L、0. 156mg/mL、0. 078mg/mL、0mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按 20uL/孔加入加到 96 孔板 的標(biāo)準(zhǔn)品孔中。
[0111] 4)取樣品10uL用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋5彳首，混勾后取20 μ L稀釋后的樣品到96孔 板的樣品孔中。
[0112] 5)各孔加入200 yL BCA工作液，37°C孵育30min。
[0113] 4)利用酶標(biāo)儀上機(jī)測定560nm處的總蛋白濃度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線計算出樣品總蛋白濃度。
[0114] 注：剩余蛋白樣品加上樣緩沖液和DTT 100°C煮沸5-10min充分變性，分裝保存 于-80 °C備用。
[0115] 2. 7. 3電泳、轉(zhuǎn)膜、顯色及成像
[0116] 1)灌制凝膠
[0117] 將已經(jīng)清洗干凈的凹槽及無凹槽的玻璃板對齊，夾緊放入電泳槽中。
[0118] 凝膠配比如下：
[0119] 8 %分離膠：
[0120] 蒸饋水 4.6 mL 30%丙烯酰胺混合液(丙烯酰胺/亞甲叉丙烯酰胺=29:1) 2.7mL 1.5 moL/I. Tris(PH8.8) 2.5rnL 10% SDS 0.1 mL 10%過硫酸銨 O.lmL TEMED
[0121] 10% 分離膠：
[0122] 蒸餾水 4 mL 30%丙烯酰胺混合液(丙烯酰胺/亞甲叉丙烯酰胺=29:1) 3.3 rnL 1.5 moL/I. Tris(PH8.8) 2.5 mL 10% SDS O.lmL 10%過硫酸銨 0.1 mL TEMED 4μL.
[0123] 15% 分離膠：
[0124] 蒸饋水 2.3 mL 30%丙烯酰胺混合液(丙烯酰胺/亞甲叉丙烯酰胺=29:1) 5mL 1.5 lrioL/L Tris(PH8.8) 2.5 mL 10% SDS O.lmL 10%過硫酸銨 O.hnL TEMED
[0125] 5%濃縮膠：
[0126] 蒸餾水 3.4 mL 30%丙烯酰胺混合液(丙烯酰胺/亞甲叉丙烯酰胺=29:1) 0.83 mL 1.0 moL./L Tris(PH6.8) 0.63 mL
[0127] 10% SDS 50 pL 10%過硫酸銨 50pL TEMED 5 μι
[0128] 按照上述比例灌制分離膠，混合均勻后，用移液槍緩慢加到兩玻璃板的空隙內(nèi)，加 至距離上層約3cm處，上層用三蒸水填滿，室溫放置約15min，待分離膠灌制好后，將上層 的三蒸水倒干，之后加入按上述比例灌制的上層濃縮膠，慢慢加入到凝膠槽內(nèi)，迅速插上梳 子。
[0129] 2)電泳
[0130] 將灌好的膠板固定于電泳槽中，加入適量IX電泳緩沖液，輕輕拔出梳子。向通 道內(nèi)加入待測蛋白樣品和預(yù)染Marker，80V電泳約30min，待Marker清晰分開，切換電壓至 120V，電泳約lh，待溴酚藍(lán)跑出后，終止電泳。
[0131] 3)半干轉(zhuǎn)膜法
[0132] 根據(jù)目的蛋白的大小裁剪適當(dāng)大小的PVDF膜，在甲醇中浸泡5min左右，將PVDF 膜及濾紙放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中l(wèi)〇min，按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序制備轉(zhuǎn)膜三明治，調(diào) 節(jié)適當(dāng)電流，根據(jù)目的蛋白分子量大小調(diào)節(jié)適當(dāng)轉(zhuǎn)膜時間。
[0133] 4)封閉，顯色及成像
[0134] 轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將PVDF膜取下放入麗春紅染色液中，染色5min，蛋白條帶清晰可見，用 雙蒸水清洗2-3次，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至之前配好的封閉液中，封閉lh，加一抗。翌日放于搖 床用1 X TBST洗滌3次，每次5min，然后加入HRP標(biāo)記的二抗，用1 X TBST洗滌3次，每次 5min，配制ECL化學(xué)反光液，將其加到PVDF膜上，用UVP凝膠成像系統(tǒng)成像。
[0135] 2. 7. 4 3, 4-二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織AQP-4表達(dá)的影響
[0136] 用Western-Blot測定AQP-4，beta-actin。每個樣品的蛋白上樣量為61 μ g，用 AQP-4 (1:2000)室溫孵育 2h，二抗（1:2000)孵育 lh，顯色。用 beta-actin (1:1500)室溫孵 育2h，二抗（1:2000)孵育lh，顯色。
[0137] 2.7.5 3, 4-二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織抗凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3、 Caspase-9)表達(dá)的影響
[0138] 用 Western-Blot 測定 Caspase-3、Caspase-9，beta_actin。每個樣品的蛋白上樣 量為 122 μ g，用 Caspase-3 (1:200)、Caspase-9 (1:100)，4°C過夜，二抗（1:2000)孵育 lh， 顯色；Caspase_3、Caspase_9 的內(nèi)參用 beta-actin (1:1500)室溫解育 2h，二抗（1:2000)解 育lh，顯色。
[0139] 2. 7. 6 3, 4-二羥基苯甲醛對腦組織星型膠質(zhì)細(xì)胞特征性蛋白（GFAP)表達(dá)的影響
[0140] 用Western-Blot測定GFAP，beta-actin。每個樣品的蛋白上樣量為61 μ g，用 GFAP (1:800)室溫孵育 2h，二抗（1:2000)孵育 lh，顯色。用 GAPDH(1:1500)室溫孵育 2h， 二抗（1:2000)孵育lh，顯色。
[0141] 3.數(shù)據(jù)處理
[0142] 實驗數(shù)據(jù)用GraphPad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(f ir*) 表示，采用單因素方差分析（one-way AN0VE)，先進(jìn)行Dunnett分析，如其他組間需要進(jìn)行 比較在進(jìn)行Tukey分析，以P〈0. 05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。利用ph〇tsh〇pCS5進(jìn)行圖像處 理，利用ImageJ進(jìn)行圖像灰度值處理。
[0143] 4.實驗結(jié)果
[0144] 4. 1 3,4-二羥基苯甲醛對血腦屏障的保護(hù)作用
[0145] 4. 1. 1 3,4-二羥基苯甲醛對大鼠腦組織EB含量的影響
[0146] 實驗結(jié)果表明，各組大鼠正常側(cè)腦組織EB含量之間比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0. 05);與假手術(shù)比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織EB含量有明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意 義（p〈0.001);與模型組比較，3,4_二羥基苯甲醛高劑量組（20mg/kg)能明顯降低模型大鼠 缺血側(cè)腦組織的EB含量（p〈0. 01)。詳見表1、圖5、圖6 :
[0147] 表1 3,4_二羥基苯甲醛對大鼠腦組織EB含量的影響（
[0149] 注：與假手術(shù)組比：AAAP〈0. 001 ;與模型組比：★★?〈0. 01
[0150] 4. 1. 2 3,4_二羥基苯甲醛對缺血側(cè)腦組織血腦屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
[0151] 4. 1. 2. 1 3,4-二羥基苯甲醛對缺血側(cè)腦組織AQP-4表達(dá)的影響
[0152] 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織AQP-4的表達(dá)明顯升高，差 異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇.〇5);與模型組比較，3,4_二羥基苯甲醛高劑量（20mg/kg)組能明顯 下調(diào)模型大鼠缺血側(cè)腦組織AQP-4的高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0. 05)。詳見表2、圖7。
[0153] 表2 3,4-二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織AQP-4表達(dá)的影響（宏土#):
[0154]
[0155] 注：與假手術(shù)組比>AAP〈0. 001 ;與模型組比產(chǎn)P〈0. 05
[0156] 4. 1. 2. 2 3,4-二羥基苯甲醛對缺血側(cè)腦組織TJ表達(dá)的影響
[0157] 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織Occludin表達(dá)有明顯的 降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇.〇〇l);與模型組比較，3,4_二羥基苯甲醛高（20mg/kg)、低 (10mg/kg)劑量組均能明顯升高模型大鼠缺血側(cè)腦組織Occludin的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意 義（P〈0. 05)。詳見表3、圖8。
[0158] 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織Claudin-5表達(dá)有明顯的降低，差異 有統(tǒng)計學(xué)意義（?〈〇.〇1);與模型組比較，3,4-二羥基苯甲醛高（2〇11^/1^)劑量組能明顯升 高模型大鼠缺血側(cè)腦組織Claudin-5的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0. 05)。詳見表3、圖9。
[0159] 表3 3,4_二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織TJ蛋白表達(dá)的影響（f itf)
[0161] 注：與假手術(shù)組比：▲▲▲?〈0· 001，▲々〈0· 01 ;與模型組比：々〈Ο. 05
[0162] 4. 1. 2. 3 3,4-二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織ΜΜΡ-3表達(dá)的影響
[0163] 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織ΜΜΡ-3的表達(dá)有明顯升 高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ρ〈〇.〇5);與模型組比較，3,4_二羥基苯甲醛高（20mg/kg)、低 (10mg/kg)劑量組均能明顯下調(diào)模型大鼠缺血側(cè)腦皮層MMP-3的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (Ρ〈0· 05)。詳見表 4,圖 10。
[0164] 表4 3,4-二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織ΜΜΡ-3表達(dá)的影響（牙±*〇
[0165]
[0166] 注：與假手術(shù)組比>P〈0. 05 ;與模型組比：*P〈0. 05
[0167] 4. 1. 2. 4