名之中，英文名稱也稱為邁卡(maca)，秘魯人參(Peruvian ginseng)，quechua；在西班牙語中，被稱為maca、maka、maca-maca，而在蓋楚瓦語中被稱為ayak chichica，ayak willku，maka。它屬于十字花科家族中的獨行菜屬。
邁卡是一種小型草本植物，高度為12至20cm。其地下部份為2至5cm。它包括一個由寬闊的、肥厚的胚軸的較低部分所覆蓋著的直根。在干燥狀態(tài)下，整個直根保持成蘿卜的形狀。簡而言之，將該植物形成的可被使用的地下部分稱為“塊莖”。
葉子成玫瑰花型，且從中心分生。小花是自花授粉的。果實為小長角果(4至5mm)，并帶有兩片各包含一粒種子的莢片。
目前，邁卡和其他植物學上相近的野生獨行菜一直分布在安第斯山脈的幾個山區(qū)中(秘魯、玻利維亞、厄瓜多爾)。這些植物甚至在其生長期也能耐受霜凍。由于其產(chǎn)地的原因，長期以來一直認為該植物是“短日照”植物，然而對其光周期的研究則顯示其在長或短日照條件下的生長情況是相似的。
在氣候條件有利的條件(充分潮濕的土壤和溫和的溫度)下，該植物為一年生。它的植物生長周期為11個月。在高山氣候下，它變成兩年生，在干燥季節(jié)里其地下部分休眠。
在1300至2000年以前，邁卡在秘魯?shù)腟an Blas可能是“家庭養(yǎng)植”的。從那時起，其栽培一直限定在秘魯?shù)闹行纳絽^(qū)，即位于Junin和Pasco地區(qū)海拔3500至4000處。最大的栽培面積集中在Junin湖附近。由于以前對它們的約束較少，所以其延伸遠至Cusco和Titicaca湖。這些地區(qū)的低溫和強風極大限制了除馬鈴薯之外的其他莊稼的生長。
通常在500sq.m.的小塊土地上，采用非常傳統(tǒng)的方式栽培邁卡。在9月到10月雨季的早期播種種子。通常在播種之后的8到10個月后采收塊莖。采收開始于五至六月。采收后將塊莖放置在陽光下干燥6至15天。然后避開陽光和濕氣保存直至使用。塊莖一直保持完好。
邁卡化學組成的主要分析結(jié)果在由Dini等在1994年出版(Dini A.，Migliuolo G.，Rastrelli L.，Saturnino P.，Schettino O，ChemicalComposition of Lepidium meyenii.Food chemistry，1994，49，4，pp.347-349(英文))，以及隨后的Comas等在1997年發(fā)表的(Comas M.，Miquel X.，Arias G.，de la Torre M.C.Bromatological Studies onlepidium meyenii.Alimentaria(Madrid)，1997，286，pp.85-90(西班牙語))中都有描述-濕度10至20％-重要礦物質(zhì)(mg/100g).鉀1150至2050.鈣150至260.鐵3至16.銅0.2至6.鋅1.5至6.鋁3至7-碳水化合物60至65％.淀粉30至35％.蔗糖3至20％.果糖8至10％-葡萄糖3至7％-纖維 4至8％-蛋白質(zhì)10至14％-脂質(zhì) 0.5至2％邁卡傳統(tǒng)上用作食物，但也可使用其治療特性。
邁卡的營養(yǎng)價值與傳統(tǒng)食用的谷類相似，實際上是生活在高原秘魯人主要感興趣和選擇的食物。
為提高男性和動物的生育能力的藥物目的而使用邁卡的塊莖已有數(shù)百年的歷史(Leon J.，邁卡(Lepidium meyenii)，a little-known foodplant of Peru.Economic botany，1964，18，2pp.122-127(英文))。
在安第斯山脈的行走醫(yī)生，Kallawaya，描述過將新鮮塊莖切成薄片，熬制，給月經(jīng)周期三或四天后希望懷孕的不孕婦女服用(Girault L.Kallawaya.Guérisseurs Itinérants des Andes.ORSTOMéd.，Paris，1984，pp.218-219(法文))。
現(xiàn)在，由于推測其具有刺激和引發(fā)性欲的特性，所以邁卡越來越受到關(guān)注。已經(jīng)將邁卡塊莖與人參聯(lián)系在一起(在有潛力的市場方面可能超過人參)，因此它的名字也稱為秘魯人參。
塊莖的其他用途包括其有利于呼吸疾病(肺結(jié)核)、慢性疲勞、記憶疾病、絕經(jīng)綜合征，以及治療風濕損傷等。
本發(fā)明的目的是提供一種邁卡提取物，其能刺激成纖維細胞的代謝和增殖以防止和/或抵抗來自時間的、外來因素(陽光、煙草、污染、壓力)和絕經(jīng)引起的皮膚老化。
皮膚老化的特征特別在于成纖維細胞數(shù)量的減少和活性的降低。
粗制的邁卡(一般以干燥粉末形式存在)幾乎不溶于水。出于這種原因，其很難用于化妝護理產(chǎn)品中。而且，該植物的組成分子(礦物鹽、碳水化合物、蛋白質(zhì)和維生素)通過皮膚路線的生物利用度幾乎不存在。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及一種完全水溶的邁卡的肽提取物，其制備方法，包含該物質(zhì)的化妝品組合物以及它們用作抗老化活性劑的用途。
肽提取物可以是液體也可以是固體，這取決于提取物在其制備的第二步驟中是否進行了冷凍干燥。
皮膚老化可以自己顯示出來，特別是通過組織的萎縮，尤其當轉(zhuǎn)變?yōu)槠つw失去張力和緊繃感，皮膚厚度和彈性減少，開始出現(xiàn)色斑，失去皮膚光澤和均勻度以及開始出現(xiàn)皺紋和細線時。
更具體地，本發(fā)明的目的是一種制備邁卡的含水肽提取物的方法，其特征在于采用邁卡地下塊莖的粉末，所述方法還包含至少一個蛋白質(zhì)的酶水解步驟。
水解優(yōu)選為酶水解。酶水解可以專門采用淀粉酶和蛋白酶的混合物來進行。優(yōu)選地，淀粉酶/蛋白酶比例范圍從50/50至90/10，優(yōu)選從75/25至85/15以使植物的蛋白質(zhì)片段變成水溶性肽。
然后將這樣獲得的含水提取物濃縮以除去不可溶物例如纖維。
根據(jù)對本發(fā)明方法的改進，含水提取物可以隨后通過超濾來純化以提取殘留的痕量蛋白質(zhì)。在這種情況下，有利地選擇10KD的斷開閾值(cut-off threshold)以保留分子量小于10KD的那些肽。
而且，根據(jù)對本發(fā)明方法的優(yōu)選改進，該方法包括以下步驟-清洗，然后在熱空氣中干燥邁卡(例如在60℃)，-將邁卡塊莖研磨成細粉末，-使粉末懸浮在水中，有利地在1至25重量％之間，-在蛋白酶和淀粉酶存在的情況下(例如比例為80/20)水解蛋白質(zhì)，-離心以除去不可溶物(纖維)，-對溶液進行超濾(有利地，斷開閾值為10KD)，-然后任選采用滲濾(有利地為100Da)和/或采用受控蒸發(fā)步驟來經(jīng)過濃縮步驟使其成為干物質(zhì)，最后，任選地進行無菌過濾步驟(優(yōu)選在0.2μm過濾器上)。
本發(fā)明的另一目的是一種邁卡的含水肽提取物，其能通過上面描述的方法及其各種改進方法獲得。
有利地，所述邁卡的含水肽提取物中干物質(zhì)的含量是在1至300g/l之間，優(yōu)選在2至10g/l之間。
至于干物質(zhì)，還原糖的含量可以在2至70％之間，優(yōu)選在35至45％之間。還原糖即反應糖它們能夠向分子提供電子。葡萄糖、果糖和麥芽糖都包括在內(nèi)。歷史上，該術(shù)語源自XIX世紀Fehling的發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ehling證明一些糖與二價銅離子反應可使后者變成一價銅離子。視覺可見地，這種被稱為“還原”的作用可通過Fehling’s溶液中顏色的變化來觀察開始為藍色，在還原糖存在下變成磚紅色。
具有20g/l干物質(zhì)的溶液的pH值可以在5至8之間，優(yōu)選6至7之間。
本發(fā)明的另一目的是用于制備邁卡的固體肽提取物的方法，所述方法的特征在于將可任選地進行通過濃縮和/或滅菌的含水肽提取物冷凍干燥，。換句話說，所得的固體粉末(干燥提取物)具有特別的水溶性特點，這不同于原始邁卡塊莖粉末。
本發(fā)明的另一目的是一種能夠采用上述方法獲得的邁卡的固體肽提取物。
這種邁卡的固體肽提取物的特征還在于它的a氨基氮的含量。這個含量可以在2至70之間。
優(yōu)選地，本發(fā)明邁卡的固體肽提取物具有如下氨基酸組成(以氨基酸總重量計的重量百分比)


本發(fā)明的另一目的是一種化妝品組合物，其特征在于它包含前述邁卡的含水的或固體肽提取物以及化妝品可接受的至少一種賦形劑。
所述化妝品組合物尤其可以用于抗皮膚老化。
本發(fā)明的另一目的是一種化妝處理方法，所述方法包括將所述組合物應用在個體的皮膚上。
最后，本發(fā)明的目的是使用本發(fā)明的含水或固體肽提取物作為抗老化活性劑。更具體地，所述的含水或固體提取物用于刺激細胞代謝，即線粒體的活性，特別是在皮膚的成纖維細胞中。這種含水或固體提取物也可以用于刺激細胞能量?！凹毎芰俊笆侵讣毎M行所有生命活動(特別是有絲分裂、生長、大分子的合成和DNA修復)所需的能量庫。最后，所述的含水或固體提取物還可以用于對抗外界損害如陽光、污染或壓力。
下面，通過對實施方案的實施例的描述來說明本發(fā)明。
實施例實施例1提取物的制備將10kg邁卡粉末在0.25kg淀粉酶存在的情況下分散在80升去礦物質(zhì)水中?；旌衔镌?0℃中維持5小時，pH保持5。
在第二步驟中，加入0.25kg Novo Nordisk公司的Alcalase_蛋白酶。然后將混合物在60℃下放置1小時，pH保持8。
然后，將水解酶通過加熱至90℃并持續(xù)20分鐘而使之變性。
在過濾粘土輔劑存在的情況下在5550rpm下離心混合物并且通過1um布料過濾使其澄清。
將收集的溶液超濾(斷開閾值為10KD)，通過滲濾(10Da)將濾液濃縮至干物質(zhì)含量為10％，然后進行無菌過濾(0.2μm)。
所得提取物具有以下特性


邁卡粉末水解物的HPLC圖譜——分子量分布

實施例2生物活性2-1對正常人成纖維細胞的影響材料和方法細胞正常人成纖維細胞模型，單層培養(yǎng)。
處理將細胞在缺少(對照)或含有從實施例1中獲得的0.1％肽提取物中培養(yǎng)。
細胞代謝的評價通過在一個星期中每天檢測線粒體的活性(MTT檢測，即3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)來評價該提取物產(chǎn)生的影響。
結(jié)果平均來說，相對于未處理的對照細胞，劑量為0.1％的邁卡肽提取物刺激皮膚成纖維細胞的代謝率增加20％。

圖1示例了細胞培養(yǎng)在缺少(對照)或存在邁卡肽提取物時的活力。
結(jié)論邁卡的肽提取物能夠刺激皮膚成纖維細胞的代謝。
2-2在體外對人成纖維細胞人工老化的影響研究模型對于本研究我們采用了體外人工老化的皮膚成纖維細胞模型，所述模型的特征在于采用來自整容手術(shù)者(女性，26歲)的成纖維細胞并且培養(yǎng)至高傳代數(shù)量＞p15。在每次傳代或數(shù)量加倍后，成纖維細胞具有a)外觀變化并且變得更加伸展b)與＜p5傳代并認為是“年輕”的相同成纖維細胞相比，倍增更加緩慢(圖2說明了“年輕”成纖維細胞(＜p5)復制能力(分裂)與老化的成纖維細胞(＞p15)的對比)。
體外人工老化或復制衰老現(xiàn)象已經(jīng)由Leonard Hayflick在1961年證實了(Hayflick L和Moorhead PS.The serial cultivation of humandiploid cell strains.Exp Cell Res，25585-621 1961)。最初的Hayflick曲線顯示細胞在培養(yǎng)的情況下僅能分裂有限的次數(shù)，然后描述了復制衰老和細胞老化之間可能的聯(lián)系(Hayflick L.The limited lifetime ofhuman diploid cell strains.Exp Cell Res.，37)。細胞似乎具有一個內(nèi)在的時鐘效應或可直接限制它們的分裂能力。這種程序化的細胞分裂終止可能與端粒(染色體末端)的缺失相關(guān)。一種可接受的體內(nèi)(缺失大約50堿基對/細胞倍增)和體外(缺失大約70堿基對/細胞倍增)之間的對應性傾向于說明體外細胞分裂的模式預示了體內(nèi)發(fā)生的情況。
結(jié)果細胞在存在或缺少劑量為0.01％的邁卡的肽提取物的情況下培養(yǎng)7天。細胞活力采用MTT試驗檢測。結(jié)果表示為生長率％/培養(yǎng)的第一天(dl)，并根據(jù)公式[OD dX-OD dl/OD D1]X100，其中OD＝在570nm檢測的光密度；d＝培養(yǎng)天數(shù)。
在這些實驗條件下，邁卡的水解產(chǎn)物(劑量為0.01％)在d4和d7時能夠提高“年輕”成纖維細胞的分裂能力(傳代＜5)分別至+35％和40％(圖3A)以及在d4和d7時能提高“年老”的成纖維細胞(＞p15)的分裂能力分別至+26％和29％(圖3B)。圖3A和3B在這作為附圖。
結(jié)論邁卡的水解產(chǎn)物通過刺激“年老”成纖維細胞的增殖能力從而彌補與年齡相關(guān)的皮膚數(shù)量的降低，從而對抗內(nèi)在的皮膚老化。
2-3對人體細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生的影響本研究的目的是評價邁卡肽提取物對暴露或不受UVA+UVB輻射的人細胞(Jurkat)中脂質(zhì)過氧化率(LP)的影響。采用流式細胞計通過特異的熒光探針來進行LP檢測。該方法的優(yōu)點在于從大量的細胞中(每樣本分析10,000細胞)檢測個體細胞熒光時具有高靈敏性。
材料&方法所用的細胞是Jurkat人淋巴細胞，以8×105細胞/孔分布于24孔板中。
培養(yǎng)基為RPMI1640(Invitrogen 31870-025)，在37.5℃下，并在5％ CO2存在的情況下。
檢測緩沖液為不帶有酚紅和小牛血清(Polylabo 5503401)的MEM。
對實施例1中獲得的肽提取物進行檢測，二倍稀釋，即以含有5％干物質(zhì)的提取物的形式。在檢測緩沖液中制備包含2％該提取物的溶液S1。
所用對照為50μm丁基羥基苯甲醚(BHA Sigma ref.B 1253)的純乙醇溶液。檢測是用在檢測緩沖液中制備的含有100μm BHA的溶液S2進行的。
熒光探針為5μm 5-N-十二酰-氨基-熒光素(Free.Rad.Biol.Med.，1997，22 13-100)的純乙醇溶液。檢測是用在檢測緩沖液中制備的1μm探針溶液S3進行的。
將人細胞在培養(yǎng)基中預孵育，然后用檢測緩沖液清洗。隨后將其在肽提取物的S1溶液或S2對照溶液存在下孵育。將探針溶液S3加入到每批中進行LP檢測。
在孵育45分鐘后，通過在檢測緩沖液清洗除去除熒光探針。
每一批中的一部分進行UVB照射，而另一部分不進行照射以作為對照。
在20分鐘孵育后，采用流式細胞計進行熒光參數(shù)檢測。
脂質(zhì)過氧化物相對數(shù)量的確定是基于整合在細胞膜上的探針的熒光減少。熒光信號的增加反映了膜脂質(zhì)過氧化物基礎(chǔ)率的減少。
研究分三組進行。
結(jié)果結(jié)果以熒光強度值來表示，關(guān)于對照的百分率采用熒光強度值計算。
所得結(jié)果匯集在下表中脂質(zhì)過氧化物的相對細胞內(nèi)數(shù)量(LP)

P＜0.01沒有經(jīng)過UV的脂質(zhì)過氧化物(LP)的相對細胞內(nèi)數(shù)量


P＜0.01明顯減少照射。探針的熒光強度反映為細胞膜自由基反應的出現(xiàn)，并由此導致的LP數(shù)量的增加。
在100μm下檢測的參考BHA明顯抑制了熒光的喪失，相對于UV存在下的對照，顯示了50％的輻射。
本發(fā)明的肽提取物在UV不存在(與對照相比減少72％)和UV存在(與對照相比減少75％)的情況下都明顯減少了脂質(zhì)過氧化物的數(shù)量。
結(jié)論邁卡的肽提取物通過防止自由基的形成而使其能抵抗由反應性氧化的物質(zhì)組成的皮膚老化的一個主要因素。
實施例3用于抗老化霜的化妝品配方的實施例抗老化霜水 QSP100異壬酸異壬酯 7.00Di-C12-13烷基蘋果酸 7.00異十六烷硬脂酸酯 5.00丁烯乙二醇 3.00實施例1中制備的邁卡含水肽提取物 2.00
己二酸基醚 2.00硅烷二醇水楊酸酯2.00二十醇 1.65氨丁三醇1.18十六烷基乙醇1.00甘氨酸 1.00維生素E醋酸酯 1.00二十二醇0.90角鯊烷 0.79檸檬酸鈉0.66PPG-12/SMDI異量分子聚合物 0.50二十烷葡糖苷0.45芳香劑 0.40菌核樹膠0.16鯨蠟硬脂醇(Cetearyl Alcohol)0.13檸檬酸 0.11Sepigel 305*0.10保鮮劑 QS*為Seppic商標
權(quán)利要求
1.一種制備邁卡的含水肽提取物的方法，其特征在于所述方法是使用邁卡地下塊莖的粉末進行的，并且所述方法的特征還包含至少一個蛋白質(zhì)的酶水解步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備邁卡塊莖的水溶性肽提取物的方法，所述方法的特征在于水解是酶類型的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備邁卡塊莖的水溶性肽提取物的方法，所述方法的特征在于水解是用淀粉酶和蛋白酶的混合物進行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的制備邁卡塊莖的水溶性肽提取物的方法，其特征在于淀粉酶/蛋白酶的比率在50/50和90/10之間變化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的方法，其特征在于隨后將含水提取物濃縮以除去不可溶物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述的方法，其特征在于隨后將含水提取物通過超濾來純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于超濾的斷開閾值為10KD。
8.采用權(quán)利要求1至7任一所述方法獲得的邁卡的含水肽提取物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的邁卡的含水肽提取物，其特征在于所述提取物的干物質(zhì)含量為1至300g/l，優(yōu)選為2至10g/l。
10.制備邁卡的固體肽提取物的方法，其特征在于對根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的任選進行濃縮和/或滅菌的含水肽提取物進行冷凍干燥。
11.采用如權(quán)利要求10所述的方法獲得的邁卡的固體肽提取物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的邁卡的固體肽提取物，其特征在于α氨基氮的含量在2至70％之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的邁卡的固體肽提取物，其特征在于所述提取物具有如下氨基酸組成(以氨基酸總重量計的重量百分比)
14.根據(jù)權(quán)利要求8或9和11至13任一所述的邁卡的肽提取物，其中，所述提取物能用于刺激皮膚細胞特別是成纖維細胞的增殖和生長。
15.根據(jù)權(quán)利要求8或9和11至13任一所述的邁卡的肽提取物，其中，所述提取物能用于刺激皮膚細胞特別是成纖維細胞的線粒體活性。
16.一種化妝品組合物，其特征在于所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求8或9和11至13任一所述的邁卡的肽提取物及化妝品上可接受的至少一種賦形劑。
17.一種防止和/或?qū)蛊つw老化的化妝處理方法，其特征在于所述方法包括在皮膚上使用如權(quán)利要求16所述的組合物。
18.一種對抗外界損害如陽光、煙草、污染和壓力的化妝處理方法，其特征在于所述方法包括在皮膚上使用如權(quán)利要求16所述的組合物。
19.一種將根據(jù)權(quán)利要求8或9和11至13任一所述的提取物用作抗老化活性劑的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中用提取物去刺激細胞尤其是皮膚成纖維細胞的代謝。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中用提取物去刺激細胞能量。
22.一種將根據(jù)權(quán)利要求8或9和11至13任一所述的提取物作為活性劑來對抗皮膚張力和/或彈性的缺失和/或?qū)顾ダ仙唛_始形成的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從邁卡中提取物質(zhì)的方法、所獲得的提取物、含有所述提取物的化妝品和藥物組合物，以及所述提取物作為抗老化劑的用途。所述方法的特征在于包括使用酶水解蛋白質(zhì)的步驟。
文檔編號A61Q19/08GK1809337SQ200480017201
公開日2006年7月26日 申請日期2004年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者N·皮爾卡迪, A·皮奇里利, P·姆西卡, F·保羅 申請人:科學發(fā)展實驗室