一種高精度的生物3d打印方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞打印技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高精度的生物3D打印方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Boland等于2003年提出“細(xì)胞打印”技術(shù)的概念，該技術(shù)利用傳統(tǒng)增材制造的原理與方法，以生物材料、生長(zhǎng)因子及活性細(xì)胞為材料，進(jìn)行人工組織與器官等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的可控制造。在“細(xì)胞打印”過(guò)程中，將細(xì)胞(或細(xì)胞聚集體)、溶膠(水凝膠的前驅(qū)體)和生長(zhǎng)因子的混合液同時(shí)置于打印機(jī)的噴頭中，由計(jì)算機(jī)控制含細(xì)胞液滴的沉積位置，通過(guò)由點(diǎn)到線，由線到面，由面成體的方式逐層完成三維多細(xì)胞水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的構(gòu)建。與傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)相比，“細(xì)胞打印”的優(yōu)勢(shì)主要有:(I)可同時(shí)構(gòu)建有生物活性的二維或三維“多細(xì)胞/材料”體系；(2)有望精確實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞在三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)體內(nèi)的按需、可控、均勻種植；(3)可構(gòu)建細(xì)胞生長(zhǎng)所需的三維微結(jié)構(gòu)環(huán)境。
[0003]細(xì)胞打印技術(shù)為制造可供臨床移植的人工組織或器官提供了新的思路和技術(shù)方法。同時(shí)，也有助于推動(dòng)生物學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研宄與創(chuàng)新，如3D打印的體外三維組織模型可用于研宄腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)機(jī)理、代謝綜合癥中糖的代謝和新藥的研發(fā)等。
[0004]目前的細(xì)胞打印方法主要包括噴墨打印技術(shù)、微擠出成型技術(shù)以及激光輔助打印技術(shù)等。這些方法在細(xì)胞活性、多細(xì)胞打印等方面均取得了較大的進(jìn)展，但主要挑戰(zhàn)在于無(wú)法以較低的成本制造出與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)尺度相近的微觀結(jié)構(gòu)環(huán)境，從而精確調(diào)控細(xì)胞的分化生長(zhǎng)與組織再生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種高精度的生物3D打印方法，能夠在基板上快速、并按要求打印各種精細(xì)的細(xì)胞圖案以及三維細(xì)胞/凝膠微結(jié)構(gòu)體系。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0007]一種高精度的生物3D打印方法，包括以下步驟:
[0008]I)根據(jù)想要打印的細(xì)胞圖案或三維細(xì)胞凝膠結(jié)構(gòu)在計(jì)算機(jī)上編制出控制平臺(tái)移動(dòng)的程序，然后在20 μ m?200 μ m之間選擇要打印的圖案的線寬，從而確定平臺(tái)移動(dòng)的速度:1mm/s ?500mm/s ；
[0009]2)配置用于3D打印的細(xì)胞/生長(zhǎng)因子/生物材料的混合溶液，將配置好的混合溶液在孔徑為?ο μπι的過(guò)濾網(wǎng)中往復(fù)過(guò)濾，所使用的生物材料包括光交聯(lián)的明膠或聚乙二醇、可鈣離子交聯(lián)的海藻酸鈉、可溫度交聯(lián)的膠原蛋白或聚乙烯醇，或者這些材料相互混合后的復(fù)合材料，其質(zhì)量濃度介于0.5%?10%之間；所使用的細(xì)胞包括肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或具有多向分化功能的干細(xì)胞，細(xì)胞在混合溶液中的濃度為I X 15?5X 107個(gè)/ml ;所使用的生長(zhǎng)因子包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、或這些生長(zhǎng)因子的混合物，生長(zhǎng)因子在混合溶液中的濃度為0.05?I μ g/ml ;
[0010]3)將配置好的細(xì)胞/生長(zhǎng)因子/生物材料的混合溶液吸入裝有金屬噴頭的注射器內(nèi)，金屬噴頭的內(nèi)孔徑為100?1000 μ m，通過(guò)精密注射泵控制注射器使混合溶液的打印流量為20?1000 μ Ι/h，將金屬噴頭與直流高壓電源的正極相接，將接收板固定金屬噴頭下方的移動(dòng)平臺(tái)上，并接地，其中接收板采用厚度為0.1?Imm的導(dǎo)電材料，導(dǎo)電材料包括導(dǎo)電玻璃、金屬板、硅片，調(diào)整接收板與金屬噴頭的距離為I?5mm ;
[0011]4)打開(kāi)高壓直流電源開(kāi)關(guān)，調(diào)整電壓幅值介于0.5?20KV，從而在金屬噴頭與接收板之間形成穩(wěn)定的高壓靜電場(chǎng)，混合溶液在高電場(chǎng)的作用下形成材料射流，啟動(dòng)移動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)程序，從而使材料射流在接收板上形成預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案或結(jié)構(gòu)，并根據(jù)生物材料的交聯(lián)方式通過(guò)光照、改變溫度、鈣離子處理方式使材料射流快速原位形成細(xì)胞/水凝膠；
[0012]5)待第一層圖案或結(jié)構(gòu)制造完成后，通過(guò)采用不同的細(xì)胞與材料混合溶液，重復(fù)步驟4)的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)三維復(fù)雜細(xì)胞/水凝膠復(fù)合結(jié)構(gòu)的打印。
[0013]上述步驟均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。
[0014]與現(xiàn)有的細(xì)胞打印方法相比，本發(fā)明可將圖案的分辨率從大于200 μ m提高到20?30 μ m?其次，通過(guò)改變移動(dòng)速度來(lái)觀察打印圖案分辨率的實(shí)驗(yàn)，得到分辨率關(guān)于移動(dòng)速度的變化規(guī)律，這意味著可以通過(guò)改變平臺(tái)的移動(dòng)速度在一個(gè)細(xì)胞圖案上得到不同的線寬。最后，由于可以得到分辨率很高的圖案(最高為20 μ m)，而單個(gè)細(xì)胞的直徑約為10?40 μ m,能夠通過(guò)改變單位體積細(xì)胞懸浮夜中的細(xì)胞個(gè)數(shù)來(lái)獲得單個(gè)細(xì)胞分布的細(xì)胞圖案。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為實(shí)施例1制造出的單根直線細(xì)胞/凝膠結(jié)構(gòu)圖。
[0016]圖2為實(shí)施例2制造出的單根直線細(xì)胞/凝膠結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0018]實(shí)施例1
[0019]一種高精度的生物3D打印方法，包括以下步驟:
[0020]I)根據(jù)想要打印的細(xì)胞圖案或三維細(xì)胞凝膠結(jié)構(gòu)在計(jì)算機(jī)上編制出控制平臺(tái)移動(dòng)的程序，選擇40 μ m作為需要打印的圖案的線寬，從而確定平臺(tái)移動(dòng)的速度為60mm/s ；[0021 ] 2)配置用于3D打印的細(xì)胞/生長(zhǎng)因子/生物材料的混合溶液，所使用的生物材料為海藻酸鈉與PVA，其質(zhì)量濃度分別為0.5%和6% ;所使用的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，細(xì)胞在混合溶液中的濃度為2X 16個(gè)/ml，生長(zhǎng)因子在混合溶液中的濃度為I μ g/ml ；
[0022]3)將配置好的細(xì)胞/生長(zhǎng)因子/生物材料的混合溶液吸入裝有金屬噴頭的注射器內(nèi)，金屬噴頭的內(nèi)孔徑為500 μ m，通過(guò)精密注射泵控制注射器使混合溶液的打印流量為60 μ 1/h，將金屬噴頭與直流高壓電源的正極相接，將接收板固定金屬噴頭下方的移動(dòng)平臺(tái)上，并接地，其中接收板采用方阻為4 Ω、厚度為0.7mm的ITO導(dǎo)電玻璃，調(diào)整接收板與金屬噴頭的距離為1.75mm ；
[0023]4)打開(kāi)高壓直流電源開(kāi)關(guān)，調(diào)整電壓幅值為1.9KV，從而在金屬噴頭與接收板之間形成穩(wěn)定的高壓靜電場(chǎng)，混合溶液在高電場(chǎng)的作用下形成材料射流，啟動(dòng)移動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)程序，從而使材料射流在接收板上形成預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案或結(jié)構(gòu)，并根據(jù)生物材料的交聯(lián)方式通過(guò)鈣離子處理方式使材料射流快速原位形成細(xì)胞/水凝膠；
[0024]5)待第一層圖案或結(jié)構(gòu)制造完成后，可通過(guò)采用不同的細(xì)胞與材料混合溶液，重復(fù)步驟4)的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)三維復(fù)雜細(xì)胞/水凝膠復(fù)合結(jié)構(gòu)的打印。
[0025]上述步驟均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。
[0026]本實(shí)施例的有益效果為:所制造的單根直線細(xì)胞/凝膠結(jié)構(gòu)如圖1所示，圖1是實(shí)施例I中所產(chǎn)生的單根直線細(xì)胞/凝膠結(jié)構(gòu)，圖中的小點(diǎn)兒是成纖維細(xì)胞，線寬在40μπι左右。
[0027]實(shí)施例2
[0028]—種高精度的生物3D打印方法，包括以下步驟:
[0029]I)根據(jù)想要打印的細(xì)胞圖案或三維細(xì)胞凝膠結(jié)構(gòu)在計(jì)算機(jī)上編制出控制平臺(tái)移動(dòng)的程序，選擇150 μ m作為需要打印的圖案的線寬，從而確定平臺(tái)移動(dòng)的速度為5mm/s ；
[0030]2)配置用于3D打印的細(xì)胞/生長(zhǎng)因子/生物材料的混合溶液所使用的生物材料為PVA和II型鼠尾膠原蛋白，其質(zhì)量濃度分別為8 %和0.5 % ;所使用的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞在混合溶液中的濃度為I X 17個(gè)/ml，生長(zhǎng)因子在混合溶液中的濃度為0.05 μ g/ml ；
[0031]3)將配置好的細(xì)胞/生長(zhǎng)因子/生物材料吸入裝有金屬噴頭的注射器內(nèi)，金屬噴頭的內(nèi)孔徑為200 μ m，通過(guò)精密注射泵控制注射器使混合溶液的打印流量為20 μ 1/h，將金屬噴頭與直流高壓電源的正極相接，將接收板固定金屬噴頭下方的移動(dòng)平臺(tái)上，并接地，其中接收板采用方阻為4 Ω、厚度為0.5mm的ITO導(dǎo)電玻璃，調(diào)整接收板與金屬噴頭的距離為 1.75mm ；
[0032]4)打開(kāi)高壓直流電源開(kāi)關(guān)，調(diào)整電壓幅值為3KV，從而在金屬噴頭與接收板之間形成穩(wěn)定的高壓靜電場(chǎng)，混合溶液在高電場(chǎng)的作用下形成材料射流，啟動(dòng)移動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)程序，從而使材料射流在接收板上形成預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案或結(jié)構(gòu)，并根據(jù)生物材料的交聯(lián)方式通過(guò)改變溫度方式使材料射流快速原位形成細(xì)胞/水凝膠；
[0033]5)待第一層圖案或結(jié)構(gòu)制造完成后，可通過(guò)采用不同的細(xì)胞與材料混合溶液，重復(fù)步驟4)的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)三維復(fù)雜細(xì)胞/水凝膠復(fù)合結(jié)構(gòu)的打印。
[0034]上述步驟均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。
[0035]本實(shí)施例的有益效果為:所制造的單根直線細(xì)胞/凝膠結(jié)構(gòu)圖2所示，圖2是實(shí)施例2中所產(chǎn)生的單根直線細(xì)胞/凝膠結(jié)構(gòu)，圖中的小點(diǎn)兒是成纖維細(xì)胞，線寬在100 μπι左右。
[0036]實(shí)施例3
[0037]一種高精度的生物3D打印方法，包括以下步驟:
[0038]I)根據(jù)想要打印的細(xì)胞圖案或三維細(xì)胞凝膠結(jié)構(gòu)在計(jì)算機(jī)上編制出控制平臺(tái)移動(dòng)的程序，選擇20 μ m作為需要打印的圖案的線寬，從而確定平臺(tái)移動(dòng)的速度為500mm/s ；
[0039]2)配置用于3D打印的細(xì)胞/生長(zhǎng)因子/生物材料的混合溶液，所使用的生物材料為明膠溶液，其質(zhì)量濃度分別為5% ;所使用的細(xì)胞為成干細(xì)