可用于治療多種皮膚病的衍生自人類c-x-c趨化因子的四肽的制作方法
【專利說明】可用于治療多種皮膚病的衍生自人類c-x-c趨化因子的四 肽
[0001] 本申請主張對于2013年6月14日提交的美國臨時申請?zhí)?1/835, 424的優(yōu)先權(quán) 的益處，其以引用方式全文并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及具有生物、美容和治療活性的四肽。特定而言，本發(fā)明涉及衍生自若干 c-x-c趨化因子的保守區(qū)的四肽。這些肽已顯示促進細胞迀移、血管生成、中和細菌細胞組 分（諸如LTA誘導(dǎo)的促炎性信號）、并刺激正常表皮皮膚替代物的活性。本發(fā)明還涉及使用 這些肽促進傷口修復(fù)并治療各種影響皮膚和其他相關(guān)體表（諸如口腔）的傷害的方法。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 角質(zhì)細胞和真皮內(nèi)皮細胞為調(diào)控皮膚傷口和潰瘍的愈合的可溶性因子的主要來 源。由于降低的活性而導(dǎo)致的異常（包括生長因子產(chǎn)生、血管生成反應(yīng)、巨噬細胞功能、 膠原累積、表皮障壁功能和角質(zhì)細胞以及纖維母細胞迀移和增殖）均有助于缺陷性傷口愈 合。生長因子和細胞因子已用于供治療傷口的臨床環(huán)境。實例包括（但不限于）已顯示對 罹患不同病因的多種傷口和慢性皮膚潰瘍的患者的傷口愈合發(fā)揮有益效應(yīng)的TOGF(血小 板源生長因子（Rees等人，1999)和GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子），這些病因 包括羥基脲相關(guān)的腿潰瘍（Stagno等人，1999)、靜脈腿潰瘍（DaCosta等人，1999)、血紅素 病相關(guān)的潰瘍（Voskaridou等人，1999)和由切除術(shù)導(dǎo)致的傷口（Gaches等人，1998)。向患 有皮膚病灶的麻風(fēng)患者真皮內(nèi)施用GM-CSF也導(dǎo)致傷口愈合增強和角質(zhì)細胞的數(shù)量和層增 加（Kaplan等人，1992;Braunstein等人，1994)。
[0005] 生長因子和細胞因子二者均為蛋白質(zhì)。使用蛋白質(zhì)治療劑治療表皮傷口的困難通 常與所涉及蛋白質(zhì)的大尺寸相關(guān)。天然蛋白質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和制造成本對于廣泛臨床用途而 言令人望而卻步。制劑中的此類天然蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和兼容性也是主要問題。由于天然蛋 白質(zhì)的大尺寸而到達皮膚的目標層的滲透性較差常減少效力并解釋蛋白質(zhì)治療劑的失敗 有益效應(yīng)。為克服這些問題，攜帶大蛋白質(zhì)的活性的短肽應(yīng)滿足較不昂貴、成本有效的產(chǎn)生 以及處置和操縱簡單的需求。另外，短生物活性肽因?qū)Φ鞍酌篙^不敏感而被傷口組織較好 地吸收并保留。短生物活性肽的吸收特征的優(yōu)勢也使其成為除護理急性和慢性傷口以外的 用途、諸如治療與老化和日曬相關(guān)的皮膚問題的可行選擇。
[0006] 趨化因子在結(jié)構(gòu)上相關(guān)并代表具有不同生物活性的8kd至150kd蛋白質(zhì)的較大超 家族。它們通常在細胞刺激時分泌來在體內(nèi)平衡期間以及在炎癥期間控制白細胞運輸，且 對于先天性與適應(yīng)性免疫間的聯(lián)系是必要的。連同諸如整合素和選擇蛋白等黏著分子，趨 化因子及其受體主要用作促進具體細胞類型選擇性移動至靶向組織微環(huán)境中并移動出所 述微環(huán)境的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)的一部分（Key等人，2003 ;0no等人，2003)。趨化因子選擇性介導(dǎo) 嗜中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的區(qū)域特異性募集。除了為趨化性因子以外，趨化因子 也在體內(nèi)平衡的維持、血管生成/血管抑制、細胞分化和活化、傷口愈合、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、 淋巴組織的淋巴細胞歸巢和發(fā)育以及影響免疫反應(yīng)的總體1型/2型平衡方面起重要作用 (Behm等人，2012;Gillitzer等人，2001;Raman等人，2011;Romagnani等人，2004;Rossi等 人，2000) 〇
[0007]由四半胱氨酸基序來定義，根據(jù)其胺基末端處的半胱氨酸殘基的構(gòu)型將趨化因子 細分為四個不同家族。有兩個較大亞家族CCL亞家族（CCL1至CCL28)和CXCL亞家族（CXCL1 至CXCL16)以及兩個較小亞家族XCL亞家族（XCL1至XCL2)和CX3CL1亞家族（Bacon等人， 2003)。趨化因子的CXC亞家族在不同過程（包括炎癥、傷口愈合、生長調(diào)控、血管生成和腫 瘤生成）中起重要作用（Keeley等人，2008;2011)。許多趨化因子與內(nèi)皮細胞和細胞外基 質(zhì)上的蛋白聚糖的糖胺聚糖（GAG)部分相互作用（Handel等人，2005)。充當(dāng)硫酸肝素的模 型化合物的肝素是在體內(nèi)實際上每一個細胞上表達的最普遍的GAG類別。所有趨化因子均 與肝素GAG相互作用。
[0008] 在我們的研究中，注意到C-X-C趨化因子在其一級氨基酸序列中顯示一些序列類 似性但在二級結(jié)構(gòu)中高度保守。九種人類C-X-C趨化因子的一級氨基酸序列的檢查使用下 文"本發(fā)明的詳細說明，第1段落"中顯示的每一個趨化因子的NCBI登錄號揭露定位于處C 末端部分處的參與GAG結(jié)合的高度保守區(qū)。我們自GAG結(jié)合區(qū)生成四肽并測試生物活性。 令人驚奇地，所述四肽顯示不同生物活性，包括促進角質(zhì)細胞迀移、誘導(dǎo)人類臍靜脈內(nèi)皮細 胞上的血管生成、中和LTA誘導(dǎo)的促炎性細胞因子和調(diào)節(jié)細胞生長和生長因子產(chǎn)生。所述 四肽可用作用于改善多種皮膚病的藥品和化妝品二者。
[0009]發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明涉及可用于促進哺乳動物的傷口愈合的短生物活性肽。由分離肽優(yōu)選地靶 向的傷口為影響皮膚和相關(guān)黏膜表面的那些傷口。盡管并不限于任何特定機制，但本發(fā)明 肽能夠通過刺激細胞迀移和血管生成來影響傷口愈合。本發(fā)明肽可以體外和體內(nèi)方式二者 使用，并且能夠誘導(dǎo)角質(zhì)細胞的前述活性。
[0011] 本發(fā)明的一個實施方案涉及式（I或W-XfK-l的分離四肽，其中XI可選自E、Q 和K;且X2可選自M、F、I、W、V和L。分離肽可包含氨基酸的L-或D-對映異構(gòu)體形式或其 組合。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，分離肽可偶聯(lián)至載體蛋白，或經(jīng)由利用脂肪酸進行C末 端酰胺化或N末端酰化（即，脂化）來修飾。當(dāng)施加至皮膚及其傷口時，這些添加增強肽的 生物活性。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案，所述分離肽均在3位處包含賴氨酸。分離肽的 具體實施方案包含SEQIDNO: 1、2、3、4、5、6和7，其均顯示對細胞迀移的刺激活性并且影響 傷口修復(fù)。
[0013] 下文所顯示的所衍生四肽適合式（I或W-Xi-K-l，其中XI可選自E、Q和K;且X2 可選自M、F、I、W、V和L。
[0014]

[0015] 本發(fā)明的另一實施方案涉及包含藥學(xué)上或美容學(xué)上可接受的載體和一種或多種 前述肽的治療或化妝品組合物。前述組合物可用于制造用于在使哺乳動物的皮膚傷口愈合 的應(yīng)用中使用的藥劑或化妝品組合物。優(yōu)選地，此種組合物中的肽的濃度在約0. 1yg/mL 至約500μg/mL或約0. 1μg/mL至約20mg/mL的范圍內(nèi)。組合物的優(yōu)選形式為氣溶膠、乳 液、液體、溶液、洗劑、乳膏、糊劑、油膏、粉劑、凝膠和泡沫劑（foam)。
[0016]另外，本發(fā)明的肽及包含其的組合物可提供納入一般皮膚護理和化妝品制劑中的 有用特性，所述制劑諸如多種皮膚化妝品、皮膚乳膏、洗劑、防曬液和治療洗劑或乳膏，諸如 用于激光手術(shù)后護理的抗痤瘡制劑。
[0017] 本發(fā)明還涉及使用前述組合物用于愈合哺乳動物的傷口的方法。通常，所述治療 方法需要向傷口和或炎癥性病狀、尤其皮膚（表皮）和相關(guān)黏膜組織的那些施用有效量的 含肽組合物，持續(xù)有效時間量。此類傷口包括外科傷口、擦傷、水皰、燒傷、裂傷、潰瘍、挫傷、 皮疹、瘢痕、妊娠紋和由于老化和環(huán)境暴露的內(nèi)在和外在效應(yīng)導(dǎo)致的皮膚損害，包括起皺 紋、皮膚下垂和光損害。炎癥性皮膚病包括牛皮癬、異位性皮膚炎和酒糟鼻以及因去除毛發(fā) 引起的炎癥。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 趨化因子調(diào)節(jié)傷口愈合、炎癥性/抗炎癥性和血管生成/血管抑制活性。它們通 過結(jié)合至白細胞上的受體的G蛋白偶合受體（GPCR)類別和目標組織中的細胞表面糖胺聚 糖（GAG)來發(fā)揮其功能。趨化因子與GAG的結(jié)合是通過GAG上的帶負電荷的鏈與趨化因 子中的堿性殘基團簇的相互作用生成的離子力來介導(dǎo)（Handel等人，2005)。在體內(nèi)，情況 更加復(fù)雜，并且已報導(dǎo)趨化因子通過產(chǎn)生固定化或趨觸性梯度來起作用，梯度引導(dǎo)細胞至 炎癥部位的迀移（Proudfoot，2006)。GAG-趨化因子相互作用可在沿細胞外基質(zhì)確立梯度 中起關(guān)鍵作用且可促進趨化因子與其G蛋白質(zhì)偶合受體的結(jié)合。GAG或硫酸肝素（HS)蛋 白聚糖也可作為信號傳導(dǎo)的功能性趨化因子共同受體起作用，從而導(dǎo)致形成GAG/趨化因 子和趨化因子受體的三元復(fù)合物（Handel等人，2005)。關(guān)于具體趨化因子的研究已映射 GAG與趨化因子的結(jié)合位點。在九種人類C-X-C趨化因子前體蛋白質(zhì)（包括GRO-α前體 (CXCL-1)、趨化因子2前體（CXCL-2)、趨化因子3前體（CXCL-3)、趨化因子4前體（CXCL-4)、 趨化因子5前體（CXCL-5)、趨化因子6前體（CXCL-6)、IL-8前體（CXCL8)、趨化因子9前體 (CXCL-9)、趨化因子11前體（CXCL-11))的保守GAG結(jié)合位點的一級氨基酸序列的密切檢 查中，我們發(fā)現(xiàn)尤其感興趣的保守四肽區(qū)。此研究中所定義的保守四肽段定位于部分GAG 結(jié)合區(qū)內(nèi)。下文是選定人類c-x-c趨化因子前體的C末端序列的比對的示意性說明并且突 出短四肽。比對是使用NCBI網(wǎng)站（ncbi.nlm.nih.gov)上關(guān)于的多個蛋白質(zhì)序列比對的 COBALT程序生成。僅顯示比對中的每一趨化因子的C末端部分并且數(shù)字為序列中的殘基 的始端和末端。A.GRO-α前體（NCBI登錄號P09341. 1) ;B.趨化因子2前體（NCBI登錄號 NP_002080. 1) ;C.趨化因子3前體（NCBI登錄號NP_002081. 2) ;D.趨化因子4前體（NCBI 登錄號P80162. 4) ;E.趨化因子5前體（NCBI登錄號NP_002985. 1) ;F.趨化因子6前體 (NCBI登錄號ΝΡ_002984· 1) ;G.IL-8前體（NCBI登錄號）；Η·趨化因子9前體（NCBI登錄 號NP_002407. 1) ;I.趨化因子 11 前體（NCBI登錄號EAX05774. 1)。
[0020]
[0021] 比對中顯示在CXC趨化因子中高度保守的短四肽基序。*指示趨化因子的部分GAG 結(jié)合位點。四肽顯示保守骨架I-K-。除具有纈氨酸（V)的IL-8以外，所有其他IL-8在四 肽基序的1位處具有異亮氨酸（I)且在3處具有賴氨酸（K)。因此，（I或W-Xi-K-A式可 用于代表所生成且在表1中所顯示的四肽。值得注意的是，趨化因子的GAG結(jié)合區(qū)也參與 二聚體形成，這是因為大部分CXC趨化因子可逆地以單體和二聚體形式存在，且因此募集 特征將不僅受單體-二聚體平衡常數(shù)影響而且也受單體和二聚體與目標組織中的嗜中性 粒細胞上的受體和與細胞表面及間隙空間上的GAG的結(jié)合相互作用影響（Gangavarapu等 人，2012)。
[0022] 下文所顯示的所衍生四肽適合式I(W-Xi-K-l，其中XI可選自E、Q和K;且X2可 選自M、F、I、W、V和L。
[0023]

[0024]C-X-C趨化因子在其對許多細胞類型的趨化性活性方面眾所周知。為評估最新衍 生的四肽是否具有刺激角質(zhì)細胞迀移的活性，使SEQIDN0 1、2、3、4、5、6、7和8經(jīng)受角質(zhì) 細胞刮傷測試，即充分接受的用于評估活性化合物誘導(dǎo)細胞迀移和體外傷口閉合的能力的 測定。在不存在補充物以限制細胞增殖的無血清角質(zhì)細胞生長培養(yǎng)基中實施實驗。在所 指示時間通過相位差顯微術(shù)檢查受傷區(qū)域。如表1中所顯示，四肽顯著誘導(dǎo)刮傷閉合。在 20yg/ml下，與經(jīng)PBS處理的傷口（以其為100%)相比，通過SEQID1、2、3、4、5、6和7 誘導(dǎo)的傷口閉合的百分比在165%至240%的范圍內(nèi)（表1)。隨機生成的肽SEQIDN0 8 不誘導(dǎo)細胞迀移和刮傷閉合。為證實肽在針對刮傷閉合所測試的濃度下對角質(zhì)細胞無毒， 使所有肽經(jīng)受MTT細胞毒性測試。在高達500ug/ml的濃度下孵育24小時后，任一肽對體 外正常皮膚角質(zhì)細胞均無細胞毒性。總而言之，與經(jīng)PBS處理的對照細胞的百分比相比，使 用