MERS-CoV疫苗的制作方法
【專利摘要】本文公開了一種包含中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS?CoV)抗原的疫苗。所述抗原可以是共有抗原。所述共有抗原可以是共有刺突抗原。本文還公開了一種通過向有此需要的受試者施用所述疫苗來治療受試者的方法。
【專利說明】MERS-CoV 疫苗
[0001] 相關(guān)申請的引證
[0002] 本申請要求2013年11月29日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/910,153的優(yōu)先權(quán)，所 述申請據(jù)此以引用的方式并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種用于中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的疫苗和施用所述疫 苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 冠狀病毒(CoV)是全世界常見的病毒家族并且在人類中引起從感冒到嚴重的急性 呼吸綜合征（SARS)的多種疾病。冠狀病毒還可在動物中引起許多疾病。人冠狀病毒229E、 0C43、NL63及HKU1都是人群體中的地方病。
[0005] 在2012年，一種新型冠狀病毒(nCoV)出現(xiàn)在沙特阿拉伯并且現(xiàn)在被稱為中東呼吸 綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)(圖1) JERS-CoV可被分類為β冠狀病毒（圖2，星形MERS-CoV菌 株HC〇V-EMC/2012)。已在中東的其他地方（例如卡塔爾和約旦）和更近來在歐洲報道了 MERS-CoV感染的后續(xù)病例。MERS-CoV的感染表現(xiàn)為嚴重的急性呼吸道疾病，伴有發(fā)熱、咳嗽 和呼吸急促的癥狀。約有一半MERS-CoV感染的報道病例造成了死亡并且大部分報道病例發(fā) 生在老年至中年男性中。僅少數(shù)報道病例涉及患有輕度呼吸道疾病的受試者。MERS-CoV的 人際間傳播是可能的，但在此時非常有限。
[0006] 因此，在本領(lǐng)域中仍然需要開發(fā)一種適用于MERS-CoV的安全和有效的疫苗，由此 提供針對MERS-CoV感染的保護并提高MERS-CoV感染的存活率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含核酸 分子的疫苗，其中所述核酸分子可包含在SEQ ID NO: 1中列出的核酸序列的全長上具有至 少約90%同一性的核酸序列或所述核酸分子可包含在SEQ ID N0:3中列出的核酸序列的全 長上具有至少約90 %同一性的核酸序列。
[0008] 本發(fā)明還涉及一種包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子可編碼包含在SEQ ID NO: 2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽或所述核酸 分子可編碼包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的氨 基酸序列的肽。
[0009] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO: 1中列出的核酸序列的核酸分子。
[0010]本發(fā)明還涉及包含SEQ ID N0:3中列出的核酸序列的核酸分子。
[0011]本發(fā)明還涉及包含SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列的肽。
[0012]本發(fā)明還涉及包含SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的肽。
[0013]本發(fā)明還涉及一種包含抗原的疫苗，其中所述抗原是由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO :3編碼。
[0014] 本發(fā)明還涉及一種包含肽的疫苗，其中所述肽可包含在SEQ ID N0:2中列出的氨 基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的氨基酸序列或所述肽可包含在SEQ ID N0:4中 列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的氨基酸序列。
[0015] 本發(fā)明還涉及一種在有此需要的受試者中誘導針對中東呼吸綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV)的免疫應答的方法。所述方法可包括向受試者施用上述疫苗、核酸分子或肽中 的一種或多種。
[0016] 本發(fā)明還涉及一種保護有此需要的受試者以免感染上中東呼吸綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV)的方法。所述方法可包括向受試者施用上述疫苗、核酸分子或肽中的一種或多 種。
[0017] 本發(fā)明還涉及一種針對中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)治療有此需要的受 試者的方法。所述方法可包括向受試者施用上述疫苗、核酸分子或肽中的一種或多種。
【附圖說明】
[0018] 圖1示出了說明MERS-CoV的出現(xiàn)的時間線。
[0019] 圖2示出了描繪所示冠狀病毒之間的關(guān)系的種系發(fā)生樹。
[0020] 圖3示出了描繪所示MERS-CoV與MERS-CoV共有刺突抗原之間的關(guān)系的種系發(fā)生 樹。
[0021 ]圖4示出了 (A)說明MERS-HC〇V-WT構(gòu)建體的示意圖；和(B)染色凝膠的圖像。
[0022]圖5示出了通過基于萬維網(wǎng)的軟件Phobius生成的曲線圖。
[0023] 圖6示出了通過基于萬維網(wǎng)的軟件InterProScan生成的示意圖。
[0024]圖7示出了 (A)說明MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體的示意圖；和(B)染色凝膠的圖像。 [0025]圖8示出了（A)編碼MERS-CoV共有刺突抗原的核苷酸序列；（B)MERS-CoV共有刺突 抗原的氨基酸序列；（C)編碼缺少細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的MERS-CoV共有刺突抗原(MERS-CoV共有刺 突抗原A⑶)的核苷酸序列；以及(D)MERS-CoV共有刺突抗原Δ⑶的氨基酸序列。
[0026]圖9示出了免疫印跡。
[0027]圖10示出了說明免疫方案的示意圖。
[0028] 圖11在(A)和(B)中示出了繪制取血對0D450的圖。
[0029]圖12示出了肽集合的矩陣。
[0030]圖13示出了繪制肽集合對每106個細胞的斑點形成單位(SFU/106個細胞)的圖。 [0031]圖14示出了繪制肽集合對每106個細胞的斑點形成單位(SFU/106個細胞)的圖。 [0032]圖15示出了繪制免疫組對每10 6個細胞的斑點形成單位(SFU/106個細胞)的圖。 [0033] 圖16示出了（A)繪制免疫組對CD3+CD4+IFN-Y+T細胞百分比的圖；（B)繪制免疫組 對CD3 +CD4+TNF-a+T細胞百分比的圖；（C)繪制免疫組對CD3+CD4+IL-2+T細胞百分比的圖；以 及(D)繪制免疫組對⑶3+⑶4+IFN- γ +TNF-a+T細胞百分比的圖。
[0034] 圖17示出了（A)繪制免疫組對CD3+CD8+IFN-y +T細胞百分比的圖；（B)繪制免疫組 對CD3+CD8+TNF-a+T細胞百分比的圖；（C)繪制免疫組對CD3+CD8+IL-2+T細胞百分比的圖；以 及(D)繪制免疫組對⑶3+⑶8+IFN- γ +TNF-a+T細胞百分比的圖。
[0035] 圖18在（A)中示出了在用pVaxlDNA載體（陰性對照）、共有MERS-刺突DNA疫苗 (MERS-S)或共有MERS-刺突-Δ CD DNA疫苗(MERS-S-CD)接種之后的抗體應答。通過ELISA測 量抗體應答。在(B)中，示出了在用共有MERS-刺突DNA疫苗(MERS-S)接種之后隨時間的抗體 應答。在(C)中，示出了在用pVaxlDNA載體（陰性對照）、MERS-S DNA疫苗或MERS-S-CD DNA疫 苗接種之后第35天的中和抗體滴度。將小鼠血清在MEM中稀釋連續(xù)并且在37°C下用50ul每 孔含有100個感染性HCoV_EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012) 顆粒的DMEM孵育。90min之后，將病毒-血清混合物添加到96孔平底板的單層Vero細胞（100， 000個細胞/孔）中并在5 % C02孵育箱中在37 °C下孵育5天。每個樣品的中和抗體滴度報告為 少于50%的細胞顯示CPE的最高稀釋度。數(shù)值報告為倒數(shù)稀釋度。所有樣品都一式兩份操 作，因此最終結(jié)果被定為兩者的平均值。中和百分比計算如下：中和百分比={目標1-PFU mAb (每個濃度)/平均PFU陰性對照(所有濃度）}。
[0036] 圖19示出了MERS-HCoV刺突DNA疫苗的構(gòu)建和特征。(A)樹狀圖示出了MERS-HCoV病 毒分離株與刺突疫苗菌株之間在氨基酸水平上的種系發(fā)生關(guān)系。有根的鄰接樹是從展示為 (★)的刺突蛋白與共有疫苗的氨基酸序列比對生成并且（□)表示用于測試Nab測定的 MERS-病毒株。陰影區(qū)表示來自2012-2013爆發(fā)的報道病例。括號表示特定的進化枝。樹是按 比例描繪（比例尺，0.1%差異穴⑶用于密碼子優(yōu)化的DNA疫苗的刺突-Wt基因插入物的示 意圖。構(gòu)建了刺突-Wt和刺突Δ CD-DNA疫苗。顯示了不同刺突蛋白結(jié)構(gòu)域。（C)蛋白的表達是 通過蛋白質(zhì)印跡來檢測。刺突-Wt和刺突△ CD-刺突蛋白的表達是在轉(zhuǎn)染后兩天使用在1: 100稀釋度下的來自MERS-刺突-Wt DNA接種小鼠的血清通過蛋白質(zhì)印跡進行分析。轉(zhuǎn)染的 DNA構(gòu)建體和加載的細胞裂解物的量如所示。箭頭表示刺突蛋白。（D)在Vero細胞中的免疫 熒光測定，其示出了使用來自DNA免疫小鼠的血清（1:100)的刺突-Wt和刺突△ CD蛋白表達。 [0037] 圖20示出了MERS-刺突假病毒的構(gòu)建和特征。（A)MERS-HCoV-刺突假病毒的示意 圖。（B)病毒感染性的測定:將Vero細胞用以熒光素酶報道基因主鏈假型化的MERS-刺突孵 育。然后在所示時間下測定熒光素酶報道基因活性以產(chǎn)生表達的時間過程。通過非線性回 歸分析將曲線擬合到數(shù)據(jù)且最佳擬合是直線。（C)在不同細胞系中MERS-HCoV-刺突假病毒 感染性的檢測。MERS-刺突假病毒和陰性對照VSV-G病毒被用于感染。數(shù)據(jù)表示為96孔培養(yǎng) 板中的3個平行孔的平均相對熒光素酶單位(RLU)±#準偏差(SD)。重復實驗三次，并獲得 類似的結(jié)果。
[0038]圖21示出了由MERS-HCoV疫苗引發(fā)的細胞免疫應答的功能概況。（A)對C57/BL6小 鼠 （η = 9/組)組免疫三次，每隔2周用25yg如所示的刺突-Wt和刺突Δ⑶DNA疫苗。在第三次 免疫之后一周收集樣品。（B)使用覆蓋了刺突蛋白的6個肽集合，通過IFN-γ ELISpot測定分 析刺突特異性T-淋巴細胞應答。數(shù)值表示在第三次免疫之后一周在每個組中的平均應答。 誤差范圍用標準誤差表示。（C&D)MERS-刺突特異性顯性表位的特征。使用肽集合矩陣，通過 來自MERS-刺突特異性免疫應答的脾細胞進行的IFN- γ分泌。結(jié)果表示為在減去沒有肽刺 激下的數(shù)值之后的IFN-γ分泌細胞數(shù)目/106個脾細胞(平均值土SD，對于每組三只小鼠來 說）。在兩個單獨的實驗中獲得類似結(jié)果。
[0039]圖22示出了在DNA免疫之后的全身性抗MERS-HCoV IgG水平。（Α)用如所示針對作 為包被抗原的MERS-刺突的血清稀釋度，通過ELI SA測量的小鼠中的血清抗IgG應答。連續(xù)稀 釋來自小鼠的各個組的混合血清(在第三次免疫之后一周）并通過ELI SA測量MERS-刺突特 異性總IgG。每個曲線表示接受如所示的刺突-Wt DNA疫苗、刺突Δ⑶-刺突DNA疫苗或空的 DNA載體的9只小鼠的每個組的0D值。每個數(shù)據(jù)點是來自九只小鼠的平均吸光度。(B)在所示 時間點下計算刺突-Wt免疫小鼠血清的終點滴度。（C)在所示濃度(yg)下結(jié)合至重組刺突蛋 白的免疫血清的蛋白質(zhì)印跡分析。來自刺突-Wt免疫小鼠的混合血清在1:100稀釋度下被用 作一級抗體。(D)通過病毒感染測定檢測的中和抗體應答。在第三次免疫之后一周從免疫小 鼠處收集血清。在對靶細胞的病毒感染50%抑制（IC 5Q)下測量中和抗體滴度。所示數(shù)據(jù)是在 標準偏差下每組的幾何平均滴度。測定每個測試組之間的統(tǒng)計學差異并顯示了P值。（E)通 過從接受刺突-Wt DNA或pVax 1DNA的三次注射之后的小鼠處獲得的抗血清對MERS-刺突-假 型化病毒的感染性的中和。IC5〇被定義為病毒侵入被抑制了50% (虛線)時的抗血清稀釋度 的倒數(shù)。示出了來自每組4只小鼠的數(shù)據(jù)。
[0040]圖23示出了在非人靈長類動物（NHP)中由MERS-刺突DNA疫苗誘導的干擾素 -γ (IFN-γ)產(chǎn)生細胞的分析。(Α)在恒河猴中的研究設(shè)計、疫苗和攻擊方案。如所示在第0、3及 6周(wks)用MERS-刺突DNA對三組(低、高和對照)恒河猴(η = 4/每組)免疫。對來自第三次免 疫的樣品進行IFN-γ ELI Spot、細胞內(nèi)細胞因子染色及抗體結(jié)合和Nab測定。在MERS-攻擊之 后進行活組織檢查。（B)來自MERS-刺突DNA免疫的猴的細胞的ELISP0T分析。從每個DNA免疫 的猴中分離PBMC并用于ELISP0T測定以如實施例9中所述檢測響應于MERS-刺突肽集合的 IFN- γ -產(chǎn)生細胞持續(xù)24小時。通過ELISpot測定測定MERS-刺突特異性IFN- γ分泌細胞/ 106個PBMC的出現(xiàn)率。結(jié)果表示為平均值土 SEMJC)產(chǎn)生⑶4+和⑶8+Τ細胞的疫苗誘導的細胞 因子（IFN-γ、IL-2或TNF-α)的出現(xiàn)率。獼猴PBMC(n = 4)是在最后一次DNA免疫之后分離并 用集合的MERS-刺突肽離體刺激。就IFN-γ、TNF-a及IL-2的細胞內(nèi)產(chǎn)生對細胞進行染色，然 后通過多參數(shù)流式細胞術(shù)來分析。
[00411圖24示出了MERS-刺突DNA接種之后的抗體結(jié)合滴度和中和抗體(Nab)應答。（A&B) 在免疫后的各個時間下的血清結(jié)合中的MERS-特異性抗體和IgG特異性終點滴度。在每次接 種之后收集血清并通過ELI SA計算終點滴度。（C&D) DNA接種的作用和中和抗體應答的特征。 在每次免疫之前并在最后一次接種之后兩周從動物處獲得血液樣品。測試血清的中和抗 體。用活病毒(C)或MERS-假病毒(D)中和。用MERS-病毒測試連續(xù)稀釋的免疫血清。對于假病 毒中和測定，抗CHIKV猴血清被用作陰性抗體對照，且VSV-G假型化病毒被用作假病毒對照 用于中和特異性。用MERS病毒，通過PRNT50測定測試樣品。
[0042]圖25示出了由MERS-刺突疫苗引發(fā)的⑶4+和⑶8+T細胞應答的功能概況。在接種之 后誘導的特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞的細胞因子概況分別示于(A)和(B)中。小鼠脾細胞 (n = 3)是在最后一次DNA免疫之后一周分離并用集合的MERS-刺突肽離體刺激。就IFN-γ、 TNF-α及IL-2的細胞內(nèi)產(chǎn)生對細胞進行染色，然后通過FACS來分析。（Α&Β)散布圖描繪了釋 放IFN- γ、TNF-a、IL-2及雙重IFN- γ /TNF-a細胞因子的MERS-特異性CD4+T和CD8+T細胞。（C& D)柱圖示出了釋放細胞因子IFN-γ、TNF-a及IL-2的單、雙重及三重陽性⑶4+和⑶8+T細胞的 多功能亞群。圓圖示出了每個細胞因子亞群的比例。數(shù)據(jù)表示每組三只小鼠的平均值± SEM〇
[0043]圖26示出了通過來自刺突DNA免疫小鼠的免疫血清的MERS-S假病毒誘導的細胞凋 亡的抑制。(A)MERS-HCoV-刺突小鼠血清體外中和MERS并阻斷合胞體形成。未感染的Vero細 胞表示陰性對照，而陽性對照表示感染了 MERS-HCoV假病毒的那些細胞。箭頭表示合胞體形 成。感染后36小時在顯微鏡下觀察合胞體形成。（B)在1:100稀釋度下的pVax-Ι或MERS-刺突 免疫的血清存在下預孵育MERS-刺突假病毒并添加到Vero細胞中。感染后兩天，通過膜聯(lián)蛋 白V/PI染色測量細胞死亡百分比。條形圖顯示來自一式三份進行的單個實驗的FACS數(shù)據(jù)的 MERS-假病毒值的感染。在三個單獨的實驗中獲得類似結(jié)果。
[0044]圖27示出了在用MERS-刺突DNA疫苗接種與電穿孔組合之后的抗體應答。在第三次 免疫之后兩周收集用pVaxl、pMERS-刺突(0.5mg/動物;低劑量)或pMERS-刺突(2mg/動物;高 劑量)接種的猴的血清。就結(jié)合MERS-刺突蛋白的抗體對這些血清進行測試。此測試的結(jié)果 示了 (A)和(B)中。
[0045]圖28示出了來自接種后的MERS攻擊和病理學的結(jié)果。（A)由在尸體剖檢時收集的 單獨的組織通過qRT-PCR測定的平均病毒負荷。(B)組合的所有肺葉的平均病毒負荷在插圖 中示出。分析了Log TCID50eq/g、log TCID50當量/克組織;一個樣品/組織/來自三個動物 的動物/組。
【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明涉及一種包含中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)抗原的疫苗。MERS-CoV 是一種新型的高度致病病毒，僅出現(xiàn)于2012年，且因此，本文所述的疫苗是針對祀MERS-CoV 的首選疫苗之一。因此，所述疫苗提供一種用于此新型的致病病毒的治療，其先前治療不存 在并且仍然有大流行的潛力。
[0047] MERS-CoV抗原可以是MERS-CoV共有刺突抗原。MERS-CoV共有刺突抗原可來源于來 自MERS-CoV菌株的刺突抗原序列，且因此，MERS-CoV共有刺突抗原是獨特的。MERS-CoV共有 刺突抗原可缺少細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明的疫苗因為MERS-CoV共有刺突抗原的獨特序 列而廣泛適用于MERS-CoV的多個菌株。這些獨特序列允許疫苗對MERS-CoV的多個菌株有全 面保護性，包括MERS-CoV的遺傳多樣變體。
[0048]所述疫苗可用于保護以免感染MERS-CoV的許多菌株并治療這些菌株。所述疫苗可 弓丨發(fā)靶向MERS-CoV刺突抗原的體液和細胞免疫應答。所述疫苗可引發(fā)與MERS-CoV刺突抗原 反應的中和抗體和免疫球蛋白G(IgG)抗體。所述疫苗還可引發(fā)對MERS-CoV刺突抗原有反應 的CD8+和CD4+T細胞應答并產(chǎn)生干擾素_丫（IFN-γ )、腫瘤壞死因子a(TNF-a)及白細胞介素-2(IL-2)〇
[0049] 1.定義
[0050] 除非另外定義，否則本文所用的全部技術(shù)和科學術(shù)語都具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員通常理解的相同含義。當發(fā)生沖突時，以本文件(包括定義)為準。雖然在本發(fā)明的實踐或 測試中可以使用與本文所描述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料，但以下描述了 優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有公布、專利申請、專利以及其他參考文獻以其全文以引 用的方式并入本文。本文公開的材料、方法和實施例僅是示例性的，并不意圖為限制性的。 [00 51] 如本文所用，術(shù)語"包含（comprise)"、"包括（include)"、"具有(having)"、"具有 (has)"、"可以（can)"、"含有(contain)"以及其變化形式意圖是不排除另外行為或結(jié)構(gòu)的 可能性的開放式連接詞、術(shù)語、或詞語。除非上下文另外清楚地說明，否則單數(shù)形式"一個/ 種(a)"、"一個/種(an)"以及"所述(the)"包括復數(shù)引用。本公開還涵蓋"包括本文所呈現(xiàn)的 實施方案或要素"、"由本文所呈現(xiàn)的實施方案或要素組成"以及"主要由本文所呈現(xiàn)的實施 方案或要素組成"的其他實施方案，無論是否明確地提出。
[0052] 如本文所用的"佐劑"意指添加至本文所描述的疫苗中以增強抗原的免疫原性的 任何分子。
[0053] 如本文所用的"抗體"意指類型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗體，或片段、其片段或 衍生物，包括Fab、F (ab '）2、Fd以及單鏈抗體、雙鏈抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍 生物。所述抗體可以是從哺乳動物的血清樣本中分離出的抗體、多克隆抗體、親和純化抗體 或其混合物，所述混合物對所需的表位或從其衍生的序列表現(xiàn)足夠的結(jié)合特異性。
[0054] 如本文所用的"編碼序列"或"編碼核酸"意指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核 酸(RNA或DNA分子）。所述編碼序列可以進一步包括可操作地連接至調(diào)控元件的起始信號和 終止信號，所述調(diào)控元件包括能夠在施用核酸的個體或哺乳動物的細胞中指導表達的啟動 子和多聚腺苷酸化信號。
[0055] 如本文所用的"互補序列"或"互補的"意指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之 間的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對。
[0056]如本文所用的"共有"或"共有序列"可指基于對特定抗原的多個亞型的比對的分 析而構(gòu)建的合成核酸序列或相應多肽序列。序列可用于誘導針對特定抗原的多個亞型、血 清型或菌株的廣泛免疫性。合成抗原，如融合蛋白，可被操縱以產(chǎn)生共有序列（或共有抗 原)。
[0057]如本文可互換使用的"電穿孔"、"電-透化作用"或"電動增強"（"EP"）意指使用跨 膜電場脈沖來誘導在生物膜中的微觀途徑(孔隙）；它們的存在允許生物分子如質(zhì)粒、寡核 苷酸、s iRNA、藥物、離子以及水從細胞膜的一側(cè)流動到另一側(cè)。
[0058]如本文所用的"片段"意指編碼能夠在哺乳動物中引發(fā)免疫應答的多肽的核酸序 列或其部分。所述片段可以是選自編碼下文所述的蛋白質(zhì)片段的各種核苷酸序列的至少一 種的DNA片段。
[0059]就多肽序列來說，"片段"或"免疫原性片段"意指能夠在與全長野生型菌株MERS-CoV抗原交叉反應的哺乳動物中引發(fā)免疫應答的多肽。共有蛋白的片段可以包含共有蛋白 的至少10%、至少20%、至少30%、至少40 %、至少50%、至少60 %、至少70%、至少80%、至 少90%或至少95%。在一些實施方案中，共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少20個氨 基酸或更多、至少30個氨基酸或更多、至少40個氨基酸或更多、至少50個氨基酸或更多、至 少60個氨基酸或更多、至少70個氨基酸或更多、至少80個氨基酸或更多、至少90個氨基酸或 更多、至少100個氨基酸或更多、至少110個氨基酸或更多、至少120個氨基酸或更多、至少 130個氨基酸或更多、至少140個氨基酸或更多、至少150個氨基酸或更多、至少160個氨基酸 或更多、至少170個氨基酸或更多、至少180個氨基酸或更多、至少190個氨基酸或更多、至少 200個氨基酸或更多、至少210個氨基酸或更多、至少220個氨基酸或更多、至少230個氨基酸 或更多或至少240個氨基酸或更多。
[0060] 如本文所用的術(shù)語"遺傳構(gòu)建體"是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA或RNA 分子。所述編碼序列包含可操作地連接至調(diào)控元件的起始信號和終止信號，所述調(diào)控元件 包括能夠在施用核酸分子的個體的細胞中指導表達的啟動子和多聚腺苷酸化信號。如本文 所用的術(shù)語"可表達的形式"是指含有可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)的編碼序列的必需調(diào)控 元件的基因構(gòu)建體，以使得當存在于個體的細胞中時，編碼序列將被表達。
[0061] 如本文在兩種或更多種核酸或多肽序列的背景下所使用的術(shù)語"相同的"或"同一 性"意指序列具有指定百分比的在指定區(qū)上相同的殘基。可以通過以下來計算所述百分比： 最佳地比對兩個序列、在指定區(qū)域比較兩個序列、確定在兩個序列中相同的殘基的位置的 數(shù)量以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量、以匹配位置的數(shù)量除以在指定區(qū)域內(nèi)的位置的總數(shù)量，并且 將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。在兩個序列具有不同的長度或者比對產(chǎn)生一 個或多個交錯的末端并且比較的指定區(qū)域僅包括單一序列的情況下，單一序列的殘基被包 括在計算的分母中而不是分子中。當比較DNA和RNA時，胸腺嘧啶（T)和尿嘧啶(U)可以被認 為是等同的。同一性可以手動地或者通過使用計算機序列算法如BLAST或者BLAST 2.0來執(zhí) 行。
[0062] 如本文所用的"免疫應答"意指響應于抗原的引入而產(chǎn)生的宿主的免疫系統(tǒng)（例 如，哺乳動物的免疫系統(tǒng)）的活化。所述免疫應答可以是細胞應答或體液應答或兩者的形 式。
[0063] 如本文所用的"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"意指共價連接在一起的至少兩 個核苷酸。單鏈的描述還定義了互補鏈的序列。因此，核酸還涵蓋了所描述的單鏈的互補 鏈。核酸的很多變體可以被用于與給定的核酸相同的目的。因此，核酸還涵蓋了基本上相同 的核酸和其互補體。單鏈提供可以與靶序列在嚴格的雜交條件下雜交的探針。因此，核酸還 涵蓋了在嚴格雜交條件下雜交的探針。
[0064] 核酸可以是單鏈的或者雙鏈的或可以含有雙鏈或者單鏈序列兩者的部分。所述核 酸可以是DNA、基因組和cDNA兩者、RNA或雜合體，其中所述核酸可以含有脫氧核糖核苷酸和 核糖核苷酸的組合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌啉、肌苷、黃嘌呤次黃 嘌呤、異胞嘧啶以及異鳥嘌呤的堿基的組合。核酸可以通過化學合成方法或者通過重組方 法來獲得。
[0065] 如本文所用的"可操作地連接"意指基因的表達是在空間上與之連接的啟動子的 控制下進行的。在其控制下，啟動子可以被定位在基因的5'（上游)或者3'（下游）。所述啟動 子和基因之間的距離可以大約與所述啟動子和其在啟動子從中衍化的基因中所控制的基 因之間的距離相同。如本領(lǐng)域所已知，這個距離的變化可以在沒有失去啟動子功能的情況 下進行調(diào)整。
[0066] 如本文所用的"肽"、"蛋白質(zhì)"或"多肽"可以意指氨基酸的連接序列，并且可以是 天然的、合成的、或天然與合成的修飾或組合。
[0067] 如本文所用的"啟動子"意指合成的或自然來源的分子，所述分子能夠賦予、活化 或增強細胞中的核酸的表達。啟動子可包含一個或多個特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以便進一步增 強表達和/或改變其空間的表達和/或時間的表達。啟動子還可以包含遠端增強子或阻遏元 件，它們可以位于從轉(zhuǎn)錄的起始點開始的差不多幾千對堿基對處。啟動子可以從包括病毒、 細菌、真菌、植物、昆蟲以及動物的來源中獲得。啟動子可以調(diào)控基因組分相對于其中發(fā)生 表達的細胞、組織或器官或相對于發(fā)生表達所處的發(fā)育階段或響應于外部刺激(如生理應 激、病原體、金屬離子或誘導劑)而組成型地或差異性地表達。啟動子的代表性實例包括噬 菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、乳糖操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40后期啟 動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或者SV40后期啟動 子以及CMV IE啟動子。
[0068] "信號肽"和"前導序列"在本文可互換使用并且是指可以被連接在本文所述的 MERS-CoV蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信號肽/前導序列通常指示蛋白質(zhì)的位置。本文所 用的信號肽/前導序列優(yōu)選地促進蛋白質(zhì)從產(chǎn)生其的細胞中分泌。信號肽/前導序列常常從 蛋白質(zhì)的剩余部分裂解，所述蛋白質(zhì)在從細胞分泌后經(jīng)常被稱為成熟蛋白質(zhì)。信號肽/前導 序列連接在所述蛋白質(zhì)的N端。
[0069] 如本文所用的"受試者"可以意指想要或需要用本文所描述的疫苗進行免疫的哺 乳動物。哺乳動物可以是人、黑猩猩、狗、貓、馬、牛、小鼠或大鼠。
[0070] 如本文所用的"大致上相同的"可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或 更多個氨基酸的區(qū)域上至少 60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。"大致 上相同的"還可以意指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多個核苷酸的區(qū)域上至少 60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0071 ] 如本文所用的"治療(Treatment)"或"治療(Treating)"可以意指通過預防、抑制、 阻遏的手段保護動物免于疾病或完全消除疾病。預防疾病涉及在疾病發(fā)作之前向動物施用 本發(fā)明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病誘發(fā)之后但在其臨床出現(xiàn)之前向動物施用本發(fā)明的疫 苗。阻遏疾病涉及在疾病的臨床出現(xiàn)之后向動物施用本發(fā)明的疫苗。
[0072] 本文就核酸而言所用的"變體"意指（i)參考核苷酸序列的一部分或片段；（ii)參 考核苷酸序列或其部分的互補體；（iii)與參考核酸或其互補體基本上相同的核酸；或者 (iv)在嚴格的條件下與參考核酸、其互補體或與其基本上相同的序列雜交的核酸。
[0073] 變體可以進一步定義為通過氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列 上有所不同、但保留至少一種生物活性的肽或多肽。"生物活性"的代表性實例包括被特異 性抗體結(jié)合或促進免疫應答的能力。變體還意指具有與參考蛋白質(zhì)基本上相同的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)，所述參考蛋白質(zhì)具有保留至少一種生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性 取代，即以相似特性(例如，親水性、帶電區(qū)域的程度和分布）的不同氨基酸來替換氨基酸， 在本領(lǐng)域中被認為通常涉及微小變化。這些微小變化可部分地通過考慮氨基酸的親水指數(shù) 來鑒定，如本領(lǐng)域中所理解的。Kyte等，J.Mol. Biol. 157:105-132(1982)。所述氨基酸的親 疏水性指數(shù)是基于其疏水性和電荷的考慮。本領(lǐng)域已知的是相似的親疏水性指數(shù)的氨基酸 可以被取代并仍然保留蛋白質(zhì)功能。在一個方面，親疏水性指數(shù)為±2的氨基酸被取代。氨 基酸的親水性還可以被用來揭示會產(chǎn)生保留生物功能的蛋白質(zhì)的取代。在肽的情形下考慮 氨基酸的親水性允許計算所述肽最大的局部平均親水性，這是已經(jīng)被報道來與抗原性和免 疫原性良好關(guān)聯(lián)的有用測量。如本領(lǐng)域中所理解，用親水性值相似的氨基酸進行取代可產(chǎn) 生保留生物活性(例如免疫原性)的肽?？捎糜H水性值處在±2范圍內(nèi)的氨基酸進行取代。氨 基酸的親疏水性指數(shù)和親水性值兩者都受所述氨基酸的特定側(cè)鏈影響。與所述觀察一致的 是，與生物功能相容的氨基酸取代被理解為取決于這些氨基酸相對的相似性，并且特別是 那些氨基酸的側(cè)鏈，如通過疏水性、親水性、電荷、大小以及其他特性所揭示的。
[0074] 變體可以是在全基因序列或其片段的全長上大致相同的核酸序列。核酸序列可在 基因序列或其片段的全長上 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%相同。變體可以是在氨基 酸序列或其片段的全長上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的 全長上 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
[0075] 如本文所用的"載體"意指含有復制起點的核酸序列。載體可以是病毒載體、噬菌 體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以是自我復制的 染色體外載體，并優(yōu)選地是DNA質(zhì)粒。
[0076] 對于本文數(shù)值范圍的敘述來說，明確地涵蓋具有相同精確度的介于其間的每個中 間數(shù)字。例如，對于6至9的范圍來說，除6和9之外，還涵蓋數(shù)字7和8，并且對于范圍6.0至7.0 來說，明確地涵蓋數(shù)字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
[0077] 2.疫苗
[0078]本文提供了免疫原性組合物，如疫苗，其包含中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)抗原、其片段、其變體或其組合。所述疫苗可用于保護以免感染任何數(shù)量的MERS-CoV的 菌株，由此治療、預防和/或保護以避免基于MERS-CoV的病變。所述疫苗可顯著地誘導施用 所述疫苗的受試者的免疫應答，由此保護以免感染MERS-CoV并治療MERS-CoV感染。
[0079]所述疫苗可以是DNA疫苗、肽疫苗、或DNA與肽疫苗的組合。DNA疫苗可包含編碼 MERS-CoV抗原的核酸序列。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其變體、其片段或其組合。 所述核酸序列還可包含編碼接頭、前導序列或標記序列的另外的序列，其通過肽鍵與MERS-CoV抗原連接。肽疫苗可包括MERS-CoV抗原性肽、MERS-CoV抗原性蛋白、其變體、其片段或其 組合。DNA與肽疫苗的組合可包含編碼MERS-CoV抗原的上述核酸序列和MERS-CoV抗原性肽 或蛋白，其中MERS-CoV抗原性肽或蛋白與所編碼的MERS-CoV抗原具有相同的氨基酸序列。
[0080] 所述疫苗可在施用疫苗的受試者中誘導體液免疫應答。所誘導的體液免疫應答可 對MERS-CoV抗原有特異性。所誘導的體液免疫應答可與MERS-CoV抗原反應。體液免疫應答 可在施用疫苗的受試者中被誘導約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍、或約3倍至約10倍。體 液免疫應答可在施用疫苗的受試者中被誘導至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約2.5倍、至 少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4.0倍、至少約4.5倍、至少約5.0倍、至少約5.5倍、至少約 6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0 倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0 倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約 15.0倍、至少約15.5倍、或至少約16.0倍。
[0081] 由疫苗誘導的體液免疫應答可包括與不施用疫苗的受試者相比與施用疫苗的受 試者有關(guān)的增加水平的中和抗體。中和抗體可對MERS-CoV抗原有特異性。中和抗體可與 MERS-CoV抗原反應。中和抗體可在施用疫苗的受試者中提供針對MERS-CoV感染及其相關(guān)病 變的保護和/或治療MERS-CoV感染及其相關(guān)病變。
[0082] 由疫苗誘導的體液免疫應答可包括與不施用疫苗的受試者相比與施用疫苗的受 試者有關(guān)的增加水平的I gG抗體。這些I gG抗體可對MERS-CoV抗原有特異性。這些I gG抗體可 與MERS-CoV抗原反應。優(yōu)選地，體液應答對MERS-CoV的兩種或更多種菌株有交叉反應性。與 施用疫苗的受試者有關(guān)的IgG抗體水平與不施用疫苗的受試者相比可提高了約1.5倍至約 16倍、約2倍至約12倍、或約3倍至約10倍。與施用疫苗的受試者有關(guān)的I gG抗體水平與不施 用疫苗的受試者相比可提高了至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至 少約3.5倍、至少約4.0倍、至少約4.5倍、至少約5.0倍、至少約5.5倍、至少約6.0倍、至少約 6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5 倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約 12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少 約15.5倍或至少約16.0倍。
[0083] 所述疫苗可在施用疫苗的受試者中誘導細胞免疫應答。所誘導的細胞免疫應答可 對MERS-CoV抗原有特異性。所誘導的細胞免疫應答可對MERS-CoV抗原有反應性。優(yōu)選地，細 胞應答對MERS-CoV的兩種或更多種菌株有交叉反應性。所誘導的細胞免疫應答可包括引發(fā) CD8+T細胞應答。所引發(fā)的CD8+T細胞應答可與MERS-Co V抗原反應。所引發(fā)的CD8+T細胞應答 可以是多功能的。所誘導的細胞免疫應答可包括引發(fā)CD8+T細胞應答，其中CD8+T細胞產(chǎn)生干 擾素 -γ (IFN- γ )、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、白細胞介素-2(IL_2)、或IFN- γ與TNF-α的組 合。
[0084] 所誘導的細胞免疫應答可包括與不施用疫苗的受試者相比與施用疫苗的受試者 有關(guān)的增強的CD8+T細胞應答。與施用疫苗的受試者有關(guān)的CD8+T細胞應答與不施用疫苗的 受試者相比可增強了約2倍至約30倍、約3倍至約25倍、或約4倍至約20倍。與施用疫苗的受 試者有關(guān)的CD8+T細胞應答與不施用疫苗的受試者相比可增強了至少約1.5倍、至少約2.0 倍、至少約3.0倍、至少約4.0倍、至少約5.0倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至 少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約 10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少 約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少約16.0倍、至少約17.0倍、至 少約18.0倍、至少約19.0倍、至少約20.0倍、至少約21.0倍、至少約22.0倍、至少約23.0倍、 至少約24.0倍、至少約25.0倍、至少約26.0倍、至少約27.0倍、至少約28.0倍、至少約29.0 倍、或至少約30.0倍。
[0085] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生IFN-γ的CD3+CD8+T細胞的出現(xiàn)率增加。與施用 疫苗的受試者有關(guān)的CD3+CD8+IFN-Y+T細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受試者相比可增加了 至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17 倍、18倍、19倍、或20倍。
[0086] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生TNF-a的CD3+CD8+T細胞的出現(xiàn)率增加。與施用 疫苗的受試者有關(guān)的CD3+CD8+TNF-a+T細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受試者相比可增加了 至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、或14倍。
[0087] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生IL-2的⑶3+⑶8+T細胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫 苗的受試者有關(guān)的CD3+CD8+IL-2+T細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受試者相比可增加了至少 約 0.5 倍、1.0 倍、1.5 倍、2.0 倍、2.5 倍、3.0 倍、3.5 倍、4.0 倍、4.5 倍、或 5.0 倍。
[0088] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生IFN-γ和TNF-a的⑶3+⑶8+T細胞的出現(xiàn)率增 加。與施用疫苗的受試者有關(guān)的CD3+CD8+IFN-Y+TNF-a+T細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受 試者相比可增加了至少約25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、 80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、或 180倍。
[0089] 由疫苗誘導的細胞免疫應答可包括引發(fā)CD4+T細胞應答。所引發(fā)的CD4+T細胞應答 可與MERS-CoV抗原反應。所引發(fā)的CD4+T細胞應答可以是多功能的。所誘導的細胞免疫應答 可包括引發(fā)CD4+T細胞應答，其中CD4+T細胞產(chǎn)生IFN- γ、TNF-α、IL-2、或IFN- γ與TNF-α的組 合。
[0090] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生IFN-γ的CD3+CD4+T細胞的出現(xiàn)率增加。與施用 疫苗的受試者有關(guān)的CD3+CD4+IFN-Y+T細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受試者相比可增加了 至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17 倍、18倍、19倍、或20倍。
[0091] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生TNF-a的CD3+CD4+T細胞的出現(xiàn)率增加。與施用 疫苗的受試者有關(guān)的CD3+CD4+TNF-a+T細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受試者相比可增加了 至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17 倍、18倍、19倍、20倍、21倍、或22倍。
[0092] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生IL-2的⑶3+⑶4+T細胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫 苗的受試者有關(guān)的CD3+CD4+IL-2+T細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受試者相比可增加了至少 約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18 倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33 倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、45倍、50倍、55倍、或60倍。
[0093] 所誘導的細胞免疫應答可包括產(chǎn)生IFN-γ和TNF-a的⑶3+⑶4+T細胞的出現(xiàn)率增 加。與施用疫苗的受試者有關(guān)的CD3+CD4+IFN-Y+TNF-a+細胞的出現(xiàn)率與不施用疫苗的受試 者相比可增加了至少約2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5 倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、 12.5 倍、13.0 倍、13.5 倍、14.0 倍、14.5 倍、15.0 倍、15.5 倍、16.0 倍、16.5 倍、17.0 倍、17.5 倍、 18 · 0倍、18 · 5倍、19 · 0倍、19 · 5倍、20 · 0倍、21 倍、22倍、23倍、24 倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29 倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、或35倍。
[0094] 本發(fā)明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，如為安全的，以使得疫苗本身不 會引起疾病或死亡;保護免受由暴露于活的病原體(如病毒或細菌）引起的疾病;誘導中和 抗體來預防細胞的感染;誘導針對細胞內(nèi)病原體的保護性T細胞；以及提供施用容易性、很 少副作用、生物穩(wěn)定性以及每劑量的低成本。
[0095] 當施用至不同組織如肌肉或皮膚時，疫苗可進一步誘導免疫應答。當經(jīng)由電穿孔 或注射或皮下或肌內(nèi)施用時，疫苗可進一步誘導免疫應答。
[0096] a.中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)抗原
[0097]如上所述，疫苗包含MERS-CoV抗原、其片段、其變體或其組合。冠狀病毒（包括 MERS-CoV)是由膜包被并且具有稱為刺突（S)蛋白的1型膜糖蛋白，其在冠狀病毒表面上形 成凸出刺突。刺突蛋白促進冠狀病毒結(jié)合至位于細胞表面上的蛋白質(zhì)，例如金屬蛋白酶氨 肽酶N，并介導細胞-病毒膜融合。具體說來，刺突蛋白含有S1亞單位，其促進冠狀病毒結(jié)合 至細胞表面蛋白。因此，刺突蛋白的S1亞單位控制哪些細胞被冠狀病毒感染。刺突蛋白還含 有S2亞單位，其是促進病毒和細胞膜融合的跨膜亞單位。因此，MERS-CoV抗原可包含MERS-CoV刺突蛋白、MERS-CoV刺突蛋白的S1亞單位、或MERS-CoV刺突蛋白的S2亞單位。
[0098] 一旦結(jié)合細胞表面蛋白和膜融合，冠狀病毒便進入細胞并且其單鏈RNA基因組釋 放到受感染細胞的細胞質(zhì)中。單鏈RNA基因組是正鏈且因此可被翻譯成RNA聚合酶，其產(chǎn)生 是負鏈的另外的病毒RNA。因此，MERS-CoV抗原還可以是MERS-CoV RNA聚合酶。
[0099]病毒RNA負鏈被轉(zhuǎn)錄成較小的亞基因組RNA正鏈，其被用于翻譯其他病毒蛋白，例 如核衣殼(N)蛋白、包膜(E)蛋白、及基質(zhì)(M)蛋白。因此，MERS-CoV抗原可包含MERS-CoV核衣 殼蛋白、MERS-CoV包膜蛋白或MERS-CoV基質(zhì)蛋白。
[0100]病毒RNA負鏈還可用于復制病毒基因組，其被核衣殼蛋白結(jié)合?；|(zhì)蛋白連同刺突 蛋白一起被整合到受感染細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。同時，核衣殼蛋白結(jié)合至病毒基因組且膜包埋 基質(zhì)和刺突蛋白出芽到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔內(nèi)，由此在膜中包住病毒基因組。然后病毒子代通過高 爾基小泡轉(zhuǎn)運到受感染細胞的細胞膜并且通過胞吞作用釋放到細胞間隙中。
[0101] 在一些實施方案中，MERS-CoV抗原可以是MERS-CoV刺突蛋白、MERS-CoV RNA聚合 酶、MERS-CoV核衣殼蛋白、MERS-CoV包膜蛋白、MERS-CoV基質(zhì)蛋白、其片段、其變體或其組 合。MERS-CoV抗原可以是來源于兩種或更多種MERS-CoV刺突抗原、兩種或更多種MERS-CoV RNA聚合酶、兩種或更多種MERS-CoV核衣殼蛋白、兩種或更多種包膜蛋白、兩種或更多種基 質(zhì)蛋白或其組合的共有抗原。MERS-CoV共有抗原可被修飾以便改善表達。修飾可包括密碼 子優(yōu)化、RNA優(yōu)化、加入kozak序列以便增加翻譯起始和/或加入免疫球蛋白前導序列以提高 MERS-CoV抗原的免疫原性。在一些實施方案中，MERS-CoV抗原包含IgE前導序列，其可以是 SEQ ID N0:6中列出的氨基酸序列并由SEQ ID N0:5中列出的核苷酸序列編碼。
[0102] (l)MERS-CoV 刺突抗原
[0103] MERS-CoV抗原可以是MERS-CoV刺突抗原、其片段、其變體或其組合。MERS-CoV刺突 抗原能夠在哺乳動物中引發(fā)針對一種或多種MERS-CoV菌株的免疫應答。MERS-CoV刺突抗原 可包含使其作為可誘導抗MERS-CoV免疫應答的免疫原尤其有效的表位。
[0104] MERS-CoV刺突抗原可以是來源于兩種或更多種MERS-CoV菌株的共有序列。MERS-CoV刺突抗原可包含共有序列和/或用于改善表達的修飾。修飾可包括密碼子優(yōu)化、RNA優(yōu) 化、加入kozak序列以便增加翻譯起始和/或加入免疫球蛋白前導序列以提高MERS-CoV刺突 抗原的免疫原性。MERS-CoV共有刺突抗原可包含信號肽如免疫球蛋白信號肽，例如但不限 于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白（IgG)信號肽。在一些實施方案中，MERS-CoV共有刺突抗 原可包含血球凝集素(HA)標記物。MERS-CoV共有刺突抗原可被設(shè)計來引發(fā)比相應的密碼子 優(yōu)化刺突抗原更強且更廣泛的細胞和/或體液免疫應答。
[0105] MERS-CoV共有刺突抗原可以是核酸序列SEQ ID N0:1，其編碼SEQ ID N0:2(圖8A 和8B)。在一些實施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原可以是在SEQ ID NO: 1中列出的核酸序 列的全長上具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同一性的核酸序列。在其他實 施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原可以是編碼在SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列的全長 上具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0106] MERS-CoV共有刺突抗原可以是氨基酸序列SEQ ID N0: 2。在一些實施方案中， MERS-CoV共有刺突抗原可以是在SEQ ID N0: 2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
[0107] 可提供SEQ ID N0: 2的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60%、至少65%、 至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少 98%或至少99%的SEQ ID N0:2。在一些實施方案中，免疫原性片段包括前導序列，例如像 免疫球蛋白前導物，如IgE前導物。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導序列。
[0108] 可提供具有與SEQ ID N0:2的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫原 性片段。所述免疫原性片段可包含至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%與SEQ ID N0: 295%同源的蛋白質(zhì)。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有96% 同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有 97%同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具 有98%同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段 具有99%同源性的免疫原性片段。在一些實施方案中，免疫原性片段包括前導序列，例如像 免疫球蛋白前導物，如IgE前導物。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導序列。
[0109] 一些實施方案涉及SEQ ID NO: 1的免疫原性片段。免疫原性片段可以是至少60%、 至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少 97%、至少98%或至少99%的SEQ ID N0:1。免疫原性片段可與SEQ ID N0:1的片段至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源。在一些實施方案中，免疫原性片段包 括編碼前導序列的序列，例如像免疫球蛋白前導物，如IgE前導物。在一些實施方案中，片段 不含編碼前導序列的編碼序列。
[0110] (a)缺少細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的MERS-CoV刺突抗原
[0111] MERS-CoV抗原可以是缺少細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的MERS-CoV刺突抗原（即，在本文中也稱 作"MERS-CoV刺突抗原Δ CD"）、其片段、其變體或其組合。MERS-CoV刺突抗原Δ CD能夠在哺 乳動物中引發(fā)針對一種或多種MERS-CoV菌株的免疫應答。MERS-CoV刺突抗原△⑶可包含使 其作為可誘導抗MERS-CoV免疫應答的免疫原尤其有效的表位。
[0112] MERS-CoV刺突抗原Δ CD可以是來源于兩種或更多種MERS-CoV菌株的共有序列。 MERS-CoV刺突抗原△ CD可包含共有序列和/或用于改善表達的修飾。修飾可包括密碼子優(yōu) 化、RNA優(yōu)化、加入kozak序列以便增加翻譯起始和/或加入免疫球蛋白前導序列以提高 MERS-CoV刺突抗原Δ⑶的免疫原性。MERS-CoV共有刺突抗原Δ⑶可包含信號肽如免疫球蛋 白信號肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白（IgG)信號肽。在一些實施方案 中，共有刺突抗原A⑶可包含血球凝集素 (HA)標記物。MERS-CoV共有刺突抗原Δ⑶可被設(shè) 計來引發(fā)比相應的密碼子優(yōu)化刺突抗原A CD更強且更廣泛的細胞和/或體液免疫應答。
[0113] MERS-CoV共有刺突抗原ACD可以是核酸序列SEQ ID N0:3,其編碼SEQ ID N0:4 (圖8C和8D)。在一些實施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原Δ CD可以是在SEQ ID NO: 3中列出 的核酸序列的全長上具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%同一性的核酸序列。在其他實施方案中，MERS-CoV共有刺突抗原△ CD可以是編碼在 SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0114] MERS-CoV共有刺突抗原Δ CD可以是氨基酸序列SEQ ID N0:4。在一些實施方案中， MERS-CoV共有刺突抗原Δ⑶可以是在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少 約90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同一性的氨基酸序列。
[0115] 可提供SEQ ID N0:4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60%、至少65%、 至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少 98%或至少99%的SEQ ID N0:4。在一些實施方案中，免疫原性片段包括前導序列，例如像 免疫球蛋白前導物，如IgE前導物。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導序列。
[0116] 可提供具有與SEQ ID N0:4的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫原 性片段。所述免疫原性片段可包含至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%與SEQ ID N0: 495%同源的蛋白質(zhì)。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有96% 同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有 97%同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具 有98%同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段 具有99%同源性的免疫原性片段。在一些實施方案中，免疫原性片段包括前導序列，例如像 免疫球蛋白前導物，如IgE前導物。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導序列。
[0117] 一些實施方案涉及SEQ ID N0:3的免疫原性片段。免疫原性片段可以是至少60%、 至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少 97%、至少98%或至少99%的SEQ ID N0:3。免疫原性片段可與SEQ ID N0:3的片段至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源。在一些實施方案中，免疫原性片段包 含編碼前導序列的序列，例如像免疫球蛋白前導物，如IgE前導物。在一些實施方案中，片段 不含編碼前導序列的編碼序列。
[0118] b.載體
[0119] 所述疫苗可包含一種或多種包括編碼抗原的核酸的載體。所述一種或多種載體能 夠表達抗原。載體可以具有含有復制起點的核酸序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、細菌人工 染色體或酵母人工染色體。載體可以是自主復制的染色體外載體，或整合到宿主基因組中 的載體。
[0120] -種或多種載體可以是表達構(gòu)建體，所述表達構(gòu)建體通常是用于將特定基因引入 靶細胞中的質(zhì)粒。一旦表達載體位于細胞內(nèi)部，那么通過細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機器核糖體復合 物產(chǎn)生由基因編碼的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒經(jīng)常經(jīng)過工程改造以含有調(diào)控序列，所述調(diào)控序列充當 增強子和啟動子區(qū)域，并且導致表達載體上攜帶的基因的有效轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的載體表達大 量穩(wěn)定的信使RNA，和因此形成的蛋白質(zhì)。
[0121] 載體可具有表達信號（如強啟動子、強終止密碼子）、啟動子與克隆基因之間的距 離的調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄終止序列和PTIS(可移動翻譯起始序列）的插入。
[0122] (1)表達載體
[0123] 載體可以是環(huán)狀質(zhì)粒或線性核酸。環(huán)狀質(zhì)粒和線性核酸能夠指導適當?shù)氖茉囌呒?胞中的特定核苷酸序列的表達。載體可以具有可操作地連接至編碼抗原的核苷酸序列的啟 動子，所述核苷酸序列可以可操作地連接至終止信號。載體還可以含有核苷酸序列的正確 翻譯所需的序列。包含目標核苷酸序列的載體可以是嵌合的，這意味著至少一種其組分相 對于至少一種它的其他組分是異源的。表達盒中的核苷酸序列的表達可在組成型啟動子或 誘導型啟動子的控制下，所述啟動子僅在宿主細胞暴露于一些特定外部刺激時起始轉(zhuǎn)錄。 在多細胞有機體的情況下，啟動子還可以是對特定組織或器官或發(fā)育階段特異性的。
[0124] (2)環(huán)狀載體和線性載體
[0125] 載體可以是環(huán)狀質(zhì)粒，所述環(huán)狀質(zhì)?？赏ㄟ^整合至細胞基因組中來轉(zhuǎn)化靶細胞或 存在于染色體外(例如，具有復制起點的自主復制質(zhì)粒）。
[0?26] 載體可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能夠表達編碼抗原的DNA并且使細胞能將 序列翻譯成由免疫系統(tǒng)識別的抗原的任何其他表達載體。
[0127]本文也提供一種能夠通過電穿孔高效遞送至受試者中且表達一種或多種所需抗 原的線性核酸疫苗或線性表達盒（"LEC"）1EC可以是沒有任何磷酸主鏈的任何線性DNA。 DNA可編碼一種或多種抗原。LEC可包含啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和/或多腺苷酸化信號。 抗原的表達可受啟動子控制。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主鏈。LEC可不含 有與所需抗原基因表達無關(guān)的其他核酸序列。
[0128] LEC可源自能夠線性化的任何質(zhì)粒。質(zhì)?？赡軌虮磉_抗原。質(zhì)?？梢允莗NP(Puerto 尺;[(30/34)或口]\12(如￥0&16(1〇11丨&/99)。質(zhì)粒可以是￥1^0094\^?(4〇0嫩3.0或口1'〇￥&1，或能夠 表達編碼抗原的DNA并且使細胞能將序列翻譯成由免疫系統(tǒng)識別的抗原的任何其他表達載 體。
[0129] LEC可以是pcrlV^LEC可以是pcrNPepcrNP和pcrMR可以分別源自 pNP(Puerto Rico/34)和pM2(New Caledonia/99)。
[0130] (3)啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和多腺苷酸化信號
[0131] 載體可具有啟動子。啟動子可以是能夠驅(qū)動基因表達并且調(diào)控所分離核酸的表達 的任何啟動子。所述啟動子是為通過DNA依賴性RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄所需的順式作用序列元 件，所述RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄本文所述的抗原序列。用于指導異源核酸表達的啟動子的選擇取決 于具體應用。在載體中，啟動子可定位在距離轉(zhuǎn)錄起始點與其天然環(huán)境中距離轉(zhuǎn)錄起始位 點大約相同的位置上。然而，可容許所述距離的變化而不損失啟動子功能。
[0132] 啟動子可以可操作地連接至編碼抗原以及轉(zhuǎn)錄物的有效多腺苷酸化、核糖體結(jié)合 位點和翻譯終止所需的信號的核酸序列。啟動子可以是CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40 晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子、多 角體蛋白啟動子，或?qū)τ谡婧思毎械谋磉_顯示有效的另一種啟動子。
[0133] 載體可包含增強子和具有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。載體可含有位于 結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來提供有效終止。可從與啟動子序列相同的基因獲得或可從不 同的基因獲得終止區(qū)。
[0134] c.賦形劑和疫苗的其他組分
[0135] 疫苗可還包含藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可以是功能性分 子，如媒介物、載體或稀釋劑。所述藥學上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進劑，其可包括表 面活性劑如免疫刺激復合物(ISC0MS)、費氏(Freunds)不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰 酯A)、胞壁肽、苯醌類似物、囊泡如角鯊烯和角鯊烯、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、媽離子、病毒 蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米粒子或其他已知的轉(zhuǎn)染促進劑。
[0136] 所述轉(zhuǎn)染促進劑是聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促 進劑是聚-L-谷氨酸鹽，并且聚-L-谷氨酸鹽可以小于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn)染促 進劑還可包括表面活性劑，如免疫刺激復合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括 單磷酰脂質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物以及囊泡(如角鯊烯和角鯊烯），并且透明質(zhì)酸還可結(jié)合 基因構(gòu)建體施用而使用。DNA質(zhì)粒疫苗還可包含轉(zhuǎn)染促進劑，如脂質(zhì)、脂質(zhì)體(包括卵磷脂脂 質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其他脂質(zhì)體，如DNA-脂質(zhì)體混合物(參見例如W09324640))、鈣離子、病 毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒，或其他已知的轉(zhuǎn)染促進劑。所述轉(zhuǎn)染促進劑是聚 陰離子、聚陽離子（包括聚-L-谷氨酸（LGS))或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染劑在所述疫苗中的濃度為小于 4mg/ml、小于2mg/ml、小于lmg/ml、小于0 · 750mg/ml、小于0 · 500mg/ml、小于0 · 250mg/ml、小 于0 · 100mg/ml、小于0 · 050mg/ml 或小于0 · 010mg/ml。
[0137] 所述藥學上可接受的賦形劑可以是佐劑。所述佐劑可以是在替代的質(zhì)粒中表達或 作為蛋白質(zhì)與在疫苗中的以上質(zhì)粒組合而被遞送的其他基因。佐劑可選自由以下各項組成 的組:α-干擾素（IFN-a)j-干擾素（IFN-β)、γ -干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNF €[、丁即0、61-05?、表皮生長因子化6?)、皮膚1'細胞虜獲趨化因子(0^00、上皮胸腺表達趨化 因子(TECK)、粘膜相關(guān)上皮趨化因子(]\^〇、11^-12、11^-15、]\01(^080、0)86(包括信號序列缺 失的IL-15并且任選地包括來自IgE的信號肽）。佐劑可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、 TECK、血小板衍生的生長因子(？〇6?)、了陬€^陬0、61?^、表皮生長因子"6?)、11^-1、幾-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 或其組合。
[0138] 可以用作佐劑的其他基因包括編碼以下的那些基因：103-1、11?-1 &、11?-1?、幾-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-l、MadCAM-l、LFA-1、VLA-1、 Mac-l、pl50.95、PECAM、I CAM-1、I CAM-2、I CAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 的突 變體形式、CD40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、IL-22、神經(jīng)生長因子、 血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF 受體、Flt、Ap〇-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Ap〇-3、AIR、LARD、 NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap-l、Ap-2、口384651^1、]\^088、11^1(、了1^?6、11^、無活性的肌1(、5厶？1(、5厶?-1、見1(、干擾素應答基因、 NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、 0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl、TAP2以及其功能 性片段。
[0139] 疫苗可還包含如1994年4月1日提交的美國序列號021，579中所描述的基因疫苗促 進劑，所述專利文獻以引用的方式全部并入。
[0140] 可以根據(jù)待使用的施用方式來配制疫苗?？勺⑸涞囊呙缢幬锝M合物可以是無菌、 不含熱原并且不含微粒的?？梢允褂玫葷B制劑或溶液。用于等滲性的添加劑可以包括氯化 鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可以包含血管收縮劑。等滲溶液可以包括磷酸鹽緩 沖鹽水。疫苗可以還包含穩(wěn)定劑(包括明膠和白蛋白）。穩(wěn)定劑可以允許制劑在室溫或環(huán)境 溫度下穩(wěn)定持續(xù)延長的時間段，所述穩(wěn)定劑包括LGS或聚陽離子或聚陰離子。
[0141] 3.接種疫苗的方法
[0142] 本文還提供了一種通過向有此需要的受試者施用疫苗在受試者中治療、保護和/ 或預防疾病的方法。向受試者施用疫苗可在所述受試者中誘導或引發(fā)免疫應答。所誘導的 免疫應答可用于治療、預防和/或保護以免患上疾病，例如與MERS-CoV感染有關(guān)的病變。所 誘導的免疫應答提供施用針對一種或多種MERS-CoV菌株有抗性的疫苗的受試者。
[0143] 所誘導的免疫應答可包括誘導的體液免疫應答和/或誘導的細胞免疫應答。體液 免疫應答可被誘導了約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍、或約3倍至約10倍。所誘導的體液 免疫應答可包括對抗原有反應性的IgG抗體和/或中和抗體。所誘導的細胞免疫應答可包括 CD8+T細胞應答，其被誘導了約2倍至約30倍、約3倍至約25倍、或約4倍至約20倍。
[0144] 疫苗劑量可以是在lyg至10mg之間的活性組分/kg體重/時間，并且可以是20yg至 l〇mg 組分/kg 體重/時間?？梢悦?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治療的疫苗劑量的數(shù)目可 以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0145] a.施用
[0146] 所述疫苗可根據(jù)藥物領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的標準技術(shù)來配制。這類組合物可通 過醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)以考慮到如具體受試者的年齡、性別、體重和條件及施用 途徑的劑量來施用。受試者可以是哺乳動物，如人、馬、牛、豬、綿羊、貓、狗、大鼠或小鼠。
[0147] 可以預防性地或治療性地施用疫苗。在預防性施用中，可以足以誘導免疫應答的 量施用疫苗。在治療性應用中，以足以引起治療效果的量向有需要的受試者施用疫苗。將足 夠?qū)崿F(xiàn)此目標的量定義為"治療有效劑量"。對于這種用途有效的量取決于例如所施用的疫 苗方案的具體組成、施用方式、疾病的階段和嚴重程度、患者的總體健康狀況以及處方醫(yī)師 的判斷。
[0148] 所述疫苗可通過如下文獻中所述本領(lǐng)域中公知的方法來施用：Donnelly等人 (Ann.Rev.Immunol .15:617-648( 1997)) ;Felgner等人（美國專利號5,580,859,1996年 12月 3日授權(quán)）；Felgner(美國專利號5,703,055，1997年12月30日授權(quán)）；以及0&^〇11等人(美國 專利號5，679，647，1997年10月21日授權(quán)），所有文獻的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文?？?以例如使用疫苗槍將疫苗的DNA與可以施用至個體的顆?；蛑榱＿M行復合。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員將知道藥學上可接受的載體(包括生理學上可接受的化合物）的選擇取決于例如表達 載體的施用途徑。
[0149] 可以經(jīng)由多種途徑來遞送疫苗。典型的遞送途徑包括腸胃外施用，例如，皮內(nèi)、肌 肉內(nèi)或皮下遞送。其他途徑包括口服施用、鼻內(nèi)和陰道內(nèi)途徑。特別是對于疫苗的DNA來說， 可以將疫苗遞送至個體的組織的間隙空間（Feigner等，美國專利號5,580,859和5,703， 055,所有所述專利的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文）。還可以將疫苗施用至肌肉，或可以 經(jīng)由皮內(nèi)或皮下注射或經(jīng)皮（如通過離子電滲療法)施用。還可以采用疫苗的表皮施用。表 皮施用可以涉及機械地或化學地刺激表皮的最外層，以刺激對刺激物的免疫應答(Carson 等，美國專利號5，679，647，所述專利的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文）。
[0150] 還可以配制疫苗，用于經(jīng)由鼻通道施用。適合用于經(jīng)鼻施用的制劑(其中載體是固 體)可以包括具有例如在約10微米至約500微米范圍中的顆粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉 末以其中采用鼻吸的方式來施用，即，通過鼻道從靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制劑 可以是鼻用噴霧劑、滴鼻劑或通過噴霧器進行氣霧劑施用。制劑可以包含疫苗的水性溶液 或油性溶液。
[0151] 疫苗可以是液體制劑，如混懸劑、糖漿或酏劑。疫苗還可以是用于腸胃外、皮下、皮 內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用(例如，可注射施用）的制劑，如無菌混懸劑或乳劑。
[0152] 疫苗可以摻入脂質(zhì)體、微球體或其他聚合物基質(zhì)中（Feigner等人，美國專利號5， 703,055;Gregoriadis，Liposome Technology，第I卷至第III卷（第二版，1993)，所述文獻 的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文）。脂質(zhì)體可以由磷脂或其他脂質(zhì)組成，并且可以是制造 和施用相對簡單的無毒的、生理學上可接受的和可代謝的載體。
[0153]可以經(jīng)由電穿孔，如通過美國專利號7,664,545中所描述的方法來施用疫苗，所述 專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。電穿孔可以通過美國專利號6，302，874、5，676，646、6， 241，701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6，192,270、6，181，964、6，150，148、6，120， 493、6，096，020、6，068，650和5，702，359中所描述的方法和/或裝置來進行，所述專利的內(nèi) 容以引用的方式整體并入本文?？山?jīng)由微創(chuàng)設(shè)備來進行電穿孔。
[0154]微創(chuàng)電穿孔設(shè)備（"MID"）可以是用于將以上所描述的疫苗和相關(guān)流體注射至身體 組織中的裝置。所述設(shè)備可包括中空針、DNA盒和流體遞送部件，其中所述設(shè)備適于在使用 中致動流體遞送部件，以便在將針插入身體組織中的過程中同時(例如，自動地)將DNA注射 至所述身體組織中。這具有以下優(yōu)點:在插入針的同時逐漸注射DNA和相關(guān)流體的能力導致 通過身體組織的流體的更均勻分布。由于注射的DNA分布在較大面積上，可減少注射過程中 經(jīng)受的疼痛。
[0155] MID可在不使用針的情況下將疫苗注射至組織中。MID可將疫苗作為小的流或射流 以使得疫苗穿透組織的表面并且進入下層組織和/或肌肉的力進行注射。小的流或射流之 后的力可由壓縮氣體(如在幾分之一秒內(nèi)通過微小孔的二氧化碳)的膨脹提供。微創(chuàng)電穿孔 設(shè)備的實例和使用它們的方法在公布的美國專利申請?zhí)?0080234655、美國專利號6，520， 950、美國專利號7，171，264、美國專利號6,208,893、美國專利號6,009,347、美國專利號6， 120,493、美國專利號7,245,963、美國專利號7,328,064和美國專利號6,763,264中進行描 述，每個所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0156] MID可包括產(chǎn)生無痛地穿透組織的液體的高速射流的注射器。這類無針注射器可 商購獲得?？稍诒疚闹欣玫臒o針注射器的實例包括美國專利號3，805，783、4，447，223、5， 505，697及4，342，310中所述的那些，這些專利的內(nèi)容各自以引用的方式并入本文。
[0157] 可以使用無針注射器將呈適用于直接或間接電轉(zhuǎn)運形式的所需的疫苗引入(例如 注射)至待治療的組織中，通常通過將組織表面與注射器接觸，以便以足以導致疫苗滲透至 組織中的力致動藥劑射流的遞送。例如，如果待治療的組織是粘膜、皮膚或肌肉，那么將藥 劑朝向粘膜或皮膚表面以足以導致藥劑滲透穿過角質(zhì)層并且進入真皮層中或分別進入下 層組織和肌肉中的力進行噴射。
[0158] 無針注射器非常適合于將疫苗遞送至所有類型的組織，特別是遞送至皮膚和粘 膜。在一些實施方案中，無針注射器可以用于將含有疫苗的液體推送至表面并且進入受試 者的皮膚或粘膜中。可以使用本發(fā)明的方法治療的各種類型的組織的代表性實例包括胰 腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心臟、腎、肌肉、乳房、結(jié)腸、前列腺、胸腺、睪丸、皮膚、 粘膜組織、卵巢、血管或其任何組合。
[0159] MID可具有將組織電穿孔的針電極。通過在多電極陣列（例如設(shè)置成矩形或正方形 圖案）中的多對電極之間脈沖來提供優(yōu)于在一對電極之間脈沖的結(jié)果的改良的結(jié)果。例如 于題為"Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes" 的美國專利 號5,702,359中公開針陣列，其中可在治療性處理過程中對多對針產(chǎn)生脈沖。在所述應用中 (其以引用的方式并入本文，如同其全文陳述一樣），針安置在環(huán)形陣列中，但具有連接器和 轉(zhuǎn)換裝置，從而實現(xiàn)相對對的針電極之間的脈沖?？墒褂糜糜趯⒅亟M表達載體遞送至細胞 的一對針電極。這種設(shè)備和系統(tǒng)在美國專利號6，763，264中進行描述，所述專利的內(nèi)容以引 用的方式并入本文?；蛘撸墒褂脝吾樤O(shè)備，所述設(shè)備允許DNA注射和使用類似于正常注射 針的單針電穿孔并且施加比通過目前所使用設(shè)備遞送的電壓低的電壓的脈沖，從而減少患 者經(jīng)受的電感覺。
[0160] MID可包括一個或多個電極陣列。陣列可包括具有相同直徑或不同直徑的兩個或 多個針。針可均勻或不均勻地間隔開。針可介于0.005英寸與0.03英寸之間、0.01英寸與 0.025英寸之間，或0.015英寸與0.020英寸之間。針的直徑可以是0.0175英寸。針可間隔開 0.5mm、l. 0mm J .5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
[0161] MID可由脈沖發(fā)生器和在單個步驟中遞送疫苗和電穿孔脈沖的兩個或更多個針疫 苗注射器組成。脈沖發(fā)生器可允許經(jīng)由閃存卡操作的個人計算機靈活地編程脈沖和注射參 數(shù)，以及電穿孔和患者數(shù)據(jù)的全面記錄和儲存。脈沖發(fā)生器可在短的時間段期間遞送多種 伏特脈沖。例如，脈沖發(fā)生器可遞送1 〇〇ms持續(xù)時間的三個15伏特脈沖。所述MI D的實例是 Inovio Biomedical Corporation的Eigen 1000系統(tǒng)，所述系統(tǒng)在美國專利號7,328,064中 進行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0162] MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)設(shè)備和系統(tǒng)，其 是便于將大分子(如DNA)引入身體或植物中選定組織的細胞中的模塊化電極系統(tǒng)。模塊化 電極系統(tǒng)可包括多個針電極、皮下針、提供從可編程恒流脈沖控制器至多個針電極的導電 鏈路的電連接器，以及電源。操作者可以抓住固定在支撐結(jié)構(gòu)上的多個針電極并將它們堅 固地插入到身體或植物中所選定的組織中。然后經(jīng)由皮下針將大分子遞送到選定組織中。 啟動可編程的恒定電流脈沖控制器，并將恒定電流電脈沖施加到多個針電極中。所施加的 恒流電脈沖促進將大分子引入多個電極之間的細胞中。由于細胞的過度加熱造成的細胞死 亡通過借助于恒流脈沖限制組織中的功率消耗而得以最小化。Cellectra設(shè)備和系統(tǒng)在美 國專利號7,245,963中進行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0163] MID可以是Eigen 1000系統(tǒng)（Inovio Pharmaceuticals) aElgen 1000系統(tǒng)可包括 提供中空針的設(shè)備;和流體遞送部件，其中裝置適于在使用中致動流體遞送部件，以便在將 針插入身體組織中的過程中同時(例如，自動地)將流體(本文所描述的疫苗)注射至所述身 體組織中。優(yōu)點是:在插入針的同時逐漸注射流體的能力導致通過身體組織的流體的更均 勻分布。還據(jù)信，由于注射的流體的體積分布在較大面積上，減少了在注射過程中經(jīng)受的疼 痛。
[0164] 此外，流體的自動注射有助于所注射流體的實際劑量的自動監(jiān)測和配準?？梢愿?據(jù)需要出于文件編制目的通過控制單元來儲存這一數(shù)據(jù)。
[0165] 應理解，注射速率可以是線性或非線性的，并且可在已經(jīng)將針插入穿過待治療的 受試者的皮膚之后并且在將所述針進一步插入身體組織中時進行注射。
[0166] 可通過本發(fā)明的裝置將流體注射至其中的適合組織包括腫瘤組織、皮膚或肝組 織，但也可以是肌肉組織。
[0167] 裝置還包括用于引導針插入身體組織中的針插入部件。通過針插入的速率來控制 流體注射的速率。這具有以下優(yōu)點：既可以控制針插入，又可以控制流體的注射，以使得可 以根據(jù)需要使插入速率與注射速率相匹配。它還使裝置更易于用戶操作。如果需要，可以提 供用于將針自動地插入身體組織中的部件。
[0168] 用戶可以選擇何時開始流體的注射。然而，理想地，在針的尖端到達肌肉組織時開 始注射，并且裝置可包括用于感測針何時插入至足以開始注射流體的深度的部件。這意味 著當針達到所需深度(其將通常是肌肉組織開始處的深度)時，可以提示以自動地開始流體 的注射。肌肉組織開始處的深度可以例如采用為預設(shè)針插入深度(如4_的值），所述深度將 被認為是對于針穿過皮膚層來說是足夠的。
[0169] 感測部件可包括超聲探針。感測部件可包括用于感測阻抗或電阻的變化的部件。 在這種情況下，部件可不如此記錄針在身體組織中的深度，而將相反適于隨著針從不同類 型的身體組織移動至肌肉中來感測阻抗或電阻的變化。這些替代方案中的任一個提供相對 準確和簡單地操作的感測可開始注射的部件?？梢愿鶕?jù)需要進一步記錄針的插入深度，并 且所述深度可以用于控制流體的注射，以使得根據(jù)正被記錄的針的插入深度來確定待注射 的流體的體積。
[0170] 裝置可還包括：用于支撐針的底座和用于在其中接納底座的殼體，其中底座可相 對于殼體移動，以使得當?shù)鬃鄬τ跉んw處于第一后方位置時，針縮回殼體內(nèi)，并且當?shù)鬃?在殼體內(nèi)處于第二前方位置時，針延伸出殼體外。由于殼體可以在患者的皮膚上對準，并且 然后可以通過相對于底座移動殼體來將針插入患者的皮膚中，所以這對于用戶來說是有利 的。
[0171] 如上所述，希望實現(xiàn)流體注射的受控速率，以使得在將針插入皮膚中時，流體在針 的長度上均勻分布。流體遞送部件可包括適于以受控速率注射流體的活塞驅(qū)動部件?？梢?例如通過伺服馬達來激活活塞驅(qū)動部件。然而，可通過在軸向方向上相對于殼體移動的底 座來致動活塞驅(qū)動部件。應理解，可以提供用于流體遞送的替代裝置。因此，例如可以提供 可以被擠壓用于以受控或非受控速率流體遞送的的封閉容器來代替注射管和活塞系統(tǒng)。
[0172] 以上所描述的裝置可以用于任何類型的注射。然而，設(shè)想到它在電穿孔的領(lǐng)域中 尤其有用，并且因此它可還包括用于向針施加電壓的部件。這允許針不僅用于注射，而且還 用作電穿孔過程中的電極。這一點是尤其有利的，因為它意味著電場被施加至與所注射的 流體相同的面積上。電穿孔在傳統(tǒng)上存在的問題在于很難使電極與先前注射的流體準確對 準，且因此使用者已傾向于在較大區(qū)域注射體積大于所需的流體且在較大區(qū)域施加電場以 試圖保證注射物質(zhì)與電場之間重疊。使用本發(fā)明，可減少所注射流體的體積和所施加電場 的大小，同時實現(xiàn)電場與流體之間的良好配合。
[0173] 4.試劑盒
[0174] 本文提供了一種試劑盒，其可用于使用如上所述的接種方法治療受試者。所述試 劑盒可包含所述疫苗。
[0175] 試劑盒還可包含用于進行如上所述的接種方法和/或如何使用試劑盒的說明書。 試劑盒中所容納的說明書可附于包裝材料上或可作為包裝插入物包括在內(nèi)。雖然說明書通 常是書寫或印刷的材料，但它們不限于此類。本公開涵蓋能夠儲存說明書并且將它們傳達 給最終用戶的任何介質(zhì)。所述媒介包括但不限于電子存儲媒介(例如，磁盤、磁帶、磁片盒）、 光學媒介（例如，CD ROM)等等。本文所用，術(shù)語"說明書"可以包括提供說明書的網(wǎng)站 (internet site)的地址。
[0176] 本發(fā)明具有多個方面，所述方面通過以下非限制性實施例說明。
[0177] 5.實施例
[0178] 實施例1
[0179] MERS-CoV共有刺突抗原
[0180] 如本文中別處所述，MERS-CoV的多個菌株如圖3所示存在并且生成共有刺突抗原 以說明這多個MERS-CoV菌株之間的差異。因此，MERS-CoV共有刺突抗原來源于圖3中所列的 病毒的相應刺突抗原?；诖掏豢乖M行種系發(fā)生分析并且相對于其組分刺突抗原（圖3， 標記"MERS-HCoV-共有"表示MERS-CoV共有刺突抗原）放置MERS-CoV共有刺突抗原。MERS-CoV共有刺突抗原還含有N端免疫球蛋白E(IgE)前導序列。包含MERS-CoV共有刺突抗原的核 酸和氨基酸序列分別示于圖8A和8B中。在圖8A中，下劃線指示編碼IgE前導序列的核苷酸。 在圖8B中，下劃線指不IgE如導序列。
[0181] kozak序列被置于編碼MERS-CoV共有刺突抗原的核酸序列的5'端上且所得核酸序 列被插入pVAXl載體(Life Technologies，Carlsbad，CA)的BamHI與Xhol位點之間（圖4A，所 得構(gòu)建體命名為MERS-HCoV-WT)。此核酸序列向pVAXl載體中的正確插入是通過BamHI和 Xhol消化、接著凝膠電泳來證實（圖4B)。在圖4B中，泳道Μ指示標記，泳道1是未消化的MERS-HCoV-WT構(gòu)建體，且泳道2是消化的MERS-HCoV-WT構(gòu)建體。消化產(chǎn)生預期的片段大小，表明 MERS-HC〇V-WT構(gòu)建體包含pVAXl載體和插入的核酸序列（即，核酸序列含有kozak序列并編 碼MERS-CoV共有刺突抗原）。
[0182] 此MERS-HCoV-WT構(gòu)建體的構(gòu)建和特征也在下文的實施例9和10中描述。
[0183] 實施例2
[0184] 缺少細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的MERS-CoV共有刺突抗原
[0185] 來自冠狀病毒的刺突抗原是1型膜糖蛋白，其具有跨膜結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域又界定 刺突抗原的細胞質(zhì)和非細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。為了確定細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域在MERS-CoV刺突抗原中的位 置，基于萬維網(wǎng)的軟件被用于預測結(jié)構(gòu)域在各種MERS-CoV刺突抗原內(nèi)的位置。具體說來，基 于萬維網(wǎng)的軟件Phobius和InterProScan被用于此分析中。來自Phobius和InterProScan分 析的代表性結(jié)果分別示于圖5和6中。
[0186] 由MERS-CoV刺突抗原的此結(jié)構(gòu)域分析生成第二MERS-CoV共有刺突抗原，其缺少細 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。具體說來，編碼MERS-CoV共有刺突抗原的核酸序列（描述于實施例1中，圖8A， SEQ ID NO: 1)被修飾以插入兩個終止密碼子以使得翻譯的蛋白質(zhì)不含有細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 (即，MERS-CoV共有刺突抗原Δ CD)。
[0187] MERS-CoV共有刺突抗原Δ CD的核酸和氨基酸序列分別示于圖8C和8D中。在圖8C 中，下劃線指示編碼IgE前導序列的核苷酸且雙下劃線指示兩個插入的終止密碼子(相對于 SEQ ID N0:1，其防止細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的翻譯）。在圖8D中，下劃線指示IgE前導序列。示出所得 構(gòu)建體MERS-HCoV- Δ CD的示意圖示于圖7A中。
[0188] 用BamHI和Xhol消化MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體，接著凝膠電泳以證實插入物存在于 pVAX 1載體中（圖7B)。在圖7B中，泳道Μ指示標記，泳道1是未消化的MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體， 且泳道2是消化的MERS-HCoV-Δ⑶構(gòu)建體。消化產(chǎn)生預期的片段大小，表明MERS-HCoV-Δ⑶ 構(gòu)建體包含pVAXl載體和插入的核酸序列（即，核酸序列含有kozak序列并編碼MERS-CoV共 有刺突抗原A⑶）。
[0189] 此MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體的構(gòu)建和特征也在下文的實施例9和10中描述。
[0190] 實施例3
[0191] 表達和體液應答
[0192] 檢查上述MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體以確定相應的抗原在細胞內(nèi)表 達并且可被抗體識別。MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體連同pVAXl-起被轉(zhuǎn)染到 293T細胞中。pVAXl充當對照。
[0193] 在轉(zhuǎn)染后兩天制備細胞裂解物并且在5-15 % SDS凝膠上電泳。具體說來，將10yg、 25yg及50yg細胞裂解物加載到單獨的孔中，細胞裂解物是從用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-A CD構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293T細胞處獲得。然后使用來自用MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的小鼠的血 清進行免疫印跡分析。在從用pVAXl (圖9，泳道標記的pVAXl)轉(zhuǎn)染的293T細胞處獲得的細胞 裂解物中沒有檢測到蛋白條帶。對于MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體兩者，檢測到 對應于相應抗原的預測分子量的蛋白條帶，由此證實來自MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ⑶ 構(gòu)建體的相應抗原的表達(圖9)。
[0194] 免疫印跡還顯示來自用MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的小鼠的血清識別MERS-CoV共 有刺突抗原和MERS-CoV共有刺突抗原△ CD兩者，而不識別細胞裂解物中的其他蛋白質(zhì)（如 通過在從用pVAXl轉(zhuǎn)染的293T細胞處獲得的細胞裂解物中沒有觀察到條帶來證明）。因此， 此血清對共有刺突抗原有特異性。免疫印跡還顯示MERS-HCoV-WT構(gòu)建體是免疫原性的并產(chǎn) 生強的體液應答。
[0195] 實施例4
[0196] 實施例5-7的免疫程序
[0197] 按照圖10中示出的免疫方案，用pVAXl、MERS-HCoV-WT構(gòu)建體、或MERS-HCoV-Δ CD 來免疫C57/BL6小鼠。在第0天，向每只小鼠肌內(nèi)（IM)給予其相應的疫苗，接著電穿孔。具體 說來，用三溴乙醇-阿佛丁使每只小鼠麻醉并且使用小家畜剪剃去位于脛骨前肌(TA)肌肉 區(qū)域處的毛發(fā)以暴露皮膚。經(jīng)由IM注射以30至50yL的最終體積施用疫苗。然后將無菌 CELLECTRA 3P ID陣列穿過皮膚插入到頂注射部位周圍的肌肉中。CELLECTRA 3P ID陣列包 括三個26號針-電極，其長度為3mm并且通過模制塑料保持在一起。針-電極被連接至具有 CELLECTRA 3P應用的CELLECTRA電穿孔裝置。在陣列插入到肌肉中之后，遞送瞬時電脈沖并 且將免疫的小鼠置于其相應的籠中并仔細觀察直到蘇醒。在第14天和第28天重復以上免疫 程序。因此，在第0天的免疫是初始免疫且在第14和28天的免疫是加強免疫。在第35天，處死 小鼠并且進行如下實施例5-7中所述的免疫分析。
[0198] 實施例5
[0199] IgG抗體應答
[0200] 為了進一步檢查由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體誘導的體液免疫應答， 如上實施例4中所述使小鼠免疫。在免疫方案開始之前獲得免疫前取血并且在免疫方案的 第21天和第35天也獲得取血。免疫前取血和取血經(jīng)由眼眶后方法獲得。
[0201] 檢查來自用MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的小鼠的免疫前取血、第21天取血和第35天 取血以測定與來源于全長共有刺突抗原的肽有免疫反應性的IgG抗體的水平。具體來說，將 來自免疫前取血和每次取血的血清1:50稀釋并添加到用混合肽集合包被的ELISA板中?；?合肽集合含有來源于全長共有刺突抗原的不同部分的肽。具體來說，混合肽集合是如下實 施例6和圖15中所述6個線性肽集合1-6的等量混合物。
[0202] 如圖11A所示，MERS-HCoV-WT構(gòu)建體引發(fā)高水平的I gG抗體，所述I gG抗體與來源于 全長共有刺突抗原的肽有免疫反應性。圖11A中的數(shù)據(jù)是來自于4只小鼠的血清并且表示平 均值土平均標準誤差（SEM)。這些數(shù)據(jù)顯示(經(jīng)由免疫前取血與取血的比較)MERS-HCoV-WT 構(gòu)建體誘導約4倍至約6倍IgG抗體水平的增加，IgG抗體識別來源于全長共有刺突抗原的 肽。
[0203] 也檢查來自用MERS-HCoV-Δ⑶構(gòu)建體免疫的小鼠的免疫前取血、第21天取血及第 35天取血以測定與來源于全長共有刺突抗原的肽有免疫反應性的IgG抗體的水平。將來自 免疫前取血和每次取血的血清1: 50稀釋并添加到用混合肽集合包被的ELISA板中?；旌想?集合含有來源于全長共有刺突抗原的不同部分的肽。具體來說，混合肽集合是如下實施例6 和圖15中所述6個線性肽集合1-6的等量混合物。
[0204] 如圖11B所示，MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體引發(fā)高水平的IgG抗體，所述IgG抗體與來源 于全長共有刺突抗原的肽有免疫反應性。圖11B中的數(shù)據(jù)是來自于4只小鼠的血清并且表示 平均值土SEM。這些數(shù)據(jù)顯示(經(jīng)由免疫前取血與取血的比較)MERS-HCoV-Δ⑶構(gòu)建體誘導 約6倍至約8倍IgG抗體水平的增加，IgG抗體識別來源于全長共有刺突抗原的肽。
[0205] 概括地說，圖11A和11B中的數(shù)據(jù)顯示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體兩者 引發(fā)高水平的IgG抗體，所述IgG抗體與來源于全長共有刺突抗原的肽有免疫反應性。這些 數(shù)據(jù)還顯示MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體引發(fā)比MERS-HCoV-WT構(gòu)建體更高水平的免疫反應性IgG 抗體。因此，如通過IgG抗體應答所測量，MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體比MERS-HCoV-WT構(gòu)建體的 免疫原性更強。
[0206] 實施例6
[0207] CD8+T細胞應答
[0208] 如上所述，MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體各自誘導針對MERS-CoV刺突抗 原的顯著體液免疫應答。為了確定MERS-HCoV-WT和MERS-CoV- Δ CD構(gòu)建體是否還誘導細胞 免疫應答，如上實施例4中所述使小鼠免疫。在免疫方案第35天的處死之后，使用干擾素 -γ (IFN-γ )ELISpot測定分析CD8+T細胞的抗原特異性應答，其中肽集合的矩陣覆蓋全長共有 MERS-CoV刺突抗原的氨基酸序列。肽集合的矩陣示于圖12中并且還有利于鑒別由⑶8+T細 胞應答識別的顯性表位，CD8+T細胞應答是由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體誘導。 此肽集合矩陣來源于在MERS-HCoV-WT刺突抗原全長上的肽掃描并且所述肽是具有11個氨 基酸重疊的15聚體。
[0209] 具有此肽集合矩陣的IFN- γ ELISpot測定的結(jié)果對于分別MERS-HCoV-WT和MERS- HCoV- Δ CD構(gòu)建體示于圖13和14中。在圖13和14中，數(shù)據(jù)表示平均值土 SEM。兩個構(gòu)建體誘導 顯著的CD8+T細胞應答，其中顯性表位駐留在集合18、19、20及21(圖13和14,圓圈）中。另一 個表位駐留在集合4中。因此，這些數(shù)據(jù)表明MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體誘導對 刺突抗原肽亞群有反應性的強細胞免疫應答。
[0210] 為了進一步檢查⑶8+T細胞應答，按照以上實施例4中所述的免疫方案，用25yg的 pVAXl、MERS-HCoV-WT構(gòu)建體或MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體使小鼠免疫。用pVAXl的免疫充當對 照。在免疫方案第35天的處死之后，使用IFN-γ ELISpot測定檢查從三組小鼠分離的⑶8+T 細胞的抗原特異性應答。具體說來，用6個不同的肽集合刺激CD8+T細胞。這些肽集合1-6覆 蓋圖12的矩陣中所示的肽。
[0211] 如圖15所示，由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體誘導的細胞免疫應答的強 度是根據(jù)用于刺激從相應的小鼠分離的CD8+T細胞的肽集合而變化。對于MERS-HC〇V-WT和 MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體兩者，肽集合1引發(fā)類似于對照pVAXl的⑶8+T細胞應答，由此指示肽 集合1不含刺激CD8+T細胞的表位。肽集合1-6引發(fā)來自從用pVAXl免疫的小鼠分離的CD8+T細 胞的類似應答。
[0212] 肽集合2、3及4引發(fā)來自從用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體免疫的小鼠 分離的CD8+T細胞的相當?shù)膽?。另外，與pVAXl對照相比，當用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-A CD構(gòu)建體免疫小鼠時，對肽集合2、3及4的CD8+T細胞應答顯著更高（圖15)。具體說來，與 對照pVAXl相比，當用MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體免疫小鼠時，對肽集合2、3及4的⑶8+T細胞應 答要高約7倍。與對照pVAXl相比，當用MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫小鼠時，對肽集合2、3及4的 CD8+T細胞應答要分別高約7.5倍、約9倍及約10倍。因此，這些數(shù)據(jù)顯示MERS-HCoV-WT和 MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體不同于對照pVAXl，其誘導對肽集合2、3及4內(nèi)所含肽的顯著的⑶8+T 細胞應答。
[0213]與肽集合1、2、3及4相比，肽集合5和6引發(fā)來自從用MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體免疫的小鼠分離的CD8+T細胞的更強的應答（圖15)。另外，與對照pVAXl相比，當用 MERS-HCoV-WT或MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體免疫小鼠時，對肽集合5和6的CD8+T細胞應答顯著 更高。具體說來，與對照pVAXl相比，當用MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體免疫小鼠時，對肽集合5和6 的⑶8+T細胞應答要分別高約9倍和約11倍。與對照pVAXl相比，當用MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免 疫小鼠時，對肽集合5和6的CD8+T細胞應答要分別高約13倍和約15倍。因此，這些數(shù)據(jù)顯示 MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體不同于對照pVAXl，其誘導對肽集合5和6內(nèi)所含肽 的顯著的CD8+T細胞應答。
[0214] 概括地說，以上數(shù)據(jù)顯示用MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體的免疫誘導對 刺突抗原肽亞群有特異性和反應性的顯著的細胞免疫應答。
[0215] 實施例7
[0216] 多功能細胞免疫應答
[0217] 如上所述，MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體誘導對MERS-CoV刺突抗原有反 應性和特異性的CD8+T細胞應答。為了進一步檢查由MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建 體誘導的細胞免疫應答，檢查免疫之后T細胞的功能性。具體說來，按照以上實施例4中所述 的免疫方案，用口￥4乂1、腿1?-!1(：〇￥-11'構(gòu)建體、或腿1?-!1(：〇￥-/^0構(gòu)建體免疫小鼠。在免疫方 案第35天，將脾細胞從被處死的小鼠中分離。用含有來源于全長共有MERS-CoV刺突抗原的 肽的肽集合體外刺激分離的脾細胞。將肽集合與脾細胞一起孵育5小時。然后就IFN-γ、月中 瘤壞死因子a(TNF-a)及白細胞介素-2(IL_2)的細胞內(nèi)產(chǎn)生對細胞染色并通過熒光激活細 胞分選(FACS)來分選。
[0218] 圖16A、16B、16C及16D示出了在刺激的脾細胞群中分別產(chǎn)生IFN-γ、TNF-a、IL-2、 或IFN- γ和TNF-a兩者的CD3+CD4+T細胞的測量的出現(xiàn)率。圖16A-16D中的數(shù)據(jù)表示對于每個 組，脾細胞是從3只小鼠中分離。圖16A-16D中的數(shù)據(jù)表示平均值土 SEM。產(chǎn)生IFN- γ、TNF-a、 IL-2、或IFN- γ和TNF-a兩者的CD3+CD4+T細胞的出現(xiàn)率與對照pVAXl組相比在MERS-HCo V-WT 和MERS-HCoV- Δ⑶組中顯著增加。
[0219] 具體說來，與對照pVAXl相比，CD3+CD4+IFN- γ +Τ細胞的出現(xiàn)率在從用MERS-HCoV- △ CD和MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的小鼠中分離的脾細胞群中分別要高約6倍和約13倍（圖 16A)。與對照pVAXl相比，CD3+CD4+TNF-a+T細胞的出現(xiàn)率在從用MERS-HCoV- Δ CD和MERS-HC〇V-WT構(gòu)建體免疫的小鼠中分離的脾細胞群中分別要高約6倍和約11倍（圖16B)。與對照 pVAXl相比，CD3+CD4+IL-2+T細胞的出現(xiàn)率在從用MERS-HCoV- Δ CD和MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免 疫的小鼠中分離的脾細胞群中分別要高約12.5倍和約30倍（圖16C)。與對照pVAX 1相比，CD3 +CD4+IFN- γ +TNF-Q+T細胞的出現(xiàn)率在從用MERS-HCoV- Δ CD和MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的 小鼠中分離的脾細胞群中分別要高約7.5倍和約17.5倍（圖16D)。因此，這些數(shù)據(jù)顯示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ⑶構(gòu)建體不同于對照pVAXl，其誘導多功能的T細胞應答，其中增加 數(shù)量的CD3+CD4+T細胞產(chǎn)生 IFN- γ、TNF-α、IL-2、或 IFN- γ 和TNF-α兩者。
[0220] 圖17A、17B、17C及17D示出了在受刺激的脾細胞群中分別產(chǎn)生IFN-γ、TNF-a、IL-2、或IFN- γ和TNF-a兩者的CD3+CD8+T細胞的測量的出現(xiàn)率。圖17A-17D中的數(shù)據(jù)表示對于每 個組，脾細胞是從4只小鼠中分離。圖17A-17D中的數(shù)據(jù)還表示平均值土 SEM。與對照pVAXl相 比，產(chǎn)生IFN-γ、TNF-a、IL-2、或IFN-γ和TNF-a兩者的CD3+CD8+T細胞的出現(xiàn)率在MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD組中顯著增加。
[0221] 具體說來，與對照pVAXl相比，CD3+CD8+IFN-y+T細胞的出現(xiàn)率在從用MERS-HCoV-△ CD和MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的小鼠分離的脾細胞群中分別要高約8倍和約13倍（圖 17A)。與對照pVAXl相比，CD3+CD8+TNF-a+T細胞的出現(xiàn)率在從用MERS-HCoV- Δ CD或MERS-HC〇V-WT構(gòu)建體免疫的小鼠分離的脾細胞群中要高約7倍（圖17B)。與對照pVAXl相比，CD3+ CD8+IL-2+T細胞的出現(xiàn)率在從用MERS-HCoV- Δ CD或MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的小鼠分離的 脾細胞群中要高約2.5倍（圖17C)。與對照pVAXl相比，CD3+CD8+IFN- γ +TNF-a+T細胞的出現(xiàn) 率在從用MERS-HCoV-Δ CD和MERS-HCoV-WT構(gòu)建體免疫的小鼠分離的脾細胞群中分別要高 約50倍和約90倍（圖17D)。因此，這些數(shù)據(jù)顯示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體不同 于對照pVAXl，其誘導多功能的T細胞應答，其中增加數(shù)量的⑶3+⑶8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-a、IL-2、或IFN-γ 和TNF-a兩者。
[0222] 概括地說，上述數(shù)據(jù)顯示MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體顯著地誘導產(chǎn)生 IFN-γ、TNF-a、IL-2、或IFN-γ 和TNF-a兩者的多功會泛CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞。MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體支持比對照pVA)Q更大的CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞兩者 的多功能性。因此，共有構(gòu)建體能夠引發(fā)對MERS-CoV刺突抗原有反應性的多功能的細胞免 疫應答。
[0223] 實施例8
[0224] 中和抗體
[0225] 如上實施例5中所述，MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV-Δ CD構(gòu)建體誘導體液免疫應答。 為了進一步檢查所誘導的體液免疫應答，檢查與用口￥4乂1、腿1?-!1(：〇￥-11'構(gòu)建體、或腿1?-HCoV- △ CD構(gòu)建體免疫的小鼠有關(guān)的中和抗體水平。具體地說，將血清在最低必需培養(yǎng)基中 稀釋并在37°(：下用5(^1每孔含有100個感染性!1(：〇￥1]\1(：/2012(!11111^11(：〇別仙￥化118 Erasmus Medical Center/2012)顆粒的DMEM孵育。90分鐘之后，將病毒-血清混合物添加到 96孔平底板的單層Vero細胞（100,000個細胞/孔）中并在5^^0 2孵育箱中在37°(：下孵育5 天。每個樣品的中和抗體滴度被報道為少于50%的細胞顯示CPE的最高稀釋度。數(shù)值報告為 倒數(shù)稀釋度。所有樣品都一式兩份操作，以使得最終結(jié)果被定為兩個樣品的平均值。
[0226] 結(jié)果在以下表1中示出。用MERS-HCoV-WT和MERS-HCoV- Δ CD構(gòu)建體的免疫不同于
[0228] 對照pVAXl，其誘導顯著水平的對MERS-CoV刺突抗原有反應性的中和抗體。[0227] 表1:中和抗體的滴度。
[0229]
[0230] 概括地說，本文實施例中提供的數(shù)據(jù)表明MERS-HCoV-WT和MERS-CoV- Δ CD構(gòu)建體 是有效的疫苗，其顯著誘導對MERS-CoV刺突抗原有反應性的體液和細胞免疫應答兩者。所 誘導的體液免疫應答包括與缺少共有抗原的構(gòu)建體（即pVAX 1)相比增加的I gG抗體和中和 抗體滴度，這些抗體與MERS-CoV刺突抗原有免疫反應性。所誘導的細胞免疫應答包括與缺 少共有抗原的構(gòu)建體（即pVAXl)相比增強的CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞應答，這些細胞應答 產(chǎn)生IFN- γ、TNF-a、IL_2、或IFN- γ 和TNF-α兩者。
[0231 ] 實施例9
[0232] 實施例10-19的材料和方法
[0233] 細胞培養(yǎng)、質(zhì)粒及MERS-HCoV-刺突蛋白的表達。將HEK293T細胞(ATCC#:CRL-N268) 和 Ver〇-E6 細胞(ATCC#:CRL-1586)在具有 10%FBS 的 DMEM(DMEM)中生長。MERS-HCoV-刺突 WT 和刺突△ CD質(zhì)粒DNA構(gòu)建體編碼MERS刺突蛋白（S)的優(yōu)化的共有序列。另外，Ig重鏈ε-l信號 肽被融合至每個序列的Ν末端，替代Ν末端甲硫氨酸，其促進表達。為在小鼠中表達而在遺傳 上優(yōu)化每個基因，包括密碼子-和RNA-優(yōu)化。然后，優(yōu)化基因在巨細胞病毒立即早期(CMV)啟 動子(GenScript)的控制下被亞克隆到修飾的pVaxl哺乳動物表達載體中。這些MERS-HCoV-刺突WT和刺突Δ CD質(zhì)粒DNA構(gòu)建體的構(gòu)建也如上實施例1和2中所述。
[0234] 對于體外表達研究，使用TurboFectin 8.0試劑，按照制造商方案(OriGene)進行 轉(zhuǎn)染。簡言之，細胞在35-mm平皿中生長至80%匯合并用3yg刺突質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時收 獲細胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次，然后懸浮在細胞裂解緩沖液(Cell Signaling Techno 1 ogy)中以通過蛋白質(zhì)印跡分析驗證刺突蛋白的表達。
[0235] 小鼠和免疫。將雌性C57BL-6小鼠（6-8周齡;Jackson Laboratories)用于這些實 驗中并分成三個實驗組。根據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院（Bethesda)和University of 卩61111871￥31113(?11；[13(16]^1113，？4，1]34)的動物保護和使用委員會(]^〇]〇的指南，所有動物 都被圈養(yǎng)在溫度控制的、光循環(huán)機構(gòu)中。所有免疫都通過體內(nèi)最小侵入性EP遞送技術(shù)(MID-EP)以25μ1的總體積遞送至脛骨前肌(25yg)中。
[0236] 從免疫小鼠制備脾的單細胞懸浮液。簡言之，將來自剛施以安樂死的小鼠的脾單 獨收集在l〇ml補充有10%FBS(R10)的RPMI 1640中，然后經(jīng)由槳式摻混機(STOMACHER 80槳 式慘混機;A.J. Seward and Co .Ltd.，London,England)在高速下處理60秒。處理過的脾樣 品經(jīng)由45μπι尼龍過濾器過濾，然后在室溫下在800x g下離心10分鐘。將細胞沉淀在室溫下 再懸浮于5ml ACK裂解緩沖液(Life Technology)中5分鐘，然后添加 roS以終止反應。在室 溫下，將樣品再次在800x g下離心10分鐘。將細胞沉淀以IX 107個細胞/ml的濃度懸浮于 R10中，然后穿過45μπι尼龍過濾器，之后用于酶聯(lián)免疫吸附斑點(ELISpot)測定和流式細胞 分析中。
[0237] ELISpot分析。使用IFN-γ ELISpot測定抗原特異性T細胞應答。簡言之，用純化的 抗小鼠 IFN- γ捕獲抗體包被PVDF 96孔板(Mi 11 ipore)并在4°C下孵育24h(R&D Systems)。 次日，洗滌板并且用1%BSA和5%蔗糖阻斷2h。將來自免疫小鼠的二十萬個脾細胞添加到每 個孔中并在RPMI 1640(陰性對照）、Con A(5ug/mL;陽性對照）或特異性肽抗原(Ag) (10yg/ ml;GenScript)存在下在5%⑶2和37°C下刺激過夜。肽集合由重疊11個氨基酸的15聚體肽 (GenScript)組成。刺激24h之后，將細胞洗滌并在4°C下用生物素化抗小鼠 IFN-yAb(R&D Systems)孵育24h。洗滌板，添加鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(R&D Systems)到每個孔中 并在室溫下孵育2h。洗滌板，添加5-溴代-4-氯代-3吲哚磷酸對甲苯胺鹽和氯化硝基藍四 氮唑(色原顯色試劑;R&D Systems)到每個孔中。然后用蒸餾水沖洗板并且在室溫下干燥過 夜。通過自動ELI Spot讀數(shù)器(CTL Limited)計數(shù)斑點。
[0238] 流式細胞術(shù)和細胞內(nèi)細胞因子染色（ICCS)測定。將脾細胞添加到96孔板（1 X 106/ 孔）中并且根據(jù)制造商說明書，在蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑混合物（布雷菲德菌素 A和莫能菌素； eBioscience)存在下在37C/5%⑶2下用合并的MERS抗原肽刺激5-6h。細胞刺激混合物(加 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑）（佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸鹽(PMA)、離子霉素、布雷菲德菌素 A以及 莫能菌素;eBioscience)被用作陽性對照且R10培養(yǎng)基被用作陰性對照。然后如由制造商說 明書(BD)所述就表面和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)對所有細胞染色。簡言之，將細胞在FACS緩沖液(含有 o.l %疊氮化鈉和1%FCS的ros)中洗滌，之后用熒色物綴合的抗體進行表面染色。將細胞用 FACS緩沖液洗滌，固定并且使用BD Cytofix/Ctyoperm TM(BD)，根據(jù)制造商方案進行透化， 接著進行細胞內(nèi)染色。以下抗體被用于表面染色:LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell 染色試劑盒（Invitrogen)、CD19(V450;克隆 1D3;BD Biosciences)、CD4(FITC;克隆RM4-5; ebioscience)、CD8(APC-Cy7;克隆53-6.7 ;BD Biosciences)、CD44(A700;克隆IM7; Biolegend)。對于細胞內(nèi)染色，使用以下抗體：IFN-y (APC;克隆XMG1.2;Biolegend)、TNF-a (PE;克隆MP6-XT22;ebioscience)、CD3(PerCP/Cy5.5;克隆 145-2C11;Biolegend)、IL-2 (PeCy7;克隆JES6-SH4;ebioscience)。使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)收集所有 數(shù)據(jù)并且使用Flowjo軟件(Tree Star)和SPICE v5來分析。使用Flowjo軟件進行布爾門控 (Boolean gating)以檢查來自接種動物的T細胞的多功能性。
[0239]免疫原特異性ELISA。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)被用于測定小鼠血清的滴度。簡 言之，在4°C下將5μg/ml的純化重組人冠狀病毒-刺突蛋白2c EMC/2012(分化體A)(Sino Biological Inc.)用于包被96孔微量滴定板（Nalgene Nunc International,Naperville, IL)過夜。在用PBS中的10%FBS阻斷之后，用0.05%PBST(在PBS中的Tween20)洗滌板4次。在 l%FBS、0.2%roST中連續(xù)稀釋來自免疫小鼠的血清樣品，添加到板中，然后在室溫下孵育 lh。在0.05%PBST中再次洗滌板4次，然后在室溫下用根據(jù)制造商說明書（Sigma Aldrich) 稀釋的HRP-綴合的抗小鼠 IgG孵育lh。根據(jù)制造商說明書(SIGMAFAST;Sigma Aldrich)，通 過添加0PD(鄰苯二胺二鹽酸鹽)檢測結(jié)合酶。15分鐘之后通過添加2N H2S〇4終止反應。然后 在96微板光度計(GL0MAX; Promega)上，在450nm的光密度下對板進行讀數(shù)。一式兩份鋪板所 有樣品。終點滴度被確定為具有超過平均吸光度值至少三個正常血清加三個標準偏差的吸 光度值的最高稀釋度。
[0240]間接免疫熒光測定（IFA)。對于用MERS-HCoV-刺突質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，將載玻片用冰 冷的丙酮固定5min。然后在37°C下用在PBS中的5%脫脂乳阻斷非特異性結(jié)合30min。然后在 PBS中洗滌載玻片5min且隨后用來自免疫小鼠的血清在1:100稀釋度下孵育。lh孵育之后， 如上所述洗滌載玻片并且在37°C下用在含有l(wèi)ug/mL和4 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的 PBS中稀釋的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 IgG(Invitrogen)孵育30min。沖去未結(jié)合的抗體 之后，用Prolong Go Id抗衰減劑（Invitrogen)安裝蓋玻片，并且在共焦顯微鏡（LSM710 ; Carl Zeiss)下觀察載玻片。使用Zen軟件(Carl Zeiss)分析所得圖像。
[0241] MERS-HCoV-刺突假病毒顆粒的制備。合成密碼子優(yōu)化的共有MERS-HCoV刺突基因 并且亞克隆到pVaxl載體中。制備MERS-HCoV-刺突假病毒。具體地說，將2 X 106個HEK293T細 胞接種于1〇-〇11組織培養(yǎng)板中并使用1\11'13〇?6〇1:;[118.0(01^66116)轉(zhuǎn)染劑在約80%匯合下用 表達MERS-刺突或VSV-G蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。為了產(chǎn)生HIV/MERS-刺突假顆粒，將來自各種分化 體的l0yg pNL Luc E-R-(NIH_AIDS-Reagent Program)和10yg pVaxl-MERS-刺突共轉(zhuǎn)染到 細胞中。12小時之后，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并替換為新鮮培養(yǎng)基持續(xù)大約12h并且在37°C下孵育 細胞24-48h。收集含有假病毒粒子的培養(yǎng)基，過濾并且在SW41轉(zhuǎn)子中在40，OOOrpm下通過在 TNE緩沖液（10mM Tris、135mM NaCl、2mM EDTA，pH 8.0)中制備的20%蔗糖墊濃縮假病毒粒 子lh。將沉淀再懸浮于500yL TNE緩沖液中過夜，等分并儲存在-80°C下。
[0242] 中和測定。計算50 %組織培養(yǎng)感染性劑量（TCID5Q)并且病毒的標準濃度（即 100TCID5Q)在整個研究中被用于中和試驗，該中和試驗是用來自MERS-HCoV DNA免疫動物的 小鼠血清進行。簡言之，將小鼠血清在MEM中稀釋連續(xù)并且在37°C下用50ul每孔含有100個 感染性HCoV_EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012)顆粒的DMEM 孵育。90min之后，將病毒-血清混合物添加到96孔平底板的單層Vero細胞(100，000個細胞/ 孔）中并在5 % C02孵育箱中在37 °C下孵育5天。每個樣品的中和抗體滴度被報道為少于50 % 的細胞顯示CPE的最高稀釋度。數(shù)值報告為倒數(shù)稀釋度。所有樣品都一式兩份操作，因此最 終結(jié)果被定為兩者的平均值。中和百分比計算如下：中和百分比={目標1-PFU mAb(每個濃 度)/平均PFU陰性對照(所有濃度）}。生成中和曲線并使用GraphPad Prism 5分析。用S形劑 量-反應(可變斜率)擬合的非線性回歸被用于測定IC5Q和IC8Q。包括陽性和陰性對照血清以 驗證測定。
[0243]對于中和試驗，在4°C下將MERS-刺突假顆粒(50ng)用連續(xù)稀釋的小鼠血清預孵育 30min，然后一式三份添加到細胞中。感染后三天讀取CPE。完全地保護細胞以免一半孔中有 CPE的最高血清稀釋度被定為中和抗體滴度。對于基于熒光素酶的測定，在感染后兩天將 MERS-刺突假顆粒感染的細胞在50μ1蛋白裂解緩沖液和100μΙ熒光素酶底物中裂解。在96微 板光度計(GL0MAX;Promega Corporation)中測量焚光素酶活性。
[0244] 細胞活力測定和膜聯(lián)蛋白V/FITC測定。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5_二苯 基-四唑溴(11'1'，511^/1111以8111 &)測定細胞活力。在96孔板中在每孔2.5\103個細胞的密度 下開始培養(yǎng)。48h孵育以后，將細胞用MERS-假病毒感染并且培養(yǎng)48h。孵育之后，將15μ1 MTT 試劑添加到每個孔中并且在黑暗中在37°C下孵育4h。吸出上清液并且在37°C下伴隨溫和的 攪拌將甲晶體溶于1〇〇μ1 DMS0中持續(xù)15min。使用光度計讀數(shù)器(GL0MAX;Promega)在540nm 下測量每孔的吸光度。分析來自三個獨立實驗的數(shù)據(jù)，然后針對僅含有培養(yǎng)基(0%)和未處 理的細胞（100%)的孔的吸光度進行歸一化。用Prism GraphPad軟件，由S形劑量反應曲線 計算IC5Q值。
[0245] 使用膜聯(lián)蛋白V-FITC檢測試劑盒I(BD Biosciences)，根據(jù)制造商說明書進行膜 聯(lián)蛋白V-FITC結(jié)合測定。用MERS-假病毒感染細胞12h。胰酶消化之后對細胞計數(shù)并用冷PBS 洗滌兩次。將細胞沉淀以IX 1〇3個細胞/ml的密度再懸浮于100μΙ結(jié)合緩沖液中并在黑暗中 在室溫下用5μ1 FITC-綴合的膜聯(lián)蛋白-V和5μ1 ΡΙ孵育15min。將四百微升的lx結(jié)合緩沖液 添加到每個樣品管中，并且立即通過流式細胞儀(BD Biosciences)分析樣品。使用Flowjo 軟件(Tree Star)分析數(shù)據(jù)。
[0246]非人靈長類動物(NHP)免疫和MERS攻擊。三組恒河猴接受3個劑量（初始和2次加 強），相隔3周施用（第0、3、6周）。組1和2獼猴通過用EP裝置肌內(nèi)免疫接受總共0.5mg和2mg/ 劑量的表達MERS-刺突(N=4)疫苗的DNA疫苗。組1和2接受全長共有MERS刺突抗原。組3獼猴 接受總共2mg/劑量的對照疫苗(pVaxl)。先前確定用于這些研究中的DNA疫苗的劑量和免疫 方案在恒河猴中是最佳的。在每個劑量之后收集血液以分析血清抗體和中和及全身性T細 胞應答。用氯胺酮HCL(10-30mg/kg)肌內(nèi)麻醉動物。向每條大腿(每次接種每條大腿一個注 射部位）施用疫苗并且通過肌內(nèi)（IM)途徑遞送。DNA注射之后即刻，對IM施用施加在具有 5 2ms脈沖寬度(脈沖之間為1 s)的0.5A恒定電流下的3個脈沖。
[0247] NHP攻擊。三組恒河猴接受3個劑量(初始和2次加強），相隔3周施用（第0、3、6周）。 組1和2獼猴通過用EP裝置肌內(nèi)免疫接受總共0.5mg和2mg/劑量的表達MERS-刺突(N=4)疫 苗的DNA疫苗。在3只獼猴的組中接受總共2mg/劑量的對照疫苗(pVaxl)。先前確定有待用于 這些研究中的DNA疫苗的劑量、免疫方案在恒河猴中是最佳的。在每個劑量之后收集血液以 分析血清抗體和中和及全身性T細胞應答。用氯胺酮HCL(10-30mg/kg)肌內(nèi)麻醉動物。向每 條大腿(每次接種每條大腿一個注射部位)施用疫苗并且通過IM途徑遞送。DNA注射之后即 亥IJ，對IM施用施加在具有52ms脈沖寬度(脈沖之間為Is)的0.5A恒定電流下的3個脈沖。
[0248] 攻擊：將年齡在4-6歲的12只健康的丨旦河猴（rhesus macaques/Macaca mulatta) 通過如先前所建立的組合的氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)口及眼部途徑用總共7X106TCID50的MERS-CoV接種(Falzarano等人Nature Medicine 19,1313-1317(2013)。將動物以非盲方式隨機 分配給治療組或未治療組。
[0249] 統(tǒng)計分析。重復評估免疫應答的動物實驗至少三次并且每個小鼠的應答被記為統(tǒng) 計分析的單獨的數(shù)據(jù)點。所有數(shù)據(jù)都表示為平均值土標準偏差。通過使用來自GraphPad的 單向AN0VA檢查從動物研究和各種免疫測定獲得的數(shù)據(jù);差異被視為在p〈0.05下是顯著的。 將 GraphPad Prism V. 5.0(GraphPad Software, Inc.)用于統(tǒng)計分析。
[0250] 實施例10
[0251] MERS-HCoV刺突和刺突Δ⑶蛋白的克隆和表達
[0252] 由在GenBank-NCB I數(shù)據(jù)庫中保藏的16個刺突基因組序列生成MERS-HCoV刺突基因 的共有序列。對于免疫原設(shè)計，來自分化體A和B兩者的序列被包括在共有序列中，且通過測 量在MERS-HCoV的分化體A和B病毒株中的中和活性對所得共有序列進行測試。如圖19A所 示，MERS-HCoV-刺突共有序列的種系發(fā)生位置是在分化體B四分體的中心，這歸因于落在此 分化體內(nèi)的多重序列。此外，設(shè)計MERS刺突糖蛋白的兩個共有序列，其中一個構(gòu)建體的細胞 質(zhì)結(jié)構(gòu)域序列是完整無缺的并且第二構(gòu)建體的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是截短的。這些構(gòu)建體分別被 稱為MERS-HCoV刺突（刺突-Wt)及截短的細胞質(zhì)部分(刺突△ CD)。對于兩個免疫原，做出幾 個修飾以增加體內(nèi)表達，包括加入高效IgE前導肽序列以促進表達和mRNA輸出。然后將插入 物亞克隆到pVaxl載體中（圖19B)。這些刺突-Wt和刺突Δ⑶DNA構(gòu)建體的構(gòu)建也如上實施 例1和2中所述。
[0253]將質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染到293T細胞中，并且通過蛋白質(zhì)印跡評估刺突蛋白的表達。對來 自免疫小鼠的刺突-Wt蛋白有特異性的小鼠抗血清被用于檢測刺突蛋白由質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞 裂解物的表達。在轉(zhuǎn)染后48小時，提取蛋白裂解物。在刺突-Wt和刺突△ CD轉(zhuǎn)染的細胞中檢 測到MERS-刺突蛋白（140kDa)的強特異性條帶，而沒有在來自用對照載體(空的pVaxl質(zhì)粒） 轉(zhuǎn)染的細胞的裂解物中檢測到（圖19C)。
[0254] 另外，使用免疫熒光測定(IFA)研究轉(zhuǎn)染后刺突蛋白的表達和定位。使用小鼠刺突 抗血清的IFA顯示強信號存在于細胞質(zhì)中（圖19D)。正信號未在用pVaxl載體轉(zhuǎn)染的完整細 胞中檢測到。全長構(gòu)建體(刺突-Wt)和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域突變構(gòu)建體(刺突△ CD)兩者類似地定 位在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)。這些結(jié)果表明MERS-HCoV構(gòu)建體強烈地在哺乳動物細胞中表達的能力并 且由這些構(gòu)建體誘導的抗體可結(jié)合其靶抗原。
[0255] 實施例11
[0256] MERS-HCoV DNA構(gòu)建體的功能性表達和感染
[0257] 為了測定共有序列免疫原的功能性(例如，病毒結(jié)合和進入），開發(fā)了一種假病毒 表達系統(tǒng)以測試共有構(gòu)建體的病毒進入性質(zhì)。具體地說，MERS-HCoV假病毒顆粒通過用編碼 MERS-刺突抗原的質(zhì)粒和不表達HIV-1包膜的HIV-1熒光素酶報道基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞 而產(chǎn)生（圖20A)。通過用各種MERS-刺突基因+慢病毒基因組片段轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生顆粒。這 造成了穩(wěn)固的病毒顆粒形成。為了表征MERS-刺突介導的感染，通過在同步感染了共有 MERS-刺突假病毒的細胞中測量熒光素酶活性進行時程分析（圖20B)。如圖20C所示，對于具 有假病毒顆粒的MERS-CoV表達功能性受體的Vero細胞和A549細胞的細胞系接種產(chǎn)生強熒 光素酶信號，表明用假病毒的生產(chǎn)性感染。這些實驗示出了具有刺突蛋白的MERS假病毒粒 子的發(fā)展，其進入靶細胞并為中和抗體的檢測建立基于假病毒的抑制測定。
[0258] 實施例12
[0259] MERS-HCoV DNA疫苗在小鼠中增強的免疫原性
[0260] 為了研究共有和修飾的刺突糖蛋白的的免疫原性，分析構(gòu)建體在C57BL/6小鼠肌 內(nèi)注射之后引發(fā)免疫應答的能力。用25yg的三種DNA質(zhì)粒中的一種來免疫雌性C57BL/6小鼠 (η = 9):刺突-Wt、刺突△ CD或?qū)φ誴Vax 1載體。在每次免疫之后即刻，使用自適應電穿孔 (EP)系統(tǒng)。在兩周間隔時間下接種動物三次，并且如圖21A中所述在第三次免疫之后一周測 量免疫應答。
[0261]通過使用標準ELISpot測定來評估細胞介導免疫以監(jiān)測在用編碼MERS-刺突糖蛋 白的整個蛋白區(qū)域的肽集合進行抗原特異性體外再刺激之后來自免疫小鼠的脾細胞分泌 細胞因子的能力。第三次免疫之后一周進行ELISpot測定。如圖21B所示，來自刺突-Wt以及 免疫的刺突A CD接種的脾細胞誘導針對多個肽集合的強細胞免疫應答。集合2和5中的肽在 兩種構(gòu)建體下都表現(xiàn)出顯性。
[0262] 基于這些T細胞應答，針對覆蓋整個MERS-刺突蛋白的31個不同集合的詳細作圖。 產(chǎn)生含有具有11個氨基酸重疊并且覆蓋刺突蛋白殘基的15聚體肽的227個肽集合。使用矩 陣形式制備31個肽集合并進行測試。在用肽再刺激之后，檢測到針對刺突蛋白上的幾個區(qū) 域的強CD8+T細胞應答（圖21C和圖21D)。存在顯示超過100個斑點的15個矩陣集合，表明 MERS-刺突引發(fā)廣泛的細胞免疫應答。鑒別來自氨基酸301-334的區(qū)域中的四-肽-集合。重 要的是，刺突-Wt以及刺突-Δ⑶免疫原對覆蓋肽集合4-6、11-13、18-21及29-31的4個主要 區(qū)域有反應。然而，顯性集合似乎覆蓋18-21。這些集合包括在氨基酸307-321處 (RKAWAAFYVYKLQPL(SEQ ID N0:7))的計算機鑒別的⑶8+T-淋巴細胞免疫顯性表位，其可以 是兩種抗原的顯性應答(圖21C和21D)。
[0263] 實施例13
[0264] MERS-刺突疫苗誘導的T細胞應答是多功能的
[0265] 為了進一步確定誘導的T細胞應答的表型，評價多功能T細胞應答。多色流式細胞 術(shù)被用于測量在⑶4+和⑶8+兩種T細胞中以抗原特異性方式誘導的IFN-γ、IL-2及TNF-α的 產(chǎn)生。分泌MERS-刺突-特異性IL-2、TNF-a及IFN-γ的CD4+和CD8+T細胞的代表性流式細胞術(shù) 概況分別示于圖25Α和25Β中。構(gòu)建體產(chǎn)生來自CD8+T細胞的相當?shù)膽?全長構(gòu)建體誘導顯 著更高百分比的分泌IL-2、TNF-a及IFN- γ的CD4+T細胞。
[0266] 比較針對MERS-HCoV-刺突以及MERS-HCoV Δ CD疫苗構(gòu)建體的疫苗誘導的CD4+和 CD8+T細胞應答的強度。使用布爾門控，評價單獨的細胞產(chǎn)生多個細胞因子的能力，即疫苗 誘導的⑶4+和⑶8+T細胞應答的多功能性（圖25C和25D)。此分析顯示⑶8+T細胞應答在全長 或截短的刺突蛋白疫苗組中是類似的，然而，CD4+T細胞應答的強度在全長刺突抗原疫苗組 中更大。鑒別七個不同的刺突特異性⑶4+和⑶8+T細胞群。雖然三、雙及單功能細胞的比例在 這兩個疫苗組之間稍微變化，但在兩個組中觀察到以下趨勢：總強度有利于在CD4+以及CD8+ T細胞應答誘導中的全長構(gòu)建體。當應答接著進一步被分成7個可能的功能組合時，觀察到 在兩個接種組中的CD8+T細胞是類似的，例外的是產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細胞的誘導，其在強度 上也有利于全長構(gòu)建體(圖25C和25D)。
[0267] 實施例14
[0268] MERS-HCo V-刺突接種在小鼠中誘導充分的結(jié)合抗體應答以及中和抗體(Nab)應答
[0269] 還檢查了通過兩種構(gòu)建體對體液免疫的誘導。在小鼠中的DNA免疫之前和之后獲 得血清樣品。就結(jié)合至重組刺突抗原以及在功能性抗體研究中對抗刺突體液免疫應答進行 分析。如圖18A和22A所示，與用質(zhì)粒主鏈免疫的對照動物相比，所有的接種動物都誘導特異 性抗體應答。類似于CD4+T細胞應答，結(jié)合抗體活性在量化為終點滴度的全長免疫動物中要 更強（圖18B和22B)。由免疫小鼠產(chǎn)生的抗體在蛋白質(zhì)印跡測定中同樣結(jié)合至MERS-刺突重 組（圖22C)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明刺突DNA疫苗誘導特異性抗體產(chǎn)生以及特異性地結(jié)合 至靶刺突抗原的抗體。
[0270] 實施例15
[0271 ] 對MERS-HCo V-刺突的抗血清證明針對MERS病毒的中和活性
[0272] 用分化體A株病毒HCoV_EMC/2012(Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012)，經(jīng)由病毒中和測定評價來自用刺突-Wt或刺突Δ⑶疫苗免疫的小鼠的血清 的中和活性。從用刺突_Wt或刺突Δ⑶和陰性對照pVaxl免疫的小鼠 （η = 9/組)處收集血清。 如圖18C和22D所示，兩種疫苗誘導顯著高于來自用對照載體(pVaxl)單獨免疫的小鼠的血 清滴度的中和抗體滴度(P = 〇.0018)。類似于抗體結(jié)合測定，盡管不是顯著不同，但截短的 構(gòu)建體似乎誘導比全長構(gòu)建體水平更低的中和應答。
[0273] 由于中和測定因此時缺乏可利用的全長病毒而受限，所以利用如上所述的假顆粒 中和測定來測試抗血清中和MERS-刺突假病毒的能力。如圖22E所示，MERS-刺突-Wt接種小 鼠 （n = 4)抗血清通過50%中和Ab滴度在120至960和更高范圍內(nèi)的MERS-刺突假病毒有效地 抑制Vero細胞的感染。此外，使用基于MERS-假病毒的抑制測定，就針對MERS-CoV感染的不 同分化體的中和活性對以上血清進行評估(參見圖24D)。圖24D示出了針對MERS-CoV感染的 接種血清的中和抗體的檢測。簡言之，從接種動物處收集在第三次免疫之后兩周的獼猴血 清并且在Vero細胞中分MERS-低和高劑量兩個組進行基于MERS-CoV假病毒的抑制測定。在 接種后40小時通過熒光素酶活性量化假病毒進入。
[0274] 結(jié)果表明來自這些血清的中和抗體如通過假病毒抑制測定所測試示出了更廣泛 的抑制?？傮w說來，這些結(jié)果與從使用野生型MERS-HCoV的中和測定處獲得的結(jié)果一致并且 進一步示出了由此疫苗誘導的抗體應答的交叉保護性質(zhì)。
[0275] 實施例16
[0276] 多功能T細胞在MERS-刺突DNA接種之后的獼猴的外周血液中的產(chǎn)生
[0277] 還在臨床前非人靈長類動物模型中評價針對MERS-攻擊的疫苗功效。此研究概述 于下表2中。
[0278] 表 2
[0279]
[0280] 如實施例9 (圖23A)中所述用MERS-刺突疫苗免疫三組(低、高及對照)動物(每組四 只印度恒河猴）。為了確定MERS-刺突疫苗對T細胞應答的影響，ELISpot測定被用于對響應 于用來源于全長MERS-刺突蛋白的重疊肽集合的刺激分泌IFN- γ的接種動物的血液中的T 細胞進行計數(shù)。三次免疫之后，存在于接種動物血液和低劑量組中的總疫苗應答中的MERS-刺突特異性Τ細胞的數(shù)目是在600與1，100SFU/百萬PBMC之間，而高劑量組示出在100與 1500SFU/百萬PBMC之間，一只動物除外且大多數(shù)接種動物具有陽性IFN-γ應答。結(jié)果顯示 為堆疊組平均應答土平均標準誤差（圖23Β和23C)。這些數(shù)據(jù)表明MERS-刺突疫苗誘導與不 接受所述疫苗的動物(即pVaxl對照組)相比多功能的特異性Τ細胞應答。
[0281] 實施例17
[0282] 體液免疫應答的檢測
[0283]在從第三次免疫兩周之后的接種動物處獲得的血清中檢測到MERS-刺突特異性抗 體。首先，利用全長MERS-刺突蛋白進行MERS-刺突特異性ELISA。結(jié)合ELISA結(jié)果示于圖24A、 27A及27B中。通過ELISA，所有預接種（第0天）的血清就MERS-刺突特異性抗體而言是陰性 的。在用MERS-刺突第三次接種之后，低劑量和高劑量組顯示產(chǎn)生高滴度抗體。在具有MERS-刺突蛋白的低和高劑量疫苗免疫猴中都觀察到超過10，〇〇〇的終點MERS-刺突特異性抗體滴 度的顯著提高（圖24B)。因此，不同于沒有接受疫苗的動物（即pVaxl對照組），接受疫苗的動 物具有MERS-刺突抗原特異性體液免疫應答。
[0284] 實施例18
[0285] 在非人靈長類動物(NHP)中交叉中和抗體應答的增強的能力
[0286] 同樣從取血前及第三次免疫之后測量針對MERS-HCoV的實驗室修改儲備液的中和 抗體（Nab)。通過IM-EP，用500ug或2mg總DNA免疫猴子三次并且示出了高水平的針對活 MERS-EMC/2012分離株(分化體A)的Nab(圖24CKMERS-COV基因組在種系發(fā)生上被分為2個 分化體，分化體A和B簇。為了測試此交叉分化體中和活性，通過表達多個刺突蛋白分化體并 引發(fā)針對所有其他MERS-CoV分化體的中和活性的MERS-假病毒進行交叉中和（圖24D)。因 此，用表達共有MERS-刺突的DNA的接種導致產(chǎn)生更高的抗體滴度和針對MERS-CoV的更持久 的Nab應答?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明MERS-刺突DNA接種產(chǎn)生多克隆抗體，其不僅結(jié)合至MERS-刺 突蛋白，而且具有功能活性并引發(fā)MERS中和抗體。
[0287] 實施例19
[0288] 接種后的MERS攻擊和病理學
[0289]設(shè)計實驗來評價用MERS-CoV接種的恒河猴的臨床觀察。
[0290] 如上表2所示，在第10周用MERS鼻內(nèi)（i.η.)攻擊NHP，之后在第12周進行分析。此12 周分析包括X射線數(shù)據(jù)/病理學分析。
[0291] 用pVaxlDNA載體免疫的對照組在此期間在所有肺葉中都具有肉眼損害且在攻擊 之后第5天在較低肺葉中具有顯著的病變。對照組中的此宏觀病理學與MERS感染一致。表3 概述了動物的病理學。概括地說，MERS-刺突DNA接種動物與對照動物組相比示出了不存在 肉眼損害的改善的臨床參數(shù)，由此表明MERS-刺突DNA疫苗提供針對MERS感染的保護。
[0292] 表3:在用1與6dp i之間的MERS-CoV接種的恒河猴肺臟中的輻射圖像發(fā)現(xiàn)。在第1、 3、5及6天進行圖像和臨床觀察。
[0293]
[0294]
[0295] 1用pVaxl免疫。2用MERS-刺突(高)免疫。 3用MERS-刺突(低)免疫。
[0296] 6.條款
[0297]條款1.一種包含核酸分子的疫苗，其中：（a)所述核酸分子包含在SEQ ID NO: 1中 列出的核酸序列的全長上具有至少約90%同一性的核酸序列；或(b)所述核酸分子包含在 SEQ ID N0:3中列出的核酸序列的全長上具有至少約90%同一性的核酸序列。
[0298]條款2.條款1的疫苗，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1中列出的核酸序列。 [0299]條款3.條款1的疫苗，其中所述核酸分子包含SEQ ID N0:3中列出的核酸序列。 [0300]條款4.條款1的疫苗，其還包含：（a)包含在SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列的全 長上具有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽;或(b)包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸 序列的全長上具有至少約90 %同一性的氨基酸序列的肽。
[0301]條款5.條款1的疫苗，其中所述核酸分子包含表達載體。
[0302]條款6.條款1的疫苗，其中所述核酸分子并入病毒顆粒中。
[0303]條款7.條款1的疫苗，其還包含藥學上可接受的賦形劑。
[0304]條款8.條款1的疫苗，其還包含佐劑。
[0305]條款9.一種包含核酸分子的疫苗，其中：（a)所述核酸分子編碼包含在SEQ ID N0: 2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽;或(b)所述核酸 分子編碼包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的氨基 酸序列的肽。
[0306]條款10.條款9的疫苗，其中所述核酸分子編碼包含SEQ ID N0:2中列出的氨基酸 序列的妝。
[0307]條款11.條款9的疫苗，其中所述核酸分子編碼包含SEQ ID N0:4中列出的氨基酸 序列的妝。
[0308]條款12.條款9的疫苗，其還包含：（a)包含在SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列的 全長上具有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽;或(b)包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基 酸序列的全長上具有至少約90 %同一性的氨基酸序列的肽。
[0309]條款13.條款9的疫苗，其中所述核酸分子包含表達載體。
[0310]條款14.條款9的疫苗，其中所述核酸分子并入病毒顆粒中。
[0311]條款15.條款9的疫苗，其還包含藥學上可接受的賦形劑。
[0312]條款16.條款9的疫苗，其還包含佐劑。
[0313]條款17.-種核酸分子，其包含SEQ ID N0:1中列出的核酸序列。
[0314]條款18.-種核酸分子，其包含SEQ ID N0:3中列出的核酸序列。
[0315]條款19.一種肽，其包含SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列。
[0316]條款20.-種肽，其包含SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列。
[0317]條款21.-種包含抗原的疫苗，其中所述抗原是由SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3編 碼。
[0318]條款22.條款21的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO: 1編碼。
[0319]條款23.條款21的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID N0:3編碼。
[0320] 條款24.條款21的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的 氨基酸序列。
[0321] 條款25.條款24的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列。 [0322]條款26.條款24的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列。 [0323]條款27.-種包含肽的疫苗，其中（a)所述肽包含在SEQ ID N0:2中列出的氨基酸 序列的全長上具有至少約90%同一性的氨基酸序列；或(b)所述肽包含在SEQ ID N0:4中列 出的氨基酸序列的全長上具有至少約90 %同一性的氨基酸序列。
[0324] 條款28.條款27的方法，其中所述肽包含SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列。
[0325] 條款29.條款27的方法，其中所述肽包含SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列。
[0326]條款30.-種在有此需要的受試者中誘導針對中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的免疫應答的方法，所述方法包括向所述受試者施用條款1、9、21或27的疫苗。
[0327] 條款31.條款30的方法，其中施用包括電穿孔和注射中的至少一種。
[0328] 條款32.-種保護有此需要的受試者以免感染中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的方法，所述方法包括向所述受試者施用條款1、9、21或27的疫苗。
[0329]條款33.條款32的方法，其中施用包括電穿孔和注射中的至少一種。
[0330]條款34.-種治療有此需要的受試者的中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的方 法，所述方法包括向所述受試者施用條款1、9、21或27的疫苗，其中所述受試者由此對一種 或多種MERS-CoV菌株有抗性。
[0331 ]條款35.條款34的方法，其中施用包括電穿孔和注射中的至少一種。
[0332] 應理解先前詳細描述和隨附實施例僅是說明性的，并且不應視為對本發(fā)明的范圍 的限制，所述范圍僅由隨附權(quán)利要求和它們的等效物限定。
[0333] 所公開的實施方案的各種改變和改進對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在不偏離 其本質(zhì)和范圍的前提下，可進行與包括但不限于本發(fā)明的化學結(jié)構(gòu)、取代基、衍生物、中間 體、合成、組合物、制劑和/或使用方法有關(guān)的此類改變和改進。
【主權(quán)項】
1. 一種包含核酸分子的免疫原性組合物，其中： (a) 所述核酸分子包含在SEQ ID NO: 1中列出的核酸序列的全長上具有至少約90%同 一性的所述核酸序列;或 (b) 所述核酸分子包含在SEQ ID NO: 3中列出的核酸序列的全長上具有至少約90%同 一性的所述核酸序列。2. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1中列出的 所述核酸序列。3. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID N0:3中列出的 所述核酸序列。4. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其還包含： (a) 包含在SEQ ID NO: 2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的所述 氨基酸序列的肽;或 (b) 包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的所述 氨基酸序列的肽。5. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子包含表達載體。6. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子并入病毒顆粒中。7. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其還包含藥學上可接受的賦形劑。8. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其還包含佐劑。9. 一種包含核酸分子的免疫原性組合物，其中： (a) 所述核酸分子編碼包含在SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約 90 %同一性的所述氨基酸序列的肽;或 (b) 所述核酸分子編碼包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約 90 %同一性的所述氨基酸序列的肽。10. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子編碼包含SEQ ID N0:2中 列出的所述氨基酸序列的所述肽。11. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子編碼包含SEQ ID N0:4中 列出的所述氨基酸序列的所述肽。12. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其還包含： (a) 包含在SEQ ID NO: 2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的所述 氨基酸序列的肽;或 (b) 包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性的所述 氨基酸序列的肽。13. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子包含表達載體。14. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中所述核酸分子并入病毒顆粒中。15. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其還包含藥學上可接受的賦形劑。16. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其還包含佐劑。17. -種核酸分子，其包含SEQ ID NO: 1中列出的核酸序列。18. -種核酸分子，其包含SEQ ID NO:3中列出的核酸序列。19. 一種肽，其包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。20. -種肽，其包含SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列。21. -種包含抗原的免疫原性組合物，其中所述抗原是由SEQ IDNO:l或SEQ ID NO:3編 碼。22. 如權(quán)利要求21所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是由SEQ ID NO: 1編碼。23. 如權(quán)利要求21所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是由SEQ ID N0:3編碼。24. 如權(quán)利要求21所述的免疫原性組合物，其中所述抗原包含SEQ ID N0:2或SEQ ID NO :4中列出的氨基酸序列。25. 如權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述抗原包含SEQ ID N0:2中列出的所 述氨基酸序列。26. 如權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述抗原包含SEQ ID N0:4中列出的所 述氨基酸序列。27. -種包含肽的免疫原性組合物，其中 (a) 所述肽包含在SEQ ID N0:2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性 的所述氨基酸序列;或 (b) 所述肽包含在SEQ ID N0:4中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約90%同一性 的所述氨基酸序列。28. 如權(quán)利要求27所述的免疫原性組合物，其中所述肽包含SEQID NO: 2中列出的所述 氨基酸序列。29. 如權(quán)利要求27所述的免疫原性組合物，其中所述肽包含SEQID NO:4中列出的所述 氨基酸序列。30. -種誘導有此需要的受試者中針對中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的免疫應 答的方法，所述方法包括向所述受試者施用如權(quán)利要求1、9、21或27所述的免疫原性組合 物。31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中施用包括電穿孔和注射中的至少一種。32. -種保護有此需要的受試者以免感染中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的方 法，所述方法包括向所述受試者施用如權(quán)利要求1、9、21或27所述的免疫原性組合物。33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中施用包括電穿孔和注射中的至少一種。34. -種治療有此需要的受試者的中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的方法，所述 方法包括向所述受試者施用如權(quán)利要求1、9、21或27所述的免疫原性組合物，其中所述受試 者由此對一種或多種MERS-CoV菌株有抗性。35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中施用包括電穿孔和注射中的至少一種。
【文檔編號】A61K39/12GK105939730SQ201480074433
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年11月26日
【發(fā)明人】大衛(wèi)·B·韋納, 卡魯皮亞·穆蘇馬尼, 尼蘭詹·Y·薩爾德賽
【申請人】賓夕法尼亞大學理事會, 艾諾奧醫(yī)藥品有限公司