專利名稱：殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白功能區(qū)變構(gòu)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用于治療人體細(xì)菌感染和內(nèi)毒素血癥的活性多肽分子，具體涉及殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白質(zhì)(BPI)功能區(qū)生物活性肽--BPI變構(gòu)肽。
革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌引起的膿毒癥是導(dǎo)致臨床病人死亡的重要原因之一，其中存在于G-細(xì)菌外膜的脂多糖(內(nèi)毒素，LPS)起著重要的作用。針對(duì)G-菌的治療主要是采用抗生素來(lái)殺滅細(xì)菌。但是抗生素在殺滅細(xì)菌的同時(shí)導(dǎo)致內(nèi)毒素的大量釋放，其結(jié)果往往是病人死于嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥，這一直是臨床亟待解決的難題。
目前已有一些或具有中和內(nèi)毒素能力或具有殺菌作用的多肽分子，如從鱟血細(xì)胞提取的抗內(nèi)毒素因子(LALF)，從多粘菌中提取的多粘菌素B1。和LALF一樣，多粘菌素的類似物由于缺乏脂肪酸基因，雖然可以和LPS結(jié)合但無(wú)殺菌能力。又如Cecropins和magainins是兩種具有殺菌功能的肽類化合物，此類肽的氨基酸長(zhǎng)度多在20-40之間，殺菌能力最強(qiáng)的Cecropin是Cecropin A，但它們的中和內(nèi)毒素作用卻不強(qiáng)。為此尋找一種既能殺滅細(xì)菌又能中和細(xì)菌死亡后釋放的內(nèi)毒素的活性多肽分子，將是一項(xiàng)非常有意義的工作。
人體存在許多抵御外來(lái)微生物侵襲的防御機(jī)制，其中白細(xì)胞是一重要環(huán)節(jié)，殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(Bactericidal/permeability-increasingprotein，BPI)就是從哺乳類動(dòng)物白細(xì)胞嗜天青顆粒中分離出的蛋白質(zhì)。人源BPI已由weiss(Weiss J.et al.1987.Blood 69652)在1987年利用酸抽提及親合層分析分離成功，其分子量為55KD，其cDNA及氨基酸序列已由Gray(Gray PW.Et al.1989.J.Bio.Chem.2649505)證實(shí)。研究結(jié)果表明其具有強(qiáng)大而廣譜的殺滅G-細(xì)菌及中和內(nèi)毒素的能力。
BPI特異殺滅G-細(xì)菌的機(jī)制可能與帶正電的BPI與帶負(fù)電脂多糖相互吸引，細(xì)菌表面電位發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)菌外膜通透性的改變有關(guān)。同時(shí)，BPI還具有中和LPS毒性的能力，因此BPI可應(yīng)用于治療由G-細(xì)胞引起的感染性疾病，包括菌血癥、內(nèi)毒素血癥、膿毒癥等。不僅全序列的BPI具有殺菌和中和內(nèi)毒素的能力，而且N末端的199個(gè)氨基酸(rBPI23)也具有完整BPI的全部生物學(xué)功能，不過(guò)C末端僅有輕微或無(wú)殺菌能力(Ooi CE.et al.1991 J.Exp.Med.174649)。但是rBPI23在對(duì)細(xì)菌感染和LPS血癥的治療時(shí)，需要絕對(duì)的量才能達(dá)到殺滅細(xì)菌和中和LPS的目的，存在用量較大、成本較高等問(wèn)題。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(J5 Study Group.1992 J.Infect Dis.165695，Ziegler EJ.et al.1991 New Eng J.Med.324429)，BPI功能區(qū)主要由三大部分組成，①BPI 17-45氨基酸序列，②BPI 65-99氨基酸序列，③BPI 142-169氨基酸序列，也就是說(shuō)BPI殺菌和中和LPS的生物活性區(qū)域分別存在于這三個(gè)氨基酸序列的區(qū)域內(nèi)。
能否尋找出更小的既能殺滅細(xì)菌又能中和內(nèi)毒素的BPI功能區(qū)結(jié)構(gòu)，以及在此基礎(chǔ)上尋找到新的殺菌和中和LPS活性更強(qiáng)、生產(chǎn)成本更低的多肽分子，并能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以滿足臨床治療的需要，是一個(gè)十分重要的研究課題。
本發(fā)明的目的在于利用現(xiàn)今公知的合成方法提供一種可穩(wěn)定重復(fù)生產(chǎn)的、包括全部或部分BPI生物功能如殺菌、中和內(nèi)毒素活性的、小分子量多肽分子--BPI變構(gòu)肽。
本發(fā)明所提供的BPI變構(gòu)肽是一種具有與BPI同樣功能的活性短肽，是基于在BPI功能區(qū)的一個(gè)位點(diǎn)置換不同的氨基酸，或在2個(gè)以上不同位置置換同一氨基酸或不同氨基酸所得的線性的BPI功能區(qū)片段變構(gòu)體。
上述本發(fā)明所定義的這種BPI變構(gòu)肽，具有以下特征(一)SEQ ID NO1(BPI A)(1)序列特征(A)長(zhǎng)度10氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO1A. N’---RRAFVFIHKM---C’或Arg Arg Ala Phe Val Phe Ile His Lys Met(二)SEQ ID NO2(BPI B)(1)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO2B. N’--RHKRRVGILLQLVRKR--C’或Arg His Lys Arg Arg Val Gly Ile Leu Leu Gln Leu ValArg Lys Arg。
(三)SEQ ID NO3(BPI C)(1)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO3C. N’--KTKVGWLIQLFHKK--C’或Lys Thr Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys。
(四)SEQ ID NO4(BPI D)(1)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類型氨基酸
(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO4D. N’--KGKVGWLIQLFHKK--C’或Lys Gly Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His LysLys。
本發(fā)明的這些短肽--BPI變構(gòu)肽，可按照Merrifield等(Merrifield RB.1963 J Am Chem Soc.852149)報(bào)告的公知的合成方法合成，這種公知的固相化學(xué)合成技術(shù)，是氨基酸為Fmoc保護(hù)的氨基酸，合成用樹(shù)脂為HMP樹(shù)脂，以水楊醛法測(cè)總胺來(lái)監(jiān)控縮合率。合成時(shí)按多肽順序由C端逐個(gè)向N端延伸，縮合劑為DCCI，加HOBT以活化氨基酸的羧基，每輪循環(huán)用六氫吡啶除去Fmoc。本發(fā)明物是在PE公司的433A多肽自動(dòng)合成儀上進(jìn)行合成，根據(jù)給定的BPI變構(gòu)肽氨基酸序列，多肽自動(dòng)合成儀能自動(dòng)完成各種反應(yīng)程序而得到所需的BPI變構(gòu)肽片段，最后用三氟醋酸法將多肽從樹(shù)脂上切割并除去所有的保護(hù)基團(tuán)，合成得到的多肽須經(jīng)過(guò)高壓液相(HPLC)純化純化柱C-18反相柱，流動(dòng)相A 0.1％三氟醋酸(TEA)，流動(dòng)相B 100％乙晴/0.1％TFA，0-30min.10-100％流動(dòng)相B線性梯度，檢測(cè)波長(zhǎng) 220nm，流速 2.0ml/分。
計(jì)算主峰面積占整個(gè)峰面積的比例即為純度。經(jīng)Sephadex G-25脫鹽，冷凍干燥后作質(zhì)譜鑒定和N端氨基酸序列分析測(cè)定分子量并確認(rèn)其氨基酸序列。
實(shí)施例1.取HMR樹(shù)脂294mg，根據(jù)給定的BPI C氨基酸序列采用PE公司433A多肽自動(dòng)合成儀合成得到825mg BPI C樹(shù)脂；
2.取上述合成的干燥BPI C樹(shù)脂，加入到一個(gè)50ml的圓底燒瓶中，并放入攪拌子，在冰浴冷卻20分鐘；另取事先在冰浴冷卻30分鐘的裂解試劑B(無(wú)苯酚，含0.25ml EDT、0.5ml Anisole、0.5ml D.I.H2O、10ml TFA)加入圓底燒瓶中，磁力攪拌15分鐘后，移去冰浴，在室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)，過(guò)濾除去樹(shù)脂，經(jīng)減壓蒸溜去除裂解試劑，再用醋酸乙酯洗滌7次，每次30ml，然后加入D.I.H2O使其溶解，再用無(wú)水乙醚萃取3次，以去除殘余的裂解試劑，最后減壓蒸溜去除殘余的乙醚，濃縮得到粗肽溶液。
3.上述粗肽溶液按以下純化條件下純化柱C-18反相柱，流動(dòng)相A 0.1％三氟醋酸(TFA)，流動(dòng)相B 100％乙晴/0.1％TFA，0-30min.10-100％流動(dòng)相B線性梯度，檢測(cè)波長(zhǎng) 220nm，流速 2.0ml/分，進(jìn)行純化，收集主峰溶液，再經(jīng)Sephadex C-25脫鹽，溶液冷凍干燥，得到77.38mg純度(HPLC百分面積)為78.33％的BPI C變構(gòu)肽。
經(jīng)質(zhì)譜鑒定和N端氨基酸序列分析測(cè)定分子量并確認(rèn)其氨基酸序列。如表1所示，本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽的實(shí)測(cè)分子量和N端氨基酸序列分析結(jié)果與理論分子量及理論序列完全相符。
表1編號(hào) 理論分子量 實(shí)測(cè)分子量 理論序列 序列分析BPI A1305 1306.37 RRAFVFIHKM 與理論序列相符BPI B2028 2029.71 RHKRRVGILLQLVRKR與理論序列相符BPI C1726 1727.65 KTKVGWLIQLFHKK 與理論序列相符BPI D 16821681.83KGKVGWLIQLFHKK 與理論序列相符這些短肽--BPI變構(gòu)肽，及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽，或這些肽作為稀釋劑、佐劑及載體，都具有殺滅G-、G+及真菌和中和LPS的多種功效，可用于細(xì)菌性感染疾病的治療，包括對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥的細(xì)菌性感染的治療，也可應(yīng)用于治療內(nèi)毒素血癥。
本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽的問(wèn)世，由于其分子量小，治療劑量小，成本低，而且可通過(guò)化學(xué)合成法合成，因而可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
BPI變構(gòu)肽生物活性的檢測(cè)1.中和內(nèi)毒素活性

圖1是本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽中和LPS能力的測(cè)試圖。將各種BPI變構(gòu)肽與內(nèi)毒素O111B4混勻，37℃孵育30分鐘，間斷搖晃，然后加入pH8.0磷酸鹽緩沖液(PBS)，使內(nèi)毒素終濃度為200pg/ml，最后采用基質(zhì)顯色法鱟試劑盒檢測(cè)內(nèi)毒素含量，以多粘菌素B為陽(yáng)性對(duì)照。如圖1所示，BPI變構(gòu)肽在體外均有中和LPS的作用，其中以BPI B的活性最高。
2.殺菌活性檢測(cè)圖2是本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽殺菌活性的測(cè)試圖。檢測(cè)細(xì)菌為大腸桿菌J5，O111B4，先將細(xì)菌復(fù)蘇于普通瓊脂平板，挑取單個(gè)菌落接種于5ml M-H肉湯，37℃，3-4h至細(xì)菌生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期。1000rpm/min離心5分鐘，棄上清，沉淀用5mlPBS沖洗，離心后用M-H肉湯稀釋至2×106cfu/ml，加入BPI變構(gòu)肽，按200μg/ml倍比稀釋至每管，37℃振蕩孵育20小時(shí)，于590nm處讀取吸光度；另取50μl菌液于血晾脂平板上，過(guò)夜培養(yǎng)計(jì)數(shù)，如圖2所示，幾種BPI變構(gòu)肽在體外有殺菌作用，BPI B效果最好。
3.抑制腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生人單核細(xì)胞株(THP-1)受內(nèi)毒素刺激后可釋放TNF，且有劑量依賴關(guān)系，中和內(nèi)毒素后，TNF必將減少，TNF的量可采用ELISA法檢測(cè)(試劑盒由Roch公司提供)。
圖3是本發(fā)明的BPI變構(gòu)肽抑制腫瘤壞死因子能力的測(cè)試圖。將THP-1培養(yǎng)于RPMI1640中，細(xì)胞懸液離心后用新鮮RPMI1640配成1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，加入大腸桿菌O111B4內(nèi)毒素5μg/ml，37℃培養(yǎng)6小時(shí)，每孔中分別加入BPI變構(gòu)肽0.1μg/ml至100μg/ml，離心，取上清，測(cè)TNF含量，如圖3所示，BPI B在濃度為0.1μg/ml時(shí)即產(chǎn)生明顯的抑制TNF產(chǎn)生的作用。
4.對(duì)小鼠內(nèi)毒素血癥的治療作用小鼠尾靜脈注射大腸桿菌O111B4內(nèi)毒素，LD90為20mg/kg。然后迅速同途徑注射不同劑量BPI變構(gòu)肽(劑量為1mg/kg或5mg/kg體重)，用地塞米松為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為空白對(duì)照，觀察7天后動(dòng)物死亡率。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 BPI變構(gòu)肽對(duì)小鼠內(nèi)毒素血癥模型的保護(hù)作用組別 劑量(mg/kg) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(只) 死亡動(dòng)物(只) P值空白對(duì)照組0 20 18BPIA 1 20 7 ＜0.05BPIA 5 20 4 ＜0.01BPIB 1 20 4 ＜0.01BPIB 5 20 1 ＜0.01BPIC 1 20 12 ＞0.05BPIC 5 20 8 ＞0.05BPID 1 20 14 ＞0.05BPID 5 20 10 ＞0.05地塞米松 5 20 6 ＜0.05結(jié)論BPI變構(gòu)肽對(duì)LPS(20mg/kg體重)攻擊的小鼠有明顯的保護(hù)作用。
5.對(duì)小鼠腹膜炎的保護(hù)作用小鼠腹腔注入活大腸桿菌O111B4，1×107cfu/ml 0.5ml，隨即注入1mlBPI變構(gòu)肽(劑量為1或5mg/kg體重)，以多粘菌素B為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為空白對(duì)照，觀察動(dòng)物7天后的死亡率，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 BPI變構(gòu)肽對(duì)小鼠腹膜炎的保護(hù)作用組別 劑量(mg/kg) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(只)死亡動(dòng)物(只) p值空白對(duì)照組 020 19BPIA120 9 ＞0.05520 5 ＜0.05BPIB120 2 ＜0.01520 0 ＜0.01BPIC120 11 ＞0.05520 7 ＜0.05BPID120 13 ＞0.05520 9 ＞0.05多粘菌素B 10 20 4 ＜0.01結(jié)論BPI變構(gòu)肽對(duì)產(chǎn)生腹膜炎的小鼠有較強(qiáng)的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來(lái)的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-A)，其特征在于其(1)序列特征(A)長(zhǎng)度10氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO1A. N’---RRAFVFIHKM---C’。
2.一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來(lái)的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-B)，其特征在于其(1)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO2B. N’---RHKRRVGILLQLVRKR---C’。
3.一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來(lái)的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-C)，其特征在于其(1)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO3C. N’---KTK/VGW/LIQ/LFH/KK---C’。
4.一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來(lái)的活性多肽分子--BPI變構(gòu)肽(BPI-D)，其特征在于其(1)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO4D. N’---KGK/VGW/LIQ/LFH/KK---C’。
5.如權(quán)利要求1，2，3或4所述的BPI變構(gòu)肽及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽，其特征在于用于治療G-細(xì)菌感染或內(nèi)毒素血癥。
6.如權(quán)利要求1，2，3或4所述的BPI變構(gòu)肽及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽作為稀釋劑、佐劑及載體，其特征在于用于治療G-細(xì)菌感染或內(nèi)毒素血癥。
全文摘要
一種由BPI功能區(qū)氨基酸序列經(jīng)置換而來(lái)的、其氨基酸序列為:A.N’－RRAFVFIHKM－C’,B.N’－RHKRRVGILLQLVRKR－C’C.N’－KTKVGWLIQLFHKK－C’D.N’－KGKVGWLIQLFHKK－C’活性多肽分子及其2個(gè)或3個(gè)相同或不同的肽相連成的肽,或其作為稀釋劑、佐劑及載體,用于治療G－細(xì)菌感染或丙毒素血癥,治療劑量小,成本低,而且可通過(guò)化學(xué)合成法合成,因而可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K38/10GK1270175SQ9910507
公開(kāi)日2000年10月18日 申請(qǐng)日期1999年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月13日
發(fā)明者姚志勇, 沈福泉, 曾少貴 申請(qǐng)人:深圳市翰宇生物工程有限公司