光合細菌在斑蝥抗癌功效中的減毒增效的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及光合細菌在斑蝥抗癌功效中的減毒增效的應用，所述光合細菌為紫色非硫菌群紅細菌屬的類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）。更具體地為光合細菌在具有抗肺癌、肝癌、子宮癌功效的斑蝥轉化液中的應用。本發(fā)明首次將光合細菌應用在斑蝥提取液中用于對斑蝥提取液的生物轉化，研究證明光合細菌對斑蝥提取液具有減毒增效的作用，生物轉化后得到的斑蝥轉化液的毒性降低、抗癌效果增強，所得斑蝥轉化液下一步可嘗試用于人肝癌、肺癌以及子宮癌的預防和治療。
【專利說明】
光合細菌在斑蝥抗癌功效中的減毒増效的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及光合細菌在斑蝥抗癌功效中的減毒增效的應 用。
【背景技術】
[0002] 斑蜜為芫青科昆蟲南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas或黃黑小斑蜜 Mylabris cichorii Linnaeus的干燥體，其性辛熱有大毒，歸肝、胃、腎經。內服有攻毒、逐 瘀散結、抗腫瘤的作用。斑蝥的主要成分斑蝥素及其衍生物對多種癌癥尤其是原發(fā)性肝癌 有肯定的治療效果。其具有較強的毒性，以消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)毒性反應為主，嚴重的出現(xiàn) 急性腎功能衰竭和中毒性休克，且毒性隨給藥劑量增加而增強，由于斑蝥的劇烈毒性限制 了其在臨床的應用。在實際臨床應用中多以復方、斑蝥素、斑蝥素衍生物等形式使用。而自 古以來對于斑蝥減毒的研究都集中在通過傳統(tǒng)的炮制降低斑蝥的毒性，使部分的斑蝥素升 華而含量減少從而降低斑蝥的毒性。另外，還有少數(shù)學者提出用低濃度的NaOH堿水處理斑 蝥，以期將斑蝥素轉化成毒性更低的斑蝥素酸鈉。
[0003] 現(xiàn)有技術中的方法目前都無法滿足在有效的去除斑蝥的毒性的同時保持或提高 斑蝥的抗癌性能；因此，仍需研究一種有效降低斑蝥毒性同時提高其抗癌性能的方法及產 品。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供光合細菌在斑蝥抗癌功效中的減毒 增效的應用，光合細菌對斑蝥提取液具有減毒增效的作用，生物轉化后得到的斑蝥轉化液 的毒性降低、抗癌效果增強，所得斑蝥轉化液下一步可用于人肝癌、肺癌以及子宮癌的預防 和治療。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有抗癌功效的斑蝥轉化液的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的斑蝥轉化液。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有抗癌功效的斑蝥生物制劑。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0009] 光合細菌在斑蝥抗癌功效中的減毒增效的應用，所述光合細菌為紫色非硫菌群紅 細菌屬的類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)。
[0010] 優(yōu)選地，光合細菌在具有抗肺癌、肝癌、子宮癌功效的斑蝥轉化液中的應用。
[0011] 優(yōu)選地，光合細菌在肝癌細胞株HepG-2、BEL-7402、SMCC-7211、QGY-7701中的應 用;光合細菌在肺癌細胞株A549中的應用;光合細菌在子宮癌細胞株Hela中的應用。
[0012] 本發(fā)明中的光合細菌購于中國科學院微生物研究所，其保藏名稱為紫色非硫菌群 紅細菌屬的類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)，保藏編號為CGMCC 1.2174。
[0013] -種具有抗癌功效的斑蝥轉化液的制備方法，所述制備方法具體包括如下步驟：
[0014] Sl:用提取液提取斑蝥粉得斑蝥提取液；
[0015] S2:濃縮提取液并接種上述光合細菌，然后加入PSB培養(yǎng)基進行生物轉化；
[0016] S3:生物轉化結束后除去光合細菌菌體即得斑蝥轉化液。
[0017]優(yōu)選地，所述光合細菌為處于對數(shù)期的光合細菌，所述光合細菌的接種量為7~ 10%〇
[0018]優(yōu)選地，所述步驟S2中的生物轉化的時間為8~12天。
[0019]優(yōu)選地，步驟S1中所述斑蝥提取液的質量濃度為7~I Omg/mL。
[0020]優(yōu)選地，步驟Sl中的提取液為水;步驟S2中濃縮提取液的體積至轉化液總體積的5 ~8 % ;優(yōu)選地，所述轉化液體系的pH為6~9。
[0021 ]上述方法制備得到的斑蝥轉化液。
[0022] -種具有抗癌功效的斑蝥生物制劑，所述斑蝥生物制劑含有權利要求9所述的斑 蝥轉化液。
[0023] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024] 本發(fā)明首次將光合細菌應用在斑蝥提取液中用于對斑蝥提取液的生物轉化，研究 證明光合細菌對斑蝥提取液具有減毒增效的作用，生物轉化后得到的斑蝥轉化液的毒性降 低、抗癌效果增強，所得斑蝥轉化液下一步可用于人肝癌、肺癌以及子宮癌的預防和治療。
【附圖說明】
[0025]圖1為不同轉化液中光合細菌的ODn/ODo生長變化曲線；
[0026] 圖2為光合細菌的生長曲線；
[0027] 圖3為不同斑蝥提取液質量濃度下光合細菌的生長情況；
[0028] 圖4為斑蝥水提液組小鼠累積死亡數(shù)一時間曲線；
[0029] 圖5為斑蝥轉化液組小鼠累積死亡數(shù)一時間曲線；
[0030] 圖6為斑蝥轉化液對肝癌HepG-2細胞24h、48h、72h后的劑量效應曲線；
[0031]圖7為斑蝥轉化液對肝癌he Ia細胞24h、48h、72h后的劑量效應曲線；
[0032]圖8為斑蝥轉化液對肺癌A549細胞24h、48h、72h后的劑量效應曲線；
[0033]圖9為斑蝥轉化液對肝癌QGY-7701細胞24h、48h、72h后的劑量效應曲線；
[0034]圖10為斑蝥轉化液對肝癌SMC-7211細胞24h、48h、72h后的劑量效應曲線。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發(fā)明 作任何限定。除非特別說明，所有本發(fā)明提供的實施例中，提供的原材料均可從市面采購獲 得。
[0036]實施例1斑蝥提取液的制備 [0037] (1)藥物與試劑
[0038] 斑蜜為芫青科昆蟲南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas的干燥蟲體，購于安 國路路通中藥飲片有限公司；胎牛血清（杭州四季青產品）；RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclone產 品）；0.25 % Trypsin-EDTA(美國GIBCO產品）；CCK-8試劑盒（碧云天公司產品）；PSB(美國 GIBCO產品）；乙醇(AR)。
[0039] (2)細胞株
[0040] 人肝癌細胞HepG-2、人肝癌細胞BEL-7402、人肺癌細胞A549均由廣東藥學院生命 科學與生命制藥學院提供。
[0041] 1.主要儀器
[0042] GalaxyS+二氧化碳培養(yǎng)箱（華粵行儀器有限公司）；重慶奧特倒置生物顯微鏡 BDS200;BIO-RAD Mode 1-1680酶標儀;移液槍(Eppendorf公司）；0 · 22μπι濾器（美國Pal 1)。 [0043] (4)斑蝥各轉化液的制備
[0044]準確稱取相同質量的斑蝥粗粉(將斑蝥粉碎后過30目篩，50°C干燥6小時，得斑蝥 粗粉)4份，分別加20倍量的水、55 %乙醇、75 %乙醇、95 %乙醇溶液，浸泡30min，加熱回流 提取2h，冷卻、過濾，依次得到各提取液。
[0045] 將各提取液減壓濃縮至低于轉化液總體積的5%~8%，接種7%~10% (體積比） 處于對數(shù)期的光合細菌(PSB)，加入PSB培養(yǎng)基至所需體積，pH=6~9,相應得到以斑蝥藥材 計算濃度為，7~10mg/mL的轉化液I、II、III、IV。以不加入斑蝥提取液的PSB正常生長組為 對照組，置于人工氣候箱中，厭氧培養(yǎng)，生物轉化8~12天。
[0046] 每天定時在660nm處測定各轉化液和對照組中PSB的光密度OD值，以轉化液中PSB 的菌體濃度變化比0Dn/0DQ(0DQ初始光密度，ODn代謝η天的光密度)來反映光合細菌生長情 況，繪制PSB的生長變化曲線。
[0047] 生物轉化結束時，取I、II、III、IV組的斑蝥各轉化液，3500r/min離心20min除去 PSB菌體，上層液體濃縮成含斑蝥藥材100mg/mL的藥物母液，-20 °C冷藏備用。
[0048] (5)斑蝥各轉化液的體外抗腫瘤活性比較
[0049] 1.細胞試藥的配制
[0050] ①細胞培養(yǎng)液:每IOOmL的RPMI1640培養(yǎng)液中含10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素和 100yg/mL鏈霉素。
[0051 ]②取適量藥物母液用細胞培養(yǎng)液稀釋配制成濃度為lmg/mL含藥培養(yǎng)液，用0.22μπι 的濾器過濾除菌，密封冷藏備用，用時根據(jù)所需給藥濃度用細胞培養(yǎng)液稀釋調配即可。 [0052] 2.細胞的傳代培養(yǎng)
[0053]取各種細胞用細胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素）， 置于37 °C、5 %CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長2~3天至對數(shù)期時，棄去舊培養(yǎng)液，用 0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶消化，于顯微鏡下見細胞間隙增大、胞質回縮變圓即終止消 化，去掉胰酶，加入新的培養(yǎng)液輕輕吹打制成單細胞懸液，傳代培養(yǎng)，一般2~3天傳代一次。 [0054] 3.各轉化液的體外抗腫瘤活性測定
[0055] 根據(jù)不同細胞生長速率，調整細胞濃度8~12X X 104/mL，每孔IOOyL接種于96孔 板，培養(yǎng)24h使其貼壁后，吸掉舊培養(yǎng)液，加入含不同藥物濃度的培養(yǎng)液IOOyL，并設置對照 組(不含藥的細胞培養(yǎng)液）；空白組(不含細胞的細胞培養(yǎng)液），每組設計4個復孔。置于細胞 培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，吸掉舊培養(yǎng)液，加入IOOyL新的培養(yǎng)液和IOyL的CCK-8試劑，輕搖混勻。繼 續(xù)培養(yǎng)反應Ih后取出，按照CCK-8試劑盒方法，以630nm為參考波長，用BIO-RAD酶標儀在波 長450nm處測定吸光度（OD)值。計算細胞抑制率IR (%)=(對照組一實驗組_ 勝）/(對照組空白組_顏）xxI00%。
[0056]根據(jù)統(tǒng)計學原理，實驗數(shù)據(jù)以iV±.練表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分 析，根據(jù)細胞抑制率IR用統(tǒng)計回歸方法求半數(shù)抑制濃度IC50。
[0057]根據(jù)不同提取方法的轉化液中PSB的生長快慢情況，以各轉化液對各腫瘤細胞的 IC50作為指標，綜合考慮優(yōu)選斑蝥作為轉化底物的提取方法。
[0058] (6)斑蝥提取方式的實驗結果
[0059] ①不同轉化液中光合細菌的生長情況
[0060] 圖1為本實施例提供的不同轉化液中光合細菌的生長情況示意圖，從圖1中可以看 出，斑蝥的加入會抑制PSB的生長，I組中光合細菌的生長增殖速率較快，PSB的生長周期趨 勢也較接近對照組。而在II組、III組、IV組中的PSB生長緩慢，對數(shù)期延遲至第3天。提示在 相同斑蝥濃度下I組提取斑蝥的物質對光合細菌的生長毒性抑制作用比II組、III組和IV組 小。
[0061 ]②不同轉化液對肝癌BEL-7402細胞的抑制作用
[0062] 在本實施例中，肝癌BEL-7402細胞接種密度為15 X X IO4個/mL。
[0063] 表1各轉化液對肝癌BEL-7402細胞增殖的抑制率(n = 4，.f ±放± s)
[0065]由表1可知，各組藥物對BEL-7402細胞的抑制率隨著濃度增加而增大，在相同給藥 濃度下，I組和ΠΙ組對細胞的抑制率比較接近，且比其他兩組藥物的抑制作用略強。SPSS 處理得出I組、II組、III組、IV組的藥物對BEL-7402細胞的半數(shù)抑制濃度依次為：153.86yg/ mL; 187 · 93yg/mL; 160 · 05yg/mL，262 · 08yg/mL。提示 I 組藥物對肝癌 BEL-7402 細胞的抑制效 果最好。
[0066]③不同轉化液對肝癌HepG-2細胞的抑制效果
[0067]在本實施例中，肝癌HepG-2細胞接種密度為10 X X IO4個/mL。
[0068] 表2各轉化液對肝癌HepG-2細胞增殖的抑制率(n = 4，f ±.拔土 s)
[0070] 由表2可知，在相同給藥濃度下III組藥物對肝癌HepG-2細胞的抑制率較高，計算 得至丨組、II組、III組、IV組對肝癌HepG-2細胞的IC 5Q依次是151.59yg/mL，206.11yg/mL， 133 · 38yg/mL，289 · 98yg/mL;提示III組藥物對肝癌H印G-2細胞的抑制效果較好。
[0071] ④不同轉化液對肺癌A549細胞的抑制效果
[0072]在本實施例中，肺癌A-549細胞接種密度為8 X X IO4個/mL。
[0073] 表3各轉化液對肺癌A-549細胞增殖的抑制率(n = 4，± sf ± i')
[0075]由表3可知，各組藥物對肺癌A-549細胞均有一定的抑制作用，且與給藥濃度呈正 相關。在相同給藥濃度下I組藥物對細胞的抑制率略比其他組藥物高。計算得到I組、II組、 III組、IV組對肝癌HepG-2細胞的IC5q依次是390 · 56yg/mL，611 · 19yg/mL，425 · 09yg/mL， 495.85yg/mL，提示I組藥物對肺癌A-549細胞的抑制效果較其他組的好。
[0076]⑤藥物作用于各腫瘤細胞的IC50
[0077]由實驗結果，①對BEL-7402細胞的抑制效果由強到弱：I組>>III組>II組>IV組； ②對HepG-2細胞的抑制效果由強到弱：III組>I組>II組>IV組;③對A-549細胞的抑制效 果由強到弱：I組》111組>IV組>11組?？傮w來看斑蝥水提取轉化液的體外抗腫瘤效果更 好，I組中的PSB生長受斑蝥毒性抑制最小，綜合考慮PSB轉化斑蝥中選擇用水提取斑蝥來作 為轉化的底物(I組）。
[0078]實施例2斑蝥提取液生物轉化工藝
[0079] (1)主要材料
[0080] 光合細菌：紫色非硫菌群紅細菌屬的類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)購 于中國科學院微生物研究所。
[0081 ]光合細菌的培養(yǎng)基：乙酸鈉3. Og氯化鈣0.05g磷酸氫二鉀1.0 g硫酸銨1.0 g酵母膏 2 · Og硫酸鎂0 · 2g磷酸二氫鉀0 · 7g微量元素液5ml水1000 ml。
[0082] 微量元素溶液：乙二胺四乙酸二鈉2 · OOOg七水合硫酸亞鐵0 · 200g硼酸1 · 500g硫酸 銅0.030g二水合鉬酸鈉0.450g水合硫酸錳1.200g七水合硫酸鋅0.150g六水合氯化鎳 0·020g水1000 ml。
[0083] (2)主要儀器
[0084]島津UV2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；人工氣候箱（寧波江南儀器 廠）；BL-220H電子天平（日本SMMADZU公司）；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安）； SW-CJ-IF潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；移液槍(Eppendorf公司）。
[0085] (3)方法與結果
[0086]①光合細菌的生長曲線
[0087]配制光合細菌培養(yǎng)基，接種10% (體積比）的處于對數(shù)期的光合細菌，設空白組和 加藥組(實驗組），每組4個平行樣，加藥組的加藥濃度為10mg/mL(斑蝥的量按生藥量算），從 而測定在不加藥和加藥情況下光合細菌的生長曲線。每12小時測定菌液在660nm下的吸光 度，共測定12天。相應的生長曲線見附圖2。
[0088]從圖2可以看出空白組不存在適應期，加藥組存在明顯的適應期;第96小時空白組 結束對數(shù)期，進入穩(wěn)定期，吸光度穩(wěn)定于5左右。對于加藥組，從第36小時開始到第96小時處 于明顯的對數(shù)期，96小時之后，增幅變緩;空白組穩(wěn)定期存在時間較長，第八天進入衰亡期。 加藥組不存在明顯的穩(wěn)定期，但同樣第八天進入衰亡期;確定生物轉化的時間為4-~8天符 合光合細菌生長周期的特點。一方面，在這個過程中光合細菌生長旺盛，酶活更大，轉化能 力更強;另一方面，進入衰亡期之后光合細菌轉化廢物增多，不利于生物轉化后分析。
[0089]②斑蝥安全濃度的考察
[0090]準確稱取適量的斑蝥粗粉加20倍量的水浸泡30min，加熱回流提取2h，冷卻、過濾， 得到斑蝥水提液。
[0091] 用PSB培養(yǎng)基依次配成含斑蝥藥材濃度為0、4、8、10、12、16、20mg/ml的溶液，已培 養(yǎng)好處于對數(shù)期的PSB以10%接種量(體積比）接種，放置在光照培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，每隔 12h分別取樣，在660nm處測PSB的OD值以表示PSB的生長，連續(xù)測定96h。每個濃度平行3個 樣，取平均值。以0D n/0DQ(0DQ是溶液的初始光密度，00"是11小時的光密度)反應光合細菌的 生長情況。
[0092] 說明書附圖3為不同斑蝥提取液質量濃度下光合細菌的生長情況，由說明書圖3可 以看出斑蝥藥物濃度為0、4、8、10mg/mL時，PSB生長趨勢大體相同，而濃度為12、16、20mg/mL 時PSB細菌生長緩慢，快速生長期延遲或未出現(xiàn)。可見轉化液中斑蝥的濃度越大對PSB生長 抑制作用也越明顯。
[0093] 利用測得的各溶液96h的OD值和Oh的OD值比值OD96h/OD〇h為指標(如表4)，用SPSS通 過均值最小差異法(LSD)比較各斑蝥濃度與Omg/mL的對照組是否有顯著性差異(P<0.05)， 確定斑蝥對PSB生長的安全濃度。
[0094] 表4不同斑蝥濃度溶液的OD96h/OD〇h
[0097] 從表4可看出隨著斑蝥濃度的增加，光合細菌的菌體濃度變化比值0D96h/0DQh逐漸 減小，說明斑蝥對PSB的生長抑制隨著濃度增加而加強。從P值看出，斑蝥濃度為4、8、10mg/ mL的轉化組和對照組沒有顯著性差異(P>0.05)，證明在濃度4、8、10mg/mL的濃度下對光合 細菌的生長影響與對照組沒有顯著性差異。故PSB轉化斑蜜的安全濃度為4~I Omg/mL，大于 lOmg/mL將會對PSB產生明顯的毒性作用，抑制PSB的生長。故光合細菌生物轉化斑蝥時斑蝥 的藥物濃度為4~I Omg/mL。
[0098] 實施例3光合細菌對斑蝥提取液生物轉化前后的毒性比較
[0099] 1.主要材料
[0100] 斑蜜為芫青科昆蟲南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas的干燥蟲體，購于安 國路路通中藥飲片有限公司;斑蝥水提液和斑蝥轉化液均實驗室自制。
[0101] 2.受試動物
[0102] 受試動物:SPF級昆明種健康小鼠（18~22g，），雌雄各半，購于廣州中醫(yī)藥大學實 驗動物中心，SCXK (粵)2013-0020。
[0103] 3.方法與結果
[0104] (1)藥品的制備
[0105] 準確稱取斑蝥粗粉(30目，50°C干燥6小時)4份，加20倍量的水，浸泡30min，加熱回 流提取2h，冷卻、過濾，得到提取液。
[0106] 將提取液減壓濃縮至轉化液總體積的5%，接種10% (體積比）對數(shù)期的光合細菌 (PSB)，得到以斑蝥藥材計算濃度為I Omg/mL的轉化液。厭氧培養(yǎng)，生物轉化8天。取斑蝥轉化 液，3500r/min離心20min除去PSB菌體，上層液體濃縮成含斑蜜藥材lOOmg/mL的藥物母液，-20°C冷藏備用。小鼠灌胃給藥前用蒸餾水調成所需給藥濃度。
[0107] (2)急性毒性實驗
[0108] ①取SPF級昆明種小鼠，隨機分組，每組10只，雌雄各半。根據(jù)預實驗結果斑蝥代謝 液的全部致死的最小劑量為Dminl620mg/kg和全部不致死的最大劑量Dmax為3000mg/kg，將 斑蝥水提液和斑蝥轉化液分別以不同劑量灌胃給藥，藥物均設置6個給藥劑量組。對照組 灌胃相同體積的蒸餾水。小鼠給藥前禁食不禁水12h，灌胃體積0.2mL/10g。給藥后觀察老鼠 中毒反應和死亡情況，連續(xù)觀察14天，每2天稱取存活小鼠的體重。根據(jù)不同劑量組小鼠的 死亡計算LD50。
[0109] ②小鼠肝臟和腎臟病理切片觀察
[0110] 取高中低三個劑量組的小鼠，在小鼠死亡時和14天實驗結束時處死，立即解剖小 鼠取出肝臟、腎臟，做成石蠟切片，顯微鏡下（100倍)觀察拍照
[0111] (3)結果
[0112] ①小鼠毒性反應癥狀及出現(xiàn)時間
[0113] 斑蝥水提液和斑蝥轉化液的毒性反應癥狀類似，劑量越大毒性反應越強烈、出現(xiàn) 時間也越早。斑蝥水提液組和斑蝥轉化液組給藥后均出現(xiàn)小鼠自發(fā)活動減少，四肢趴伏，腹 部變大，反應遲鈍、性器官充血腫大；閉眼、拒食、尿失禁;死前呼吸急促、抽搐、流淚。斑蝥水 提液組中毒出現(xiàn)時間集中在給藥后2~3h。存活小鼠多于4~5天癥狀減輕，并逐漸恢復正 常。斑蝥轉化液組中毒出現(xiàn)時間集中在給藥后4~6h，存活小鼠2~3天后逐漸恢復正常。
[0114] ②死亡率及劑量與反應的關系
[0115] 不同劑量組小鼠累積死亡數(shù)與劑量的關系見表5 [0116]表5斑蝥轉化前后小鼠死亡情況和LD50
[0119]從表5可以看出斑蝥水提液和斑蝥轉化液的給藥劑量越高，小鼠死亡率越高，毒性 越大。采用SPSS20的回歸方法求得斑蝥水提液LD5Q = 206mg/kg，95%可信限為：179~233mg/ kg;而斑蜜轉化液LD5Q = 2036mg/kg，95 %可信限：1923~2150mg/kg。1^)5〇值越大則藥物毒性 越小，由此證明斑蝥經光合細菌轉化后對小鼠灌胃給藥的毒性顯著降低，從數(shù)量關系來看， 斑蝥經光合細菌轉化后毒性大概降低10倍。
[0120] ③解剖學觀察
[0121] 對不同給藥劑量組的小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)食管、胃粘膜潰爛出血；胃發(fā)泡水腫，胃 腸道充血，胸腹腔血性積液;肺水腫而表面有充血斑點，心臟色澤暗淡;肝臟邊緣濁腫，色澤 暗淡;腎臟暗紅色，渾濁無透明感。
[0122] ④小鼠肝臟和腎臟病理切片觀察結果
[0123] 對照組的小鼠肝臟組織的肝小葉結構完整，表現(xiàn)為肝細胞以中央靜脈為中心呈放 射狀排列，匯管區(qū)無炎性細胞浸潤及明顯纖維組織增生，肝細胞完整正常，細胞核橢圓形， 可清晰看見核仁。給藥組會出現(xiàn)不同程度的肝細胞排列混亂、炎性細胞浸潤、肝小葉結構被 破壞等情況。
[0124] 對照組小鼠的腎臟腎小管正常，腎小球圓形完整，中毒的小鼠腎臟會選擇性出現(xiàn) 腎小球固縮、體積增大，腎小管壞死等情況。
[0125] 從小鼠毒性反應癥狀及出現(xiàn)時間的結果來看，斑蝥水提液的小鼠中毒出現(xiàn)時間集 中在給藥后2~3h，存活小鼠多于4~5天癥狀減輕，并逐漸恢復正常。而斑蝥轉化液的小鼠 中毒出現(xiàn)時間集中在給藥后4~6h，存活小鼠2~3天后逐漸恢復正常。中毒出現(xiàn)的時間延 后，恢復正常時間提前，提示毒性降低。斑蝥轉化液的半數(shù)致死量LD 5q為1383mg/kg，斑蝥水 提液LD5q為206mg/kg，證明斑蝥經光合細菌轉化后毒性顯著降低，達到了減毒的效果。
[0126] 斑蝥轉化前后對小鼠的肝組織減毒作用明顯，病理主要表現(xiàn)在中央靜脈淤血，炎 細胞浸潤，肝小葉結構被破壞，局部壞死。腎臟病理毒性不明顯，主要變現(xiàn)在輕微的腎小球 增大，腎小管細胞病變;可能是由于在單次給藥情況下，毒性成分在短時間內未對腎臟產生 器質性損傷。但解剖觀察到心臟外膜有充血點、胸腔有積血，提示小鼠急性中毒死亡可能與 血液循環(huán)系統(tǒng)有關。
[0127] 實施例4斑蝥轉化液體外抑瘤作用試驗
[0128] 1.藥物與試劑
[0129] 斑蜜為芫青科昆蟲南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas的干燥蟲體，購于安 國路路通中藥飲片有限公司；胎牛血清（四季青）；RPMI1640培養(yǎng)液（Hyclone); 0.25 % Trypsin-EDTA(GIBCO) ;CCK-8試劑盒（碧云天公司）；PBS(GIBC0)。
[0130] 2.細胞株
[0131] 人肝癌細胞HepG-2、人肝癌細胞BEL-7402、人肺癌細胞A549均由廣東藥學院生命 科學與生命制藥學院提供。
[0132] 3.主要儀器
[0133] GalaxyS+二氧化碳培養(yǎng)箱（華粵行儀器有限公司）；重慶奧特倒置生物顯微鏡 BDS200;BI0-RAD Model-1680酶標儀;0·22μπι濾器（美國Pall)。
[0134] 4.方法與結果
[0135] (1)細胞試藥的制備
[0136] 取適量斑蝥轉化液用細胞培養(yǎng)液稀釋配制成濃度為lmg/mL含藥培養(yǎng)液，用0.22μπι 的濾器過濾除菌，密封冷藏備用。用時根據(jù)實驗需要，稀釋調配。
[0137] (2)細胞的復蘇、培養(yǎng)
[0138] 細胞的復蘇:常規(guī)滅菌在培養(yǎng)瓶中加入10-15mL的培養(yǎng)液，快速從液氮耀中取出腫 瘤細胞株的冷凍管，并迅速放入已預熱的37°C水浴鍋中，不斷搖動，使凍存管迅速融化 (Imin內）；將凍存液移至加入細胞培養(yǎng)液中，第二天更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0139] 細胞的擴大培養(yǎng):常規(guī)處理，加入500ul 0.25%胰蛋白酶對貼壁細胞進行消化，于 顯微鏡觀察確定消化的程度，將細胞按照1: 2至1:4的比例傳代，放在C02培養(yǎng)箱中進行培 養(yǎng)。待細胞狀態(tài)好、增殖速度快時，將細胞進行凍存以及進行試驗。
[0140] (3)四唑鹽(MTT)比色法檢測多種腫瘤細胞株生長的抑制作用
[0141] ① CCK-8法以630nm為參考波長，用BIO-RAD酶標儀在波長450nm處測定吸光度(OD) 值。計算細胞抑制率IR( % )=(對照組一實驗組OD)/(對照組一空白組）100%。
[0142] ②體外抗腫瘤的抑制率測定
[0143] 人肝癌細胞HepG-2、人肝癌細胞SMCC-7211、人肺癌細胞A549、人子宮癌細胞He Ia 以8 X IO4個/mL作為接種量進行種板;人肝癌細胞QGY-7701以5 X IO4個/mL作為接種量進行 種板。
[0144] (4)試驗結果
[0145] ①藥物對肝癌HepG-2細胞的抑制作用
[0146] 表6藥物對肝癌HepG-2細胞增殖的抑制率/% (η = 4，Λ:±>s.)
[0148]表7藥物對HepG-2細胞作用的回歸方程和中效濃度
[0150]從表6、表7可知，斑蝥轉化液對HepG-2細胞具有抑制作用，一定劑量時，抑制率隨 著作用時間的延長而上升，一定時間下，抑制率隨著藥物濃度的上升而上升，呈明顯的劑 量-時間依賴性。經SPSS 22.0處理得出斑蝥轉化液對HepG-2細胞的24h、48h、74h的IC50依 次為：249 · 44yg/mL(置信區(qū)間為（214 · 37-322 · 23yg/mL)); 168 · I lyg/mL(置信區(qū)間為 (155 · 00-183 · 87yg/mL)); 106 · 60yg/mL(置信區(qū)間為（68 · 13-131 · 68yg/mL))。
[0151]②藥物對子宮癌Hela細胞的抑制作用
[0152] 表8各轉化液對子宮癌HeIa細胞增殖的抑制率/% (η = 4，? 士^)
[0154]表9藥物對He Ia細胞作用的回歸方程和中效濃度
LU1&6J 田衣8、9巧知，圾蛩轉化淞別Hela細M具有仰制作用，一疋刑重町，仰制準隨宥作 用時間的延長而上升，一定時間下，抑制率隨著藥物濃度的上升而上升，呈明顯的劑量-時 間依賴性。經SPSS 22.0處理得出斑蝥轉化液對He Ia細胞的24h、48h、74h的IC5Q依次為： 452.79yg/mL(置信區(qū)間為（343.89-545.32yg/mL)) ; 279.76yg/mL(置信區(qū)間為（242.90_ 351 · 53yg/mL)); 126 · 19yg/mL(置信區(qū)間為（108 · 43-140 · 70yg/mL))。
[0157] ③藥物對肺癌A549細胞的抑制效果
[0158] 表10各轉化液對肝癌A549細胞增殖的抑制率(η = 4，?±$)
[0162] 由表10、11可知，斑蝥轉化液對Α549細胞具有抑制作用，一定劑量時，抑制率隨著 作用時間的延長而上升，一定時間下，抑制率隨著藥物濃度的上升而上升，呈明顯的劑量-時間依賴性。經SPSS 22.0處理得出斑蝥轉化液對Α549細胞的24h、48h、74h的IC5q依次為： 249.44yg/mL(置信區(qū)間為（214.37-322.23yg/mL)) ; 112.36yg/mL(置信區(qū)間為（98.39_ 126 · 48yg/mL)); 66 · 82yg/mL(置信區(qū)間為（53 · 37-78 · 50yg/mL))。
[0163] ④藥物對肝癌QGY-7 7 01細胞的抑制作用
[0164] 表12各轉化液對肝癌QGY-7701細胞增殖的抑制率/%(η = 4，〗:±Λ、）

[0169]從表12、表13可知，斑蝥轉化液對QGY-7701細胞具有抑制作用，一定劑量時，抑制 率隨著作用時間的延長而上升，一定時間下，抑制率隨著藥物濃度的上升而上升，呈明顯的 劑量-時間依賴性。經SPSS 22.0處理得出斑蝥轉化液對QGY-7701細胞的24h、48h、74h的IC50 依次為：234 · 80yg/mL(置信區(qū)間為（208 · 44-280 · 94yg/mL)); 165 · 98yg/mL(置信區(qū)間為 (151 · 85-183 · 18yg/mL)); 95 · 68yg/mL(置信區(qū)間為（84 · 44-105 · 12yg/mL)。
[0170]⑤藥物對肺癌SMC-7 211細胞的抑制效果
[0171] 表14各轉化液對肝癌SMC-7 211細胞增殖的抑制率(η = 4，5 士 ）
[0173] 表15藥物對SMC-7211細胞作用的回歸方程和中效濃度
[0175] 由表14、15可知，斑蝥轉化液對SMC-7211細胞具有抑制作用，一定劑量時，抑制率 隨著作用時間的延長而上升，一定時間下，抑制率隨著藥物濃度的上升而上升，呈明顯的劑 量-時間依賴性。經SPSS 22.0處理得出斑蝥轉化液對SMC-7211細胞的24h、48h、74h的IC50依 次為：289 · 30yg/mL(置信區(qū)間為（260.54-336 · 36yg/mL)); 207 · 45yg/mL(置信區(qū)間為 (189 · 78-228 · 95yg/mL)); 119 · 60yg/mL(置信區(qū)間為（105 · 54-131 · 40yg/mL))。
[0176] (5)細胞形態(tài)觀察
[0177] 從細胞抑制率來看，藥物對細胞48h的抑制率A549>QGY-7701>HepG-2>SMC-7211> Hela，選擇抑制率前三種的細胞進行鏡下的細胞形態(tài)觀察，即藥物對肝癌QGY-7701、A549、 H印G-2細胞48h作用后的細胞形態(tài)觀察。
[0178] QGY-7701、A549、HepG-2空白對照組，腫瘤細胞貼壁生長，排列緊密，多邊形呈現(xiàn)， 經藥物作用后腫瘤細胞皺縮變圓或死亡，鏡下觀察細胞量也少于空白組的細胞貼壁不良而 漂浮在上面，有碎片狀，隨著給藥濃度越高，細胞死亡皺縮漂浮的越多，這些現(xiàn)象表明斑蝥 轉化液作用于細胞后能明顯抑制腫瘤細胞的生長。從圖中也可以看出隨著藥物濃度的增 加，A549細胞出現(xiàn)更加明顯的細胞量減少，腫瘤細胞皺縮變圓死亡的現(xiàn)象，由鏡下觀察的圖 片也可知斑蝥轉化液對A549細胞的抑制作用較其他細胞明顯，抑制作用更強。
[0179] 本實施例考察了斑蝥轉化液對多種腫瘤細胞株的時效和量效，即采用CCK-8法檢 測不同劑量、作用不同時間對癌細胞的敏感性，來初步探討對腫瘤的抑制作用。體外實驗作 為抗腫瘤藥物的初篩，是在體實驗的基礎。
[0180] 從實驗的結果可知，不同的斑蝥轉化液濃度對不同的細胞株在不同的作用時間均 有抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的時間和劑量依賴性。
[0181] 在實驗室前期的課題實驗中，對轉化前后成分研究表明，斑蝥經光合細菌轉化過 程中的總斑蝥素含量在下降，經工藝優(yōu)化后的斑蝥轉化液的體外對多種細胞的抗腫瘤實驗 提示斑蝥轉化液的抗腫瘤作用增強，這一結果提示轉化后可能產生抗腫瘤效果優(yōu)于斑蝥素 的新化學成分。
[0182] 實施例5斑蝥轉化液對移植性肝癌H22的作用
[0183] 1.菌種與動物
[0184] 瘤株:小鼠腹水型肝癌細胞株H22，由廣東藥學院基礎教研室惠贈。
[0185] 動物：昆明小鼠，雌雄各半，體重(20 ± 2)g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗中心，合格證 號:SCXK(蘇)2008-0010。
[0186] 2.主要材料與儀器(略）
[0187] 3方法與結果
[0188] (1)小鼠肝癌模型建立
[0189]首先常規(guī)進行H22腫瘤細胞株的復蘇和傳代，共進行三次傳代。調整細胞數(shù)1.0 X 10%L，腫瘤的細胞活力在95%，按每鼠0.2mL接種于小鼠右腋皮下，制備成實體瘤動物模 型;另以每鼠〇. 2mL接種于小鼠腹腔，制備成腹水瘤動物模型。
[0190] (2)實驗分組和給藥
[0191]①斑蝥轉化液給藥劑量的換算
[0?92] 經預實驗，設定斑蜜轉化液的給藥劑量為100mg/kg，200mg/kg，300mg/kg。昆明鼠 的灌胃容量為〇. 2mL/1 Og，因此低中高組的斑蜜轉化液的濃度為5mg/mL，I Omg/mL，15mg/mL。
[0193] ②斑蝥水提液給藥劑量
[0194] 斑蝥水提液的給藥劑量為斑蝥轉化液的低劑量100mg/kg，即濃度為5mg/mL。
[0195] ③5-Fu配置方法
[0?96] 每天5_Fu的給藥劑量為15mg/kg，加入生理鹽水配成0.75mg/mL，備用。
[0197] ④實驗分組
[0198] 接種24h后隨機設計分組，分為6組，每組10只。即空白對照組、荷瘤模型組、陽性對 照組（5-Fu組）、斑蝥轉化液低劑量組(BMDX低劑量組）、斑蝥轉化液中劑量組(BMDX中劑量 組)和斑蝥轉化液高劑量組(BMDX高劑量組），。
[0199] ⑤給藥處理
[0200]昆明鼠喂養(yǎng)于廣東藥學院動物中心。自接種腫瘤細胞24h后，開始灌胃和腹腔注 射，每天1次，連續(xù)10天。
[0201] 正常組、模型組均以0.9%NaCl溶液灌胃0.4ml/20g/d; 5-Fu組予5-Fu溶液腹腔注 射15mg/kg/d;第四組到第六組分別給與低、中、高不同劑量斑蝥轉化液灌胃，按0.2mL/10g/ d進行。
[0202] (3)腹水瘤觀察指標及檢測方法
[0203]①一般狀況的觀察
[0204]實驗過程中觀測昆明鼠精神狀態(tài)情況、自主活動情況、飲食情況、糞便情況、體型 外觀情況、出現(xiàn)腹水的時間及毛發(fā)情況等。
[0205]②腹水量的測定
[0206]在第十天用藥結束24h后處死小鼠，抽取腹水并測量腹水量。
[0207]③各組小鼠生存期的觀察
[0208] 給藥IOd后，停止給藥，至20d止，記錄，Kap Ian-Meier法繪制生存期曲線。
[0209] (4)實體瘤觀察指標及檢測方法
[0210]①一般狀況的觀察
[0211] 實驗過程中觀測昆明鼠精神狀態(tài)情況、自主活動情況、飲食情況、糞便情況、體型 外觀情況及毛發(fā)情況等。
[0212] ②腫瘤重量測定
[0213]稱動物重量，處死，打開腋下，剝離瘤體，稱重，記錄。
[0214] ③胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)
[0215] 在實驗給藥結束后，處死小鼠，取出胸腺和脾，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。
[0216] (5)腹水瘤各指標結果
[0217]①一般狀況的觀察
[0218] 較模型組，陽性對照組(5-Fu組）、BMDX低、中劑量組均使得小鼠的精神狀態(tài)情況有 所提高，其中5-Fu組小鼠的狀況較好，隨著斑蝥轉化液的劑量的升高，BMDX高劑量組的小鼠 狀態(tài)欠佳，出現(xiàn)了小鼠死亡的現(xiàn)象。
[0219] ②腹水量的測定見表16
[0220] 表16各組小鼠腹水量的觀察(n = 10，? 土 d
L〇222」 注：與模型組比較*P〈0 · 05、#P〈0 · 01
[0223] 較模型組，5-Fu組在實驗給藥過程中沒有出現(xiàn)有腹水的現(xiàn)象，即對腹水瘤的治療 效果好；
[0224] 斑蝥水提液組的小鼠產生的腹水量比模型組的還要多，即對小鼠的腹水量無改善 作用；
[0225] 經過代謝后的斑蝥轉化液低、中、高劑量組對小鼠的腹水瘤的治療效果隨著藥物 濃度的增加，治療效果也有所提高，但是效果不佳。
[0226] ③各組小鼠生存期的觀察見表17
[0227] 表17小鼠的平均壽命
[0229]注：與模型組比較 *P〈0 · 05 ;#P〈0 · 01
[0230] 5-Fu組的小鼠在給藥后小鼠在20d中止實驗時小鼠未出現(xiàn)小鼠的死亡現(xiàn)象，較模 型組，5-Fu藥物延長了小鼠的壽命。
[0231] 斑蝥轉化液低、中劑量組較模型組，均延長了小鼠的生存時間，和模型組相比具有 非常顯著性差異(林P〈〇.01);高劑量組的小鼠在給藥時間還未達到IOd時，出現(xiàn)了小鼠死亡 的現(xiàn)象。
[0232] (6)實體瘤各指標結果
[0233] ①一般狀況的觀察(略）
[0234] ②腫瘤重量測定結果見表18.
[0235] 表18各組小鼠抑瘤率的觀察(n = 10，i h)
[0237] 注：與模型組比較 *P〈〇 · 05 ;#P〈0 · 01
[0238] 與模型組比較:斑蝥水提液、斑蝥轉化液低、中、高劑量組對腫瘤有非常明顯的抑 制作用(**P〈〇. 01)，但抑瘤效果不如5-Fu組。
[0239] ③胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)結果見表19
[0240] 表19各組小鼠胸腺和脾系數(shù)的測定(n = 10，〕i λ' )

[0243] 注：與模型組相比：#P〈〇 · 01、*P〈〇 · 05;與陽性組對比：##P〈0 · 01、#P〈0 · 05
[0244] 與斑蝥水提液相比:aaPW · 01、ΛΡ〈0 · 05
[0245] 與模型組相比，BMDX中劑量組的脾系數(shù)與模型組有非常顯著性差異(#Ρ〈0.01)， 其胸腺系數(shù)與模型組相比也具有顯著性差異(*Ρ〈〇. 05)。
[0246] 與5-Fu組對比，BMDX低劑量組、中劑量組的胸腺和脾系數(shù)均與其有非常顯著性差 異(##Ρ〈0·01)。
[0247] 與斑蝥水提液相比，BMDX低劑量組、中劑量組的胸腺和脾系數(shù)均與其有非常顯著 性差異(aaPW. 01)。
[0248] 在本實驗研究中可知，斑蝥水提液與斑蝥轉化液相同劑量對腹水的治療效果與模 型模型組比具有非常顯著的差異(**Ρ〈〇.01)，轉化液隨著藥物濃度的增加，治療效果反而 下降。
[0249] 與對照組相比，斑蝥轉化液低劑量組、中劑量組均延長Η22腹水瘤小鼠的生存期， 提高了壽命時間，差異具有非常顯著的意義。
[0250] 斑蝥轉化液抑瘤率為18.11 %、25.98%、37.01 %，斑蝥水提液抑瘤率為26.7%、對 小鼠的Η22腫瘤具有抑制作用，較模型組有非常顯著性的提高(Ρ〈0.01)，陽性藥抑瘤率優(yōu)于 斑蝥。而陽性藥與斑蝥水提液對免疫功能的作用沒有意義，斑蝥轉化液卻能非常顯著增強 小鼠的免疫功能，從而能很好地發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0251 ]實施例6斑蝥轉化液對移植性肺癌Lewis的作用
[0252] 1.菌種與動物
[0253] 瘤株:小鼠肺癌細胞株Lewis，購自中國科學院細胞庫。
[0254] 動物:C57小鼠，雌雄各半，6-8周齡，體重（18 ± 2)g，購自廣東省動物中心，合格證 號：SCXK(粵）2015-0020。
[0255] 2.主要材料與儀器同上。
[0256] 3.方法與結果
[0257] (I)Lewis小鼠肺癌模型建立
[0258] 首先常規(guī)進行Lewis腫瘤細胞株的復蘇和傳代。將準備好的細胞液按每鼠 0.2mL接 種于小鼠右腋皮下，制備成實體瘤動物模型。
[0259] (2)實驗分組和給藥
[0260] 該步驟的操作方法同實施例5中肝癌的實驗分組和給藥方法。
[0261 ] (3)實體瘤觀察指標及檢測方法
[0262] ①一般狀況的觀察:精神狀態(tài)情況、自主活動情況、飲食情況、糞便情況、體型外觀 情況、體重檢測及毛發(fā)情況等。
[0263] 體重增長率=((給藥后體重一給藥前體重)/給藥前體重〕X 100%。
[0264] ②腫瘤重量測定。
[0265] ③胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的測定:給藥結束后，處死小鼠，取出胸腺和脾，計算脾指 數(shù)和胸腺指數(shù)。
[0266] (4)實體瘤各指標結果見表20:
[0267]表20各組小鼠胸腺、脾指標的測定(n = 10，X 土 i>)
[0270] 注：與模型組相比：#P〈0 · 01、*P〈0 · 05;與陽性組對比：##P〈0 · 01、#P〈0 · 05;與斑蝥 水提液組相比:^?〈〇.〇1、Λρ〈0.05
[0271] ①一般狀況的觀察
[0272] 與模型組相比，給藥組的小鼠的體重增加率均有所減少;與5-Fu組相比，斑蝥水提 液與斑蝥轉化液的體重增加率非常顯著提高( ##P〈〇. 01);與斑蝥水提液相比，斑蝥轉化液的 體重增加率非常顯著提高(MP〈〇.01);斑蝥轉化液組的小鼠隨著小鼠給藥劑量的增加，小 鼠的體重增加率逐漸降低。
[0273] ②腫瘤重量測定
[0274] 陽性藥物5-Fu對腫瘤的抑制率大，斑蝥轉化液抑制率隨著給藥劑量的增加，抑制 率增強，與斑蝥水提液組小鼠相比，具有非常顯著差異性(Mp〈o. 01)。
[0275] 斑蝥轉化液低、中、高劑量抑瘤率依次為21.47%、27.72%、33.39%，中、高劑量組 的小鼠對腫瘤的抑制率優(yōu)于斑蝥水提液的25.33%，具有非常顯著性的提高(P〈0.01)，陽性 藥抑瘤率49.29%。
[0276] ③胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)
[0277] 與陽性藥物5-Fu組對比，斑蝥水提液、BMDX低劑量組、中劑量組、高劑量組的胸腺 和脾系數(shù)均與其有非常顯著性差異(##p〈0.01);與斑蝥水提液相比，斑蝥轉化液對小鼠的脾 臟系數(shù)、胸腺系數(shù)均有非常顯著性增加(M〈0.01)。
[0278] 綜上結果表明：陽性藥局部治療腫瘤的效果好，但是對機體整體作用不佳;斑蝥轉 化液治療實體腫瘤的優(yōu)勢在于能非常顯著地調節(jié)并增強機體免疫功能。胸腺和脾是重要的 免疫器官，胸腺系數(shù)在一定程度上反應了機體免疫細胞的數(shù)量和功能，脾系數(shù)也一定程度 反映了機體的免疫功能，機體免疫功能失調常導致腫瘤的發(fā)生，免疫功能受抑制導致腫瘤 細胞持續(xù)增生。在本實驗中的實體瘤模型，小鼠的胸腺，脾系數(shù)較陽性藥物5-Fu、斑蝥水提 液均有非常顯著性增加，因此斑蝥轉化液藥物可能通過調節(jié)并增強免疫功能來發(fā)揮抗腫瘤 作用。
【主權項】
1. 光合細菌在斑蝥抗癌功效中的減毒增效的應用，所述光合細菌為紫色非硫菌群紅細 菌屬的類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) 〇2. 根據(jù)權利要求1所述應用，其特征在于，光合細菌在具有抗肺癌、肝癌、子宮癌功效的 斑蝥轉化液中的應用。3. 根據(jù)權利要求2所述應用，其特征在于，光合細菌在肝癌細胞株HepG-2、BEL-7402、 SMCC-7211、QGY-7701中的應用；光合細菌在肺癌細胞株A549中的應用;光合細菌在子宮癌 細胞株Hela中的應用。4. 一種具有抗癌功效的斑蝥轉化液的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體包括 如下步驟： S1:用提取液提取斑蝥粉得斑蝥提取液； S2:濃縮提取液并接種權利要求1所述光合細菌，然后加入PSB培養(yǎng)基進行生物轉化； S3:生物轉化結束后除去光合細菌菌體即得斑蝥轉化液。5. 根據(jù)權利要求4所述制備方法，其特征在于，所述光合細菌為處于對數(shù)期的光合細 菌，所述光合細菌的接種量為7~10%。6. 根據(jù)權利要求4所述制備方法，其特征在于，所述步驟S2中的生物轉化的時間為8~ 12天。7. 根據(jù)權利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟S1中所述斑蝥提取液的質量濃度為 7~10mg/mL〇8. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，步驟S1中的提取液為水;步驟S2中濃縮提取 液的體積至轉化液總體積的5~8%;所述轉化液體系的pH為6~9。9. 權利要求4~8所述方法制備得到的斑蝥轉化液。10. -種具有抗癌功效的斑蝥生物制劑，其特征在于，所述斑蝥生物制劑含有權利要求 9所述的斑蝥轉化液。
【文檔編號】A61K35/64GK106074613SQ201610397313
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月6日 公開號201610397313.4, CN 106074613 A, CN 106074613A, CN 201610397313, CN-A-106074613, CN106074613 A, CN106074613A, CN201610397313, CN201610397313.4
【發(fā)明人】趙越
【申請人】趙越