壁虎蛆蟲蛋白質的制備方法及其在制備抗子宮肌瘤藥品中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法及其新用途，尤其是壁虎蛆蟲蛋白質的制備方法 及其在制備抗子宮肌瘤藥品中的應用。
【背景技術】
[0002] 子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，是女性生殖器常見的一種良性腫瘤，大部分無癥狀， 少數(shù)患者表現(xiàn)為陰道出血、月經(jīng)失調、白帶增多等癥狀。
[0003] 現(xiàn)常用的治療方法有：藥物治療、宮腹腔鏡手術切除、腫瘤剝除術等，但手術治療 帶來的副作用較多。
[0004] CN102370851A公開了治療子宮肌瘤調經(jīng)的中草藥，由丹參、當歸、紅花、月季花、 雞冠花、穿山甲、菊花、鳳尾草、夏枯草等12味中草藥組成；CN102319392A公開了一種治 療子宮肌瘤的中藥滴丸劑及其制備方法，由牡蠣、香附、三棱、莪術、白花蛇舌草等中草藥 組成；CN102327531A公開了一種有效治療子宮肌瘤的中成藥及中藥湯劑，由當歸、桃仁、 莪術、香附、王不留行、三棱等12味中草藥組成；CN102247581A公開了一種治療子宮肌瘤 的藥物，由香附、當歸、川穹、桃仁、三棱、丹參、元參、丹皮、甘草等15種中草藥粉碎而成； CN102302649A公開了一種治療子宮肌瘤的中藥組合物，由黃藥子、黃麻子、南瓜藤、化橘紅、 茴香根、藕節(jié)等組成。
[0005] 現(xiàn)有治療方法中，有采用桂枝茯苓膠囊聯(lián)合米非司酮治療子宮肌瘤取得了一定療 效，也有采用《濟坐方》中香棱丸加味治療子宮肌瘤的；也有的醫(yī)師自擬四合克瘤方治療子 宮肌瘤取得了一定療效；藥物治療有用米非司酮、達那唑、他莫昔芬雄性激素及促性腺激 素。
[0006] 201210315707. 2公開了人工培殖壁虎蛆蟲的工藝，本發(fā)明描述了以壁虎等為原 料，經(jīng)培殖、培養(yǎng)、后處理制備成為壁虎蛆蟲。本發(fā)明過程重組壁虎基因，生成的壁虎蛆蟲成 分具有抗子宮肌瘤的功能，可以批量生產(chǎn)。
[0007] 原則上，上述的幾種中藥制劑都可以用于治療子宮肌瘤藥品的制備。但是，由于前 述的幾個藥方中藥材繁多，每種中草藥由于種植地域、氣候、品種、采收時間、炮制及加工方 法的差異，因此，在工業(yè)化生產(chǎn)中難于保證產(chǎn)品的一致性，也難于控制產(chǎn)品的質量。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種壁虎蛆蟲蛋白質的制備方法及其在制備抗子宮肌瘤藥 品中的應用，利用壁虎蛆蟲為原料，經(jīng)過分離純化蛋白質，再用此蛋白質制備各種劑型的藥 品，本過程工藝簡要明了，藥品成分明確，一致性好，療效明顯。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的： (1)將1000 g壁虎蛆蟲在常溫膨化裝置（200520108339.X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0010] 本步驟中，所述膨化壓力為0?l~5MPa，時間為10~60min。
[0011] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出壁虎蛆蟲蛋白質粗品。
[0012] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH3 ?H2O組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0013] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時間為10~30min。
[0014] (3)收集含有壁虎蛆蟲蛋白質粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質。
[0015] 本步驟中，所述微孔過濾器的孔徑為0. 5~50Mm。
[0016] (4)用超濾機超濾處理，收集含有相應分子量的壁虎蛆蟲蛋白質超濾溶液。
[0017] 本步驟中，所述超濾機的孔徑為50~100nm。
[0018] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0019] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0020] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0021] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500(重量比）組成。
[0022] (7)純化后的壁虎蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機制備成凍干蛋白粉。
[0023] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_30~50°C、時間為18~26h。
[0024](8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服劑、栓劑，可用于制備抗子 宮肌瘤藥品。
[0025] 本技術方案中分離的純化壁虎蛆蟲蛋白質經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向聚丙烯酰 胺凝膠電泳及瓊脂聚糖免疫電泳譜上測得非均一蛋白質；用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 及葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾法測得相對分子量為10. 9~12. 6KPa;用等電聚焦發(fā)測定其等 電點為PH8. 8~10. 2;常規(guī)化學法分析結果表明其不含糖基；紫外分光光度法測定純化的壁 虎蛆蟲蛋白質含量為96. 7%。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限如此，凡是對 本發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵 蓋在本發(fā)明的保護范圍中。
[0027] 實施例1: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至0.l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ?H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓 至常壓，生成壁虎蛆蟲蛋白質粗品與甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應分子量的壁虎蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測器波長260~280nm; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~501：、時間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0028] 實施例2: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至0.l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液態(tài)二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ?H2O,加壓至5MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度15°C，時間20min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓至常壓，生成壁虎蛆蟲蛋 白質粗品與甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑30Mm的微孔過濾器過濾去處固體雜 質； (4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應分 子量的壁虎蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化預處理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 5mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率I. 0KW，頻率500KHz，流速200mL/ min，紫外檢測器波長260nm; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~40°C、時間20h干燥制備 成凍干蛋白粉。
[0029] 實施例3: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至0.l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨，加壓至2~10MPa，形成膨脹 溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓至 常壓，生成壁虎蛆蟲蛋白質粗品與乙醇-氯化銨的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應分子量的壁虎蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6)將洗脫成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)溶劑體系中， 用超聲駐波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率 500~1000KHz，流速50~500mL/min，紫外檢測器波長260~280nm; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~501：、時間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0030] 實施例4: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至2MPa，時間40min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆蟲被膨化 成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入6Kg液態(tài)二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化銨，加壓至6MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度20°C，時間lOmin，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后