用于器官的離體免疫調(diào)節(jié)和/或保存的組合物和方法，方法及用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)離體器官——即從供體摘除，隨后移植到受體中的器官——的細胞中的MARCH?I、MHC II和/或CD86的組合物。在一個實施方案中，所述組合物包括一種或多種器官保存液與Hsp。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包括Hsp70和/或一種或多種衍生自Hsp70的合成肽。本發(fā)明的組合物在提供器官保存的同時還減少器官的排斥反應(yīng)，從而提供許多優(yōu)勢并解決多種相關(guān)的技術(shù)問題：不但保持器官的使用期限，而且在器官中開始了抑制急性排斥反應(yīng)的過程；延長器官的體內(nèi)使用期限；在受體中具有局部免疫調(diào)節(jié)作用；通過需要更少的免疫抑制藥物而對移植受體的生命質(zhì)量產(chǎn)生間接影響；誘導調(diào)節(jié)性T細胞(其為公認的免疫抑制劑)的活性，減少移植物中MHC分子的表達，減少受體的淋巴結(jié)中的同種異體反應(yīng)性表達，并延長受體中的移植物的存活。
【專利說明】用于器官的離體免疫調(diào)節(jié)和/或保存的組合物和方法，方法及 用途
[0001 ] 相關(guān)專利申請
[0002] 本專利申請要求于2014年1月30日提交的巴西專利申請BR 10 2014 002362 3的 優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及免疫學、藥學、化學和醫(yī)學的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了在器官細 胞--即從供體摘除，隨后移植到受體中的器官細胞--中離體調(diào)節(jié)MARCH-1、MHC II和/ 或CD86的組合物。在一個實施方案中，所述組合物包括一種或多種器官保存液以及Hsp。在 另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包括Hsp70和/或一種或多種衍生自Hsp70的合成肽。本 發(fā)明的組合物在提供器官保存的同時還減少了器官的排斥反應(yīng)，此外提供許多優(yōu)勢并解決 多個相關(guān)的技術(shù)問題:不但保持器官的使用期限，而且在器官中開始了抑制急性排斥反應(yīng) 的方法;延長器官的體內(nèi)使用期限;在受體中具有局部免疫調(diào)節(jié)作用；當需要更少的免疫抑 制藥物時，對受體的生命質(zhì)量間接產(chǎn)生影響;誘導調(diào)節(jié)性T細胞(其為公認的免疫抑制性的） 的活性，減少移植物中的MHC分子表達，降低受體的淋巴結(jié)中的同種異體反應(yīng)性 (alloreactive)應(yīng)答，延長受體中的移植物存活。本文中還公開了用于器官保存組合物中 的MARCH-I、MHC II和/或⑶86調(diào)節(jié)劑的篩選方法和制備此類組合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 器官移植的成功取決于維持器官存活的免疫抑制療法以及適當?shù)乇４婀w器官 的技術(shù)。無論器官的來源如何，被移植的所有器官在摘除和實施期間都需要保存。
[0005] 目前，大部分的中心使用在冷凍環(huán)境中的靜態(tài)貯存(靜態(tài)冷凍保存一一CS)用于器 官保存。該器官保存技術(shù)基于真核細胞的代謝率在它們所處的溫度降低l〇°C時下降兩倍到 三倍的事實。所述技術(shù)需要快速排除血液、快速冷卻器官以及在保存液和器官之間的平衡。 但是，保存條件是極其嚴苛（stressful)且損害活組織的，因為它們可引起由缺血(保存低 體溫條件）和再灌注（在供體中的移植）造成的損害。在低體溫條件中的保存技術(shù)已經(jīng)于 1952年被Lefevbre和Nizet在法國首次應(yīng)用。從那以后，在器官保存中僅取得了少許進展。
[0006] 目前，最常用的溶液是自1987年開始使用的威斯康星大學（University of Wi sconsin，UW)溶液。但是有其他使用的溶液，例如組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽(HTK)溶液、 Celsior溶液、Euro-Collins溶液以及其他的溶液。根據(jù)器官條件，目前最常用的保存液保 存內(nèi)臟器官平均長達48小時。但是它們不具有免疫調(diào)節(jié)活性。
[0007] 除了適當?shù)谋４?，處理移植的人們面臨另一個更廣的領(lǐng)域:受體的免疫系統(tǒng)。移植 物排斥反應(yīng)是涉及先天的和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一系列復雜和協(xié)調(diào)的相互作用的結(jié)果。排斥 反應(yīng)的分子基礎(chǔ)為，T細胞識別蛋白范圍（在這種情況下，來自與受體在遺傳上不同的生物 體的同種異體抗原）的多形態(tài)形式的能力。當特異性T細胞識別該同種異體抗原時，特異性T 細胞將增殖，分化為效應(yīng)細胞并且將迀移至移植物處，在那里它們將引起組織破壞(排斥反 應(yīng)）。在移植后的第一天，受體單核細胞開始通過淋巴管進入到迀移皮膚的移植的組織和樹 突細胞(DC)中，并浸潤受體的引流淋巴結(jié)。在引流淋巴結(jié)中，皮膚的DC通過以下兩種機制具 有來自供體的抗原：（a)直接方式，其中T細胞識別在供體DC中的MHC的完整抗原；（b)間接方 式，其包括通過被呈遞到受體的DC表面上的MHC分子中的供體的T細胞肽進行的確認。幾天 后，注意到在皮膚組織中單核細胞的大量浸潤，并且效應(yīng)T細胞(⑶4+和⑶8+)開始從鄰近組 織向移植物橫向迀移。最終，CD8+T細胞(細胞毒性的）破壞供體外來細胞，導致壞死并且導 致排斥反應(yīng)的最后階段。
[0008] MARCH-I為膜相關(guān)蛋白并且將泛素分子結(jié)合至MHC II分子和⑶86分子。MHC II分 子和CD86分子的這種泛素化導致其降解，以及隨后在抗原呈遞細胞(例如樹突細胞(DC))的 細胞膜中的數(shù)量/群落(title)減少。當DC為激活狀態(tài)時，它們減少MARCH-I表達并且細胞膜 中的MHC II水平和CD86水平增加。另一方面，當這些細胞被誘導時，相反的情況發(fā)生。當在 移植的器官中存在的激活的DC迀移至受體的引流淋巴結(jié)中，與T細胞相互作用并激活它們 時，急性排斥反應(yīng)開始。該激活需要由DC表達的MHC II分子和CD86分子的存在。一旦被激 活，這些T細胞回到移植體中，識別其為"奇怪"的某物并開始通過誘導細胞死亡來降解它， 引起器官的排斥反應(yīng)。歷史上，在臨床中用抑制T細胞激活和增殖的藥物來處理器官排斥反 應(yīng)。但嚴重的技術(shù)問題在于，由于迄今為止缺少替代物，治療在患者中進行且從未在供體器 官中進行，這引起全身反應(yīng)和不希望的副作用以及其他缺點。本發(fā)明提供針對這些問題的 創(chuàng)新方案。
[0009] 目前用于治療處理和處理器官排斥反應(yīng)的免疫抑制藥物關(guān)注的是同種異體反應(yīng) 性細胞激活的抑制。然而，它們存在一些與誘導嚴重副作用相關(guān)的問題。在嚴重副作用中， 本發(fā)明人可以指出：高血壓，其可能導致患者需要額外的藥物來對其進行控制的情況;腎毒 性，有高達40%的患者發(fā)生并經(jīng)常迫使醫(yī)生提供欠佳劑量的藥物以限制毒性;對中樞神經(jīng) 系統(tǒng)的影響，例如:寒戰(zhàn)，頭痛，抑郁，感覺異常，視力模糊，病毒、細菌或真菌感染的風險增 加，腫瘤發(fā)生的風險增加，缺乏食欲，惡心;一些患者對藥物有耐藥性，幾種藥物的組合是必 需的；藥物的高額費用；一些藥物顯示與其他藥物（例如抗生素類、非留體抗炎藥、抗癲癇 藥、抗真菌藥)以及免疫法(例如德國麻疹和脊髓灰質(zhì)炎)的不利相互作用。
[0010]因此，存在極大的需求來開發(fā)比可獲得的藥物具有更低副作用的、或降低它們使 用的必要性的新的藥物或干預。此外，新的干預可作為對所使用的治療方法有耐受性的患 者的替代性療法。本發(fā)明解決了該問題和另一個問題，在處理對器官的排斥反應(yīng)方面提供 了較高的潛力。
[0011]熱休克或應(yīng)激蛋白（Hsp)于1962年首次記載并且它們形成由應(yīng)激信號--包括環(huán) 境應(yīng)激(如熱）和病理生理狀態(tài)(如發(fā)熱、炎癥和感染)一一誘導的蛋白組，以廣泛方式分布 在原核生物和真核生物之間。Hsp可根據(jù)它們的分子量分為五個主要的家族：Hsp100 、 Hsp90、HSp70、HSp60和sHsp(小熱休克蛋白）并且可存在于細胞的細胞液、細胞膜、細胞核、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中。這些蛋白主要作為分子伴侶發(fā)揮作用一一在細胞腔隙之間轉(zhuǎn)運蛋白 質(zhì)，幫助所形成的蛋白的折疊或經(jīng)歷損傷的蛋白的重折疊，保護其他蛋白的聚集(除了將蛋 白定向到降解途徑)并幫助蛋白復合體溶解。在生理條件下，細胞內(nèi)的Hsp廣泛分布并且當 暴露于應(yīng)力刺激時保持其他細胞蛋白的功能完整性。該保護功能使得一些研究小組試圖誘 導Hsp增加，作為保護待被移植的器官免受缺血損傷和再灌注的嘗試。然而，該數(shù)據(jù)不是非 常有希望。
[0012] 盡管Hsp被認為是細胞內(nèi)蛋白，它們可被移動到細胞質(zhì)膜或釋放到細胞外環(huán)境中， 與來自免疫系統(tǒng)的細胞相互作用并改變其功能。對在實驗模型中和患者中的Hsp的應(yīng)答免 疫的分析已表明Hsp的促進免疫調(diào)節(jié)的能力。Hsp70家族成員顯示出在關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、肺纖 維化和腦損傷的動物模型中具有保護和抗炎作用。但是Hsp70將如何調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答?首要想 法關(guān)注的是在免疫抑制劑分布(profile)中的先天免疫系統(tǒng)的細胞調(diào)節(jié)。這些研究表明了 在樹突細胞、骨髓來源的抑制性細胞(MDSCs)、單核細胞和巨噬細胞中的這種分布。其他想 法關(guān)注的是通過Hsp70對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。提出的抗炎機制為特異性針對Hsp70肽的 調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的誘導。Tregs在抑制過度的并可造成組織損傷的效應(yīng)因子免疫應(yīng)答 方面中具有重要作用。這些細胞具有抑制效應(yīng)T細胞(⑶4+和CD8+)在引流淋巴結(jié)中增殖的 能力并且它們也負責控制其體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。如在移植的情況下，Tregs可用于控制針對在宿主中 引入的非正確抗原的應(yīng)答，并在許多實驗模型中促進同種異體移植物的無限期存活 (indefinite survival)〇
[0013] 在器官捐獻中建立免疫抑制劑策略的局限性已經(jīng)使得本發(fā)明人在器官的離體處 理中開發(fā)新的方法，作為預防并限制在移植組織中的炎性應(yīng)答的體內(nèi)平衡機制的新方法。
[0014] 在科學讀物和專利讀物中的研究已經(jīng)指出一些文獻與本發(fā)明部分相關(guān)，所述文獻 記載于以下文獻中。
[0015] 文獻W0 2001/017554記載了使用將被給予患者的熱休克蛋白（Heat shock pro te ins-Hsp)治療排斥反應(yīng)的方法和組合物。所述文獻記載了可在器官移植前、移植過程 中和移植后使用的組合物，包括減少其排斥反應(yīng)，所述組合物優(yōu)選地以藥物組合物的形式。 在其他技術(shù)原因中，本發(fā)明與所述文獻的區(qū)別在于，用于器官的離體免疫調(diào)節(jié)和/或保存的 肽和方法，所述方法包括施用至少一種Hsp70蛋白片段和/或Hsp與一種或多種器官保存液 的組合。
[0016] 文獻US 5.348.945涉及對抗在應(yīng)激下組織死亡的方法并且該應(yīng)激誘導內(nèi)源性 Hsp70的響應(yīng)。本發(fā)明與所述文獻的區(qū)別在于，當處理呈遞抗原的免疫細胞以隨后用經(jīng)處理 的細胞處理受體，調(diào)節(jié)排斥反應(yīng)時，本發(fā)明沒有抗原未綴合至Hsp( it is not conjugated no antigen to HSP)。此外，本發(fā)明的區(qū)別的事實在于:不以隨后的細胞療法或與移植同時 發(fā)生的細胞療法為目的來處理呈遞抗原的免疫細胞。在本發(fā)明中，免疫細胞被離體處理、但 是在自身待被移植的器官內(nèi)。
[0017] 文獻US 2006/0276389 A1涉及熱休克蛋白（Hsp)或熱休克蛋白樣蛋白（HSPLP)，其 作為抑真菌劑(fugetatic agent)或趨化陰性（chemiotactic negative)發(fā)揮作用。在其他 技術(shù)原因中，本發(fā)明與所述文獻的區(qū)別在于，不涉及Hsp作為抑真菌劑或趨化陰性，也不具 備這些特性的實驗證據(jù)。
[0018] 文獻W0 2008/47243 A2公開了以向細胞發(fā)送死亡抑制劑信號的方式將Hsp70與另 一種蛋白的轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域融合的策略。在其他技術(shù)原因中，本發(fā)明與該文獻的區(qū)別在于，未提 供蛋白融合。此外，本發(fā)明不涉及自身的細胞凋亡問題，但是涉及對于器官移植的急性排斥 反應(yīng)的離體問題。
[0019] 文獻US 2002/0111314 A1涉及提高在細胞中的熱休克蛋白水平的方法。在其他技 術(shù)原因中，本發(fā)明與所述文獻的區(qū)別在于，不涉及Hsp70的胞內(nèi)增多，但是涉及用Hsp70進行 的胞外處理，以及其他所有構(gòu)成待被移植的器官的細胞進行的胞外處理。
[0020] 文獻EP 2040539 B1涉及具有延長細胞器官壽命的營養(yǎng)素和輔因子，以及用于急 性排斥反應(yīng)的免疫抑制的腎上腺皮質(zhì)激素類的組合物。在其他技術(shù)原因中，本發(fā)明與所述 文獻的區(qū)別在于，沒有現(xiàn)有技術(shù)中的典型的器官保存液。此外，本發(fā)明的組合物不包含腎上 腺皮質(zhì)激素類。
[0021] 本發(fā)明人作為共同作者的文章 "Prolonged Survival of Allografts Induced by Mycobacterial Hsp70 Is Dependent on CD4+CD25+ Regulatory T Cells" 公開了 Hsp70(以與調(diào)節(jié)性T細胞的連接形式)在移植模型中的免疫調(diào)節(jié)作用。所述研究涉及研究 Hsp70在實驗模型（一個腫瘤模型和另一個非血管化組織）中抑制同種異體移植物系統(tǒng)排斥 反應(yīng)的能力，在實驗模型中用Hsp70進行的處理明顯暫時延長了移植物存活或腫瘤細胞存 活。在該文章中，提供了Hsp70蛋白在僅一種非血管化組織和腫瘤細胞的排斥反應(yīng)中的免疫 抑制作用的證據(jù)。然而，沒有引證或甚至建議關(guān)于減少受體的同種異體反應(yīng)性的內(nèi)容。另 外，盡管所述文章建議了在器官移植處理中使用Hsp70,公開或建議了在任何時刻用于在器 官的細胞中離體調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或CD86的組合物。也沒有進行用真實的保存組合 物實施的實驗。
[0022] 因此，所指出的上述文獻均沒有記載離體免疫調(diào)節(jié)方法和/或器官保存的方法，所 述方法包括施用有效劑量的至少一種本發(fā)明公開的分子實體，也沒有記載用于移植器官離 體免疫調(diào)節(jié)和保存的組合物，其包括一種或多種器官保存液（例如，Winscos in溶液 (Viaspan? )或Euro-Collins溶液（RENOGRAF? )等）與在已從供體摘除的-- 即離體--器官細胞中的MARCH-I、MHC II和/或⑶86的一種或多種調(diào)節(jié)分子(modelling molecule)。因此，本發(fā)明提供了需要離體保存的器官中的免疫系統(tǒng)細胞，其確實保持誘導 形式，減少了所有的特異性效應(yīng)因子應(yīng)答。
[0023] 根據(jù)研究過的文獻示出的內(nèi)容，沒有發(fā)現(xiàn)預見或建議本發(fā)明的教導的文獻，（在本 發(fā)明人看來)本文提出的方案相對于現(xiàn)有技術(shù)具有新穎性和創(chuàng)造性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中涉及的難以保持移植器官可行性的問題，以及涉及當減 少或避免在移植受體患者中使用免疫抑制劑時難以在移植后限制其急性排斥反應(yīng)的問題。 本發(fā)明的不同目的的共同發(fā)明構(gòu)思包括用調(diào)節(jié)已經(jīng)從供體摘除的（即離體的)MARCH-I、MHC II和/或CD86器官細胞來代替調(diào)節(jié)器官受體的細胞的策略。本發(fā)明所取得的成果表明，根據(jù) 由MARCH-I、MHC II和/或CD86調(diào)節(jié)提供的急性排斥反應(yīng)抑制作用，該策略延長了移植器官 體內(nèi)使用期限，這顯然不同于已知的【背景技術(shù)】并且因此具有未實現(xiàn)的實質(zhì)性技術(shù)優(yōu)勢。本 發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思以若干方式實施，它們都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0025] 本發(fā)明的目的之一是調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或⑶86的物質(zhì)用于制備用于待被移 植的器官細胞的離體保存和免疫調(diào)節(jié)的組合物的用途。
[0026]本發(fā)明的另一目的為器官的保存組合物，其包括：
[0027]-一種或多種器官保存液;和
[0028]-在待被移植（即來自供體并已經(jīng)處于離體狀態(tài)）的器官細胞中調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或⑶86的物質(zhì)。
[0029] 在一個實施方案中，所述器官保存液選自Winscosin溶液（Viaspan? ) ;Euro_Col 1 ins (RENOGRAF?);組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽(HTK)溶液-Custodiol?; Celsior? 冷凍貯存液;或它們的組合。
[0030] 在一個實施方案中，調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或⑶86的物質(zhì)或分子實體為Hsp(熱 休克蛋白），其選自Hsp70;Hsp60;Hsp40;Hsp90;Hspl 10;它們的片段或任何那些分子實體的 組合。
[0031 ] 在一個實施方案中，Hsp(Dnak)為結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)的重組蛋白。在 一個實施方案中，蛋白Hsp70的片段為至少一種肽，其選自被定義為SEQ ID N〇:01、SEQ ID No:02、SEQIDNo:03、SEQIDNo:04、SEQIDNo:05、SEQIDNo:06和SEQIDNo:07的肽。
[0032] 本發(fā)明還提供了制備用于移植器官細胞的離體免疫調(diào)節(jié)組合物的方法，所述方法 包括將一種或多種器官保存液與至少一種MARCH-I量、MHC II量和/或⑶86量的調(diào)節(jié)性分子 實體混合的步驟。
[0033] 本發(fā)明的另一目的為移植器官的離體免疫調(diào)節(jié)的方法，所述方法包括將器官細胞 與一種或多種調(diào)節(jié)MARCH-1、MHC II和/或CD86的物質(zhì)離體接觸的步驟。
[0034] 本發(fā)明的另一目的為篩選適用于制備用于移植器官的離體保存和/或免疫調(diào)節(jié)的 組合物的新分子實體的方法，所述方法包括以下步驟：
[0035]-第一步:將一種或多種分子實體與具有選自MARCH-I、MHC II、⑶86或它們的組合 的蛋白的細胞接觸；
[0036] -第二步：評估在以這種方式處理的細胞中MARCH-I、MHC II和/或⑶86的量的調(diào) 節(jié);和
[0037] -第三步:選擇在以這種方式處理的細胞中具有MARCH-I、MHC II和/或⑶86的量調(diào) 節(jié)的較大潛力的分子實體。
[0038]在一個實施方案中，所述方法為其中具有選自MARCH-I、MHC II、CD86或它們的組 合的蛋白的所述細胞為樹突細胞或自身待被移植的器官的細胞。
[0039] 在一個實施方案中，所述方法為其中評估細胞中的MARCH-I、MHC II和/或⑶86的 量的步驟是通過用對轉(zhuǎn)錄自編碼MARCH-I、MHC II和/或⑶86的基因的mRNA的實時PCR進行 的測量來完成。
[0040] 在一個實施方案中，所述方法還包括在與MARCH-I、MHC II和/或⑶86的量的所述 調(diào)節(jié)分子實體接觸后，體內(nèi)評估離體器官細胞的細胞可行性和/或細胞損傷的存在的步驟。
[0041] 本發(fā)明具有若干優(yōu)勢并解決了若干相關(guān)的技術(shù)問題：不僅保持了器官的使用期 限，而且開始了在器官中抑制急性排斥反應(yīng)的方法;延長了器官的體內(nèi)使用期限;在受體中 具有局部免疫調(diào)節(jié)作用；當需要更少的免疫抑制藥物時對移植受體的生命質(zhì)量間接產(chǎn)生影 響;誘導調(diào)節(jié)性T細胞(其被公認為免疫抑制性的)活性，減少移植物中的MHC分子表達，減少 受體的淋巴結(jié)中的同種異體反應(yīng)性性表達，延長受體中的移植物存活。
[0042] 本領(lǐng)域技術(shù)人員和對所述內(nèi)容感興趣的公司會立即考慮本發(fā)明的這些方面和其 他方面，并將在下文中重新對其進行足夠詳細的描述。
【附圖說明】
[0043] 圖1示出了本發(fā)明的一種實施方案，其中用一定劑量的Hsp70進行的移植物處理增 加了在鼠模型中皮膚的同種異體移植物接受度。
[0044]圖2A示出了通過表達I-Ab，在移植后24h或96h在受體DLN中的供體細胞篩選。
[0045]圖2B示出了通過表達GFP，在移植后24h或96h在受體DLN中的供體細胞篩選。
[0046]圖2C示出了通過表達I-Ab，在受體DLN中篩選的來自供體的⑶llc+細胞的代表性 點圖（dot plot)和百分數(shù)。
[0047]圖2D示出了通過表達GFP，在受體DLN中篩選的來自供體的⑶1 lc+細胞的代表性點 圖和百分數(shù)。
[0048]圖2E示出了在移植的動物DLN中篩選的細胞I-Ab+中的CCR7的表達。
[0049]圖2F示出了在移植的動物DLN中篩選的GFP+細胞群中的 [0050] CCR7 的表達。
[00511圖3示出了本發(fā)明的一個實施方案的評價結(jié)果，其中Hsp70抑制在不同DC中的MHC II表達。
[0052]圖4示出了本發(fā)明的一個實施方案的評價結(jié)果，其中Hsp70部分抑制活性BMDC中的 MHC II表達。
[0053]圖5示出了本發(fā)明的一個實施方案的評價結(jié)果，其中Hsp70抑制活性BMDC中的CD86 表達。
[0054]圖6示出了本發(fā)明的一個實施方案的評價，其中用Hsp70進行的處理抑制了供體DC 而非受體DC的MHC II表達。
[0055] 圖7示出了接受用Hsp70處理的移植物的小鼠 DLN顯示出⑶4+和⑶8+T細胞增殖減 少。
[0056]圖8示出了用經(jīng)Hsp70處理的BMDC進行的受體處理可增加皮膚的同種異體移植物 接受度。
[0057]圖9示出了在用Hsp70進行的移植物處理后，從移植物迀移到受體DLN的DC亞型分 析。
[0058] 圖10示出了證實細胞表型從移植物迀移到受體DLN的實驗結(jié)果:⑶1 lc+Langerin+ CDllb-CD103+〇
[0059] 圖11示出了Hsp誘導的IL-10的產(chǎn)生導致MARCH-1表達增加，并且這對于減少MHC II表達是重要的。
[0060] 圖12示出了TLR2對于產(chǎn)生IL-10、對于降低MHC II表達和對于抑制急性排斥反應(yīng) (所有這些均通過Hsp70誘導)是必需的。
[0061 ] 圖13示出了ERK和STAT3對于減少Hsp70誘導的MHC II表達是必需的實驗結(jié)果。
[0062] 圖14示出了ERK和STAT3對于減少Hsp70誘導的MHC II表達是必需的。
[0063] 圖15示出了經(jīng)由TLR2-ERK-STAT3進行的IL-10產(chǎn)生的信號傳導通路模型的示意 圖。
[0064]圖16示出了 Hsp70和合成的肽以及所測試的那些之間的對比結(jié)果。
[0065]圖17示出了用Hsp70的片段(肽）的移植物進行的處理增加了鼠模型中皮膚同種異 體移植物接受度。
[0066]圖18示出了用一定劑量Hsp70進行的移植物處理增加了鼠模型中皮膚同種異體移 植物接受度。
[0067]圖19示出了局部處理，直到移植物被排斥為止。
[0068] 圖20示出了在移植前7天用BMDC進行的處理。
[0069] 圖21示出了在移植前7天用BMDC進行的處理+移植物的浸沒（immersion) 〇
[0070] 圖22示出了在移植前7天用BMDC進行的處理+移植物的浸沒+局部施用7天。
[0071] 圖23示出了在移植前7天用BMDC進行的處理+移植物的浸沒+局部施用，直到移植 物被排斥。
[0072] 圖24示出了通過實時PCR進行的對MARCH-I mRNA的水平分析，相對于其他免疫抑 制劑，使用Hsp70進行的樹突細胞處理導致MARCH-I誘導。將β-肌動蛋白用作內(nèi)參(setter)。 [0073]圖25示出了在冰上生長30h的VER0細胞中，上清液中LDH量的數(shù)據(jù)(25A)，細胞中存 在的總LDH中釋放的LDH的量（25B)，使所述VER0細胞接觸：l)Eur 〇C〇llins溶液；2) EuroCol 1 ins溶液+30yg/mL 的結(jié)核分枝桿菌 Hsp70; 3 )EuroCo 11 ins溶液+30yg/mL的0VA;和 4)PBS IX (陰性對照）。
[0074] 圖26示出了用試劑盒Live/Dead標記的腎組織細胞系VER0(ATCC--CCL-81)的細 胞共焦顯微鏡術(shù)的圖像。活細胞以綠色顯示且死細胞以紅色顯示。在冰上靜態(tài)貯存30h后， 當與其他處理方法比較時，用PBS處理的細胞死亡更多。當與EuroCollins和EuroCollins+ Hsp70組比較時，細胞死亡發(fā)生沒有差異。 具體實施方案
[0075]器官保存液的主要功能為保護器官免受因在冰上長期靜態(tài)貯存(在巴西可能達到 30h)造成的細胞損傷和細胞死亡。然而，到目前為止已知的器官保存液不能令人滿意地解 決與難以保持移植器官的可行性和難以在移植后限制其急性排斥反應(yīng)相關(guān)的技術(shù)問題。本 發(fā)明通過以下方式解決了這些問題：在已經(jīng)從供體摘除的（即離體的）器官細胞中調(diào)節(jié) MARCH-I、MHC II和/或⑶86來代替已被認為是常規(guī)方法的調(diào)節(jié)器官受體細胞。除了解決關(guān) 于有效的移植成功的技術(shù)問題，一旦本發(fā)明減少了排斥反應(yīng)，本發(fā)明也為醫(yī)生和為接受器 官的患者提供更多的備選方案，本發(fā)明處理的是被移植的器官而非接受器官的患者。該方 法具有實質(zhì)性益處且至今尚不可獲得。
[0076]為了更好地理解本發(fā)明，下面將提供一些定義。
[0077] 常規(guī)器官保存液
[0078]在本專利申請的上下文中，該術(shù)語必須被理解為保存任何器官和/或組織部分的任 何溶液。也在本專利申請的上下文中，該術(shù)語也可被理解為保存待被移植(包括同種異體移植 或自體移植)的動物的任何器官和/或組織部分的任何溶液。所述動物包括哺乳動物，包括人 類。常規(guī)的器官保存溶液的實例為：W i n s c 〇 s i η溶液< Vi aspan? ) ；Euro-Co 11 ins (RENOGRAF?);組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽(HTK)溶液一一Custodiol?； Celsior? 冷凍1C存液；CoStorSol?; MaPerSol?等。對它們中一些的上述描述不應(yīng)被理解為將 該術(shù)語限制為這樣的實例。
[0079] H宣
[0080] 在本專利申請的上下文中，該術(shù)語應(yīng)被理解為動物(包括哺乳動物以及人類)的任 何器官。術(shù)語"器官"包括:皮膚、腎臟、肝臟、心臟、肺、用于骨髓移植的細胞、脾臟、骨和軟 骨、眼睛或眼睛部件(例如，角膜），以及其他器官。
[0081 ] 施用有效劑量
[0082]在本專利申請的上下文中，該術(shù)語應(yīng)被理解為施用有效劑量以實現(xiàn)MARCH-I、MHC II和/或CD86調(diào)節(jié)的生物學效果，不管所需的生物學效果是否僅部分實現(xiàn)（例如，10%、 20%、30 %、50 %、60 %、70 %、80 %至100 %的效果）。具體而言，應(yīng)該理解該術(shù)語是指一種或 多種器官保存液與調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或⑶86的任何分子實體(例如，如下所述的Hsp 或其片段)的有效劑量施用。
[0083] Hsp
[0084] 在本專利申請的上下文中，該術(shù)語應(yīng)被理解為通過熱或應(yīng)力誘導的任何蛋白，也 稱為熱休克蛋白。Hsp包括蛋白此？70、此？60、此？40、此？90、此？110以及它們的組合。
[0085] Hsp 片段
[0086]在本專利申請的上下文中，該術(shù)語應(yīng)被理解為衍生自蛋白Hsp(如Hsp70(DnaK)，由 結(jié)核分枝桿菌的DnaK序列得到的熱休克蛋白）的任何肽序列(或肽）。
[0087] 功能性等價變體
[0088]在本專利申請的上下文中，該術(shù)語必須被理解為存在于Hsp的完整氨基酸序列中 (無論氨基酸鏈大?。┎⑶揖哂蠱ARCH-I、MHC II和/或⑶86調(diào)節(jié)的相同生物學功能和/或相 同生物學效果的任何肽。它包括蛋白Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp90、Hspll0以及具有由SEQID N〇:01、SEQ ID N〇:02、SEQ ID N〇:03、SEQ ID N〇:04、SEQ ID N〇:05、SEQ ID No:06或SEQ ID No :07表示的肽序列的Hsp70片段，或也包括分枝桿菌屬(Mycobacterium)的完整Hsp70。 [0089]本發(fā)明的組合物提供了實現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)效果的生理環(huán)境。在器官保存組合物中 MARCH-I、MHC II和/或⑶86調(diào)節(jié)劑的存在為保存器官提供了替代性的方法，同時減少了移 植后的器官排斥反應(yīng)。在一個實施方案中，本發(fā)明組合物包含在供體細胞中作為MHC II和 CD86調(diào)節(jié)劑的Hsp70。此外，本發(fā)明組合物的該實施方案在移植物DC中調(diào)節(jié)MARCH-I，使排斥 反應(yīng)減少。已指出，臨床上常規(guī)用于抑制排斥反應(yīng)的其他分子(如環(huán)孢霉素 A和雷帕霉素)不 提供MARCH-I、MHC II和⑶86的調(diào)節(jié)作用;然而，就本發(fā)明人所知，本發(fā)明的組合物是第一種 在供體器官中提供這樣的效果的離體器官的保存組合物。
[0090] 實施例1.待被移植的器官細胞的離體保存和免疫調(diào)節(jié)的組合物。調(diào)節(jié)MARCH-I、 MHC II和/或⑶86的物質(zhì)Hsp70在保存液中的用途。
[0091]在本發(fā)明的該實施方案中，調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或⑶86的物質(zhì)是結(jié)核分枝桿 菌Hsp70(基因庫的序列號NC_000962.2)。這種蛋白是通過將編碼基因亞克隆到質(zhì)粒pET23a 中并引入到大腸桿菌(Escherichia coli)的菌株BL21中來實現(xiàn)。在細菌培養(yǎng)和蛋白產(chǎn)生 后，根據(jù)Mehlert&Young使用純化蛋白的ATP-瓊脂糖（Sigma)柱來純化該蛋白。為了確定蛋 白濃度，使用焚光測試(flurimetric test)Quant-iT?蛋白測定試劑盒（Invitrogen)并在 QllMt?熒光計（Invitrogen)中對樣品讀數(shù)。為了去除脂多糖(LPS)，使用Aida和Pabst中 記載的使用Triton X-114(Sigma)的方法。通過在4°C下將蛋白與Biobeads (Bio-Rad)孵育 并攪拌8h而將污染物Triton去除。為了檢查是否一些污染物LPS殘留在樣品中，進行了生物 測定。使用含有34%氯胺酮和10 %甲苯噻嗪的體積為100yL的PBS溶液經(jīng)腹膜內(nèi)麻醉小鼠 BALB/c。隨后，靜脈注射 100yL PBS、具有30yg LPS(Sigma)的PBS或具有30yg TBHsp70的 PBSA小時后，在C02模型(模型C02G，Vol: 30L3)中對動物實施安樂死并將脾臟摘除。隨后，用 D膠原酶進行處理，并通過流式細胞術(shù)分析所得到的細胞懸液的CD86表達，如Khoruts和合 作者所描述的。
[0092] 為了抑制急性排斥反應(yīng)，將移植物浸入到具有30yg TBHsp70的500yL無菌ros lx 溶液中，即60yg/mL或0.06g/L的溶液。
[0093] 在本發(fā)明的本實施方案中，與Hsp結(jié)合使用的器官保存液包括：
[0094] -Wisconsin溶液--Viaspail?，由Organ Recovery Systems制造；
[0095] -組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽（HTK)溶液--Cust〇di〇l?HTK，由Essential Pharmaceuticals，LLC 制造；
[0096] -Celsior? 冷凍 1C 存液，由 Genzyme 制造；
[0097] 和/或
[0098] -溶液Euro-Collins--RENOGRAF.?，由Claris Lifesciences Ltd.制造。 _9] 實施例1的簡要介紹
[0100]在該實施方案中，結(jié)果示出目前MHC-II的分子表達減少是由Hsp70引起，這是抑制 對同種異體移植物的急性排斥反應(yīng)的機制。這種現(xiàn)象取決于移植物細胞中TLR2和IL-10的 表達并導致受體引流淋巴結(jié)(DLN)中CD4+和CD8+T細胞的增殖降低。
[0101]用Hsp70進行的移植物處理在能有效地迀移到受體DLN中的樹突細胞(DC)CD103+ 中僅僅降低MHC II表達。值得注意的是，Hsp70誘導DC的抗炎細胞因子IL-10產(chǎn)生增加。在嚙 合（engag e)受體TLR2后，該產(chǎn)生是由分子ERK和STAT3活化介導。此外，由HSp70誘導的MHC II表達減少與MARCH-I泛素分子表達的增加同時發(fā)生，且這兩種現(xiàn)象取決于分子TLR2、ERK、 STAT3和IL-10。然而，結(jié)果不僅闡明了當Hsp70以處理移植物而不是處理移植物受體的方式 使用時，所述Hsp70的免疫抑制劑作用的機制，而且支持和使得用于篩選適用于制備移植器 官離體保存和/或免疫調(diào)節(jié)的組合物的新分子實體的方法可行。
[0102] 用于實施例1實驗的方法
[0103] 使用的動物
[0104]在實施例1的實施方案中，使用了如下動物：雌性小鼠（小家鼠 （Mus musculus)) BALB/c 和 C57B1/6;敲除 TLR2 的動物 05781/6(11^2+):野生動物 129Sv/Ev(WT)和敲除 IL-10 的動物（i 110+);和C57BL/6-GFP動物。用于實驗的所有動物為6-10周齡且被飼養(yǎng)在單獨的 籠子(Techniplast)中。自由地提供高壓滅菌水和飼料。也將所有剃毛(shaving)高壓滅菌。 每周兩次進行這些籠子(單獨的籠子）的維護:換水、喂料和清潔。將動物飼養(yǎng)在具有22-23 °C的受控溫度和12小時的光照-黑暗周期的環(huán)境中。當處理動物時，飼養(yǎng)員總是使用外科手 術(shù)的口罩和手套。該項目在登記號CEUA 08/00048下由Rio Grande do Sul的Pontifical Ca tho 1 i c大學的動物使用倫理委員會批準。
[0105] 蛋白質(zhì)純化和脂多糖(LPS)提取
[0106] 為了產(chǎn)生重組Hsp70,將結(jié)核分枝桿菌的DnaK基因插入載體pET-23a( + )中。質(zhì)粒由 公司Genscript-USA裝配，在大腸桿菌的菌株BL21中產(chǎn)生蛋白并根據(jù)MEHLERT&Y0UNG(1989) 的教導進行純化。
[0107] 為了去除LPS，使用化合物（1，1，3,3_四甲基丁基)苯酚-聚乙二醇(產(chǎn)品Triton X-114，制造商Sigma-Aldrich公司），如AIDA&PABST( 1990)所記載的。通過用吸附劑Biobeads (Bio-Rad)孵育蛋白并在4°C下攪拌12h而去除污染物（1，1，3,3-四甲基丁基）苯酚-聚乙二 醇。為了確定蛋白濃度，使用焚光測試(fluviometric test)Quant-iT?蛋白測定試劑盒 (Invitrogen)，并在Qubit?焚光計（Invitrogen)中對樣品讀數(shù)。
[0108] 皮膚同種異體移植物的鼠模型
[0109] 本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了處理移植物(包括同種異體移植物）的方法。因此，所述方 法使用已確立的皮膚移植的經(jīng)典鼠類模型作為工具，處理移植物(其可能是全器官)而不是 處理將接受所述移植物的受體。本發(fā)明人認為，這樣的方法可被認為是具有新穎性和創(chuàng)造 性。所述模型由完全不相容的MHC分子組成，并記載于BILLINGHAM&MEDAWAR(1951)。在所述 模型中，處死表達MHC II I-Ab*子的供體小鼠 C57BL/6(B6)并從動物尾部皮膚摘除lcm2的 一片并將其浸沒在冰上的具有60yg/mL的Hsp70或卵清蛋白（0VA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中 60分鐘。
[0110] 麻醉表達MHC II I-Ad分子的BALB/c受體并剔除背部軀干(dorsal stem)的毛。在 上過蠟的區(qū)域，摘除每只受體小鼠中l(wèi)cm2的皮膚并在暴露區(qū)域縫合供體尾部皮膚。將動物 飼養(yǎng)在單獨的籠子中并每日監(jiān)測。通過觀察到發(fā)紺、紅斑、糜爛和皮膚移植物損失來證實移 植物排斥反應(yīng)。
[0111] 樹突細胞培養(yǎng)和分離
[0112] 在GM-CSF和IL-4(均由BD Biosciences獲得)的存在下，來自 C57BL/6或TLR2 K0小 鼠的骨髓的樹突細胞(DC)是不同的，如由INABA和合作者（2002)所描述的。在24-孔板中以 無血清培養(yǎng)基AIM-V?(Gibco)培養(yǎng)細胞。在培養(yǎng)的第六天，將非貼壁細胞(DC)與貼壁細 胞分離。然后，將BMDC用60yg/mL的Hsp70、60yg/mL的0VA、10yg/mL的肽-聚糖-PGN( Sigma-Aldrich)或Hsp70+20ng重組鼠 IL-10(R&D System)孵育24h，隨后通過流式細胞術(shù)分析或提 取總RNA。收集上清液并用于分析細胞因子。
[0113] 從引流小鼠皮膚抗原C57B1/6 WT或TLR2 K0和129Sv/Ev WT或IL-10 K0的淋巴結(jié) 純化⑶llc+細胞。將動物處死并摘除軸向淋巴結(jié)、臂淋巴結(jié)(brachial lymph node)和腹股 溝淋巴結(jié)。將這些器官浸漬在具有含D膠原酶(Roche)的培養(yǎng)基的尼龍篩中。將所得到的細 胞懸液用綴合有抗-⑶11C抗體(N418) (Mi 1 tenyi Biotech)的磁性小珠標記15分鐘。在洗滌 后，根據(jù)制造商的說明書，使用MACS MS(Miltenyi Biotech)分離柱通過陽性選擇來純化 CD 11 c+細胞。通過流式細胞術(shù)控制純化的細胞純度，表明在陽性級分中CD 11 c+細胞的純度 為90%。因此，使所述細胞在96-孔板中的無血清培養(yǎng)基AIM-V?(Gibco)中生長。
[0114] 將DC用30yg/mL的Hsp70或0VA孵育24h，隨后通過流式細胞術(shù)分析或?qū)NA完全除 去。收集上清液并用于分析細胞因子。用20ng/ml的雷帕霉素 (Cell Signaling)、lyg/mL的 環(huán)孢菌素 A(Roche)或20ng/mL的重組鼠 IL_10(R&D System)進一步處理所述細胞24h并除去 總 RNA〇
[0115] 供體的迀移細胞和受體應(yīng)答的評估
[0116] 在移植后24h或96h通過流式細胞術(shù)檢測受體的腋窩淋巴結(jié)中的供體小鼠的細胞 (I-Ab +或GFP+)。處死被移植的小鼠，摘除腋窩淋巴結(jié)并在尼龍篩中用含有D膠原酶 (Roche? )的培養(yǎng)基浸漬。本發(fā)明人得到具有與Tripan藍接觸的細胞的細胞懸液并通過 流式細胞術(shù)進行分析。
[0117] 細胞內(nèi)標記
[0118] 在培養(yǎng)的第六天，將獲得自WT或TLR2 K0小鼠的骨髓的樹突細胞(BMDC)用30yg/mL 的Hsp70刺激0、15、30或45分鐘。作為陽性對照，將細胞用50μΜ豆蔻酸乙酸佛波酯(PMA)刺激 30分鐘。在提及的時間段中的刺激后，將細胞用Cytofix緩沖液(BD Biosciences)在37°C下 固定10分鐘并用Phosflow Perm Buffer III(BD Biosciences)在冰上通透30分鐘。在這樣 的步驟后，標記細胞的P-ERK1/2和p-STAT3。此外，在用Hsp70處理之前，用30μΜ的ERK的選擇 性抑制劑PD98059(Cayman Chemical)處理BMDC WT 40分鐘，或用50μΜ的JAK2/STAT3的抑制 劑AG490 (Sigma-Aldr ich)處理60分鐘，或保持不處理。
[0119] 流式細胞術(shù)
[0120] 為了分析DC亞型的迀移和激活，用來自eBioscience的Langerin(CD207-eBioRMUL.2)和獲得自BD Biosciences的抗體標記細胞的I-Ab(AF6-120.1)、CDllc(HL3)、 CDllb(Ml/70)、CD45R/B220(RA3-6B2)、CD103(M290)、CCR7(CD197-4B12)、CD80(16-10A1)、 CD86(GLl)〇
[0121] 為了分析受體T細胞，用獲得自BD Biosciences的物質(zhì)標記細胞的⑶4(GK1.5)、 CD8a(53-6.7)、Foxp3(MF23)、Ki67(B56)。根據(jù)制造商的說明書，使用試劑盒Mouse Foxp3Buffer Set(BD Biosciences)進行Treg Foxp3的特異性轉(zhuǎn)錄因子標記。在之前固定 和通透的BMDC中，使用p-ERKl/2和p-STAT3的抗體(BD Biosciences)來測定磷酸化的ERK和 STAT3的水平。隨后，在具有BD FACSDiva(BD Biosciences)程序的流式細胞儀FACSCanto II(BD Biosciences)中分析細胞。用Flow jo程序（版本7.6.5，Tree Star)分析得到的數(shù)據(jù)。
[0122] IL-10細胞因子測量
[0123] 借助于CBA小鼠炎癥試劑盒(BD Biosciences)，根據(jù)制造商的說明書，在IL-10的 存在下分析用Hsp70或0VA處理24h的DC培養(yǎng)物上清液。隨后在具有BD FACSDiva(BD Biosciences)程序的流式細胞儀FACSCanto II(BD Biosciences)中分析樣品。用FCAP Array程序(版本3.0，BD Biosciences)分析得到的數(shù)據(jù)并以pg/ml表示。
[0124]實時 PCR
[0125]根據(jù)制造商的說明書，使用試劑盒RNAeasy(Qiagen)從處理的DC中分離總RNA。使 用試劑盒_CJubl偷RNA分析試劑盒（Invitrogen)來測定總的純化的RNA濃度，在 焚光計（Invitrogen)中讀數(shù)。50ng的RNA具有100U的3611818(31^。1:((^38611)的逆轉(zhuǎn)錄酶。通 過試劑盒_〇 :11.1>1_dsDNA HS Assay (Invitrogen)來測定DNA濃度，在Qubit:?_焚光計 (Invi trogen )中讀數(shù)。在10yL的終體積中，根據(jù)制造商的建議使用一些檢測方法 Taqman?Gene Express ion (Applied Biosystems): IL10(Mm00439614_ml)、Marchl (Mm00613524_ml)和β-肌動蛋白（4352933E)來應(yīng)用8ng cDNA。
[0126] 在儀器StepOne?實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)中進行定量實時PCR。根據(jù)由 SCHMITTGEN&LIVAK(2008)記載的Ct對比方法來計算mRNA的相對水平。將β-肌動蛋白組分基 因用作內(nèi)參。未處理的DC作為對0VA或Hsp70處理的DC的參照。
[0127] T細胞的表位定位
[0128] 為了證明肽結(jié)合和體內(nèi)T細胞刺激實施T細胞的表位定位。為了該目的，使用在 MacLeod及其合作者（2008)論文中記載的方案。簡而言之，將具有100yg TBHsp70+7yg LPS (充當佐劑)的溶液經(jīng)腹膜內(nèi)注射BALB/c小鼠中。九天后，對動物實施安樂死，摘除脾并用膠 原酶D處理。將脾細胞置于10 6細胞/mL的濃度中。將細胞用DMS0(陰性對照，因為它被用于稀 釋肽）、60yg/mL的Hsp70或5yg/mL的每種選擇的肽分別刺激24h。這段時間后，標記細胞的 CDllc-PECy7、CD4-PE-Cy5.5、CD25-PE、Foxp3-APC、B220-APC、Grl-PE、B220-PerCP，并且根 據(jù)生產(chǎn)商的建議用試劑盒CBA Mouse Inflammation(BD Biosciences)分析上清液中IL-10 的存在。在流式細胞儀FACSCanto II(BD Biosciences)中讀取所有樣品。
[0129] 統(tǒng)計學分析
[0130] 借助于Prism軟件（版本5·00，Graphpad Software Inc·，San Diego)來進行統(tǒng)計 學分析。利用Kolmogorov-Smirnov測試來確定數(shù)據(jù)分布。在被認為是正態(tài)的分布的情況下， 通過學生t檢驗或單因子方差分析(單因子AN0VA)及隨后的事后Bonferroni檢驗來進行在 不同實驗組之間的參數(shù)比較。在非正態(tài)分布的情況下，使用Kruskal 1-Wall is和Mann-Whitney檢驗，以及Dunn事后檢驗來區(qū)分差異。對于移植物存活分析，使用了Kaplan-Meier 方法。結(jié)果表示為平均值（正態(tài)分布）或中位數(shù)（非正態(tài)分布）和平均標準偏差，并且低于 0.05的p值表明顯著差異。
[0131] 結(jié)果
[0132] 用Hsp70進行的單個移植物處理實現(xiàn)移植物的存活延長
[0133] 為了調(diào)查在用蛋白Hsp7進行0的移植物處理中Hsp70的保護作用，使用經(jīng)典和已確 立的皮膚移植鼠模型作為工具，開發(fā)了對于移植物處理而不是受體處理的具備新穎性和創(chuàng) 造性的方法。該模型由完全不相容的MHC分子組成且記載于BILLINGHAM&MEDAWAR( 1951)中。 在該模型中，處死表達MHC II I-Ab*子的供體小鼠 B6。然后，將lcm2的一片從動物尾部皮膚 摘除并浸漬在冰上的具有60yg/mL的Hsp70或卵清蛋白（0VA)的PBS溶液中60分鐘。在這段時 間后，將移植物縫合到表達MHC II I-Ad分子的BALB/c受體的后背中，并每天監(jiān)測排斥反應(yīng) 臨床進展。
[0134] 在圖1中可以注意到，當與接受用0VA處理的移植物的動物相比時，接受用Hsp70處 理的移植物的動物表現(xiàn)出更大的存活率。在4°C下將野生動物B6(I-Ab) (WT)的皮膚移植物 在具有60yg/mL Hsp70或0VA的溶液中浸漬60分鐘。然后，將移植物縫合到BALB/c(I-Ad)動 物的后背中。每日監(jiān)測動物。***，P〈〇. 〇〇〇 1。每組η = 22-24只小鼠。將七個獨立實驗組合在 一起得到結(jié)果。
[0135] 可注意到接受用0VA或Hsp70處理的皮膚移植物的每只小鼠的存活。當比較兩組的 存活中位數(shù)時，得到了顯著差異(P〈〇.0001)(表1)。
[0136] 表1:在皮膚同種異體移植鼠模型中用一定劑量的Hsp70或0VA進行的移植物浸漬 處理的效果。結(jié)果由七個獨立實驗的組合得到。
[0137]
[0138] 3與^^\ 比較
[0139] ***Ρ〈〇·〇〇〇1
[0140] 用Hsp70處理的同種異體移植物的樹突細胞有效地迀移到受體的引流淋巴結(jié) [0141 ]急性排斥反應(yīng)取決于移植物DC向受體DLN的迀移。在皮膚移植中，對這種迀移的抑 制作用降低了受體的敏感性。因此，調(diào)查了是否Hsp70阻止供體細胞迀移到DLN中。
[0142] 使用先前所述的皮膚同種異體移植物模型，通過兩種不同的方式在BALB/c動物淋 巴結(jié)中篩選由B6動物得到的移植物細胞。首先，在移植后一天和四天，分析在受體DLN中細 胞I_A b+的存在。選擇這兩個時刻是因為它們均代表皮膚細胞向DLN迀移的時刻。在接受用 0VA或Hsp70處理的移植物的小鼠之間沒有注意到任何差異（圖2A)。此外，證實了大多數(shù)迀 移細胞為DC(圖2C)。那么，由于Hsp70可在DC中調(diào)節(jié)MHC II細胞的事實，使用表達綠色蛋白 GFP (綠色熒光蛋白）的B6移植物重復移植，并且在BALB/c受體中篩選供體細胞。再一次，在 受體DLN中的供體細胞百分數(shù)在兩次處理中沒有差異（圖2B和圖2D)。
[0143] 對于向次級淋巴器官的DC迀移而言，需要CCR7表達。因此，在用Hsp70或0VA處理的 移植物產(chǎn)生的(存在于受體DLN中的)供體細胞中評估CCR7表達。出乎意料的是，移植24小時 后注意到當與用0VA處理的移植物的DC相比時，用Hsp70處理的移植物的迀移DC表達更高水 平的CCR7(圖2E和2F)。
[0144] 移植后四天，Hsp70組和0VA組之間的CCR7水平?jīng)]有差異。數(shù)據(jù)表明Hsp70不影響供 體DC向受體DLN的迀移，如圖2A、2B、2C、2D、2E和2F所示。
[0145] 在圖2A、2B、2C、2D、2E和2F中，用Hsp70處理的移植物的DC有效地迀移至受體DLN。 將B6(I-A b)野生動物(WT)或GFP的皮膚移植物在4°C下在具有60yg/mL的Hsp70或0VA的溶液 中浸漬60分鐘。然后，將移植物縫合在BALB/c(I-Ad)動物的后背中。在移植后24h或96h，通 過以下方式在受體DLN中篩選供體細胞"AU-A 1^表達或(B)GFP的表達；（C、D)在受體DLN 中篩選的供體的代表性點圖和CDllc+細胞百分數(shù)；（E)在I-Ab+細胞中的CCR7表達或(F)在 移植動物DLN中篩選的在GFP+群中的CCR7表達。圖表以平均值土 SEM表示。*，P〈0.05。每組η =3只小鼠。六個獨立實驗的代表性結(jié)果。
[0146] Hsp70減少了在激活的樹突細胞中的MHC II和CD86表達
[0147] 本發(fā)明人的小組先前發(fā)現(xiàn)Hsp70可延緩小鼠骨髓DC(BMDC)的體外分化，其通過抑 制MHC II和⑶86而證實。然而，如果Hsp70可以抑制，需要確定在已經(jīng)分化了的DC中的MHC II表達。為了回答這個問題，從由皮膚獲得的淋巴結(jié)引流抗原中分離出DC并用0VA或Hsp70 處理。當與用OVA處理的DC比較時，用Hsp70進行的處理導致表達中等或低水平MHC II的DC 的數(shù)量增加(圖3)。
[0148] 將從皮膚引流淋巴結(jié)分離的DC用0VA或Hsp70處理24h。在此之后，通過流式細胞術(shù) 分析14|3在0(：中的表達。
[0149] 發(fā)現(xiàn)在圖2A、2B、2C、2D、2E和2F中分析的DC沒有差異，處于穩(wěn)態(tài)而不是激活狀態(tài)。 然而，當進行移植時，已知存在導致這些細胞激活的局部無菌炎癥。為了確定Hsp70是否可 調(diào)節(jié)已經(jīng)激活的DC，將BMDC用LPS處理24h，隨后用Hsp70處理額外的24h。
[0150] 正如預期的那樣，用LPS處理的組表現(xiàn)出更高百分數(shù)的表達大量MHC II的細胞 (CDllc+I-Abhi)(圖4)。然而，用Hsp70進行的后續(xù)處理(LPS+Hsp70組）能夠部分地復原該過 程，與僅用Hsp70處理的細胞非常相似(圖4)。
[0151] 來自B6WT小鼠的骨髓的DC是不同的，且在培養(yǎng)的第6天用LPS處理DC 24h或不處 理。在此之后，將這些細胞用Hsp70處理額外的24h或不處理。隨后，通過流式細胞術(shù)分析ΙΑ13 的表達。 (A) 根據(jù) I-Ab 的表達 (高、中或低) 進行的細胞策略分析。 （B)CDllc+I-Abhi、CDllc+ I-Abint和CDllc+1-Ab1?細胞的百分數(shù)。（C)在CDllc+細胞中的平均熒光強度(MFI)。 圖表以平均值土 SEM表示。*，P〈0.05。實驗重復進行三次。兩個獨立實驗的代表為在圖4中所 示的結(jié)果。
[0152] 可以注意到關(guān)于⑶86表達的非常相似的響應(yīng)，其中用LPS進行的處理導致更高百 分數(shù)的表達高含量的⑶86的細胞(CDllc+CD86 hi)，用Hsp70進行的處理能部分復原該表達 (圖 5)。
[0153] 來自B6WT小鼠的骨髓的DC是不同的，且在培養(yǎng)的第6天用LPS處理DC 24h或不處 理。在此之后，將這些細胞用Hsp70處理額外的24h或不處理。隨后，通過流式細胞術(shù)分析 CD86表達。(A)根據(jù)CD86表達(高、中或低）的細胞策略分析。（B)CDllc+CD86hi、CDllc+CD86 int 和⑶llc+⑶861?細胞的百分數(shù)。（C)在⑶llc+細胞中的⑶86的平均熒光強度(MFI)。圖表以 平均值土SEM表示。*，P〈0.05。實驗重復進行三次。兩個獨立實驗的代表為在圖5中所示的結(jié) 果。
[0154] 用Hsp70進行的處理通過減少受體DC的MHC II表達抑制了同種異體抗原識別的直 接方式，而不是間接方式
[0155] 在同種異體抗原識別的直接方式中，受體T細胞識別呈遞同種異體肽的供體MHC分 子，而在間接方式中，T細胞識別存在于適當?shù)腗HC分子中的同種異體抗原。因此，對在本發(fā) 明人的體系中實現(xiàn)的抑制急性排斥反應(yīng)的更簡單的解釋可以是，由于用Hsp70處理的移植 物的DC表達低水平的MHC II和CD86，抑制同種異體抗原識別的直接方式。為了調(diào)查這個問 題，分析了在迀移至受體DLN的供體細胞中的I-Ab和共刺激分子的水平。事實上，用Hsp70的 處理導致在供體DC中的MHC II表達減少。這用先前使用的兩種方法通過I-Ab(圖6，項A)的 表達和GFP(圖6,項B)的表達來證實。本發(fā)明人還注意到，移植后24h或96h，當與用0VA處理 的移植物的DC (圖6，項C)相比時，產(chǎn)生自用Hsp70處理的移植物的DC表現(xiàn)出降低的CD80水平 和⑶86水平。
[0156]為了調(diào)查是否Hsp70可調(diào)節(jié)同種異體抗原識別的間接方式，使用BALB/c動物移植 物進行移植并將同樣的動物在B6受體中縫合。隨后，使用抗體Y-Ae通過受體DC分析同種異 體抗原呈遞。該抗體識別在MHC II I-Ab分子(在B6動物中表達）中結(jié)合的在BALB/c動物中 表達的肽(Εα52-68)。圖6，項D所示結(jié)果公開了在接受用Hsp70或OVA處理的移植物的受體的DC 之間抗原呈遞水平?jīng)]有差異。這些發(fā)現(xiàn)表明，MHC II表達調(diào)節(jié)發(fā)生在供體DC中，且不在受體 DC中。而且，用Hsp70的處理通過作用于同種異體抗原識別的直接方式來抑制急性排斥反 應(yīng)。
[0157] 在圖6中：（A)根據(jù)在接受用0VA或Hsp70處理的移植物的動物中的I_Ab的表達(高、 中或低)和供體的細胞CDllc+I-Ab hi、CDllc+I-Abint和CDllc+1-Ab1?的百分數(shù)的B6WT供體的 細胞策略分析。（B)等同于A，可是通過GFP的表達來篩選供體細胞。（C)在移植后24h或96h， 在供體的細胞中CD80表達的代表性直方圖和在細胞GFP+CDllc+中的CD80和CD86的平均熒 光強度(MFI)。圖形以平均值土 SEM表示。*，？〈0.05;#，？〈0.01;#*，卩>0.001。每組11 = 3只動 物。三個獨立實驗的代表。
[0158] 當分析在受體的DLN中的中位值響應(yīng)時，值得注意的是，出乎發(fā)明人意料，當與接 受用Hsp70處理的移植物的動物相比較時，接受用0VA處理的移植物的動物存在更大尺寸的 器官。為了證實該數(shù)據(jù)，本發(fā)明人在移植后第1天、第4天、第7天和第10天中對受體的DLN細 胞總數(shù)進行計數(shù)。實際上，在所有的檢驗日中，接受用Hsp70處理的移植物的動物具有更低 的絕對細胞數(shù)(圖7，A項）。
[0159] 對移植物的排斥反應(yīng)取決于在受體DLN中的CD4+和CD8+同種異體反應(yīng)性T細胞增 殖，且或許這些細胞的更低的增殖可能導致接受用Hsp70處理的移植物的動物的DLN中存在 的T細胞總數(shù)更低。為了分析該假設(shè)，通過在移植的動物DLN中用Ki67標記來分析這些細胞 的增殖。Ki67是在細胞周期中發(fā)揮作用的分子且由任何正在增殖的生物細胞表達。值得注 意的是，用Hsp70的移植物處理導致在受體小鼠 DLN中，在CD4+和CD8+T細胞增殖中標記的減 少（圖7,項B和C)。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的數(shù)量的增加可減少在受體DLN中的同種異體反應(yīng)性 T細胞增殖，延緩對移植物的排斥反應(yīng)。由于發(fā)明人的研究小組先前已經(jīng)注意到，由Hsp70誘 導的急性排異反應(yīng)抑制取決于Treg，調(diào)查了是否用Hsp70的移植物處理導致在受體DLN中的 Treg增加。有趣的是，在接受用Hsp70處理的移植物后的受體DLN中未檢測出Treg的顯著增 加（圖7，項D)。本發(fā)明人的結(jié)果表明，由Hsp70的MHC II調(diào)節(jié)導致同種異體反應(yīng)性增殖減少 且不通過Treg。這些發(fā)現(xiàn)是根據(jù)這一觀察，即在人類中給予未成熟的DC導致⑶8+T細胞效應(yīng) 因子功能的抑制。
[0160] 圖7(A)在移植后第1天、第4天、第7天和第10天對接受用0VA或Hsp70處理的移植物 的受體的 DLN 細胞進行計數(shù)。CD4+Foxp3-Ki67+T 細胞(B)、CD8+Foxp3-Ki67+T 細胞(C)或 Treg CD4+Foxp3+(D)的代表性點狀圖（左圖）、百分數(shù)（中圖）和絕對數(shù)（右圖）。圖形以平均值± SEM表示。*，P〈0.05; #，P〈0.01。每組η = 3只小鼠。3-4個獨立實驗的代表性結(jié)果。
[0161] 為了證實用Hsp70處理的移植物可見的效果是由于其對供體DC的作用，移植源自 小鼠 B6的皮膚移植物并將其縫合在BALB/c受體中。在這種情況下，不處理移植物。相比之 下，將預先用Hsp70或0VA處理24h的B6小鼠 BMDC通過皮下方式注射到縫合的移植物之下（圖 8,項A)。每日監(jiān)測動物，以驗證移植物排斥反應(yīng)。借此試圖模擬在先前示出的實驗中發(fā)生的 情況。如圖8，項B和表3所示，接受來自用Hsp70處理的供體的BMDC的動物呈現(xiàn)更高的移植物 存活，其存活水平與接受用Hsp70處理的移植物的動物所呈現(xiàn)的水平相似(圖1和表2)。
[0162] 圖8示出通過用Hsp70處理的BMDC的受體處理可增加皮膚同種異體移植物的接受 度。在BALB/c(I-Ad)動物的后背移植B6野生動物（I-A b) (WT)的皮膚移植物。未對移植物進 行任何處理。因此，在將移植物縫合后，動物經(jīng)皮下接受預先用30yg/mL的Hsp70或OVA處理 24h的105BMDC。每天監(jiān)測動物的移植物排斥反應(yīng)。每組n = 7-8只小鼠。結(jié)合兩個獨立的實驗 得到結(jié)果。
[0163] 表2:在皮膚同種異體移植物鼠模型中，通過用Hsp70或0VA預處理的105BMDC處理 的效果。結(jié)合兩個獨立的實驗得到結(jié)果。
[0164]
[0165] 0VA相比
[0166] *Ρ〈〇·〇194
[0167] 來自供體的DC CT103+具有主要迀移亞型，測量對用Hsp70處理的移植物的耐受性 [0168] 在皮膚中可以發(fā)現(xiàn)三個DC亞型：在表皮中發(fā)現(xiàn)的Langerhans細胞（或LCs-Langerin+CD103-CD1 lb+);兩個額外的包括DCs CD103+(Langerin+CD103+CDllb_)的亞型； 和"典型的"真皮00(1^即從丨11-〇)103-〇)11匕+)。這些在皮膚中的0(：亞型具有不同的刺激能 力，引起特異性T細胞對于相同抗原的不同極化。雖然LC可在體內(nèi)平衡狀態(tài)中誘導Treg和在 炎癥條件下誘導炎癥性T細胞，但是DC CD103+引起在腸道中的耐受性。來自人類的DC ⑶141hi等同于來自小鼠的DCXD103+。此外，在異種移植物模型中，這些細胞可通過產(chǎn)生IL-10來抑制移植物抗宿主病。
[0169] 調(diào)查了哪種DC亞型在使用的體系中介導耐受性，并且分析了為了這樣的效果，在 用Hsp70的移植物處理后，從移植物迀移到受體DLN的DC亞型。值得注意的是，在移植后24h 或96h，DC⑶103+是存在于DLN中的唯一迀移DC亞型（圖9，項A)。在分析期間，沒有檢測到LC 或"典型的"真皮DC迀移。該觀察是根據(jù)先前的研究，其表明LC對于使MHC完全喪失作用的皮 膚移植物排斥反應(yīng)不是必需的；相反，在移植后，這些細胞將在移植物表皮中保持安全。此 外，注意到在移植后24h或96h，在從用Hsp70處理的移植物迀移至受體DLN的這些DC⑶103+ 中，MHC II水平顯著降低（圖9，項B)。Hsp70還能降低從淋巴結(jié)中分離出來的DC⑶103+中的 體外MHC II表達(圖9,項C)。
[0170] 在圖9中，DC CD103+代表到達受體DLN并可由Hsp70調(diào)節(jié)的主要細胞亞型。(A)存在 于小鼠受體DNL中的DC亞型的分析策略。（B)來自供體的DC CD103+的代表圖（如在A中分析） 和在接受用0VA或Hsp70處理的移植物的小鼠的DNL中，表達高水平的I -Ab和降低水平的I -Ab 的DC CD103+的百分數(shù)。（C)將DC與LN引流皮膚抗原分離，并將這些細胞用30yg/mL的Hsp70 或OVA處理24h。在此之后，分析在DC⑶103+中的I-A b表達。圖形以平均值土 SEM表示。#，P〈 0.01 ;#*，P>0.001。每組η = 3只小鼠。3個獨立實驗的代表性結(jié)果。
[0171] 證實了在獨立的實驗中從移植物迀移到受體DLN中的細胞表型:⑶llc+Langerin+ CD1 lb-CD103+(圖 10)。在圖 10中，來自供體的迀移DC為CD1 lc+Langerin+CDllb-CD103+。査 接受來自B6動物WT的移植物的BALB/c小鼠 DLN中提出來自受體的DC CD103+的替代性的策 略分析。通過I-A%^表達篩選這些細胞。
[0172] 細胞因子IL-10對于降低在DC中的MHC II表達和對于由Hsp70誘導的急性排斥反 應(yīng)抑制作用是必需的。
[0173] 隨后，分析Hsp70誘導在DC中的MHC II表達降低和隨后增加移植物接受度的機制。 IL-10是主要的抗炎細胞因子，且已知它可導致MHC II表達減少。據(jù)證實，Hsp70可誘導在來 自骨髓的不同DC(BMDC)中的IL-10表達，以及在關(guān)節(jié)炎模型中的IL-10表達。因此，該分子伴 侶依賴于IL-10發(fā)揮其抗炎作用。假定IL-10誘導是在用Hsp70刺激的DC中MHC II表達減少 的機制。事實上，Hsp70可在從小鼠淋巴結(jié)分離出的DC中在mRNA水平或在蛋白水平誘導IL-10產(chǎn)生(圖11，A項）。
[0174] 此外，這些細胞的IL-10表達對于減少Hsp70誘導的MHC II表達是必需的，在用 Hsp70處理的IL-10敲除動物(KO)DC中不可能注意到該現(xiàn)象（圖11，項B)。
[0175] 最近，確定了MHC II表達響應(yīng)于IL-10的調(diào)控機制:跨膜蛋白誘導MARCH-LMARCH-I是泛素連接酶E3家族的成員，并且被證明能夠調(diào)節(jié)一些分子(如MHC-II、MHC I、⑶86、⑶4) 在抗原呈遞細胞(APC)中的表達。當在APC中的MARCH-I表達增加時，這導致了泛素化和隨后 的MHC II降解和⑶86降解。為了確定是否用Hsp70的處理可誘導在DC中的MARCH-I表達，從 用Hsp70或0VA處理的小鼠的LN中分離出DC，且通過實時PCR分析MARCH-I的mRNA水平。檢測 到在用Hsp70的處理后，在DC中MARCH-I mRNA增加了20倍（圖11，項C)。為了測試是否該增加 由Hsp70誘導的IL-10產(chǎn)生而引起，將從敲除IL-10的動物中分離出的DC用Hsp70處理，隨后 分析MARCH-I的mRNA水平。當與DC WT比較時，用Hsp70處理的IL-10 K0的DC沒有表現(xiàn)出 MARCH-I水平的增加（圖11，項D)。此外，在培養(yǎng)基中加入重組鼠 IL-10部分恢復了由DC K0的 MARCH-I 表達(圖 11，項D)。
[0176] 然而，Hsp70誘導的IL-10的產(chǎn)生導致MARCH-I表達增加且這對于降低MHC II表達 是重要的。對這些發(fā)現(xiàn)的解釋是需要IL-10以介導由Hsp70誘導的排斥反應(yīng)抑制作用。為了 驗證該假設(shè)，本發(fā)明人使用用Hsp70或0VA處理的源自供體IL-10 K0的移植物來進行皮膚移 植(如上所述）。在移植物中不存在IL-10中止了由Hsp70所介導的保護（圖11，項E)。
[0177] 圖11示出Hsp70誘導的IL-10產(chǎn)生導致MARCH-1表達增加，且這對降低MHC II表達 是重要的。(A)將從LN引流皮膚抗原中分離出來的DC用0VA或Hsp70處理24h。然后，通過實時 PCR分析IL-10mRNA水平。將β-肌動蛋白用作內(nèi)參。通過流式細胞儀測定在培養(yǎng)物上清液中 的IL-10濃度。（Β)將從WT動物或IL-10 Κ0的LN引流皮膚抗原中分離出來的DC用0VA或Hsp70 處理24h，并通過流式細胞儀分析I-A%^表達。（C)如同在A中，但是MARCH-I mRNA水平通過 實時PCR分析。（D)將從WT動物或IL-10 K0的LN引流皮膚抗原中分離出來的DC用0VA或Hsp70 處理。將DC IL-10 K0也用重組IL-10處理。所有的處理進行24h且通過實時PCR分析MARCH-I mRNA水平。（E)在4°C將WT動物的皮膚移植物或IL-10 K0的皮膚移植物在具有60yg/mL Hsp70或OVA的溶液中浸漬60分鐘。在此之后，將移植物縫合到BALB/c動物的后背中并每日 監(jiān)測接受度。圖形以平均值土 SEM表示。*，？〈0.05;#，？〈0.01;#*，卩>0.001。每組11 = 3-5只 小鼠。3個獨立實驗的代表性結(jié)果。
[0178] Hsp70利用TLR2-ERK-STAT3-IL-10途徑誘導了MHC II減少
[0179] 在確定了IL-10對于Hsp70對移植物的保護作用是重要的，試圖確定在體系中誘導 IL-10產(chǎn)生的信號通路。最近，除了誘導在糖尿病和關(guān)節(jié)炎中的耐受性，IL-10表達調(diào)控與 TLR2膜受體相關(guān)聯(lián)。設(shè)立了假設(shè):Hsp70誘導的IL-10表達是由TLR2介導的。因此，將從WT小 鼠或敲除TLR2(TLR2 K0)的小鼠的淋巴結(jié)中分離出的DC用Hsp70或0VA處理，并在mRNA水平 或在蛋白水平分析IL-10表達。當與DC WT比較時，用Hsp70處理的DC TLR2 K0表現(xiàn)出IL-lOmRNA表達（圖12,項A)和蛋白的顯著降低（圖12,項B)。此外，在從LNS中分離出的DC中， Hsp70誘導的MHC II表達抑制也取決于TLR2(圖12，項C)。
[0180] 也調(diào)查了是否供體細胞的TLR2表達對于Hsp70誘導的急性排斥反應(yīng)抑制作用是必 需的。移植WT或TLR2 K0的B6移植物，將其浸入含有0VA或Hsp70的溶液中并移植到BALB/c受 體中。在用Hsp70處理的功能中，移植物存活的延長取決于在移植物中的TLR2表達(圖12,項 D)。為了證實Hsp70在供體而不是受體的細胞中起作用，在B6WT或TLR2 K0受體中移植BALB/ c動物的皮膚移植物WT。當在WT或TLR2 K0受體中移植時，用Hsp70處理的WT移植物表現(xiàn)出非 常相似的存活(圖12,項E)，表明Hsp70不在受體的細胞調(diào)節(jié)中起作用。
[0181] 圖12:TLR2對于全部由Hsp70誘導的IL-10產(chǎn)生、MHC II表達減少和急性排斥反應(yīng) 抑制作用是必需的。（A)將從WT動物或TLR2 K0的LN引流皮膚抗原中分離出來的DC用0VA或 Hsp70處理24h，并通過實時PCR分析IL-10mRNA水平。將β-肌動蛋白用作參照物。（B)將WT或 TLR2 Κ0 BMDC用0VA、Hsp70或PGN處理24h，并通過流式細胞儀測量上清液中的IL-10濃度。 (C)從WT動物或TLR2 K0的LN引流皮膚抗原分離出的DC的CDllc+I-Abhi細胞、CDllc+I-Abint 細胞和CDllc+1-Ab1?細胞的代表圖和百分數(shù)。(D)將WT動物的皮膚移植物或TLR2 K0的皮膚 移植物在冰上的具有60yg/mL的0VA或Hsp70的溶液中浸漬60分鐘。在此之后，將處理過的移 植物縫合到BALB/c動物的后背中且每日監(jiān)測接受度。（E)如同在D中，但是供體是BALB/c WT，受體是B6WT或K0 TLR2。圖形以平均值土 SEM表示。*，P〈0 · 05; #，P〈0 · 01; *#，P>0 · 001。 每組η = 3-4只小鼠。3個獨立實驗的代表性結(jié)果。
[0182] 隨后，分子事件的特征為，在Hsp70刺激后在IL-10產(chǎn)生途徑中的TLR2結(jié)合之后。 ERK是參與免疫系統(tǒng)的不同細胞中IL-10表達的主要分子。最近報道了在TLR2結(jié)合后，通過 ERK的IL-10產(chǎn)生。當用Hsp70處理BMDC時，在15分鐘的刺激之后，注意到這些細胞中磷光體 ERK水平(p-ERK)的增加（圖13,項A)。當用Hsp70處理的BMDC來自TLR2 K0時，未注意到該增 加（圖13,項B)。除了 ERK，與IL-10產(chǎn)生相關(guān)且與對移植的耐受性相關(guān)的重要的轉(zhuǎn)錄因子是 STAT3。
[0183] 先前證明了Hsp70可在源自骨髓的抑制細胞(MDSC)中激活STAT3,導致免疫抑制。 在本發(fā)明人的研究小組進行的研究中，在刺激后45分鐘，Hsp70在BMDC中誘導STAT3的磷酸 化(圖13，項C)。這種磷酸化取決于在處理過的BMDC中的TLR2表達(圖13，項D)。
[0184] 為了證明ERK激活是否在該途徑中位于STAT3下游，使用抑制劑PD98059抑制在 BMDC中的ERK表達。在這些細胞中的ERK抑制作用消除了用Hsp70刺激的STAT 3激活（圖13， 項E)。還注意到，ERK或STAT3對于Hsp70誘導的IL-10產(chǎn)生是必需的（圖13,項F)。此外，Hsp70 誘導的MARCH-1表達增加依賴于TLR2-ERK-STAT3途徑（圖13，項G)。
[0185] 圖13: Hsp70通過TLR2激活ERK-STAT3，導致IL-10產(chǎn)生減少和MARCH-I表達增加。在 (A)中：將BMDC用PMA處理30分鐘；用Hsp70處理15、30或45分鐘；或不進行刺激。通過流式細 胞儀測量P-ERK表達。（B)在小鼠 WT或TLR2 KO的BMDC中的p-ERK表達的MFI和代表性直方圖， 所述小鼠 WT或TLR2 KO用Hsp70處理15分鐘或不進行刺激。（C)將BMDC用PMA處理15分鐘；用 Hsp70處理15、30或45分鐘；或不進行刺激。通過流式細胞儀測量P-STAT3表達。（D)在小鼠 WT 或TLR2 KO的BMDC中的p-STAT3表達的MFI和代表性直方圖，所述小鼠 WT或TLR2 KO用Hsp70 處理45分鐘或不進行刺激；和(E)在用Hsp70的刺激之前，在有或沒有用PD98059抑制的ERK 的BMDC中的P-STAT3表達的MFI和代表性直方圖。（F)在用Hsp70刺激24h之前，用PD98059 (ERK)抑制劑或AG490(JAK2/STAT3)抑制劑處理BMDC 60分鐘。在此之后，使用CBA小鼠炎癥 試劑盒，通過實時PCR測量IL-10mRNA水平并通過流式細胞儀測量該細胞因子的濃度。(G)在 用Hsp70刺激24h之前，用H)98059(ERK)抑制劑或AG490(JAK2/STAT3)抑制劑處理BMDC WT或 TLR2 K060分鐘。在此之后，通過實時PCR分析MARCH-I mRNA水平。將β-肌動蛋白用作內(nèi)參。 圖形以平均值土 SEM表示。*，？〈0.05;#，？〈0.01;*林，？>0.001。每組11 = 3只小鼠。3個獨立實 驗的代表性結(jié)果。
[0186] 除了 IL-10產(chǎn)生誘導，結(jié)果表明ERK和STAT3對于減少在從鼠類LN中分離出來并用 Hsp70刺激的DC中的MHC II表達是必需的（圖14)』RK或STAT3被抑制的DC在用Hsp70刺激后 無法減少MHC II表達(圖14)。
[0187] 圖14.ERK和STAT3對于減少Hsp70誘導的MHC II表達是必需的。將從LN引流皮膚抗 原中分離出來的DC用ERK(PD98059)抑制劑或JAK2/STAT3(AG490)處理60分鐘，然后用Hsp70 刺激24h。在此之后，通過流式細胞儀分析這些細胞的I-A b表達。
[0188] 免疫調(diào)節(jié)方法概要
[0189] 目前針對移植受體患者的療法的特征在于非常強的免疫抑制，導致移植后的嚴重 問題，如感染和腫瘤。在本專利申請中，也公開了基于在移植物的DC-一其將迀移到受體 DLN--中調(diào)節(jié)/MHC II表達減少的免疫調(diào)節(jié)方法，其使移植物存活時間加倍而不添加任何 其他藥物或免疫抑制藥物。圖15示出了 Hsp70提供了這種效果，在DC中誘導MARCH-1表達增 加，以及隨后的通過經(jīng)由TLR2-ERK-STAT3的IL-10產(chǎn)生的MHC II表達降低。
[0190] 本發(fā)明的方法中描述的信號通路模型的示意性代表:調(diào)節(jié)劑如Hsp70可直接與DC 的TLR2結(jié)合，或與如現(xiàn)有技術(shù)記載的可與TLR2配合的細胞內(nèi)吞作用受體結(jié)合。該結(jié)合觸發(fā) ERK激活和隨后的STAT3激活，導致IL-10產(chǎn)量增加。該IL-10將誘導MARCH-I表達增加，并因 此減少在DC膜中的MHC II表達。
[0191] 實施例2.篩選適用于制備移植器官離體保存和/或免疫調(diào)節(jié)的組合物的新分子實 體的方法。
[0192] 針對出人意料的實驗結(jié)果，發(fā)明人研究了其他分子實體是否可以提供由MARCH-I、 MHC II、⑶86調(diào)節(jié)而引起的免疫抑制效果。為了這個目的，最初認為保存組合物具有Hsp70 的合成類似物(例如，一些肽），并在研究的動物中評估了其與MHC II的結(jié)合潛力，以提供相 同的免疫抑制劑作用。由發(fā)明人所設(shè)想的實驗提供了篩選適用于制備移植器官離體保存和 免疫調(diào)節(jié)的組合物的新分子實體的方法，所述方法包括以下步驟：
[0193] -第一步:將一種或多種分子實體與具有選自MARCH-I、MHC II、⑶86或其組合的蛋 白的細胞接觸；
[0194] -第二步:評估在以這種方式處理的細胞中MARCH-I、MHC II和/或⑶86的調(diào)節(jié)量； 和
[0195] -第三步:選擇在以這種方式處理的細胞中具有調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或⑶86的 量的較大潛力的分子實體。
[0196] 在一個實施方案中，所述方法為其中具有選自MARCH-I、MHC II、⑶86或其組合的 蛋白的所述細胞為樹突細胞或自身待被移植的器官的細胞。
[0197] 在一個實施方案中，所述方法為其中評估在細胞中的MARCH-I、MHC II和/或⑶86 的量的步驟通過測量轉(zhuǎn)錄自編碼MARCH-I、MHC II和/或⑶86的基因的mRNA的實時PCR來完 成。
[0198] 在一個實施方案中，所述方法還包括在用器官保存和/或免疫調(diào)節(jié)的組合物接觸 后，體外評估器官細胞的細胞可行性和/或細胞損傷的存在的步驟，如在實施例4和5中更詳 細記載的。
[0199] 為了研究關(guān)于使用Hsp70片段調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或⑶86的可行性，用生物信 息學程序繪制源自Hsp70蛋白序列的合成肽，該合成肽隨后由公司JPT Innovative Peptide Solutions(德國柏林)合成。
[0200] 將結(jié)核分枝桿菌Hsp70(GI :61222666)的氨基酸序列輸入到IEDB Analysis Resource(http://tools·immuneepitope·org/analyze/html/mhc_II_binding.html)，預 覽肽序列結(jié)合至MHC分子II的概率的服務(wù)器根據(jù)結(jié)合概率為肽提供分數(shù)。分數(shù)越低，肽與 MHC II結(jié)合的概率越高。小于50的分數(shù)被認為是具有高親和力，大于50且小于500的分數(shù)被 認為是具有中等親和力，大于500且小于5000的分數(shù)被認為是具有低親和力。然后選擇具有 高親和力的四種肽、具有中等親和力的兩種肽和具有低親和力的一種肽。隨后，在結(jié)核分枝 桿菌Hsp70和鼠 Hsp70(分別為GI :61222666和GI :3986773)之間進行序列比對，確定在兩個 肽之間的同源性。下面的表3表明所選擇的肽。
[0201] 表3
[0202]
[0203]
[0204] 用Hsp70的片段(肽)的浸漬處理導致皮膚移植物存活增加
[0205]根據(jù)發(fā)明人得到的結(jié)果，Hsp70的急性排斥反應(yīng)抑制依賴于Treg細胞CD4+CD25+。 此外，Hsp70的皮下注射增加了 Treg在DLN中的百分數(shù)。最近，證明了在DC中的MARCH-I表達 是形成胸腺Treg(tTreg)的基礎(chǔ)。解釋所有這些觀察的模型是以下事實:Hsp70將誘導MHC II、⑶86和⑶80表達減少以及IL-10產(chǎn)生和MARCH-I增加，將產(chǎn)生有利于Treg生成的誘導的 DC。盡管期望在接受用Hsp70處理的移植物的動物的DLN中Treg百分數(shù)增加，但是不能觀察 到這樣的現(xiàn)象（圖7,項C)?？赡苁堑土康目乖@得受體，Hsp70的片段(或肽)足夠引起Treg 可檢測的增殖。
[0206]除了所有的這些觀點，也有證據(jù)表明，用Hsp70孵育的DC具有Hsp70的MHC II肽，其 將為Treg結(jié)合劑。用Hsp70的肽處理自身免疫疾病的實驗模型能夠通過誘導T細胞產(chǎn)生特異 性針對Hsp70的IL-10來克服炎癥反應(yīng)。
[0207]發(fā)明人還測試了其他作為MARCH-I、MHC II和/或⑶86調(diào)節(jié)劑的分子實體。為了這 個目的，合成并測試衍生自Hsp70蛋白序列的肽。測試了四種高親和力肽、兩種中等親和力 肽和一種低親和力肽。隨后，在結(jié)核分枝桿菌Hsp70和小鼠 Hsp70之間進行序列比對，測定肽 之間的同源性(表4)。
[0208]表4.選自結(jié)核分枝桿菌Hsp7 0序列的肽的特征。
[0209]

[0210] 使用在MacLeod和合作者的工作中記載的方案來證實在MHC II和T細胞刺激中選 擇的結(jié)合肽。為了這個目的，將BALB/c小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射具有100yg Hsp70+7yg LPS(作為 佐劑）的溶液。九天后，將脾細胞鋪板并用DMS0、60yg/mL的Hsp70或5yg/mL的每種選擇的肽 分別在體外再刺激24h。此后，通過流式細胞儀對培養(yǎng)物中Treg的存在和對上清液IL-10產(chǎn) 生進行分析。如在圖16項A中可以看出，本發(fā)明人證實了，當與DMS0相比，肽2能使⑶4+F0XP3 + (Treg)細胞百分數(shù)產(chǎn)生相當顯著的增加。
[0211] 此外，肽5也使Treg產(chǎn)生增加（圖16，項A)。然而，Hsp70也沒有誘導Tregs產(chǎn)生（圖 16,項A)，但在這種情況下是因為LPS作為佐劑被加入制備物中。如果在體系中沒有LPS， Hsp70將在這些條件下誘導這些細胞。
[0212] 也研究了當用選擇的肽刺激時，脾細胞的IL-10產(chǎn)生。為此，將源自按如上所述處 理的動物的脾細胞用DMS0、Hsp70或所有選擇的肽在體外再次刺激24h。在此之后，測定培養(yǎng) 物上清液中的IL-10的蛋白水平。注意到在用肽2而不是用肽5反復刺激后IL-10產(chǎn)生的少許 增加(圖16,項B)。
[0213] 正如預期的，用Hsp70的處理已經(jīng)導致了脾細胞的IL-10產(chǎn)生增加（圖16,項B)。對 于其他肽，沒有注意到顯著的IL-10產(chǎn)生。
[0214] 圖16.源自Hsp70的片段(肽）的T細胞的表位定位。將BALB/c小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射含 有100yg Hsp70+7yg LPS的溶液。九天后，將脾細胞鋪板并用DMS0(用作陰性對照，因為其用 于稀釋肽）、5yg/mL的肽Ε-α、60yg/mL的肽Hsp70或5yg/mL的每種選擇的肽分別在體外再刺 激24h。此后，（A)通過流式細胞儀分析細胞⑶4和⑶25的表達或(B)測定上清液IL-10濃度。 [0215]為了分析肽是否能抑制急性排斥反應(yīng)，進行了皮膚移植，其中通過用Hsp70、肽2、 肽5或0VA肽浸漬來處理B6WT供體的移植物。此后，將這些移植物縫合到BALB/c受體WT的后 背中并每日監(jiān)測它們的排斥反應(yīng)。
[0216] 出人意料地，當與〇VA肽(p =)和肽5 (p =)比較時，肽2強烈趨向于增加移植物接受 度（圖17)。并且正如預期的那樣，當與0VA肽和肽5比較但是未與肽2比較時，Hsp70抑制了急 性排斥反應(yīng)(圖17)。
[0217] 下面的表5表明了對于Hsp70以及PEPT2,在0VAPEPT、PEPT 2和PET 5之間的結(jié)果。 [0218] 表5.用Hsp70和PEPT2所得到的結(jié)果間的比較
[02191
[0220] 圖17示出了在鼠模型中，用Hsp70的片段(肽）的移植物處理增加皮膚同種異體移 植物接受度。在4°C將野生(WT)動物B6(I-A b)的皮膚移植物在具有60yg/mL的Hsp70、15yg/ mL的肽2、肽5或OVA肽的溶液中浸漬60分鐘。此后，將所述移植物縫合到BALB/c動物的后背 中。每日監(jiān)測動物。*，？〈〇.〇5。每組11 = 4只小鼠。
[0221] 實施例3:用于保存移植器官并用于抑制其排斥反應(yīng)一一增加移植物存活的組合 物
[0222] 浸漬處理，然后用Hsp70的局部處理增加皮膚移植物存活
[0223]為了更延長用Hsp70局部處理之后的移植物接受度，本發(fā)明人已經(jīng)實行了新的策 略，其中受體在第〇天接受用Hsp70或0VA處理過的移植物。
[0224] 隨后，根據(jù)移植物處理，每只動物接受2滴Hsp70或0VA溶液的局部施用，直到第7 天。即，接受用Hsp70處理過的移植物的動物接受Hsp70溶液的局部施用以及相同的0VA局部 施用。
[0225] 在圖18,項A中可以發(fā)現(xiàn)使用的策略的概述。值得注意的是，當與用0VA處理過的動 物比較時，在用Hsp70處理過的動物中的移植物存活要大得多（圖18，B和C以及表6)。此外， 該采取的策略稍微優(yōu)于用Hsp70的移植物單獨處理(圖18，項D)。
[0226] 表6:在皮膚同種異體移植物鼠模型中，用Hsp70或0VA的移植物浸漬處理，繼之7天 的Hsp70或0VA溶液的局部施用的效果。結(jié)合兩個獨立實驗得到結(jié)果。
[0227]
[0228] 3與0￥厶相比較
[0229] *Ρ〈〇·〇194
[0230] 表7.用Hsp70的處理間的比較
[0231]
[0232] *，？〈0.05;#，？〈0.001。每組11 = 5-7只小鼠。結(jié)合兩個獨立實驗得到結(jié)果。
[0233] 圖18示出了在鼠模型中，用一定劑量的Hsp70的移植物處理增加皮膚同種異體移 植物接受度。在4 °C將野生(WT)動物B6 (I-Ab)的皮膚移植物在具有60yg/mL的Hsp70或0VA的 溶液中浸漬60分鐘。此后，將移植物縫合到BALB/c(I-A d)動物的后背中。此外，在連續(xù)的7天 中，動物接受2滴具有60yg/mL的Hsp70或0VA的溶液的局部施用。每日監(jiān)測動物。（A)用于實 驗的處理策略的示意圖。（B)在Hsp70和0VA組中的急性排斥反應(yīng)的臨床進展照片記錄。（C) 接受A所述的處理的動物的移植物存活圖。（D)與接受用Hsp70或OVA處理的移植物的動物相 比，接受A所述的處理的動物的移植物存活圖。數(shù)據(jù)由先前實驗得到。
[0234]關(guān)于進一步的免疫抑制劑，用Hsp70的處理是最能誘導在樹突細胞上的MARCH-I的 一個。因此，在供體細胞上的MARCH-I的誘導已經(jīng)證明了增加移植物接受度的良好的策略。 由此，將通過Hsp70的MARCH-I誘導與通過兩種免疫抑制劑的誘導相比較，所述兩種免疫抑 制劑在臨床中廣泛用于排斥反應(yīng)處理并且已被報道在調(diào)節(jié)抗原呈遞的樹突細胞中起作用： 環(huán)孢霉素 A(CsA)和雷帕霉素(RAPA)。為了這樣做，分離淋巴結(jié)的樹突細胞，然后將其用CsA、 RAPA、Hsp70或IL-10(陽性對照）處理24小時。在此之后，通過實時PCR分析MARCH-I表達增 加。實驗結(jié)果(例如在圖24中所示的那些)表明對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Hsp70是唯一能夠誘導DC上 MARCH-I的處理。當與陽性對照（IL-10)比較時，Hsp70在更高的水平誘導MARCH-I。當與培養(yǎng) 基比較時，CsA以及RAPA不能調(diào)節(jié)在DC上的該分子。
[0235] 實施例4-離體器官保存液:細胞損傷評估
[0236] 將VER0細胞在冰上培養(yǎng)3 0h，與以下溶液接觸：1 )EuroCollins溶液；2) EuroCol 1 ins溶液+30yg/mL結(jié)核分枝桿菌Hsp70; 3)EuroCol 1 ins溶液+30yg/mL 0VA;或4) PBS lx(陰性對照）。在這個階段之后，分析了在上清液中的LDH的存在（圖25A)。根據(jù)以下的 描述評估釋放的LDH與存在于細胞中的總LDH的對比（圖25B)。在兩種情況下，用roS處理的 細胞呈現(xiàn)出LDH酶的大的釋放，表明細胞損傷高。然而，當用l)EuroCollins;2)EuroCollins +Hsp70 ;或3)EuroCol 1 ins+OVA處理細胞時，細胞損害顯著更小，表明向保存組合物加入 Hsp70沒有導致細胞損傷或可檢測細胞可行性的減少。
[0237] 方法-VER0細胞培養(yǎng)
[0238] 在37°C，5%⑶2中，在補充有10%的胎牛血清(FCS)(Cultilab)、lX必需氨基酸 (Gibco)、lX維生素(Gibco)和55μΜβ-巰基乙醇的DMEM(Cultilab)培養(yǎng)基中培養(yǎng)腎組織細 胞系VER0 (ATCC-CCL-81)的細胞。在96孔板中每孔放置5 X 104個細胞，孵育24h使細胞附著。 隨后，除去培養(yǎng)基并對細胞進行三種不同的處理：1 )EuroCo 11 ins保存溶液;2 )EuroCol 1 ins +30以8/1111^結(jié)核分枝桿菌!18。70;3祀111'〇(]〇11;[118+3(^8/1111^的0\^;或4)?133]^(陰性對照）。然 后在37 °C溫室外并與冰接觸，培養(yǎng)細胞30h，模仿冷凍貯存。
[0239] 細胞損傷的評估
[0240] 通過檢測如以上所定義處理并培養(yǎng)的VER0細胞的上清液中乳酸脫氫酶(LDH)來監(jiān) 測細胞損傷的存在。為了這樣做，根據(jù)制造商的推薦，使用了試劑盒(Bioclin-K014)以在分 光光度計(GE Healthcare)中讀出。除了監(jiān)測釋放的LDH，也監(jiān)測用PBS lx中的l%Triton在 攪拌下細胞裂解15分鐘之后，存在于裂解液中的LDH。用下面的公式計算相對的LDH:(釋放 的LDH*100)/總LDH。
[0241 ]實施例5-離體器官保存液:細胞可行性評估
[0242] 根據(jù)制造商的建議，使用UVE/D:EAD?Cell Viability(Life Technologies) 試劑盒監(jiān)測了處理過的并在冰上培養(yǎng)30h的VER0細胞的細胞可行性。在共焦顯微鏡(Zeiss) 下評估細胞。
[0243] 除了監(jiān)測LDH，用LIVE/DEAD試劑盒標記細胞并通過顯微鏡分析。在該實驗中，活細 胞是綠色且死細胞是紅色。在冰上靜態(tài)貯存30小時后，當與其他的處理比較時，用PBS處理 的細胞死亡更多。在EuroCollins組和EuroCollins+Hsp70組之間，在測量的可行性比例中 沒有顯著差異。
[0244] 本數(shù)據(jù)證實了本發(fā)明，并為證明所要求保護的主題的技術(shù)效果的數(shù)據(jù)提供了更多 科學的力量。目前的數(shù)據(jù)強化了使用MARCH-I、MHC II和/或⑶86事實上有益于移植器官離 體保存的組合物的結(jié)論。數(shù)據(jù)表明，Hsp70可與EuroCo 11 ins溶液一起使用，而不損害保存的 初始功能，具有提供免疫抑制劑效果的額外的優(yōu)勢一一調(diào)節(jié)待被移植的器官并降低排斥反 應(yīng)。
[0245] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將重視此處提出的知識，并將能夠在提出的實施方案中和以在所 附權(quán)利要求的范圍內(nèi)的其他形式重現(xiàn)本發(fā)明。
【主權(quán)項】
1. MARCH-I、MHC II和/或CD86的調(diào)節(jié)性物質(zhì)的用途，其特征在于其用于制備移植的器 官細胞的離體保存和免疫調(diào)節(jié)的組合物。2. 用于移植的器官的離體保存和免疫調(diào)節(jié)的組合物，其特征在于，其包括： -一種或多種器官保存液;和 -調(diào)節(jié)待被移植的器官細胞中的MARCH-I、MHC II和/或CD86的物質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其特征在于所述器官保存液選自W i η S C 0 S i η溶液 (Viaspan?) ;Eur〇-c〇llins(RENOGRAF@);組氨酸-色氨酸-酬戊二酸鹽化ΤΚ) 溶液一Cus化山'〇1嶺;Celsiw膨冷凍膽存液;或其組合。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3組合物，其特征在于所述物質(zhì)或MARCH-I、MHC Π 和/或CD86的調(diào) 節(jié)性分子實體為化P，其選自化p7〇;化p60;化p40;化p90;化pi 10;其片段或任何那些分子實 體的組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其特征在于所述化P為結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)的 Hsp70重組體。6. 根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其特征在于所述物質(zhì)或MARCH-I、MHC II和/或CD86的調(diào)節(jié) 性分子實體為膚，其選自鑒別為SEQ ID No:01、沈Q ID No:02、沈Q ID No:03、沈Q ID No: 04、沈Q ID No:05、沈Q ID No:06、沈Q ID No:07的膚；或其組合。7. 用于加工移植的離體器官細胞免疫調(diào)節(jié)組合物的方法，其特征在于其包括將一種或 多種器官保存液與至少一種MARCH-I、MHC II和/或CD86的量的調(diào)節(jié)性分子實體混合的步 驟。8. 用于移植器官的離體免疫調(diào)節(jié)的方法，其特征在于其包括將器官細胞與一種或多種 調(diào)節(jié)MARCH-I、MHC II和/或CD86的物質(zhì)離體接觸的步驟。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述離體器官選自皮膚、屯、臟和/或腎臟。10. 用于篩選適用于制備移植器官的離體保存和/或免疫調(diào)節(jié)的組合物的新分子實體 的方法，其特征在于其包括W下步驟： -第一步:將一種或多種分子實體與具有選自MARCH-I、M肥II、CD86或其組合的蛋白的 細胞接觸； -第二步:評估在W運種方式處理的細胞中MRCH-I、M肥Π 和/或CD86的量調(diào)節(jié);和 -第Ξ步:選擇在W運種方式處理的細胞中具有MARCH-I、MHC Π 和/或CD86的量調(diào)節(jié)的 較大潛力的分子實體。11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于具有選自MRCH-I、M肥II、CD86或其組合的蛋 白的所述細胞為樹突細胞或自身待被移植的器官的細胞。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于評估細胞中的MARCH-I、MHC II和/或CD86 的量的步驟是通過用對轉(zhuǎn)錄自編碼MARCH-I、Μ肥II和/或CD86的基因的mRNA的實時PCR進 行的測量來完成。13. 根據(jù)權(quán)利要求10、11或12的方法，其特征在于其還包括在接觸所述MARCH-I、M肥II 和/或CD86量的調(diào)節(jié)性分子實體后，體外評估離體器官細胞中的細胞可行性和/或細胞損傷 的存在的步驟。
【文檔編號】A61K38/16GK105939725SQ201480074696
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年7月30日
【發(fā)明人】C·B·C·博諾里諾, T·D·J·博爾赫斯
【申請人】巴西教育和援助聯(lián)盟