Norsampsone B在制備治療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及化合物NorsampsoneB的新用途，尤其設(shè)及NorsampsoneB在制備治 療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 陽00引登革病毒（Denguevirus,DENV)能夠引起登革熱，其通過伊蚊傳播，嚴(yán)重感染者 出現(xiàn)登革出血熱和登革休克綜合癥，病死率極高。該病毒有四個(gè)血清型，血清2型是流行病 株。本病主要在東南亞，太平洋地區(qū)和美洲的熱帶和亞熱帶國家中流行。中國廣東省，海南 省，廣西省曾經(jīng)有14次不同規(guī)模的登革熱流行。中國登革熱的主要傳播媒介是埃及伊蚊和 白蚊伊蚊。前者分布于南方沿海地區(qū)，后者則在南北地區(qū)廣泛存在南北地區(qū)。有報(bào)道顯示 已經(jīng)從蚊子體內(nèi)分離到登革病毒。但是，目前在臨床上還沒有有效的治療藥物。
[0003] 因此，我們應(yīng)該高度重視對登革病毒的研究，加強(qiáng)對其的科研力度，做好相關(guān)知識 和藥物的儲(chǔ)備，為我國在防控登革病毒感染的方面做出一定的貢獻(xiàn)。
[0004] 本發(fā)明設(shè)及的化合物NorsampsoneB是一個(gè)2014年發(fā)表（Wen-Jing Tian,eta1. ,NorsampsonesA~D,FourNewDecarbonylPolycyclic PolyprenylatedAcylphloroglucinolsfromHypericumsampsonii.Organic Letters, 2014, 16, 3448-3451.)的新化合物，該化合物擁有全新的骨架類型 (Wen-JingTian,etal.,NorsampsonesA-D,FourNewDecarbonylPolycyclic PolyprenylatedAcylphloroglucinolsfromHypericumsampsonii.OrganicLetters， 2014, 16, 3448-3451.)，對于本發(fā)明設(shè)及的NorsampsoneB在制備治療或預(yù)防登革病毒感染 藥物中的用途屬于首次公開，由于屬于全新的結(jié)構(gòu)類型，而且其對于治療或預(yù)防登革病毒 感染的活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性 特點(diǎn)，同時(shí)用于治療或預(yù)防登革病毒感染顯然具有顯著的進(jìn)步。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是在于提供了一種NorsampsoneB在作為制備治療或預(yù)防登革病毒 感染藥物中的應(yīng)用，NorsampsoneB能夠有效地抑制登革病毒的增殖，但是對細(xì)胞毒性很 小，可進(jìn)一步開發(fā)為治療登革病毒感染疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0006] 所述化合物NorsampsoneB,結(jié)構(gòu)如式（I)所示：
[0007]
[0008] 所述NorsampsoneB在制備治療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的應(yīng)用，Norsampsone B對DENV有抑制作用。
[0009] 一種治療或預(yù)防登革病毒感染藥物，由NorsampsoneB為活性成分添加輔料制備 而成，制備方法為取5克化合物NorsampsoneB,加入糊精195克，混勻，常規(guī)壓片制成1000 片。
[0010] 一種治療或預(yù)防登革病毒感染藥物，由NorsampsoneB為活性成分添加輔料制備 而成，制備方法為取5克化合物NorsampsoneB，加入淀粉195克，混勻，裝膠囊制成1000 粒。
[0011] 本發(fā)明設(shè)及的NorsampsoneB在制備治療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的用途屬于 首次公開，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對于登革病毒抑制活性強(qiáng)得意想不 至IJ，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于登革病毒 感染的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0013] 1、NorsampsoneB對Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)：
[0014] Vero細(xì)胞是DENV的易感細(xì)胞。因此，本實(shí)驗(yàn)首先檢測NorsampsoneB對Vero細(xì)胞 的細(xì)胞毒性，W不同濃度的NorsampsoneB作用于Vero細(xì)胞，來了解在細(xì)胞存活率為90% W上的NorsampsoneB的最大使用濃度，為后續(xù)的NorsampsoneB對DENV的抑制作用實(shí)驗(yàn) 提供參考數(shù)據(jù)。 陽〇1引 2、NorsampsoneB對DENV的抑制實(shí)驗(yàn)：
[0016] W不同濃度的NorsampsoneB作用于已經(jīng)感染了DENV的Vero細(xì)胞，來獲得 NorsampsoneB對病毒的抑制效率。本實(shí)驗(yàn)中的NorsampsoneB的使用濃度均在使Vero細(xì) 胞在90%W上存活率的濃度的范圍內(nèi)，因此，可W排除NorsampsoneB的濃度過高而對實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析產(chǎn)生影響。
[0017] NorsampsoneB在治療或預(yù)防登革病毒感染藥物中的（抑制）應(yīng)用，其基本過程 是：
[0018] A.NorsampsoneB對Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)：
[0019] Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）是DENV的易感細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中的Vero細(xì)胞購 買于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資料中屯、；MTT試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；胎 牛血清（FetalBovineSerum,FB巧購買于美國GIBC0公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購買于德國 Greinerbioone公司；DMEM培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基購買于美國GIBC0公司。
[0020] 實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0021] 1 :接種Vero細(xì)胞：用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液， W每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種體積lOOul;
[0022] 2 :培養(yǎng)Vero細(xì)胞：在37°C，5% (v/v)C02培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；
[002引 3:加入NorsampsoneB:吸棄每個(gè)孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個(gè)孔中加入lOOul用 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度（0uM，0. 4uM，1. 2uM，3. 7uM，lluM， 33uM，100uM，300uM)的NorsampsoneB，對照孔加不加含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 基lOOul;
[0024] 4 :呈色：培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加MTT溶液lOul，在37°C，5% (v/v)C02培養(yǎng)條件下 繼續(xù)解育4小時(shí)，然后加入化rmazan溶解液，在37°C，5% (v/v)C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)解育4 小時(shí)，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)化rmazan全部溶解； 陽〇2引 （1):測量：在570nm測定吸收值。
[0026] 表1不同濃度的NorsampsoneB對Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
[0027]
[0028]B.NorsampsoneB對DENV的抑制實(shí)驗(yàn)：
[0029] WVero細(xì)胞為培養(yǎng)病毒DENV的細(xì)胞，M0I為0. 1，實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0030] 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接入Vero細(xì)胞，24小時(shí)后細(xì)胞長至單層（細(xì)胞覆蓋孔底 的面積約為80%~90% )，吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200ul，37°C吸附2小時(shí)。吸附完成 后，吸棄各孔中的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用含10% (v/v)胎牛血 清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定濃度（0uM，0. 04uM，0. 12uM，0. 37uM，1.luM，3. 3uM，10.OuM)的 NorsampsoneB，于37°C、5% (v/v)C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時(shí)，收集各個(gè)孔中的上清，做病 毒隧斑實(shí)驗(yàn)。
[0031] 病毒隧斑實(shí)驗(yàn)：在24孔板中接入Vero細(xì)胞，24小時(shí)后細(xì)胞長至單層（細(xì)胞覆蓋 孔底的面積約為80%~90%)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3% (v/v)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200ul，37°C吸附2小時(shí)。吸附完成后將各個(gè)孔的上清板 吸棄，用10% (v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入新鮮的45°C預(yù)熱的半固 定培養(yǎng)基[A成分：3% (v/v)FBS，2XMEM培養(yǎng)基，青霉素（美國AMRESC0)和鏈霉素（美國 AMRESC0)終濃度分別為 100U/ml，0.Img/ml;B成分：1% (w/v)的瓊脂糖（法國Bio