小白菊內(nèi)酯在抑制牙周細(xì)胞炎癥和骨質(zhì)破壞藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是小白菊內(nèi)酯在牙周膜韌帶細(xì)胞炎癥反應(yīng)控制和抑制 骨質(zhì)破壞方面的藥物應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙體周圍組織感染如根尖周炎和牙周炎等疾病引起的牙槽骨吸收破壞是口腔臨 床常見的問題，嚴(yán)重者可導(dǎo)致牙齒松動、移位甚至脫落。牙周炎患病率在成年人中高達(dá)90%， 牙周炎引起的牙周組織缺損是造成中老年牙齒松動和脫落的主要原因。臨床常用的牙周齦 下刮治和根面平整術(shù)能有效的去除病原微生物，但如何有效控制炎癥，使已經(jīng)破壞的牙體 周圍組織生理性再生是口腔臨床治療的目標(biāo)，也是牙周治療的關(guān)鍵和難點(diǎn)。牙體周圍組織 炎癥常累及牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨等組織。牙槽骨的形成和吸收是成骨和破骨功能的動 態(tài)平衡。牙槽骨細(xì)胞和具有分化潛能的牙周膜韌帶細(xì)胞在維持骨生成起著重要作用，破骨 細(xì)胞及其前體巨噬細(xì)胞發(fā)揮骨吸收和溶解的作用，兩者在生理狀態(tài)下相互協(xié)同，完成骨形 成和重塑。
[0003] 目前上市的牙周局部用藥以抗生素類為主，易引起細(xì)菌耐藥性等不良后果。并且 牙周炎在經(jīng)過牙周刮治和根面平整等治療后，大多數(shù)病人已達(dá)到控制細(xì)菌感染的效果，并 不需要局部抗生素類藥物的輔助治療。然而，炎癥導(dǎo)致骨質(zhì)破壞和新骨形成受阻機(jī)制是近 年來研宄的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前臨床上非留體類消炎藥（NSAIDs)是使用最多的消炎止痛藥 物，其作用機(jī)理是抑制環(huán)氧化物酶（C0X-2)和前列腺素的合成。然而牙周組織炎癥的持續(xù) 是多種炎癥因子的綜合作用結(jié)果，同時(shí)涉及到牙周膜韌帶細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞及其前 體巨噬細(xì)胞的正常生理功能。研宄巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞參與炎癥性骨吸收和生 成機(jī)制，尋找新的藥物治療作用靶點(diǎn)，利用調(diào)控炎癥信號通路的藥物有效控制病變區(qū)牙槽 骨的降解，促進(jìn)牙槽骨、牙周骨組織和根尖周組織的有序再生，具有重要的臨床意義。
[0004] 研宄表明，核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa b，NF-κ B)信號通路不僅是調(diào)控 炎癥反應(yīng)基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，也是調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟和影響細(xì)胞成骨分化的重要調(diào) 節(jié)因子。小白菊內(nèi)醋（Parthenolide，PTL)是特異性阻斷NF- κ B信號通路的天然產(chǎn)物類藥 物。PTL是一種天然倍半萜烯內(nèi)酯類藥物，具有鎮(zhèn)痛、抗菌及抗腫瘤作用，常用來治療發(fā)熱、 偏頭痛及關(guān)節(jié)炎等疾病。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTL具有抑制多種炎癥因子合成和釋放的作用，通 過對IL-1，IL-6, TNF- a，IL-8,前列腺素，C0X2及一氧化氮合成酶（NOS)等細(xì)胞因子的抑 制而發(fā)揮抗炎作用。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTL可通過抑制NF- κ B的活性，降低血液循環(huán)中IL-6 和TNF的含量，從而阻斷脂多糖（LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。另外，在巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞的研 宄中發(fā)現(xiàn)PTL能夠抑制LPS誘導(dǎo)的NF- κ B活化，ρ65核轉(zhuǎn)位及I- κ B降解。以上研宄提示， PTL抗炎的藥理活性是通過抑制NF- κ B信號通路實(shí)現(xiàn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明研宄目的是研發(fā)一種抑制牙周膜韌帶細(xì)胞炎癥反應(yīng)和抑制牙周組織骨質(zhì) 破壞的牙科局部用藥物。該藥物在臨床上作為牙周刮治和手術(shù)治療后的輔助藥物治療使 用，從而達(dá)到促進(jìn)牙周組織修復(fù)和再生的目的。
[0006] 小白菊內(nèi)酯作為一種藥物活性成分，可以按照常規(guī)的提取方法在倍半萜烯內(nèi)酯類 植物中提取。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)，PTL適宜于牙周韌帶細(xì)胞生長的濃度范圍(低于或 等于5μΜ)，在細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS)體外模擬牙周的炎癥反應(yīng)中，PTL的應(yīng)用可顯著降低牙周韌 帶細(xì)胞中炎癥因子IL-1，IL-6和TNF-α的基因表達(dá)，同時(shí)抑制了破骨細(xì)胞活化相關(guān)基因 RANKL和M-CSF，上調(diào)RANKL的拮抗因子OPG的表達(dá)。并且PTL通過抑制ρ50的表達(dá)和抑制 I- κ B降解從而抑制牙周韌帶細(xì)胞中NF- κ B信號通路的激活。以上研宄顯示小白菊內(nèi)酯具 有抑制牙周膜韌帶細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。
[0007] 牙體周圍骨組織的修復(fù)依賴于具有分化潛能的牙周膜韌帶細(xì)胞，破骨細(xì)胞及其 前體巨噬細(xì)胞發(fā)揮骨形成和溶解的作用。兩者在生理狀態(tài)下相互協(xié)同，完成骨形成和重 塑。發(fā)明人構(gòu)建牙周膜韌帶細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的模型，通過實(shí)驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)PTL抑制了 巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟，并且下調(diào)破骨功能相關(guān)的關(guān)鍵基因，如RANK，Calcitonin Receptor，Carbonic Anhydrase II，MMP-9, Cathepsin K 和 TRAP。以上結(jié)果顯不 PTL 具有 抑制破骨細(xì)胞的分化和抑制骨質(zhì)破壞的功能。
[0008] 本發(fā)明人的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，小白菊內(nèi)酯對牙周膜韌帶細(xì)胞炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞 模型具有顯著抑制作用，具體分析見實(shí)施例1。
[0009] 作為本發(fā)明的有益效果： 小白菊內(nèi)酯PTL具有抑制牙周組織炎癥反應(yīng)的作用，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的分化和破骨 功能，具有抑制骨質(zhì)破壞的作用，其作用機(jī)制是通過抑制NF- κ B信號通路實(shí)現(xiàn)的。
[0010] 小白菊內(nèi)酯對牙周炎具有潛在的治療價(jià)值。
[0011] 作為新一代靶向抑制NF-κ B信號通路的抗炎和抗骨質(zhì)破壞的天然產(chǎn)物類藥物， 具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
[0012] 小白菊內(nèi)酯PTL可制成PTL緩釋凝膠，作為牙周治療后的輔助藥物治療，置于牙周 袋內(nèi)和牙周患處，達(dá)到促進(jìn)牙周組織修復(fù)和再生的目的。
【附圖說明】
[0013] 圖1為小白菊內(nèi)酯（PTL)對PDLCs細(xì)胞增殖能力的影響的示意圖； 圖2為小白菊內(nèi)酯（PTL)對TOLCs細(xì)胞信號通路的影響的示意圖； 圖3為小白菊內(nèi)酯（PTL)對PDLCs細(xì)胞炎癥因子和破骨相關(guān)因子基因表達(dá)的影響的示 意圖； 圖4為小白菊內(nèi)酯（PTL)對巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響（TRAP染色結(jié)果）的示意 圖； 圖5為小白菊內(nèi)酯（PTL)對破骨細(xì)胞中破骨功能相關(guān)基因的影響的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 現(xiàn)結(jié)合附圖1至5說明與實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1藥效學(xué)試驗(yàn)：小白菊內(nèi)酯對牙周細(xì)胞炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞抑制實(shí)驗(yàn)： 具體實(shí)驗(yàn)過程如下： 1、 材料： 1).牙周韌帶細(xì)胞（PDLCs)和巨噬細(xì)胞： 收集中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頒面外科門診患者（18~25歲）因阻生或正畸治療 拔除的健康、完整、無齲恒牙(經(jīng)患者知情同意后)。刮取牙周組織進(jìn)行牙周韌帶細(xì)胞的原代 培養(yǎng)。
[0015] 采用巨噬細(xì)胞Macrophage，g卩RAW264. 7細(xì)胞系作為破骨細(xì)胞前體，用于本實(shí)驗(yàn)。
[0016] 2).藥物與試劑： ①.小白菊內(nèi)酯（PTL)，實(shí)驗(yàn)試劑，購自美國Sigma公司。以100%DMS0溶解配制成 20mmol/L的儲存液；使用時(shí)以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青鏈霉素雙抗）稀釋至所 需濃度，艮卩1，5，10 and 20 μ M0
[0017] ②.革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS，E. C〇li055:B5)，購自美國Sigma公司，以 PBS溶液溶解配制儲存液；使用時(shí)以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青鏈霉素雙抗)稀釋 至 I Kg/mL 。
[0018] ③.細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM低糖培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS)購自美國Gibco公司；青鏈霉 素雙抗購自美國Sigma公司。
[0019] ④.TRIzo 1? Reagent :提取mRNA細(xì)胞裂解試劑，購自澳大利亞Life Technologies 公司。
[0020] ⑤.DyNAmo ? cDNA Synthesis Kit :逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自澳大利亞Life Technologies 公司。
[0021] ⑥.SYBR reagent :QRT-PCR反應(yīng)試劑，購自美國ABI公司。
[0022] ⑦· TRAP staining assay kit :TRAP染色試劑盒，用于多核破骨細(xì)胞的染色，購 自美國Sigma公司。 3).實(shí)驗(yàn)儀器： ①：ABI 7500 Thermal Cycler :QRT_PCR 儀器，澳大利亞 Applied Biosystems 公司。
[0023] ②：酶標(biāo)儀：美國 Molecular Devices 公司，SpectraMax Microplate Reader 系 列。
[0024] ③：倒置相差顯微鏡！Nikon公司，Nikon ECLIPSE, TSlOO系列。 2、 實(shí)驗(yàn)方法： 1).牙周韌帶細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)： 收取牙體組織樣本后，以含5%雙抗（青/鏈霉素）的無菌PBS沖洗3遍后備用；超凈 臺內(nèi)用手術(shù)刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜組織，用眼科剪剪成約Imm3大小的組織塊；收 集組織塊，將組織塊接種于25cm 2培養(yǎng)瓶中，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7-8h后待組織 塊大部分貼壁后，加入3 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(含青鏈霉素雙抗)，2-3天觀察并換液 1次。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)80%融合時(shí)，采用胰酶消化法 (0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)進(jìn)行細(xì)胞1 :3傳代，取第3~6代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0025] 將巨噬細(xì)胞系RAW264. 7置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基(含青鏈霉素雙抗)，2-3天觀察并換液1次。
[0026] 2) · MTT法檢測小白菊內(nèi)酯（PTL)對roLCs增殖能力的影響： 取生長良好的第3~5代roLCs，消化后以3 X IO3個(gè)/mL密度接種于9塊96孔板，每 塊板30孔，每孔100 μ L，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)12h保證細(xì)胞貼壁生長。按 實(shí)驗(yàn)分組更換培養(yǎng)基，PTL濃度分別為0，1，5,10和20 μΜ;繼續(xù)培養(yǎng)1，3和7天后，每孔 加入10 yL MTT試劑，37°C孵育4h后，以DMSO溶解生成的formazan。使用酶標(biāo)儀495nm 加蓋測定各孔OD值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0027] 3).小白菊內(nèi)酯（PTL)對PDLCs細(xì)胞中NF- κ B信號通路的影響： 本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測小白菊內(nèi)酯（PTL)對roLCs細(xì)胞中NF-κ B信號通路的 影響。
[0028] 取生長良好的roLCs細(xì)胞，消化后以IX IO5個(gè)/mL密度接種于6孔板，每孔1.5 mL 細(xì)胞懸液，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24h保證細(xì)胞貼壁生長；以1 μΜ PTL預(yù)處理細(xì)胞 lh，然后以I Pg/mL Escherichia coli LPS刺激細(xì)胞；在LPS加入后，在15, 30和60分 鐘時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞全蛋白；細(xì)胞裂解液配方是：1% Ipegal，l% sodium dodecyl sulphate， 50 mM Tris-HCl和150 mM