包含修飾的抗原的生物綴合物及其用圖
【專利說明】包含修飾的抗原的生物綴合物及其用途
[0001] 本申請(qǐng)要求于2012年9月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/698,843的優(yōu)先 權(quán)，將其公開內(nèi)容以其整體通過引用結(jié)合于此。
[0002] 1?引言
[0003] 本文提供了一種大腸桿菌（Escherichia coli)的修飾的抗原，來自大腸桿菌 (E. coli)血清型0121的0抗原。本文還提供了所述修飾的大腸桿菌0121 0-抗原的用途， 如所述修飾的大腸桿菌0121 0-抗原在治療和/或預(yù)防疾病中的用途，例如，治療和/或預(yù) 防由腸道沙門氏菌（Salmonella enterica)引起的疾病，包括由傷寒沙門氏菌（S.typhi) 引起的疾病。 2.【背景技術(shù)】
[0004] 傷寒癥仍然是一種嚴(yán)重的公眾健康問題，其每年發(fā)生2200-3300萬病例，包括約 216, 000-500, 000 例死亡[Crump, J. A.，Luby，S. P.，Mintz，E. D. : The global burden of typhoid fever (傷寒熱的全球負(fù)擔(dān)）? Bull World Health 0rgan82 (5) ,346-353 (2004)]。 這種人類全身感染的病原體傷寒沙門氏菌（S.typhi)是通過污染的水和食物經(jīng)口 (feco-orally)傳播的。因此，傷寒癥是衛(wèi)生條件仍然較差的較不發(fā)達(dá)地區(qū)中的地方 性疾病。包括亞洲、非洲和南美洲在內(nèi)的許多國(guó)家的學(xué)生和年輕人最經(jīng)常受到影響 [Bhan，M.K.，Bahl，R.，Bhatnagar，S.:Typhoid and paratyphoid fever(傷寒癥和副傷 寒）.Lancet366 (9487)，749-762 (2005)]。傷寒熱的抗微生物治療通過出現(xiàn)傷寒沙門氏菌 的多藥抗性菌株而日漸變得復(fù)雜[Mirza, S. H.，Beeching, N. J.，Hart, C. A. :Multi_drug resistant typhoid:a global problem(多藥抗性傷寒：全球問題）? J Med Microbiol 44(5)，317-319(1996)]。
[0005] 高危險(xiǎn)人群的疫苗接種被認(rèn)為是用于控制和預(yù)防傷寒癥的最有前景策略。目 前，有兩種被許可的傷寒疫苗：經(jīng)口施用的、全細(xì)胞減毒活疫苗Ty21a和純化的Vi多 糖腸胃外疫苗。Ty21a疫苗具有多種缺點(diǎn)：（i)有助于這種傷寒沙門氏菌菌株的減毒 表型的突變未被充分定義[Hone, D. M.，Attridge, S. R.，F(xiàn)orrest, B.，Morona, R.，Dan iels, D. , LaBrooy, J. T. , Bartholomeusz, R. C. , Shearman, D. J. , Hackett, J. :A galE via (Vi antigen-negative)mutant of Salmonella typhi Ty2retains virulence in humans (傷寒沙門氏菌Ty2的galE via(Vi抗原陰性）突變體在人中保持病毒性）.Infect Immun 56(5)，1326-1333(1988)]，（ii)減毒菌株理論上可以恢復(fù)為病毒性，和（iii) Ty21a是僅適度免疫原性的并且每5年需要三至四個(gè)初始劑量和加強(qiáng)劑量[Levine，M. M. , Ferreccio, C. , Black, R. E. , Germanier, R. :Large-scale field trial of Ty21a live oral typhoid vaccine in enteric-coated capsule formulation (腸包衣的膠囊制齊Ij中 的Ty21a活性傷寒疫苗的大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)）.Lancet 1 (8541)，1049-1052 (1987) ;Black, R. E. , Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Clements, M. L. , Lanata, C. , Rooney, J. , Germanier, R. :Ef ficacy of one or two doses of Ty21a Salmonella typhi vaccine in enteric-coated capsules in a controlled field trial (腸包衣膠囊中一個(gè)或兩個(gè)劑量的Ty21a傷 寒沙門氏菌疫苗在受控現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)中的效力）? Chilean Typhoid Committee. Vaccine 8(1), 81-84 (1990) ；Murphy, J. R. , Grez, L. , Schlesinger, L. , Ferreccio, C. , Baqar, S. , M unoz, C. , ffasserman, S. S. , Losonsky, G. , Olson, J. G. , Levine, M. M. : Immunogenicity of Salmonella typhi Ty21a vaccine for young children (傷寒沙門氏菌疫苗對(duì)于年輕幼 兒的免疫原性）? Infect Immun 59 (11), 4291-4293 (1991) ；Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Cr yz, S. , Ortiz, E. !Comparison of enteric-coated capsules and liquid formulation of Ty21a typhoid vaccine in randomised controlled field trial (Ty21a傷寒疫苗的腸包 衣膠囊和液體制劑在隨機(jī)化受控現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)中的比較）.Lancet 336(8720)，891-894(1990); Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Abrego, P. , Martin, 0. S. , Ortiz, E. , Cryz, S. !Duration of efficacy of Ty21a, attenuated Salmonella typhi live oral vaccine(Ty21a 減毒 的傷寒沙門氏菌活口服疫苗的效力的持續(xù)時(shí)間）.Vaccine 17Suppl 2, S22-27(1999)]。 Vi多糖疫苗的有用性受其年齡相關(guān)的免疫原性和針對(duì)多糖的免疫應(yīng)答是T細(xì)胞無關(guān) 這一事實(shí)所限制。因此，不能建立免疫記憶并且再接種疫苗不會(huì)引起任何加強(qiáng)應(yīng)答 [ffeintraub, A. : Immunology of bacterial polysaccharide antigens (細(xì)菌多糖抗原的 免疫學(xué)）? Carbohydr Res 338 (23) ,2539-2547 (2003)，Landy，M. : Studies on Vi antigen. VI. Immunization of human beings with purified Vi antigen(人類用純化的Vi 抗原免 疫）.Am J Hyg 60 (I) ,52-62 (1954)]。由于這些缺陷，所以期望用良好定義的、良好耐受的 且高度免疫原性的疫苗替代當(dāng)前的傷寒疫苗。
[0006] 多糖疫苗的缺點(diǎn)可以通過將糖綴合至蛋白質(zhì)載體（綴合物疫苗）而克服。在 綴合后，多糖的行為類似于T細(xì)胞依賴性抗原。已證實(shí)，共價(jià)連接至重組綠膿假單胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)外毒素A (EPA)的純化的Vi多糖在幼兒中誘發(fā)針對(duì) 傷寒沙門氏菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答[3211，3.(1，1&7101'，0.11，1'1'0€&，六.(1，01611161^8，]\ D. , Shiloach, J. , Sadoff, J. C. , Bryla, D. A. , Robbins, J. B. !Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines (Vi莢膜多糖-蛋白質(zhì)綴合物疫苗的實(shí)驗(yàn)室和初步臨床表征）.Infect Immun 62 (10), 4440-4444 (1994) ；Lin, F. Y. , Ho, V. A. , Khiem, H. B. , Trach, D. D. , Bay, P. V. , Thanh, T. C. , Kossaczka, Z. , Bryla, D. A. , Shiloach, J. , Robbins, J. B. , Schneerson, R. , Szu, S. C. :The efficacy of a Salmonella typhi Vi conjugate vaccine in tw〇-t〇-five_year-〇ld children (傷寒沙門氏菌Vi綴合物疫苗在二至五歲兒 童中的效力）.N Engl J Med 344(17)，1263-1269(2001)]。然而，綴合物疫苗的生產(chǎn)是一 個(gè)復(fù)雜的多步驟過程。首先，必須培育產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)載體和多糖抗原的分離的細(xì)菌菌株。 多糖和蛋白質(zhì)載體在該兩種組分進(jìn)行化學(xué)偶合之前必須通過不同的程序純化。最后的步驟 涉及用于獲得最終產(chǎn)物的額外純化步驟。該費(fèi)力的生產(chǎn)過程具有以下缺點(diǎn)：（i)需要多個(gè) 純化步驟，其中可能出現(xiàn)相當(dāng)大的損失和（ii)由于化學(xué)偶合的隨機(jī)性，所以產(chǎn)物不是均一 結(jié)構(gòu)而是不同糖綴合物的混合物，具有潛在的不同效力分布曲線。
[0007] 因此，仍然需要對(duì)感染了腸道沙門氏菌，包括傷寒沙門氏菌的受試者進(jìn)行治療和 預(yù)防的改進(jìn)方法。
[0008] 3?概述
[0009] 在一個(gè)方面，本文提供了包含載體蛋白和修飾的大腸桿菌0121 0-抗原的生物綴 合物。
[0010] 在某些實(shí)施方式中，本文提供的生物綴合物的修飾的大腸桿菌0121 0-抗原共價(jià) 結(jié)合至載體蛋白的糖基化位點(diǎn)內(nèi)的天冬酰胺殘基（Asn)，其中所述糖基化位點(diǎn)包含氨基酸 序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。在某些實(shí)施 方式中，本文提供的生物綴合物的載體蛋白不是天然地（例如，在其正常/天然的或"野生 型"狀態(tài)）包含糖基化位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，本文提供的生物綴合物的載體蛋白被改造 成包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，例如，所述載體蛋白被改造成包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)， 該糖基化位點(diǎn)包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的 任何氨基酸。例如，根據(jù)本文描述的方法使用的載體蛋白可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 個(gè)或更多個(gè)糖基化位點(diǎn)，每一個(gè)糖基化位點(diǎn)具有氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其 中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸；并且其中一些（例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)） 或全部糖基化位點(diǎn)已被重組地引入到所述載體蛋白中。
[0011] 適合用于本文描述的方法（例如，治療和/或預(yù)防傷寒沙門氏菌感染）中的任何 載體蛋白可以在本文描述的生物綴合物的生產(chǎn)中使用。示例性載體蛋白包括，但不限于，銅 綠假單胞菌（P. aeruginosa)的外毒素 A (EPA)、CRM197、白喉類毒素（Diphtheria toxoid)、 破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid)、金黃色葡萄球菌（S. aureus)的解毒溶血素A、聚集因子 (clumping factor)A、聚集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素 (E.coli heat labile enterotoxin)、大腸桿菌不耐熱腸毒素的解毒變體、霍亂毒素B亞基 (Cholera toxin B subunit) (CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素的解毒變體、大腸桿菌sat蛋白、大 腸桿菌sat蛋白的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域、空腸彎曲桿菌AcrA(C. jejuni AcrA)和空腸彎曲桿菌天然 糖蛋白。
[0012] 在一種【具體實(shí)施方式】中，本文提供了一種包含載體蛋白和修飾的大腸桿菌0121 0-抗原的生物綴合物，其中所述修飾的大腸桿菌0121 0-抗原包含：
[0013] - 4)- a -D-GalNAcA-(1 - 4)- a -D-GalNAcA-(1 -
[0014] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，本文提供了一種包含載體蛋白和修飾的大腸桿菌0121 0-抗原的生物綴合物，其中所述修飾的大腸桿菌0121 0-抗原包含：
[0015]
[0016] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，本文提供了一種包含載體蛋白和修飾的大腸桿菌0121 0-抗原的生物綴合物，其中所述修飾的大腸桿菌0121 0-抗原包含：
[0017]
[0018] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，本文提供了一種包含載體蛋白和修飾的大腸桿菌0121 0-抗原的生物綴合物，其中所述修飾的大腸桿菌0121 0-抗原包含：
[0019]
[0020]在另一個(gè)方面，本文提供了能夠生產(chǎn)本文描述的生物綴合物的原核宿主細(xì)胞。在 一種【具體實(shí)施方式】中，本文提供了一種可用于產(chǎn)生生物綴合物的原核宿主細(xì)胞，其中所述 原核宿主細(xì)胞包含：（i)編碼載體蛋白的異源核苷酸序列，所述載體蛋白包含至少一個(gè)糖 基化位點(diǎn)，該糖基化位點(diǎn)包含氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以 是除Pro之外的任何天然氨基酸；和（ii)編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的異源核苷酸序列；其中所述 原核宿主細(xì)胞被重組地改造成生產(chǎn)Und-PP-修飾的大腸桿菌0121 0-抗原（即，本文描述 的任一個(gè)修飾的大腸桿菌0121 0-抗原），其中所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶將修飾的大腸桿菌0121 〇-抗原轉(zhuǎn)移至所述糖基化位點(diǎn)的Asn。在一種【具體實(shí)施方式】中，本文描述的原核宿主細(xì)胞 是大腸桿菌宿主細(xì)胞。在另一種【具體實(shí)施方式】中，本文描述的原核宿主細(xì)胞是大腸桿菌菌 株K12宿主細(xì)胞。在另一種【具體實(shí)施方式】中，重組地引入到本文描述的宿主細(xì)胞，例如，大 腸桿菌宿主細(xì)胞中的寡糖基轉(zhuǎn)移酶是空腸彎曲桿菌的PglB。
[0021] 在某些實(shí)施方式中，除了異源寡糖基轉(zhuǎn)移酶之外，本文描述的宿主細(xì)胞包含異源 核酸序列（即，不是與宿主細(xì)胞在其自然/天然狀態(tài)，例如，在其"野生型"狀態(tài)正常相關(guān)聯(lián) 的核酸序列，例如，基因）。這樣的額外的異源核酸序列可以包含編碼已知是屬于糖基化操 縱子，例如，原核糖基化操縱子的基因的核酸。在具體的實(shí)施方式中，這樣的額外異源核酸 序列包含屬于空腸彎曲桿菌的Pgl簇的基因，或包含空腸彎曲桿菌的全部Pgl簇。
[0022] 在某些實(shí)施方式中，本文描述的宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)基因缺失和/或一個(gè)或 多個(gè)基因失活，即，宿主細(xì)胞的遺傳背景已經(jīng)以使得與宿主細(xì)胞正常相關(guān)的基因（例如，一 個(gè)或多個(gè)"野生型"基因）失活或功能失常，或者將該基因全部去除的方式進(jìn)行修飾。在一 種【具體實(shí)施方式】中，在本文描述的生物綴合物的生產(chǎn)中使用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌宿主細(xì) 胞，其中所述大腸桿菌宿主細(xì)胞具有在wbqG基因中的突變或該wbqG基因的缺失。在另一 種【具體實(shí)施方式】中，在本文描述的生物綴合物的生產(chǎn)中使用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌宿主細(xì) 胞，其中所述大腸桿菌宿主細(xì)胞具有在wbqC基因中的突變或該wbqC基因的缺失。在另一 種【具體實(shí)施方式】中，在本文描述的生物綴合物的生產(chǎn)中使用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌宿主細(xì) 胞，其中所述大腸桿菌宿主細(xì)胞具有在wbqE基因中的突變或該wbqE基因的缺失。在另一 種【具體實(shí)施方式】中，在本文描述的生物綴合物的產(chǎn)生中使用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌宿主細(xì) 胞，其中所述大腸桿菌宿主細(xì)胞具有在wbqG基因和wbqC基因中的突變或該wbqG基因和 wbqC基因的缺失。在另一種【具體實(shí)施方式】中，在本文描述的生物綴合物的產(chǎn)生中使用的宿 主細(xì)胞是大腸桿菌宿主細(xì)胞，其中所述大腸桿菌宿主細(xì)胞具有在wbqG基因和wbqE基因中 的突變或該wbqG基因和wbqE基因的缺失。在另一種【具體實(shí)施方式】中，在本文描述的生物 綴合物的產(chǎn)生中使用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌宿主細(xì)胞，其中所述大腸桿菌宿主細(xì)胞具有在 wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因中的突變或該wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因的缺失。
[0023] 在某些實(shí)施方式中，大腸桿菌的0121基因簇（例如，大腸桿菌0121參照菌株CCUG 11422 的 0121 基因簇；在 Fratamico 等，2003, J. Clin. Microbiol. 41 (7) :3379-3383 中描 述的0121基因簇）被引入（例如，重組地引入）到本文描述的宿主細(xì)胞中。在某些實(shí)施方 式中，0121基因簇被引入到不產(chǎn)生任何O抗原的宿主細(xì)胞中，例如，所述宿主細(xì)胞已以使其 不產(chǎn)生任何0抗原的方式