促進(jìn)傷口愈合的制劑及其制備方法及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明相關(guān)于一種醫(yī)藥制劑，特別是相關(guān)于一種促進(jìn)傷口愈合的制劑及其制備方 法及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病為全球常見(jiàn)的慢性疾病，是一種生物體將葡萄糖（糖類(lèi)）轉(zhuǎn)換成能量的方 式出現(xiàn)變化的疾病。原因?yàn)樯眢w無(wú)法制造足夠的胰島素，或是無(wú)法有效利用體內(nèi)制造的胰 島素以進(jìn)行糖類(lèi)的轉(zhuǎn)換。糖尿病易引發(fā)多種并發(fā)癥，其中之一為血管病變。高血糖使紅血 球的細(xì)胞膜變硬，導(dǎo)致血流不易通過(guò)微細(xì)血管而到達(dá)傷口組織。且，糖尿病患體內(nèi)的血紅素 亦不易釋放出氧氣，而造成傷口組織缺氧以及營(yíng)養(yǎng)素不足。此外，高血糖亦會(huì)影響纖維母細(xì) 胞以及上皮細(xì)胞的增生，因此，糖尿病患的傷口容易停滯在發(fā)炎期，而演變成慢性潰瘍。
[0003]目前相關(guān)于糖尿病患者傷口愈合的治療方式主要包括高壓氧治療、含銀活性碳纖 維敷料、以及人類(lèi)血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derivedgrowthfactor,FOGF)凝膠。高 壓氧治療系將病患置于高壓艙內(nèi)，艙內(nèi)加壓并維持在2. 5絕對(duì)大氣壓下，使人經(jīng)由其頭上 所載的氧氣面罩吸取純氧氣，以提高血中含氧濃度，進(jìn)而改善組織缺氧、促進(jìn)傷口愈合、以 及增強(qiáng)白血球的殺菌能力。然而此方式可能因高壓造成肺部、耳膜、以及鼻竇的壓力傷害、 因高濃度氧氣而造成抽搐、以及治療后因水晶體變腫而導(dǎo)致視力改變。再者，此治療方式對(duì) 于病患極為不便，因病患無(wú)法自行于家中操作。含銀活性碳纖維敷料系由PET不織布、含銀 活性碳纖維布、以及聚乙烯（polyethylene,PE)膜三層結(jié)構(gòu)所組成。當(dāng)敷料接觸傷口滲液 時(shí)，可藉由活性碳纖維本身良好的吸附性，以吸附血水滲液及細(xì)菌。同時(shí)，銀離子可破壞細(xì) 菌的細(xì)胞膜及細(xì)胞核，而達(dá)到殺菌的效果。此外，活性碳纖維的遠(yuǎn)紅外線的功能具有促進(jìn)血 液循環(huán)以及加速新陳代謝的功效，進(jìn)而縮短傷口愈合的時(shí)間。然而，此產(chǎn)品對(duì)于糖尿病患傷 口的愈合仍需花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間。且，將納米銀粒均勻鍍?cè)O(shè)于活性碳纖維布上，是一件繁復(fù) 且加工不易的制作工序，加上納米銀粒的造價(jià)并不便宜，因而導(dǎo)致此產(chǎn)品的成本提高，從而 降低商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力。另外，人類(lèi)血小板生長(zhǎng)因子凝膠，含有基因重組的人類(lèi)血小板源生長(zhǎng)因子 (Recombinatehumanplatelet-derivedgrowthfactor,rh-PDGF)，藉由其所含的生長(zhǎng)因 子以促進(jìn)傷口愈合，然而其費(fèi)用昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的即在于提供一種促進(jìn)傷口愈合的制劑及其制備方法及使用方法，能 藉由簡(jiǎn)易且成本相對(duì)較低的制備方法以制備出具有加速傷口愈合的制劑，且此制劑能隨時(shí) 隨地應(yīng)用于病患身上。
[0005] 本發(fā)明為解決習(xí)知技術(shù)的問(wèn)題所采用的技術(shù)手段提供一種促進(jìn)傷口愈合的 制劑，包括細(xì)胞培養(yǎng)基（cellculturemedium),細(xì)胞培養(yǎng)基將經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮前軀細(xì)胞 (endothelialprogenitorcell)予以培養(yǎng)而形成，且經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞為將微小核 醣核酸（microRNA)let-7g轉(zhuǎn)質(zhì)至一內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞而形成。
[0006] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中系提供一種制劑，細(xì)胞培養(yǎng)基于培養(yǎng)內(nèi)皮前軀細(xì)胞之前系 為內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（endothelialbasalmedium,EBM)。
[0007] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中系提供一種制劑，還包括至少一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載 劑、稀釋劑或賦形劑。
[0008] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中系提供一種促進(jìn)傷口愈合的制劑，賦形劑為一甘油。
[0009] 本發(fā)明為解決習(xí)知技術(shù)的問(wèn)題所采用的另一技術(shù)手段系提供一種促進(jìn)傷口愈合 的制劑的制備方法，包括以下步驟：分離步驟：自人類(lèi)全血分離出單核球細(xì)胞，并將單核球 細(xì)胞種在涂布有人類(lèi)纖維連接蛋白的孔盤(pán)（human-fibronectin-coatedplate)以得到內(nèi)皮 前軀細(xì)胞；轉(zhuǎn)質(zhì)步驟：將微小核醣核酸let_7g轉(zhuǎn)質(zhì)至內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞，以得到經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮 前驅(qū)細(xì)胞；以及培養(yǎng)步驟：將經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞予以培養(yǎng)一預(yù)定時(shí)間而得到促進(jìn)傷口 愈合的制劑。
[0010] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中系提供一種制備方法，于培養(yǎng)步驟中，將經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮前 驅(qū)細(xì)胞的培養(yǎng)系為培養(yǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（endothelialgrowthmedium-2，EGM-2)7 天，并于第7天將內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換為內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接著持續(xù)培養(yǎng)2天以收 集內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基而得到促進(jìn)傷口愈合的制劑。
[0011] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中系提供一種制備方法，預(yù)定時(shí)間為6至10天。
[0012] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中系提供一種制備方法，分離步驟中，藉由梯度劑 Histopaque-1077以密度梯度離心法自人類(lèi)全血中分離出單核球細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明為解決習(xí)知技術(shù)的問(wèn)題所采用的另一技術(shù)手段系提供一種促進(jìn)傷口愈合 的方法，包括：將治療有效量的制劑投予至一生物體的傷口。
[0014] 在本發(fā)明的一實(shí)施例中系提供一種促進(jìn)傷口愈合的方法，生物體為一患有糖尿病 的患者。
[0015] 經(jīng)由本發(fā)明所采用的技術(shù)手段，在本發(fā)明中，特別選用內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞以及微小核 糖核酸let_7g以共同制備出促進(jìn)傷口愈合的制劑。其系因內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞具有分化成血 管內(nèi)皮細(xì)胞，以修復(fù)不完整的血管內(nèi)皮層，以及促使血管新生的能力。而微小核醣核酸中 let_7g則在過(guò)往研究發(fā)現(xiàn)其可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，治療及預(yù)防血管硬化等疾病。
[0016] 藉由將let_7g轉(zhuǎn)質(zhì)入內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞，以調(diào)控內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞的表現(xiàn)，并培養(yǎng)此經(jīng)轉(zhuǎn) 質(zhì)let-7g的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞，使內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞釋放出具有加速傷口愈合的因子至培養(yǎng)基中。 此培養(yǎng)基不僅具有良好的治愈傷口的效果，且，制備方法簡(jiǎn)單，所費(fèi)的時(shí)間及成本皆不高， 因此可普遍地應(yīng)用于傷口不易愈合的患者，例如糖尿病患，而不增加病患于經(jīng)濟(jì)上的壓力。 此外，本發(fā)明的制劑的使用方法為直接將制劑施用于病患的傷口處，操作方式簡(jiǎn)便而可隨 時(shí)隨地使用。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為顯示根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的一促進(jìn)傷口愈合的制劑的流程圖。
[0018] 圖2為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的一促進(jìn)傷口愈合的制劑用于一測(cè)試糖尿病小 鼠傷口愈合表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)中，糖尿病小鼠的傷口建構(gòu)的不意圖。
[0019] 圖3為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的促進(jìn)傷口愈合的制劑用于測(cè)試糖尿病小鼠傷 口愈合表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)中，各組糖尿病小鼠傷口愈合程度的實(shí)際影像圖。
[0020] 圖4為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的促進(jìn)傷口愈合的制劑用于測(cè)試糖尿病小鼠傷 口愈合表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)中，各組糖尿病小鼠傷口愈合速率的趨勢(shì)的折線圖。
[0021] 符號(hào)說(shuō)明
[0022] S1 分離步驟
[0023]S2 轉(zhuǎn)質(zhì)步驟
[0024]S3 培養(yǎng)步驟
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下根據(jù)圖1，而說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。該說(shuō)明并非為限制本發(fā)明的實(shí)施方式， 而為本發(fā)明的實(shí)施例的一種。
[0026] 依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的一促進(jìn)傷口愈合的制劑，包括細(xì)胞培養(yǎng)基（cell culturemedium)，細(xì)胞培養(yǎng)基將經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮前軀細(xì)胞（endothelialprogenitorcell) 予以培養(yǎng)而形成，且經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞為將微小核醣核酸（microRNA)let-7g轉(zhuǎn)質(zhì)至 一內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞而形成。
[0027] 詳細(xì)而言，細(xì)胞培養(yǎng)基于培養(yǎng)內(nèi)皮前軀細(xì)胞之前為內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (endothelialbasalmedium,EBM)，用以特別培養(yǎng)內(nèi)皮前軀細(xì)胞。
[0028] 為了使本發(fā)明的促進(jìn)傷口愈合的制劑穩(wěn)定性佳、應(yīng)用范圍廣泛、或減少其刺激性 等因素，本發(fā)明的制劑還包括至少一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。舉例而 言，將一甘油添加至制劑中，藉由甘油的黏性使得原本為液態(tài)的制劑轉(zhuǎn)變?yōu)榘肓黧w，以便于 本制劑應(yīng)用在外敷的用途上。
[0029] 在本實(shí)施例中，促進(jìn)傷口愈合的制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0030] (1)分離步驟：自人類(lèi)全血分離出單核球細(xì)胞，并將單核球細(xì)胞種在涂布有人類(lèi) 纖維連接蛋白的孔盤(pán)（human-fibronectin-coatedplate)以得到內(nèi)皮前軀細(xì)胞（步驟 S1)；
[0031] (2)轉(zhuǎn)質(zhì)步驟：將微小核醣核酸let_7g轉(zhuǎn)質(zhì)至內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞，以得到經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi) 皮前驅(qū)細(xì)胞（步驟S2);以及
[0032] (3)培養(yǎng)步驟：將經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)的內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞予以培養(yǎng)一預(yù)定時(shí)間而得到促進(jìn)傷口愈 合的制劑（步驟S3)。
[0033] 詳細(xì)而言，在本實(shí)施例中系藉由梯度劑Histopaque-1077以密度梯度離心法自人 類(lèi)全血中分離出單核球細(xì)胞以得到內(nèi)皮前軀細(xì)胞。將l〇ml的梯度劑Histopaque-1077以 及l(fā)〇ml的人類(lèi)全血加入50c.c.的離心管中均勻混合后，以700g的離心速度將其離心30 分鐘，離心后收集含有高濃度的單核球細(xì)胞的棕黃層（buffy-coatlayer)。接著，將棕黃層 懸浮于 30ml的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)中，以 250g的離心速度將其離 心10分鐘，舍棄上清液且保留細(xì)胞團(tuán)塊，再將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于DMEM中并予以離心，并重復(fù) 此步驟2~3次以得到單核球細(xì)胞團(tuán)塊。最后，將單核球細(xì)胞團(tuán)塊回溶于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培 養(yǎng)基-2(EndothelialCellGrowthMedium-2,EGM-2)，以 3xl06cells/ml的密度種在涂布 有人類(lèi)纖維連接蛋白的孔盤(pán)以得到內(nèi)皮前軀細(xì)胞。
[0034] 于轉(zhuǎn)質(zhì)步驟中，將75ng的let_7g稀釋在100μ1的培養(yǎng)基中，并將之震蕩以均勻 地混合。接著，加入3μ1的轉(zhuǎn)質(zhì)液至經(jīng)稀釋的let-7g，均勻混合后置于15~25°C的環(huán)境 下5~10分鐘以形成轉(zhuǎn)質(zhì)復(fù)合物。將轉(zhuǎn)質(zhì)復(fù)合物加到內(nèi)皮前軀細(xì)胞，靜置3小時(shí)后，再加 入培養(yǎng)基以完成轉(zhuǎn)質(zhì)。
[0035] 于培養(yǎng)步驟中，將經(jīng)轉(zhuǎn)質(zhì)let_7g的內(nèi)