TGF-β1受體阻斷劑在制備治療包蟲病的藥物中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種治療包蟲病的方法，具體涉及TGF-M受體阻斷劑在制備治療包 蟲病的藥物中應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 包蟲病（Hydatiddisease)又稱棘球蝴病，是棘球蝴寄生于中間宿主引起的一種 嚴(yán)重影響人畜健康的寄生蟲疾病。包蟲病在手術(shù)治療過程中或者在正常患者體內(nèi)，由于包 囊意外破裂，部分原頭節(jié)可能進(jìn)入組織內(nèi)，造成再次感染，也給包蟲病的治療帶來很大困 難。
[0003] 針對包蟲病的治療，本領(lǐng)域已發(fā)展出了多種治療方案，主要是以外科手術(shù)為主，內(nèi) 科藥物化療為輔的方法。但此方法有許多弊端，如手術(shù)治療對人體損傷較大，且易復(fù)發(fā)。目 前，主要的抗包蟲病藥物有吡喹酮和苯并咪唑類藥物兩大類，但是由于這兩類藥物仍然存 在許多不足之處，如：毒副作用較大，且個(gè)體差異性大，有的患者不能耐受，或產(chǎn)生耐藥性， 有文獻(xiàn)報(bào)道，其化療在隨訪一年中僅有30 %的患者被治愈，30 %~50 %的患者改善，并且 療效不穩(wěn)定。
[0004]另外，包蟲病與其他寄生蟲病一樣，是一個(gè)慢性感染過程，其對宿主的作用也是慢 性而持久的過程，兩者之間的相互作用及其致病的免疫機(jī)制十分復(fù)雜，加之此病發(fā)病隱匿， 多數(shù)患者都是因包蟲病的并發(fā)癥而來醫(yī)院就診。
[0005] 為了進(jìn)一步提高治療效果，近年來，國內(nèi)外學(xué)者在包蟲致病機(jī)理、新型抗包蟲藥物 等領(lǐng)域開展了大量的研宄和臨床工作。
[0006]轉(zhuǎn)化生長因子-0(transforminggrowthfactor-0，TGF-0 )是屬于一組新近發(fā) 現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-0超家族。TGF-M屬于分泌性多肽因子，分布于多種組 織細(xì)胞中，TGF-M是種多功能生長因子。TGF-0具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長控制、分化、刺激 細(xì)胞外基質(zhì)的形成、增加粘附分子表達(dá)和抑制免疫應(yīng)答等多種生物功能。
[0007]Q34+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcells，Tregs)是體內(nèi)天然存在的、具有 獨(dú)特調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，其不同于Thl和Th2,它通過分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-M和 IL-10細(xì)胞膜分子或與其他細(xì)胞直接接觸等方式發(fā)揮廣泛的免疫抑制作用，抑制體內(nèi)T淋 巴細(xì)胞及NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的增殖和活化。包蟲病患者血清中發(fā)現(xiàn)，IL-10和TGF- 0 在包蟲病組的表達(dá)顯著高于健康對照組；體外小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原頭蝴/囊液與小鼠淋巴細(xì) 胞共培養(yǎng)組TGF-M顯著高于對照組；提示可能在這種特殊感染狀態(tài)下，能夠增強(qiáng)免疫抑 制相關(guān)性免疫應(yīng)答刺激Treg細(xì)胞，從而加強(qiáng)對宿主的免疫抑制作用。
[0008] 研宄發(fā)現(xiàn)，蟲體之所以能在宿主體內(nèi)長期生存，依賴于對宿主的免疫逃避功能。目 前關(guān)于蟲體免疫逃逸的研宄主要是Thl/Th2的漂移可能產(chǎn)生的免疫逃避。Treg細(xì)胞是一種 新型的T細(xì)胞亞群，是有別于Thl和Th2效應(yīng)T細(xì)胞，在包蟲病病灶附近發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞的 特異性因子及相關(guān)因子TGF-0、IL-10高表達(dá)，申請人通過之前的研宄發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球蝴/ 囊液感染可使小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量、特異性因子及相關(guān)因子TGF-0增加。因此，理論上講， 利用TGF-M受體阻斷劑在可用于預(yù)防包蟲病的復(fù)發(fā)，但是如何利用TGF-M受體阻斷劑 制備用于治療包蟲病，特別是針對細(xì)粒棘球蝴感染中的宿主，尚無報(bào)道。
[0009] 從目前的臨床實(shí)踐看，包蟲病的臨床診斷和防治研宄工作盡管已經(jīng)取得了很大的 進(jìn)步，但是，研發(fā)一種毒副作用小、藥效穩(wěn)定、能有效治療細(xì)粒棘球蝴感染并預(yù)防其復(fù)發(fā)的 藥物及其應(yīng)用，仍然是本領(lǐng)域亟待解決的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是通過深入研宄探索一種利用TGF-M受體阻斷劑有效治療細(xì)粒 棘球蝴感染及其復(fù)發(fā)的方法。
[0011] 申請人深入研宄了包蟲病發(fā)病的生物學(xué)機(jī)理以及感染初期宿主免疫應(yīng)答機(jī)制。申 請人通過建立細(xì)粒棘球蝴感染小鼠動物模型，研宄發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蝴通過促進(jìn)脾細(xì)胞分泌抑 制性分子TGF-M而促使⑶4+CD25+T細(xì)胞分化，從而下調(diào)NK細(xì)胞活性受體NKG2D的表達(dá)， 最終抑制NK細(xì)胞對細(xì)粒棘球蝴原頭蝴的殺傷，而形成對宿主的免疫逃避。為此，在理論上 講，如果能夠有效抑制包蟲蟲體在宿主體內(nèi)的免疫逃逸，重新激活宿主機(jī)體的免疫反應(yīng)，就 能夠有效治療細(xì)粒棘球蝴感染及其復(fù)發(fā)癥。
[0012] 具體地說，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0013]TGF-M受體阻斷劑在制備治療包蟲病的藥物中應(yīng)用，該應(yīng)用方法包括對細(xì)粒棘 球蝴感染中的宿主應(yīng)用一定量的TGF-M受體阻斷劑。
[0014]SB-431542、SB-505124和SB-525334是有效的TGF-0 1受體阻斷劑，可有效抑制 TGF-M誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化和核轉(zhuǎn)位，申請人通過研宄發(fā)現(xiàn)，SB-525334對宿主細(xì)胞 TGF-0I受體的抑制效果最佳。
[0015] 申請人采用如下試驗(yàn)步驟：制備細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)；分離小鼠脾臟細(xì)胞；體外 TGF-M受體阻斷后，細(xì)粒棘球蝴與小鼠淋巴細(xì)胞分組共培養(yǎng)；LDH法檢測NK的殺傷活性； 流式細(xì)胞染色及檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量；結(jié)果分析。
[0016] 其中，申請人研宄了TGF-M受體阻斷濃度、原頭蝴濃度以及兩者不同濃度之間 的組合，每次試驗(yàn)均設(shè)置了陰性對照、陽性對照、空白對照和技術(shù)重復(fù)，結(jié)果顯示，原頭蝴濃 度為1000個(gè)/mL-2000個(gè)/mL左右時(shí)，SB-525334的最佳工作濃度為：10-20ymol/mL。
[0017] 采用工作濃度為10-20ymol/mL的SB-525334體外阻斷TGF-0 1受體后，細(xì)粒棘 球蝴與小鼠淋巴細(xì)胞37°C，5%CO2共培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，分析分組試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯 示，在TGF- 0 1受體阻斷組，小鼠NK細(xì)胞的活性受體NKG2D和NK細(xì)胞的殺傷活性是顯著高 于陰性對照和空白對照組，即TGF-M受體阻斷后可使小鼠NK的活性受體NKG2D和NK細(xì) 胞的殺傷活性恢復(fù)甚至超過正常對照組水平。
[0018] 另外，棘球蝴組的⑶4+T細(xì)胞減少，而⑶8+T細(xì)胞則增多，從而使得⑶47⑶8+T的 比值減小，與臨床包蟲病患者淋巴細(xì)胞亞群分析的結(jié)果相一致。但TGF-M受體阻斷組， ⑶4+T細(xì)胞增多，而⑶8+T細(xì)胞則減少，從而使得⑶47⑶8+T細(xì)胞的比值增加至接近正常宿 主⑶47⑶8+T細(xì)胞的比值水平。
[0019] 最后，⑶47⑶25+T細(xì)胞比例在TGF-0 1受體阻斷的細(xì)粒棘球蝴與小鼠淋巴細(xì)胞共 培養(yǎng)組顯著低于未阻斷TGF-M受體組（P< 0. 001)，而稍高于空白對照組，但差異無統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。即體外棘球蝴與小鼠淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)可使CD4+CD25+T細(xì)胞比例增加，而選用前述 優(yōu)化濃度的TGF-M受體阻斷劑后，宿主細(xì)胞⑶47⑶25+T細(xì)胞比例下降至正常的水平。
[0020] 綜上所述，采用合適量的TGF-M受體阻斷劑可使細(xì)粒棘球蝴感染中的宿主細(xì)胞 ⑶4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量減少、⑶47⑶8+T細(xì)胞比值升高，使NK細(xì)胞活性受體NKG2D的表達(dá)增 加，而使因感染細(xì)粒棘球蝴而受抑制的NK細(xì)胞殺傷活性得到恢復(fù)，因此，TGF-M受體阻斷 劑在臨床上可作為制備治療包蟲病并預(yù)防其復(fù)發(fā)的有效藥物，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1顯示了流式細(xì)胞術(shù)檢測體外TGF-M受體阻斷后，細(xì)粒棘球蝴對小鼠 ⑶4+CD25+T細(xì)胞的影響。
[0022] A:流式細(xì)胞儀檢測體外TGF-0 1受體阻斷后，細(xì)粒棘球蝴對小鼠⑶4+⑶25+T細(xì) 胞的流式結(jié)果圖；B:CD4+CD25+T細(xì)胞流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析圖，PSC+SB組小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞 數(shù)量顯著低于PSC+PBS組；注：PSC:原頭節(jié)；SB:TGF-0 1受體阻斷劑（SB-525334) ;1640 : RPMI-1640 培養(yǎng)基；*:P< 0? 05, **:P< 0? 001。
[0023] 圖2為流式細(xì)胞術(shù)檢測體外TGF- 0 1受體阻斷后，細(xì)粒棘球蝴對小鼠T細(xì)胞亞群 的影響。
[0024] A :流式細(xì)胞儀檢測各組⑶47⑶8+T細(xì)胞的1次流式結(jié)果圖；B :流式檢測各組 ⑶4+T細(xì)胞比例結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析圖，PSC+SB組均高于PBS+PSC組；C :流式檢測各組⑶8+T細(xì)胞 比例結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析圖，PSC+SB組均低于PSC+PBS組；D各組⑶47⑶8+T細(xì)胞比值結(jié)果統(tǒng)計(jì)分 析圖，PSC+SB組較PBS+PSC組高；注：PSC :原頭節(jié)；SB :TGF-0 1受體阻斷劑（SB-525334); 木：P < 0. 05, ** :P < 0. 001。
[0025] 圖3為流式細(xì)胞術(shù)檢測體外TGF- 0 1受體阻斷后，細(xì)粒棘球蝴對小鼠NK細(xì)胞的影 響。
[0026]A流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞活性受體NKG2D的結(jié)果圖；B流式檢測各組NKG2D結(jié)果 統(tǒng)計(jì)分析圖，PSC+SB組的表達(dá)顯著高于其它組；CLDH法檢測各組小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的 統(tǒng)計(jì)分析圖，PSC+SB組小鼠NK細(xì)胞殺傷活性明顯高于其它組；D小鼠NK細(xì)胞殺傷活性與 其活性受體NKG2D的相關(guān)性分析，R2 = 0. 904 ;注：PSC:原頭節(jié)；SB:TGF-M受體阻斷劑 (SB-525334) ;*:P<0? 05, **:P<0? 001。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 1.細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的制備：
[0028] 從感染細(xì)粒棘球蝴病的羊肝上，無菌抽取無鈣化、無感染、全整的單囊型細(xì)粒棘球 蝴包囊內(nèi)容物，置于無菌離心管內(nèi)，原頭節(jié)（Protoscole，PSC)自然沉淀，再用含有100IU/ mL青霉素和鏈霉素雙抗的無菌PBS(pH7. 3)中漂洗3次，除去育囊碎片使其自然沉淀，經(jīng) 0. 5%伊紅染色5min，在顯微鏡下鑒定具有活性的蟲體數(shù)（> 90% )，用含雙抗的無菌PBS 稀釋制成含有原頭節(jié)10000個(gè)/mL的原頭節(jié)懸液，備用。
[0029] 2小鼠脾臟細(xì)胞分離：
[0030] 脫頸處死小鼠，無菌摘取小鼠脾臟，用1支5mL和1支ImL注射器在含有少許PBS 的小平皿中刮出脾細(xì)胞。用ImL注射器抽吸刮出的脾細(xì)胞3-5次，使脾細(xì)胞盡量分散。向 1新離心管加入3mL的小鼠淋巴細(xì)胞分離液，再將約I. 5mL的脾細(xì)胞懸液緩慢加入（V分離 液：V