一種陰道基質(zhì)材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞外基質(zhì)及其制備方法，具體的說是涉及一種陰道基質(zhì)材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞外基質(zhì)材料(亦稱脫細(xì)胞基質(zhì)材料)是由組織或器官脫細(xì)胞后剩余的結(jié)構(gòu)和功能蛋白的復(fù)合體，其由膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖和多種生長(zhǎng)因子等構(gòu)成，它對(duì)細(xì)胞黏著，細(xì)胞分化和細(xì)胞與生物材料之間的連接有著重要的作用。并且，細(xì)胞外基質(zhì)材料移植后會(huì)逐漸降解為單肽類物質(zhì)，其具有很強(qiáng)的生物活性，具有抗菌性，趨化宿主細(xì)胞和促其有絲分裂的特性。因其具有來源廣泛，無免疫原性，良好生物相容性，生物活性及抗菌性等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視。
[0003]目前脫細(xì)胞基質(zhì)材料通常采用動(dòng)物組織或器官經(jīng)過脫細(xì)胞處理后形成具有一定機(jī)械性能和生物性能的支架材料。現(xiàn)已公開報(bào)道的有關(guān)脫細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法有很多。如CN103191466B公開的一種制備人體或動(dòng)物脫細(xì)胞組織的方法，其是以人類或動(dòng)物組織中的皮膚、胸腹膜、食道粘膜、心臟瓣膜、骨、軟骨、肌腱等為基材，經(jīng)過初步加工制成所需形狀后，經(jīng)過滅活、采用含過氧乙酸、氯化鈉、表面活性劑、燒堿的溶液進(jìn)行兩次脫脂，然后采用過氧乙酸、氯化鈉、表面活性劑、胰酶或胰蛋白酶的溶液進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最后保存、凍干，由此將動(dòng)物組織或器官進(jìn)行脫細(xì)胞處理。該方法列舉了許多具體的人類/動(dòng)物組織，但采用的都是同一種處理方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知曉，在組織和器官脫細(xì)胞方法中，選用的組織不同，其脫細(xì)胞方法也不盡相同。每一種處理方法都會(huì)對(duì)所制備的支架材料的生物學(xué)組成以及組織的超微結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能產(chǎn)生不同的影響。另外，該文獻(xiàn)也未曾公開任何一個(gè)具體實(shí)例，說明其所制的具體材料的生物學(xué)特性以及機(jī)械性能特點(diǎn)。因此，該文獻(xiàn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員不具有任何指導(dǎo)意義。朞惠等研究人員對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制備及其生物相容性進(jìn)行了研究，其采用的方法是采用新生小牛背部真皮組織，以0.5%SDS溶液水平振蕩脫細(xì)胞，然后采用0.5%胰蛋白酶行膠原纖維結(jié)構(gòu)重塑，再用甲醛浸泡進(jìn)行交聯(lián)，0.5%硫酸軟骨素溶液中超聲振蕩進(jìn)行表面修飾。該方法制備的是一種適合軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的生物支架(詳見朞惠等.脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制備及其生物相容性研究.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志2014年6月第28卷第6期)。CN101366975B (ZL200810150792.5)公開了一種脫細(xì)胞小腸粘膜下層生物材料的制備方法，該方法是以小腸粘膜下層為基材，首先通過刮除小腸粘膜、肌層和漿膜獲得粘膜下層，然后放入0.1-1M的NaOH溶液中進(jìn)行脫細(xì)胞處理，脫細(xì)胞處理的粘膜下層置入含DNA酶和α -半乳糖苷酶的混合液中，進(jìn)行酶處理，將酶處理的粘膜下層于冷凍保護(hù)液中浸泡處理后，再經(jīng)冷凍干燥，形成脫細(xì)胞小腸粘膜下層生物材料的膜狀產(chǎn)品。由此可見，目前對(duì)不同組織來源的材料的處理方法都不盡相同。
[0004]目前針對(duì)不同的疾病需求，動(dòng)物組織脫細(xì)胞基質(zhì)材料的研究有多種，如心臟、肝臟、肺臟、膀胱、皮膚、小腸粘膜、胸膜、腹膜、心包膜等等。陰道組織缺失、盆底損傷和機(jī)能退化造成的盆腔器官脫垂是婦產(chǎn)科常見的一些疾患。先天性無陰道(MRKH綜合征)、兩性畸形、創(chuàng)傷、腫瘤術(shù)后等均可導(dǎo)致陰道組織缺失。陰道組織缺失給患者軀體帶來痛苦的同時(shí)，也給患者造成巨大的精神心理壓力。盆底損傷和機(jī)能退化造成的盆腔器官脫垂(pelvic organprolapse, POP),嚴(yán)重影響了中老年婦女的健康和生活質(zhì)量。這兩種疾病用到的脫細(xì)胞基質(zhì)材料主要是以動(dòng)物真皮、小腸粘膜和膀胱為基材，這可能是源于真皮、膀胱固有層或小腸粘膜下層比較容易進(jìn)行切割、處理的緣故(如:選用真皮可采用機(jī)器切割方式或用切割刀，即可除去表皮，獲得所需真皮材質(zhì)；膀胱固有層和小腸粘膜下層由于具有上皮層和肌層且與所取組織連接疏松的生理結(jié)構(gòu)的特性，因此比較容易獲得)。并且，雖然已有材料的應(yīng)用起到了一定的治療效果，但其生物活性、生物力學(xué)性能及其治療效果還有待進(jìn)一步提高。研究者希望找到并制備出更適用于盆底修復(fù)、陰道重建的脫細(xì)胞基質(zhì)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種更適用于盆底修復(fù)或陰道重建的脫細(xì)胞陰道基質(zhì)材料及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明所提供的脫細(xì)胞陰道基質(zhì)材料，其載體為豬/牛陰道組織粘膜層，所述載體經(jīng)以下方式處理:
Ca)將豬/牛陰道組織粘膜層在含有苯甲基磺酰氟的去離子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震蕩處理24-72小時(shí)；其中所述Tris溶液，其濃度為0.01M、pH為8.0 ;去離子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的濃度為0.1mM/L ;
(b)將(a)步驟處理過的粘膜層放置在所含十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量體積濃度為0.1-1%的水溶液或Tris-HCl緩沖溶液中震蕩處理8-12小時(shí)；
(c)將(b)步驟處理過的粘膜層，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗，然后用所含TritonX-100的體積濃度為0.1-1%的Tris-HCl緩沖溶液震蕩處理6_10天，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗；
上述(c)、(b)步驟中的所有溶液及緩沖溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟；
Cd)將(c)步驟處理過的粘膜層，放置在含脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl緩沖溶液中，在32°C _37°C溫度下震蕩處理8-12小時(shí)，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗；
(d)步所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為0.05M、pH值為8.0 ;其所含脫氧核糖核酸酶的濃度30-70U/mL ;所含核糖核酸酶的濃度為l_5U/mL ;
(e)將(d)步驟處理過的粘膜層，消毒和凍干，即得陰道基質(zhì)材料。
[0007]本發(fā)明還提供了所述陰道基質(zhì)材料的制備方法，具體包括以下步驟:
Ca)將豬/牛陰道組織，采用鈍器和銳器交替剝離除去陰道組織的外膜層及肌層，留取厚度均勻、無損傷的陰道粘膜層，漂洗后，放置在含有苯甲基磺酰氟的去離子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震蕩處理24-72小時(shí)；其中所述Tris溶液的濃度為0.01M,pH為8.0 ;去離子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的濃度為0.1mM/L ；
其中所述的鈍器如機(jī)械手、機(jī)械鉗；銳器如切割刀、手術(shù)刀、手術(shù)剪等，如此采用鈍器和銳器交替剝離法，解決了陰道組織皺襞多、質(zhì)地致密、粘膜層難以剝離的難題；
(b)將(a)步驟處理過的粘膜層放置在所含十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量體積濃度為0.1-1%的水溶液或Tris-HCl緩沖溶液中震蕩處理8-12小時(shí)；
(c)將(b)步驟處理過的粘膜層，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗，然后用所含TritonX-100的體積濃度為0.1-1%的TriS-HCl緩沖溶液震蕩處理6_10天，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗；
上述(c)、(b)步驟中的所有溶液及緩沖溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟；(c)步和(b)步中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為0.01M、pH為8.0 ;
Cd)將(c)步驟處理過的粘膜層，放置在含脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl緩沖溶液中，在32°C _37°C溫度下震蕩處理8-12小時(shí)，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗；
其中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為0.05M、pH值為8.0，其所含脫氧核糖核酸酶的濃度30-70U/mL，所含核糖核酸酶的濃度l_5U/mL ;
(e)將(d)步驟處理過的粘膜層，消毒和凍干，即得陰道基質(zhì)材料。
[0008]所述陰道基質(zhì)材料的制備方法中，步驟(e)中所述消毒的優(yōu)選方案是:使用含過氧乙酸和乙醇的溶液將(d)步驟處理過的粘膜層在25°C條件下震蕩處理2小時(shí)，振蕩速率為80-200rpm，然后依次使用無菌磷酸鹽緩沖液和無菌去離子水漂洗；其中，所述含過氧乙酸和乙醇的溶液中，所含過氧乙酸的體積百分含量為0.1%，所含乙醇的體積百分含量為20%。
[0009