穩(wěn)定天然蛋白的結(jié)構(gòu)?？梢蕴砑右掖?、低分子量的硫醇和二硫化物和NaCl。 此外，可以與需要的多肽共表達(dá)伴侶和/或折疊酶。分子伴侶通過與折疊中間體的瞬時相 互作用而促進(jìn)正確的異構(gòu)化和細(xì)胞靶向。大腸桿菌伴侶系統(tǒng)包括但不限于：GroES-GroEL、 DnaK-DnaJ-GrpE、CIpB〇
[0086] 折疊酶加速折疊途徑中的限速步驟。有三種類型的折疊酶具有重要作用：肽基脯 氨酰順式/反式異構(gòu)酶（PPI's)、二硫化物氧化還原酶（DsbA)和二硫化物異構(gòu)酶（DsbC)， 蛋白二硫化物異構(gòu)酶（PDI)，后者是真核蛋白，其催化蛋白半胱氨酸氧化和二硫鍵異構(gòu)化。 這些蛋白中的一種或多種與靶蛋白的共表達(dá)可以引起產(chǎn)生更高水平的可溶性靶蛋白。
[0087] 可以以融合蛋白的形式產(chǎn)生包含肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽，以改善其溶解性和產(chǎn)量。 所述融合蛋白包含含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽和在框內(nèi)融合在一起的第二多肽。所述第 二多肽可以是本領(lǐng)域已知的融合配對物以改善與其融合的多肽的溶解性，例如，NusA、細(xì) 菌鐵蛋白（BFR)、GrpE、硫氧還蛋白（TRX)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)。Novagen Inc. (Madison, WI)提供了 pET 43. 1載體系統(tǒng)，其允許形成NusA-靶標(biāo)融合物。已經(jīng)表明：當(dāng)用 作融合配對物時，DsbA和DsbC對表達(dá)水平具有積極影響，因此它們可用于與肽配體結(jié)構(gòu)域 融合以實現(xiàn)較高的溶解性。
[0088] 在此類融合蛋白的一個方面，表達(dá)的含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽包括連接子多肽， 所述連接子多肽包含蛋白酶切割位點，所述蛋白酶切割位點包括可被蛋白酶水解的肽鍵。 結(jié)果，可以在表達(dá)之后通過蛋白水解使多肽中的肽配體結(jié)構(gòu)域與多肽的其余部分分離。所 述連接子可以在蛋白酶的催化位點相結(jié)合的所述鍵的任一側(cè)包含一個或多個另外的氨基 酸，（見，例如，Schecter&Berger,Biochem.Biophys.Res.Commun. 27, 157-62 (1967))?；?者，連接子的切割位點可以與蛋白酶的識別位點間隔開，并且兩個切割位點與識別位點可 以被一個或多個（例如2-4個）氨基酸間隔開。在一個方面，連接子包含至少大約2、3、4、 5、6、7、8、9、大約10、大約20、大約30、大約40、大約50或更多個氨基酸。更優(yōu)選地，連接子 長度為大約5至大約25個氨基酸，最優(yōu)選地，連接子長度是大約8至大約15個氨基酸。 [0089] 在以下文獻(xiàn)中討論了可用于本發(fā)明的一些蛋白酶：11〇〇口616七31.，13;[0(3116111. J. 321:265-279 (1997) ；fferb,Cell91:439-442 (1997)；ffolfsbergetal.,J.CellBiol. 131:275-278 (1995) ；Murakami&Etlinger,Biochem.Biophys.Res. Comm. 146:1249-1259 (1987)；BergetalBiochem.J.307:313-326 (1995)； SmythandTrapani,ImmunologyToday16:202-206 (1995)；Talanianet al. ,J.Biol.Chem. 272 : 9677-9682 (1997)；andThornberryetal.,J.Biol. Chem. 272:17907-17911 (1997)。根據(jù)本發(fā)明，也可以使用細(xì)胞表面蛋白酶和可切割的連接 子，包括但不限于：氨肽酶N ;嘌呤霉素敏感性氨肽酶；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；焦谷氨酰肽酶 II ;二肽基肽酶IV ;N-精氨酸二元轉(zhuǎn)化酶；內(nèi)肽酶24. 15 ;內(nèi)肽酶24. 16 ;淀粉樣蛋白前體蛋 白分泌酶a、0和y ;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶分泌酶；TGF a分泌酶；TNF a分泌酶；FAS配體分 泌酶；TNF受體-I和TNF受體-II分泌酶；⑶30分泌酶；KL1和KL2分泌酶；IL6受體分泌 酶；⑶43、⑶44分泌酶；⑶16-1和⑶16-11分泌酶；L-選擇素分泌酶；葉酸受體分泌酶；MMP 1、2、3、7、8、9、10、11、12、13、14和15 ;尿激酶纖溶酶原激活劑；組織纖溶酶原激活物；纖溶 酶；凝血酶；BMP-1 (前膠原 C-肽酶）；ADAM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 和 11 ;以及 Granzymes A、B、C、D、E、F、G*H。
[0090] 依賴于細(xì)胞相關(guān)蛋白酶的替代性方式是使用自我切割的連接子。例如，口足病病 毒（FMDV)2A蛋白酶可用作連接子。其是17個氨基酸的短的多肽，其在2A/2B接合點切割 FMDV的多聚蛋白。FMDV 2 A前肽的序列是NFDLLKLAGDVESNPGP。切割發(fā)生于肽C-末端的 最后的甘氨酸-脯氨酸氨基酸對處，并且不依賴于其它FMDV序列的存在，即使在存在異源 序列的情況下也切割。
[0091] 可以單獨使用親和色譜或與離子交換、分子篩或HPLC色譜技術(shù)聯(lián)合用于純化含 有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽?？梢允褂弥蛞耘叫问竭M(jìn)行此類色譜技術(shù)。此類色譜純化方法 是本領(lǐng)域熟知的。
[0092] 另外，本發(fā)明提供了編碼含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽的分離的核酸，所述多肽在SEQ ID N0:1-117的序列中具有一個或多個氨基酸替換和插入或缺失：大約1至大約5個氨基 酸，優(yōu)選大約1至大約3個氨基酸，更優(yōu)選1個氨基酸，其中相關(guān)性質(zhì)基本上類似于原始肽 顯示出的性質(zhì)。
[0093] 可以通過本領(lǐng)域已知的數(shù)種方法中的任意方法進(jìn)行誘變。一般而言，可以通過將 核酸序列克隆進(jìn)入質(zhì)粒或一些其它的易于操作序列的載體來進(jìn)行誘變。然后，鑒定或在核 酸序列中插入可以向所述核酸序列中添加另外的核酸的獨特限制性位點。通常從重疊的合 成單鏈正義和反義寡核苷酸中產(chǎn)生雙鏈的合成寡核苷酸，從而所述雙鏈寡核苷酸中引入側(cè) 接靶序列的限制性位點，并且例如可用于引入替代性DNA。以限制性酶切割質(zhì)粒或其它載 體，將具有相容性粘末端的寡核苷酸序列連接進(jìn)入質(zhì)粒或其它載體中以替換原始DNA。 [0094] 其它體外定點誘變方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且是可實現(xiàn)的（尤其是， 使用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR),見，例如，Parikh&Guengerich, Biotechniques 24:428-431 (1998))。與變化位點重疊的互補(bǔ)性引物可用于在混合物中PCR擴(kuò)增完整質(zhì)粒， 所述混合物包含500mM dNTP，2單位的Pfu聚合酶，250ng每種正義和反義引物，以及200ng 包含編碼含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽的序列的質(zhì)粒DNA。PCR優(yōu)選包括18個循環(huán)，對于每Kb 的DNA，延伸時間為2. 5分鐘?？梢砸訢pnl (其僅消化腺嘌呤甲基化的質(zhì)粒DNA)處理PCR 產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 a細(xì)胞。可以通過限制性酶消化就引入的變化來篩選轉(zhuǎn)化 子，然后可以通過DNA序列分析來確認(rèn)。
[0095] 合適的蛋白檢測和含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽的定量測定方法包括Western 印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、銀染、BCA測定（見，例如，Smith et al.，Anal. Biochem.，150, 76-85(1985))、Lowry 蛋白測定（描述于，例如，Lowry et al.，J. Biol. Chem.，193,265-275(1951))(其是基于蛋白-銅復(fù)合物的比色測定），以及Bradford蛋白 測定（描述于，例如，Bradford et al.，Anal. Biochem.，72, 248 (1976))(其依賴于蛋白結(jié) 合之后考馬斯藍(lán)G-250的吸光率的變化）。一旦被表達(dá)，可以通過傳統(tǒng)的純化方法來純化含 有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽，例如離子交換、大小排阻或C18色譜。
[0096]III.偶聯(lián)肽配體結(jié)構(gòu)域的方法
[0097] 用于將合適的活性試劑例如治療劑、化療劑、放射性核素、多肽等"偶聯(lián)"（或"綴 合"或"交聯(lián)"）至含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽上的方法在本領(lǐng)域有完善的描述。在制備本文 提供的綴合物時，通過本領(lǐng)域目前已知用于連接兩個部分的任意方法將活性試劑直接或間 接連接至肽配體結(jié)構(gòu)域，只要綴合或偶聯(lián)部分與肽配體結(jié)構(gòu)域的連接不實質(zhì)上妨礙肽配體 結(jié)構(gòu)域的功能或?qū)嵸|(zhì)上妨礙活性試劑的功能即可。偶聯(lián)可以通過任意合適的方法進(jìn)行，包 括但不限于，離子和共價鍵，以及任意其它足夠穩(wěn)定的結(jié)合，由此將調(diào)節(jié)被靶向的試劑的分 布。
[0098] 用于在氨基和巰基之間形成共價鍵以及用于向蛋白中導(dǎo)入巰基的多種異雙 官能交聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的（見，例如，Cumber et al.(1992)Bioconjugate Chem. 3' :397 401 ；Thorpe et al. (1987)Cancer Res. 47:5924 5931 ；Gordon et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. 84:308 312 ；ffalden et al. (1986) J. Mol. Cel 1 Immunol.2:191 197 ；Carlsson et al. (1978)Biochem.J.173:723 737 ；Mahan et al. (1987)Anal. Biochem. 162:163 170 ；ffawryznaczak et al. (1992)Br. J. Cancer 66:361 366 ;Fattom et al. (1992) Infection&Immun. 60:584 589)。這些試劑可用于在肽配體結(jié) 構(gòu)域或含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽與本文公開的任意活性試劑之間形成共價鍵。這些試劑 包括但不限于：N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫）丙酸酯（STOP ;二硫化物連接子）；硫代 琥珀酰亞胺6-[3-(2_吡啶二硫）丙酰氨基]己酸酯（硫代-LC-SPDP);琥珀酰亞胺氧基羰 基-a-甲基芐基硫代硫酸酯（SMBT，受阻的二硫酸酯連接子）；琥珀酰亞胺6-[3-(2_吡 啶二硫）丙酰氨基]己酸酯（LC-SPDP);硫代琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己 烷-1-羧酸酯（硫代-SMCC);琥珀酰亞胺3-(2_吡啶二硫）丁酸酯（STOB;受阻的二硫鍵 連接子）；硫代琥珀酰亞胺2-(7_疊氮-4-甲基香豆素-3-乙酰胺）乙基-1，3-二硫丙酸 酯（SAED);硫代-琥珀酰亞胺7-疊氮-4-甲基香豆素-3-乙酸酯（SAMCA);硫代琥珀酰 亞胺6-|>-甲基-(1-(2-吡啶二硫）甲苯酰胺（1:〇1皿1111(1〇)]己酸醋（硫代-]^-51?1') ; 1，4_二-[3'-(2'_吡啶二硫）丙酰氨基]丁烷（DTOPB) ;4_琥珀酰亞胺氧基羰基-a-甲 基-a-(2_吡啶硫）_甲苯（SMPT，受阻的二硫酸酯連接子）；硫代琥珀酰亞胺6[a-甲 基-(1-(2-吡啶二硫）甲苯酰胺]己酸酯（硫代-1^(：-51^); 111-馬來酰亞胺苯甲酰4-羥基 琥珀酰亞胺酯（MBS) ;m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯（硫代-MBS) ;N-琥 珀酰亞胺（4-碘乙酰）氨基苯甲酸酯（SIAB;硫醚連接子）；硫代琥珀酰亞胺（4-碘乙酰） 氨基苯甲酸酯（硫代-SIAB);琥珀酰亞胺4(對馬來酰亞胺苯基）丁酸酯（SMPB);硫代琥珀 酰亞胺_4_(對馬來酰亞胺苯基）丁酸酯（硫代-SMPB);疊氮苯甲?；ｋ拢ˋBH)。
[0099] 其它的異雙官能可切割的偶聯(lián)劑包括：N-琥珀酰亞胺（4-碘乙酰）_氨基苯甲酸 酯；硫代琥珀酰亞胺（4-碘乙酰）_氨基苯甲酸酯；4-琥珀酰亞胺-氧基羰基-a_(2-吡啶 二硫）_甲苯；硫代琥珀酰亞胺-6_[a-甲基-a-(吡啶二硫）_甲苯酰胺]己酸酯；N-琥珀 酰亞胺-3-(-2-吡啶二硫）-丙酸酯；琥珀酰亞胺6 [3 (-(-2-吡啶二硫）-丙酰氨基]己酸 酯；硫代琥珀酰亞胺6[3(-(-2_吡啶二硫）-丙酰氨基]己酸酯；3-(2_吡啶二硫）-丙酰 肼，Ellman氏試劑，二氯三嘆酸（dichlorotriazinic acid)，S-(2-硫吡啶）-L-半胱氨酸。 另外的示例性的雙官能連接化合物公開于美國專利號5, 349, 066、5, 618, 528、4, 569, 789、 4, 952, 394 和 5, 137,877。
[0100] 或者，可以使用例如多肽硫氫基進(jìn)行綴合。另外，與糖蛋白例如抗體結(jié)合的糖部分 可以被氧化以形成可用于本領(lǐng)域已知的多種偶聯(lián)程序的醛基。根據(jù)本發(fā)明形成的綴合物 在體內(nèi)可以是穩(wěn)定的或不穩(wěn)定的，例如可酶促降解的四肽鍵或酸不穩(wěn)定性的順式-烏頭酰 (aconityl)或腙鍵。
[0101] 任選地，含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽通過一個或多個連接子與活性試劑連接。連接 子部分根據(jù)所需的性質(zhì)來選擇。例如，可以選擇連接子部分的長度以優(yōu)化配體結(jié)合的動力 學(xué)和特異性，包括由于配體與靶受體結(jié)合而誘導(dǎo)的任何構(gòu)象變化。連接子部分的長度和靈 活性應(yīng)該足以允許多肽配體部分與靶細(xì)胞受體自由地相互作用。如果連接子太短或太剛 硬，則在多肽配體部分與細(xì)胞毒素之間可能會有空間位阻。如果連接子部分太長，則活性試 劑可能在生產(chǎn)過程中被降解，或者可能不會將所需的效應(yīng)有效遞送至靶細(xì)胞。
[0102] 本文中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的連接子。一般而言，那些是融 合蛋白的綴合物中將使用與通過化學(xué)方式產(chǎn)生的綴合物中的連接子不同的一組連接子。適 合用于化學(xué)連接的綴合物的連接子和鍵包括但不限于：二硫鍵、硫醚鍵、受阻的二硫鍵和自 由反應(yīng)基之間的共價鍵，例如胺和巰基。使用異雙功能試劑產(chǎn)生這些鍵以在多肽中的一個 或二者中產(chǎn)生活性巰基，然后使一個多肽上的巰基與另一個多肽上的活性巰基或胺基（其 上可以連接活性馬來酰亞胺基或巰基）反應(yīng)。其它的連接子包括：酸可切割的連接子，例如 雙馬來酰亞胺乙氧基丙烷（bismaleimideothoxy propane)，酸不穩(wěn)定性轉(zhuǎn)鐵蛋白綴合物和 己二酸二酰肼，其將在更加酸性的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室內(nèi)被切割；在暴露于UV或可見光后被切割的 交聯(lián)連接子，以及連接子。在一些實施方式中，可以包括數(shù)種連接子以利用每種連接子的優(yōu) 點。可以通過將連接子共價偶聯(lián)至含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽和被靶向的試劑來插入化學(xué)連 接子和肽連接子。如下文描述的異雙官能試劑可用于進(jìn)行此類共價偶聯(lián)。還可以通過以融 合蛋白形式表達(dá)編碼連接子和肽配體結(jié)構(gòu)域的DNA，編碼連接子和活性試劑的DNA，或者編 碼肽配體結(jié)構(gòu)域、連接子和活性試劑的DNA來連接肽連接子。在本文中也考慮單獨使用或 與其它連接子一起使用彈性連接子和增加綴合物溶解性的連接子。
[0103] 因此，連接子可以包括但不限于：肽鍵、氨基酸和肽鍵，其通常包含1至大約30個 氨基酸，更優(yōu)選大約10至30個氨基酸。或者，化學(xué)連接子，例如異雙官能可切割的關(guān)聯(lián)連 接子，包括但不限于：N-琥珀酰亞胺（4-碘乙酰）-氨基苯甲酸酯；硫代琥珀酰亞胺（4-碘 乙酰）_氨基苯甲酸酯；4-琥珀酰亞胺-氧基羰基-a-(2-吡啶二硫）-甲苯；硫代琥珀酰 亞胺 -6_[a-甲基-a-(吡啶二硫）_甲苯酰胺]己酸醋；N-琥J白酰亞胺-3-(-2_吡啶二 硫）_丙酸酯；琥珀酰亞胺6(3(-(-2_吡啶二硫）-丙酰氨基）己酸酯；硫代琥珀酰亞胺 6 (3 (- (_2_吡啶二硫）-丙酰氨基）己酸醋；3- (2-吡啶二硫）-丙酰餅，Ellman氏試劑，二 氯三嗪酸，和S-(2-硫吡啶）-L-半胱氨酸。
[0104] 其它的連接子包括三苯甲基連接子，尤其是衍生的三苯甲基以產(chǎn)生一類綴合物， 其提供在不同的酸度或堿度時釋放治療劑。通過預(yù)先選擇治療劑被釋放時的pH范圍而提 供的靈活性允許基于需要遞送治療劑的組織之間的已知的生理差異來選擇連接子（見，例 如，美國專利號5, 612, 474)。例如，腫瘤組織的酸度似乎比正常組織低。
[0105] 也可以使用酸可切割的連接子，光可切割的連接子和熱敏感性連接子，尤其是在 需要切割被靶向的試劑以允許其更容易地進(jìn)入反應(yīng)的情況下。酸可切割的連接子包括但不 限于：二馬來酰亞胺乙氧基丙烷和己二酸二酰肼連接子（見，例如，F(xiàn)attom et al. (1992) Infection&Immun. 60:584 589)，以及酸不穩(wěn)定性轉(zhuǎn)鐵蛋白綴合物，其包含足夠的轉(zhuǎn)鐵蛋 白部分以允許進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白循環(huán)途徑（見，例如，Welhoner et al. (1991)J.Biol. Chem.266:4309 4314)。光可切割的連接子是在暴露于光后被切割的連接子（見，例如， Goldmacher et al. (1992) Bioconj.Chem. 3:104 107，該連接子通過引用方式并入本文）， 從而在暴露于光后釋放被靶向的試劑。在暴露于光后被切割的光可切割的連接子是已知 的（見，例如，Hazum et al. (1981)in Pept，Proc.Eur.Pept.Symp.，16th，B;runfeldt，K(Ed )，pp. 105 110,其描述了使用硝基苯甲基作為用于半胱氨酸的光可切割的保護(hù)性基團(tuán)；Yen et al. (1989)Makromol.Chem 190:69 82,其描述了水溶性的光可切割的共聚物，包括羥基 丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、熒光素共聚物和甲基羅丹明共聚物；Goldmacher et al. (1992)Bioconj.Chem.3:104 107,其描述了在暴露于近紫外光（350nm)后發(fā)生蛋白 水解降解的交聯(lián)劑和反應(yīng)劑；和Senter e