56] 3.實(shí)驗(yàn)試劑及器材
[0057] =水合二乙基二硫代氨基甲酸鋼（銅試劑）：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批 號(hào):F20111027
[005引分析天平、動(dòng)物天平、直尺、離屯、機(jī)、手術(shù)剪、眼科綴、灌胃針及注射器等。
[0化9] 4.實(shí)驗(yàn)方法
[0060](一)分組與給藥
[0061 ] Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組8只。具體分組 與給藥如下：
[0063] 從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，即第I天起，造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，共4周。
[0064] (二)觀察指標(biāo)
[0065] 分別在造模前(記為第0天）、造模第7、14、21和28天記錄大鼠體重，觀察大鼠飲食、 飲水、排便、活動(dòng)等情況。4周結(jié)束后，即第28天予大鼠麻醉后迅速取膜腺組織后處死大鼠， W10%的中性福爾馬林固定膜腺標(biāo)本，石蠟切片，肥染色，Masson染色行病理組織學(xué)檢查。
[0066] (S)病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0067] 皿染色切片評(píng)分:高倍鏡下觀察皿染色后膜腺組織形態(tài)學(xué)變化。采用文獻(xiàn)報(bào)道的 膜腺組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)膜腺腺泡細(xì)胞萎縮，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)：一:無(wú)改變;+:病變范圍在2-3個(gè)小葉內(nèi)；2+:病變范圍在一半小葉內(nèi)；3+:病變范圍超過(guò)一半小葉。每張切片在低倍鏡下 隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行評(píng)判。
[0068] Masson染色切片評(píng)分:高倍鏡下觀察膜腺組織小葉內(nèi)及小葉間纖維化程度，評(píng)分 標(biāo)準(zhǔn)為:〇分:無(wú)小葉內(nèi)及小葉間纖維化的病理改變;1分:上述改變輕微且局限于小葉內(nèi)（不 超過(guò)50 % ); 2分:上述改變?cè)谛∪~內(nèi)較廣泛(超過(guò)50 % ); 3分:上述損傷改變廣泛存在，或小 葉結(jié)構(gòu)破壞。每張切片在低倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分。6次分?jǐn)?shù)之和按W下標(biāo)準(zhǔn)分 級(jí)：一：0-2; + :3-6; +:7-12;化：13-18。
[0069] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0070] (1)體重變化
[0071] 結(jié)果如表1、圖1所示，造模開(kāi)始前，各組間體重?zé)o明顯差異（p〉〇. 05)。從第2周開(kāi) 始，各組體重變化開(kāi)始出現(xiàn)差異，其中膜酶組和中藥組體重均高于模型組(P<〇.05)。第3周 開(kāi)始，除正常組外，中藥組體重在各組中最高(P<〇. 05)。
[0072] 表1:各組大鼠體重變化(X +S，邑）
[0074] 注:與正常組比較Ap<〇. 05，與模型組比較*p<0.05，下同。
[0075] 從第2周開(kāi)始，各組體重變化開(kāi)始出現(xiàn)差異，其中膜酶組和中藥組體重均高于模型 組。
[0076] (2)病理學(xué)變化
[0077] ( - )肥染色結(jié)果
[0078] 結(jié)果如表2、表3、圖2所示。
[0079] 總體上，皿切片除正常組外其他各組均可見(jiàn)W小葉間為主的膜腺纖維化，小葉內(nèi) 亦有少量纖維形成及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括中性粒細(xì)胞、淋己 細(xì)胞、巨隧細(xì)胞等，其中模型組最為明顯，膜酶組和中藥組可見(jiàn)膜腺外分泌腺的變性細(xì)胞增 多。
[0080] 對(duì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的比較可見(jiàn)，各組的評(píng)分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。其中中藥組 明顯低于模型組(p<〇.05)。在腺泡細(xì)胞萎縮、纖維化形成方面，各組的評(píng)分比較同樣存在統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異(P<〇.05)。其中中藥組明顯好于模型組(p<0.05)。值得注意的是膜酶組與模型組 比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〉〇. 05)。
[0081 ]表2:各組大鼠膜腺炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況
[0083]表3:各組大鼠膜腺腺泡細(xì)胞萎縮情況
[0085](二)Masson染色結(jié)果 [00化]結(jié)果如表4、表5、圖3所不。
[0087]鏡下可見(jiàn)，Masson染色切片中除正常組外其他各組均可見(jiàn)W小葉間為主的膜腺膠 原纖維沉積，小葉內(nèi)亦有纖維形成。其中模型組最為明顯，可見(jiàn)小葉間及小葉內(nèi)增寬增厚的 藍(lán)色膠原纖維大量沉積;值得注意的是，膜酶組亦可見(jiàn)到與模型組類似的大量藍(lán)色膠原纖 維沉積于小葉間，小葉內(nèi)也有散在的膠原纖維沉積；中藥組較模型組及膜酶組膠原纖維沉 積明顯減少。中藥組與模型組、中藥組與膜酶組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.05)，膜酶組與模 型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〉〇. 05)。
[008引表4:各組大鼠膜腺小葉間Masson染色評(píng)分
[0091]表5:各組大鼠膜腺小葉內(nèi)Masson染色評(píng)分
[0093] 實(shí)施例2:本發(fā)明中藥復(fù)方制劑對(duì)膜腺纖維化因子影響的研究
[0094] 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:同實(shí)施例1。
[0095] 2.實(shí)驗(yàn)藥物：
[0096] 實(shí)驗(yàn)藥物為本發(fā)明的中藥復(fù)方制劑，同實(shí)施例1;
[0097] 陽(yáng)性對(duì)照藥為膜酶腸溶膠囊，同實(shí)施例1。
[0098] 3.實(shí)驗(yàn)試劑及器材:同實(shí)施例1。
[0099] 4.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
[0100] (1)免疫組化檢測(cè)膜腺層粘連蛋白（LN)表達(dá)情況
[0101] LN是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，是反應(yīng)膜腺纖維化的優(yōu)良指標(biāo)，具有很好的可 靠性。
[0102] 實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)VogeImann R , Ruf D , Wagner M , et al . Ef f ectS of fibrogenic mediators on the development of pancreatic fibrosis in a TGF-0 !transgenic mouse modeI.Am J Physiol Gastrointest liver Physiol.2001；280(1): 164-172.
[0103] 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6、圖4所示，可見(jiàn)鏡下各組層粘連蛋白在膜腺腺泡及間質(zhì)中均有 表達(dá)，四組比較中正常組表達(dá)最弱，模型組表達(dá)最強(qiáng)，中藥組較模型組、膜酶組均表達(dá)弱，（P <0.05)。
[0104] 表6:各組大鼠層粘連蛋白（LN)表達(dá)評(píng)分
[0107] 注:與正常組比較Ap<〇. 05，與模型組比較*p<0.05
[0108] (2)免疫組化檢測(cè)膜腺基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)表達(dá)情況
[0109] 基質(zhì)金屬蛋白酶-I(MMP-I)負(fù)責(zé)纖維化成分的降解，是纖維化逆轉(zhuǎn)過(guò)程中十分重 要的成分。
[0110] 實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)VogeImann R , Ruf D , Wagner M , et al . Ef f ectS of fibrogenic mediators on the development of pancreatic fibrosis in a TGF-0 !transgenic mouse modeI.Am J Physiol Gastrointest liver Physiol.2001；280(1): 164-172.
[0111] 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7、圖5所示，本實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)MMP-I主要在間質(zhì)細(xì)胞的胞核表達(dá)，鏡 下可見(jiàn)正常組中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少，但染色強(qiáng)度高，說(shuō)明纖維組織少；與之對(duì)應(yīng)的是，膜酶組及 模型組中陽(yáng)性細(xì)胞增多，但染色強(qiáng)度低，說(shuō)明纖維組織增多。對(duì)MMP-I的比較可見(jiàn)各組評(píng)分 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.05)，其中中藥組與其他=組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，但膜 酶組與模型組比較無(wú)明顯差異(P〉〇.05)。
[0112] 表7:各組大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-1 (MMP-1)表達(dá)評(píng)分
[0114] 注:與正常組比較Ap<〇. 05，與模型組比較*p<0.05
[0115] (3)免疫組化檢測(cè)膜腺基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-I(TIMP-I)表達(dá)情況
[0116] 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-I(TIMP-I)主要負(fù)責(zé)抑制纖維降解酶，如MMP-I的活 性，可促進(jìn)纖維化形成。
[0117] 實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)VogeImann R , Ruf D , Wagner M , et al . Ef f ectS of fibrogenic mediators on the development of pancreatic fibrosis in a TGF-0 !transgenic mouse modeI.Am J Physiol Gastrointest liver Physiol.2001；280(1): 164-172.
[0118] 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8、圖6所示，本實(shí)驗(yàn)中可觀察到TIMP-I主要在間質(zhì)細(xì)胞胞漿表達(dá)， 正常組中血管壁及膜管周圍極少量表達(dá);模型組及膜酶組在纖維化區(qū)及膜腺間質(zhì)表達(dá)稍 強(qiáng)；中藥組介于W上兩者之間。各組評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.05)，其中中藥組與其他=組比 較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.05)，但膜酶組與模型組比較無(wú)明顯差異(p〉0.05)。
[0119] 表8:各組大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (TIMP-I)表達(dá)評(píng)分
[0121] 注:與正常組比較Ap<〇. 05，與模型組比較*p<0.05