止的過渡時(shí)期，持續(xù)2周至4周；毛發(fā)生長終期，其是不活動(dòng)時(shí)期，持續(xù)2個(gè)月至4個(gè)月。盡 管缺少在人類中的直接證據(jù)，但對小鼠的研究表明，抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)TGF-β1產(chǎn) 生與毛發(fā)生長中期消退直接有關(guān)（Foitzik等人，2000)。在體外觀察到，分離的器官培養(yǎng) 的大鼠和人類毛發(fā)生長初期的毛囊的生長受TGF-β1抑制，此在若干方面中類似于毛發(fā)生 長中期樣轉(zhuǎn)化的早期。SEQIDNO1HB2233抑制角質(zhì)細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)TGF-βΙ表達(dá)的活性 可表明，本發(fā)明肽可能可用作治療劑來去除不期望毛發(fā)。另外，TGF-β的上調(diào)也通過下調(diào) MITF以及黑色素生成基因（從而導(dǎo)致灰發(fā)）而與黑色素細(xì)胞未成熟有關(guān)（Nishimura等人， 2010)。因此，本發(fā)明肽也具有用于諸如暗斑脫色或皮膚美白等應(yīng)用的極大可能性。
[0056] 皮贅（ST)、軟纖維瘤、纖維性上皮息肉或垂疣為描述常見良性皮膚病狀的所有替 代術(shù)語，所述常見良性皮膚病是由自周圍皮膚突出的一點(diǎn)皮膚組成。組織學(xué)上，ST為溫和 地覆蓋在棘皮癥表皮上的息肉狀病灶，即呈現(xiàn)輕度慢性炎癥和無力真皮的松散的水腫纖維 小管核。皮贅被視為皮膚的最常見纖維病灶。盡管未完全理解確切病因，但已報(bào)導(dǎo)與肥 胖、糖尿病、摩擦、肢端肥大癥、器官移植、人類乳頭狀瘤病毒和其他病狀的關(guān)聯(lián)（Zaher等 人，2007)。已證明生長因子和激素以及其受體在皮贅形成中起重要作用（Safoury等人， 2010ab)。事實(shí)上皮贅是由刺激表皮角質(zhì)細(xì)胞和真皮纖維母細(xì)胞增殖的因子造成，阻抑細(xì)胞 增殖的化合物（諸如本發(fā)明肽）可潛在地用于減緩進(jìn)程并防止形成皮贅。
[0057] 本發(fā)明包括以下實(shí)例以展示本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案。 實(shí)施例
[0058] 實(shí)施例1 :刺激細(xì)胞迀移和刮傷閉合的肽的鑒別
[0059] 使人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞（ATCCCRL-2404)在補(bǔ)充有5ng/ml人類重組上皮生長因子 (EGF)的無血清角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基（LifeTechnologies,GrandIsland,N.Y.)中生長。 將所述細(xì)胞接種至12孔板上并使其達(dá)到100%融合。使細(xì)胞單層饑餓24小時(shí)，然后使用 P200 (200μ1)移液管吸頭制備刮傷。洗滌刮傷并在時(shí)間0處進(jìn)行拍照。添加肽達(dá)20μg/ ml的最終濃度。將細(xì)胞保持于孵育器中37°C、5% 0)2下，孵育器具有>90%濕度，當(dāng)在室溫 下在短時(shí)間內(nèi)捕獲圖像時(shí)除外。在7小時(shí)至8小時(shí)處理后進(jìn)行刮傷閉合并且結(jié)果顯示于表 1中。
[0060] 表1.如使用角質(zhì)細(xì)胞刮傷閉合評估細(xì)胞迀移的刺激。在7小時(shí)處理后，經(jīng)PBS處 理的閉合區(qū)域的百分比取為100%，計(jì)算經(jīng)肽處理的傷口閉合并如相對于經(jīng)PBS處理的傷 口來呈現(xiàn)。
[0063]% 顯著
[0064] 實(shí)施例2 :對正常人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性
[0065] 為了確保肽對細(xì)胞無細(xì)胞毒性，將正常人類表皮角質(zhì)細(xì)胞接種至96孔板。在37°C 下在5%C02的存在下孵育所述板，以使得細(xì)胞生長至>95%融合。將肽稀釋至儲備溶液中 達(dá)50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和500μg/ml的濃度。將細(xì)胞培養(yǎng)基使用包含多種濃 度的肽的新鮮培養(yǎng)基置換，然后在37°C和5 % 0)2下孵育24小時(shí)。在處理結(jié)束時(shí)，使用自 ATCC(ManassasVA)購得的MTT測定試劑盒測量細(xì)胞活力。結(jié)果顯示于表1中。在50μg/ml至500μg/ml的濃度下肽不改變細(xì)胞活力，如使用MTT測定所測量。
[0066]實(shí)施例3 :刺激血管生成的肽的鑒別
[0067]使用自Millipore購得的體外血管生成測定試劑盒實(shí)施血管生成測定。簡而 言之，根據(jù)制造商說明書使用ECMATRIX?溶液制備基質(zhì)層。在補(bǔ)充有0.lmg/ml的肝素 (Sigma-Aldrich)、30ug/ml的ECGS(Sigma-Aldrich)和 10%胎牛血清（ATCC,Manassas,VA) 的完全F12K培養(yǎng)基（ATCC，Manassas，VA)中培養(yǎng)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC) (ATCC，Manassas，VA)。收獲細(xì)胞并且將其再懸浮于完全培養(yǎng)基中。在96孔板中將肽與細(xì) 胞以每孔大約5X103個(gè)至1X104個(gè)細(xì)胞混合，然后將細(xì)胞接種至聚合ECMATRIX?溶液的表 面上。將板在30°C、5%C02下孵育長達(dá)9小時(shí)至12小時(shí)。在倒置光學(xué)顯微鏡下定期檢查 管形成并且以3小時(shí)和5小時(shí)間隔獲取圖像并如下文所顯示向每一圖案指定數(shù)值。
[0068]
[0069] 如表2中所顯示。SEQIDNO1至7顯著刺激人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的毛細(xì)血管 形成。如所預(yù)期，將LL-37用作陽性對照并且它也刺激血管生成。將PBS用作陰性對照并 且細(xì)胞開始迀移并自身排列，但在5小時(shí)處未形成發(fā)芽或閉合多邊形。
[0070] 表2.新毛細(xì)血管形成的誘導(dǎo)的結(jié)果。彡3的值視為血管生成的顯著誘導(dǎo)
[0071]
[0072] % 顯著
[0073] 實(shí)施例4 :阻斷LTA誘導(dǎo)的E-6表達(dá)的肽的鑒別
[0074] 金黃色葡萄球菌LTA在人類表皮角質(zhì)細(xì)胞上誘導(dǎo)IL-6刺激。在無血清角質(zhì)細(xì)胞 培養(yǎng)基中使人類角質(zhì)細(xì)胞生長至>80%融合。將金黃色葡萄球菌LTA10ug/ml與每種肽 (50μg/ml) -起在室溫下預(yù)孵育30分鐘，然后將混合物轉(zhuǎn)移至角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中。使處 理持續(xù)24小時(shí)。去除懸浮液。在短暫旋轉(zhuǎn)以去除可能細(xì)胞碎片后，根據(jù)制造商說明書使用 自CellSciences(Canton,MA)購得的ELISA試劑盒使懸浮液經(jīng)受IL-6測試。如表3中所 顯示，SEQIDN0 1-7明顯中和或拮抗LTA刺激人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞上的IL-6表達(dá)的效應(yīng)。
[0075] 表3.阻斷人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞上的LTA誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)
[0076]
[0077] % 顯著
[0078] 實(shí)施例5 :肽調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞上的TGF-β表達(dá)的鑒別。
[0079] 使正常人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞（ATCCCRL-2404)生長在補(bǔ)充有5ng/ml人類重組上皮 生長因子（EGF)(LifeTechnologies,GrandIsland,N.Y.)的無血清角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基 中。每天用顯微鏡檢查所述細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)物變成50%至75%融合時(shí)，抽吸板中的培養(yǎng)基并 添加0. 25%胰蛋白酶/EDTA。當(dāng)細(xì)胞變成圓形并分離時(shí)，通過添加新鮮培養(yǎng)基來中和胰蛋 白酶。然后對細(xì)胞進(jìn)行離心并將沉淀物再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。使用血球計(jì)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸浮 液，并通過將100μ1的細(xì)胞懸浮液添加至每個(gè)孔中來將細(xì)胞總數(shù)調(diào)整至每孔約500個(gè)至 1000個(gè)細(xì)胞。通常，使用中心60個(gè)孔并且使用新鮮培養(yǎng)基填充外邊各孔以使蒸發(fā)降至最 低。當(dāng)在6小時(shí)至8小時(shí)孵育后細(xì)胞在每個(gè)孔中附著時(shí)，一式三份添加100μ1包含PBS的 新鮮培養(yǎng)基或2Χ期望濃度的肽。然后將微板在37°C和5%C02下孵育48小時(shí)至72小時(shí)。
[0080] 在孵育結(jié)束時(shí)，根據(jù)制造商說明書使細(xì)胞經(jīng)受CYT0SCAN?SRB細(xì)胞細(xì)胞毒性測定 (GBiosciences,St.Louis,M0)。簡而言之，將細(xì)胞固定，然后進(jìn)行磺酰羅丹明B(SRB)染色。 在大量洗滌后，使用增溶緩沖液使顏色增溶。使用微板讀數(shù)器在565nm下測量吸亮度。表 5中所顯示的結(jié)果為一式三份處理的平均值且超過對照的±10%的值視為顯著。
[0081]由SunnyBiodiscoveryLab(SantaPaula,CA)實(shí)施TGF-β刺激。簡而言之，使 正常新生兒人類表皮角質(zhì)細(xì)胞在cellnTec角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基（Switzerland)中生長。 根據(jù)培養(yǎng)基供應(yīng)商，培養(yǎng)基不含TGF-β。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，更新生長培養(yǎng)基并將細(xì)胞用50μg/ml 的肽一式三份處理72小時(shí)。在處理結(jié)束時(shí)，將懸浮液去除，活化并使用LEGENDMAXTM總 TGF-β1ELISA試劑盒（Biolegend,SamDiego,CA)量化。
[0082] 表4.本發(fā)明肽對細(xì)胞增殖和人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞上的TGF-β產(chǎn)生的活性
[0083]
[0084] %中等效應(yīng)
[0085] 實(shí)施例6 :代表性肽對S0R-300-FT人類牛皮癬組織構(gòu)建體的效應(yīng)。
[0086] 將S0R-300-FT?組織轉(zhuǎn)移至包含0. 9ml的預(yù)升溫測定培養(yǎng)基的6孔板中并平衡至 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件（37°C，5%C02)，持續(xù)1小時(shí)。在1小時(shí)平衡后，如以下用新鮮培養(yǎng)基再喂養(yǎng) 所述組織：1)對于24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，用0. 9ml的培養(yǎng)基喂養(yǎng)組織，且2)對于>24小時(shí)的時(shí)間 點(diǎn)，通過將細(xì)胞培養(yǎng)插入物（insert)置于洗滌器（零件號EPI-WSHR，MatTek公司）頂部 來用5ml的培養(yǎng)基供料組織。接著，將50μ1的測試品局部施加至牛皮癬性組織（η= 3)， 且將測試品以由贊助商選擇的3個(gè)濃度添加至培養(yǎng)基中。在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)間：a)用 300μL至400μL的PBS將組織局部沖洗3X，b)用無菌鉗緊密固持包含所述組織的插入物 且通過將插入物浸漬于PBS中來溫和地沖洗測試品并從插入物傾倒出培養(yǎng)基，并且c)在 沖洗和傾倒后立即將新鮮測試品再施加至組織（局部地50μL)。在t= 72小時(shí)處實(shí)施分 析（3X重復(fù)施加）。使用QiagenRT2第一鏈試劑盒（目錄編號330401)生成cDNA。使用 QiagenRT2SYBRGreenqPCRMastermix(目錄編號 330502)和QiagenRT2 引物測量相對 基因表達(dá)。使用Bio-RadCFX軟件實(shí)施分析。
[0087] 表5.在HB2233和卡泊三醇對S0R-300-FT組織處理后基因表達(dá)水平的倍數(shù)變化
[0088]
[0089] 實(shí)施例7:對正常人類皮膚替代物的基因譜分析。
[0090]使用由SunnyBiodiscovery公司（SantaPaula,CA)構(gòu)建的PCR陣列分析 84 個(gè) 編碼細(xì)胞外基質(zhì)和粘著分子的基因。簡而言之，EPIDERM?皮膚替代物（目錄編號EPI-212) 從MatTek(Ashland，MA)獲得并根據(jù)制造商說明書處置。在平衡過夜后，改變培養(yǎng)基并將 HB2233(330ug/ml)或水對照一式兩份施加于皮膚組織上并允許處理持續(xù)24小時(shí)。在處理 結(jié)束時(shí)，收集組織并將其保存在RNAlater溶液（Ambion，Austin，TX)中。萃取RNA并利用 IllustraminiRNAspin試劑盒（目錄編號 95017-489,GEHealthcare,Piscataway，NJ)進(jìn) 行純化。使用AgilentHP-8452A二極管陣列分光亮度計(jì)在260nm和280nm下評估經(jīng)純化 的總RNA。在樣品間平衡RNA的濃度，且通過實(shí)時(shí)定量PCR使用BioRadiCycleriQ檢測系 統(tǒng)、使用PCR陣列PAHS-121A并使用第一鏈合成試劑盒測量感興趣基因的表達(dá)。來自Qiagen 的SYBRGreen主混合物和PCR電泳條件，在使用RT2ProfilerPCR陣列數(shù)據(jù)分析3. 5版本 軟件將基因表達(dá)對5種管家基因標(biāo)準(zhǔn)化后，使用效率△ACt方法用于結(jié)果量化。若表達(dá)水 平適當(dāng)?shù)馗撸ㄐ∮?0個(gè)檢測循環(huán)）且在每一個(gè)一式兩份系列中調(diào)節(jié)為1. 5或更多，則認(rèn)為 有差別地表達(dá)基因。
[0091] 表6.對經(jīng)HB2233處理的EPIDERM?皮膚組織相對于經(jīng)水處理對照的選定基因表 達(dá)譜分析，以倍數(shù)變化表示
[0092]
[0094] 根據(jù)本公開無需過多實(shí)驗(yàn)即可獲得并實(shí)施本文所公開和要求保護(hù)的所有組合物 或方法。盡管已根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案描述本發(fā)明的組合物和方法，但所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明 了，可改變所述組合物和/或方法以及本文所述的方法的步驟或步驟順序，此并不背離本 發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體而言，應(yīng)明了，某些在化學(xué)和生理上均相關(guān)的試劑可代替 本文所述的試劑，同時(shí)可達(dá)成相同或相似的結(jié)果。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的所有此種類 似的替代和修改被視為屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0095] 本申請案中所確認(rèn)的所有專利和出版物均以引用方式全文并入本文中。
[0096] 參考文獻(xiàn)