專利名稱：：抗應(yīng)激劑和功能食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗應(yīng)激劑及功能性食品，本品具有預(yù)防和緩和由于應(yīng)激引起的精神和機(jī)體癥狀的功效。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)代社會(huì)，人們經(jīng)受各種各樣的應(yīng)激狀態(tài)。由于科學(xué)技術(shù)的高度發(fā)展和復(fù)雜化以及社會(huì)狀況的急劇變化，處于這種環(huán)境，特別是在國際化社會(huì)中，形成了復(fù)雜的人際關(guān)系，導(dǎo)致人們精神上的應(yīng)激狀態(tài)。據(jù)報(bào)道，由此能引起各種癥狀。一般認(rèn)為應(yīng)激對循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有很大的影響。然而，至今仍未準(zhǔn)確地確立應(yīng)激狀態(tài)的科學(xué)概念和定義，關(guān)于應(yīng)激狀態(tài)的評(píng)價(jià)仍存在許多問題和方法學(xué)上的困難。不過，最近幾年，人們從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)對應(yīng)激狀態(tài)進(jìn)行了研究。例如，據(jù)報(bào)道當(dāng)人們處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，血管緊張素Ⅱ增加，由于鈉的重吸收導(dǎo)致體內(nèi)鈉出現(xiàn)過剩，導(dǎo)致血壓升高(茂原治等；代謝，28，2，323，1991)?；谝陨险J(rèn)識(shí)，將高血壓治療藥物-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑依那普利，alacepril，用于因應(yīng)激而導(dǎo)致的高血壓，研究其治療效果。(美國心臟病學(xué)雜志；18，15，1362(1991)，介入醫(yī)學(xué)；32，9，691(1993))。然而，一般認(rèn)為應(yīng)激狀態(tài)不僅引起血壓升高，還影響到其他各種因素。除高血壓外還可以引起消化道潰瘍、缺血性心臟病、腦血管病、高血脂癥等的疾病。因此，應(yīng)激被認(rèn)為是高血壓的原因之一，但并不認(rèn)為單純依靠降低血壓，就可以達(dá)到抗應(yīng)激的作用。作為預(yù)防和緩和由應(yīng)激引起的精神和機(jī)體癥狀的藥劑，目前常使用化學(xué)合成的藥物如鎮(zhèn)靜劑、抗焦慮藥和安眠藥。然而，這些藥物有成癮性和副作用，所以作為預(yù)防由于應(yīng)激引起的精神和機(jī)體病癥這一目的，不希望日常性使用這些藥物。因此，人們需求能在日常中連續(xù)服用的安全的抗應(yīng)激劑，用以減輕和預(yù)防由于應(yīng)激引起的精神和身體上的癥狀。這類制劑不斷被開發(fā)。例如，建議用如含有存在于茶葉中的有效成分L-茶氨酸的抗應(yīng)激劑(特開平6-100442)，一種含有諸如鵝肌肽、valenine、n-甲基組氨酸或τ-甲基組氨酸等咪唑化合物的抗應(yīng)激組合物。(特開平9-20660)，和含有谷胱甘肽和抗氧化劑的組合物的抗應(yīng)激食物(特開平8-275752)。還有報(bào)道香料具有解除緊張的效果。(香料雜志1991-11，P44-49)。然而，未見報(bào)道三肽有緩和及預(yù)防由應(yīng)激引起的精神和機(jī)體癥狀的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能滿足如上面提到的社會(huì)需求的抗應(yīng)激劑和功能食品，它們能在日常連續(xù)服用而不存在任何安全性問題，能緩和及預(yù)防用應(yīng)激而引起的精神和機(jī)體上的癥狀。根據(jù)本發(fā)明，提供一種抗應(yīng)激劑，其中含有具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的三肽和／或其鹽類的有效成分。根據(jù)本發(fā)明，還提供一種抗應(yīng)激劑，其特征在于其中所述的三肽是Ile-Pro-Pro和／或Val-Pro-Pro。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供該三肽和／或其鹽在制備抗應(yīng)激劑中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，還提供含有上述抗應(yīng)激劑的具有抗應(yīng)激功能的食品。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供該三肽和／或其鹽在制備具有抗應(yīng)激功能食品中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供一種用于生產(chǎn)具有抗應(yīng)激功能的食品的方法，該方法包括使用一種含有序列Ile-Pro-Pro和／或Val-Pro-Pro的肽和／或蛋白的培養(yǎng)基，并且在得到的培養(yǎng)液中能產(chǎn)生三肽Ile-Pro-Pro和／或Val-Pro-Pro等的條件下，用乳酸菌發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明，還提供一種降低應(yīng)激的方法，該方法包括口服給予有效劑量的具有血管緊張素-轉(zhuǎn)換酶抑制活性的三肽和／或其鹽。實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方案本發(fā)明的抗應(yīng)激劑含有作為有效成分的三肽和／或其鹽。這些有效成分具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性。在本發(fā)明中，所謂抗應(yīng)激作用指能使受試者在服用后變?yōu)榻谖词艿綉?yīng)激的狀態(tài)。包括降低由于應(yīng)激而引起的收縮壓與舒張壓的升高；抑制和預(yù)防由于應(yīng)激導(dǎo)致的脾細(xì)胞反應(yīng)性降低等免疫功能的降低。所述的三肽可優(yōu)選地選自具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的Ile-Pro-Pro、Val-Pro-Pro(自此之后分別縮寫為IPP和VPP)及其混合物。該三肽的鹽包括藥理學(xué)上容許的鹽類，如鹽酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽等無機(jī)鹽以及有機(jī)鹽如檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽和乳酸鹽等。所述的三肽制造法可以是微生物發(fā)酵法、酶水解法或化學(xué)合成法。用微生物發(fā)酵可把乳酸細(xì)菌培養(yǎng)在一種食品原料的培養(yǎng)基中進(jìn)行，該食品原料含有包括該三肽的對應(yīng)序列如序列Ile-Pro-Pro和／或Val-Pro-Pro相應(yīng)的一種肽和／或蛋白。理想的培養(yǎng)基為含有對應(yīng)于上述三肽的氨基酸序列的肽和／或蛋白質(zhì)的食品原料。上述食品原料可以是牛奶、牛奶酪蛋白、玉米、玉米蛋白、小麥、小麥蛋白、大豆、脫脂大豆或大豆蛋白。如果有必要，該培養(yǎng)基可進(jìn)一步含有酵母提取物、維生素和礦物質(zhì)等其他成分。至于乳酸菌，可利用乳桿菌屬的乳酸菌。例如，可以使用瑞士乳桿菌、德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌或干酪乳桿菌干酪亞種。具體而言，可利用瑞士乳桿菌ATCC55796、德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC1842、嗜酸乳桿菌ATCC4356、發(fā)酵乳桿菌ATCC14931或干酪乳桿菌干酪亞種ATCC393等菌種。發(fā)酵可這樣進(jìn)行，加熱滅菌培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基冷卻到所需的培養(yǎng)溫度，然后用預(yù)先培養(yǎng)的乳酸菌引子接種到該培養(yǎng)基中。乳酸菌引子的適宜接種量為每1g培養(yǎng)基中有105～107個(gè)乳酸菌。培養(yǎng)溫度可以為20～50℃，最適溫度為30～45℃。培養(yǎng)時(shí)間可以是3～48小時(shí)，最適培養(yǎng)時(shí)間為6～24小時(shí)。當(dāng)乳酸菌數(shù)達(dá)到108以上以及乳酸的酸性達(dá)到1以上時(shí)，可以終止培養(yǎng)。在產(chǎn)生的培養(yǎng)物中，依培養(yǎng)基原料及組成不同通常IPP和／或VPP的含量為0．1～100μg／g。上述培養(yǎng)液中在乳酸菌活的狀態(tài)下，直接用于本發(fā)明的抗應(yīng)激劑。另外，上述培養(yǎng)液可在加熱到80℃后的滅菌狀態(tài)下使用。此外，通過冷凍干燥法、噴霧干燥法或鼓干燥器干燥法制成粉末狀使用。上述培養(yǎng)液可在濃縮三肽成分后用于本發(fā)明的抗應(yīng)激劑。上述濃縮和純化方法為離心培養(yǎng)液，然后從上清液中抽取。上清液可進(jìn)一步通過電透析、離子交換樹脂處理、中空纖維膜透析、反相滲透處理、疏水柱層析或用其組合方法，以獲得進(jìn)一步濃縮和純化的三肽。用上述酶水解法制備三肽時(shí)，可包括用蛋白酶和羧肽酶處理食品原料，該食品原料含有對應(yīng)于Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro三肽的氨基酸序列的肽和／或蛋白質(zhì)。上述蛋白酶可以使用來源于微生物、植物或動(dòng)物中的蛋白酶、這些蛋白酶可以用公開的方法制備。上述羧肽酶可以使用來源于微生物、植物或動(dòng)物的羧肽酶。并且可以用公開的方法制備。上述用化學(xué)合成法制備三肽的方法可以是公開的有機(jī)化學(xué)合成法。例如，三肽可用下列的方法得到，在用芴基甲氧羰基保護(hù)構(gòu)成三肽的氨基酸的氨基后，按氨基酸序列制備目的三肽組分的氨基酸，將每個(gè)氨基酸依次用芴基甲氧羰基基團(tuán)保護(hù)后，按常規(guī)方法使氨基酸反應(yīng)，以得到結(jié)合在樹脂上的三肽，然后按常規(guī)方法移去樹脂，純化該三肽。在本發(fā)明的抗應(yīng)激劑中該三肽的含量并沒有具體限制，只要是能給予下述有效量的三肽即可。該三肽的含量通?？梢詾樵撍巹┑?．001～1％(重量比)。除了該三肽和／或其鹽外，本發(fā)明的抗應(yīng)激劑中也可以含有其他添加物，如糖類、蛋白類、脂類、微生素類、礦物質(zhì)類、調(diào)味劑和增色劑。本發(fā)明的抗應(yīng)激劑可用于人或動(dòng)物。投與方法可口服或靜注。但最好是口服。在給予人時(shí)，為了達(dá)到減輕及預(yù)防應(yīng)激等本發(fā)明的使用效果，本發(fā)明的抗應(yīng)激劑的有效口服時(shí)，以三肽的量計(jì)算一般在0．1～40mg／kg體重·天的范圍。不過，也可以超出該用量范圍使用。當(dāng)本發(fā)明的抗應(yīng)激劑投與受試者時(shí)，對由于應(yīng)激引起的各種生理指標(biāo)的變化，如血壓升高，免疫功能降低等，與未投與時(shí)相比其發(fā)生程度變化。并且接近于沒有應(yīng)激負(fù)荷時(shí)的值。本發(fā)明的功能食品含有上述抗應(yīng)激劑。通過食用該功能食品，上述的應(yīng)激可以得到預(yù)防，或減輕。在本發(fā)明的功能食品中，抗應(yīng)激劑的含量并沒有具體限定，只要所含有的三肽和／或其鹽類能取得抗應(yīng)激效果就行。一般來說，功能食品中抗應(yīng)激劑的含量以三肽和／或其鹽計(jì)算含量為0．001～0．1％(重量比)。本發(fā)明的功能食品的服用量以上述三肽計(jì)算，在每kg體重每天0．1～40mg范圍內(nèi)，可以較理想地獲得本發(fā)明的效果。不過，服用量大于該范圍也可以。本發(fā)明的功能食品可包括酸乳酪、含有奶酸化的飲料、奶酪、含有發(fā)酵過酸奶或健康食品的加工食品和飼料，其制劑為粉末、顆粒和片劑等的固形，或糊、凝膠和液體等的流體。本發(fā)明的抗應(yīng)激劑和功能食品中的有效成分三肽，是用乳酸菌發(fā)酵食品原料也能獲得的、安全性高的物質(zhì)。本發(fā)明的抗應(yīng)激劑和功能食品用含有上述三肽，所以相當(dāng)安全，通過每天連續(xù)服用可以減輕及預(yù)防由各種應(yīng)激引起的精神上和機(jī)體上的病癥。實(shí)施例參考以下實(shí)施例將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于此。實(shí)施例19g脫脂乳粉末溶在100g的水中。得到的溶液在115℃滅菌20分鐘，冷卻到室溫，用鉑金環(huán)接種瑞士乳桿菌ATCC-8205，在37℃培養(yǎng)24小時(shí)，以制備初級(jí)引子(5×108細(xì)胞／ml，pH3．5)。接著，用80g的初級(jí)引子接種到2kg90℃達(dá)溫滅菌過的脫脂乳(含9％(重量比)的固體)中，然后在37℃培養(yǎng)24小時(shí)，以制備次級(jí)引子。然后，將4．5kg脫脂乳粉末溶在50kg水中。得到的溶液通過達(dá)溫90℃加熱滅菌后，冷卻到室溫，用2kg次級(jí)引子接種，然后在37℃培養(yǎng)24小時(shí)，以獲得56kg的發(fā)酵奶。由此獲得的發(fā)酵總量中IPP和VPP的含量分別為5．4mg和9．5mg。實(shí)施例26kg在實(shí)施例1制備的發(fā)酵奶用10N氫氧化鈉水溶液調(diào)整到pH7．3，然后加入1升離子交換樹脂，(商業(yè)品“AmberliteXAD-2”，由ORGANO公司制造)，并進(jìn)一步加蒸餾水至總重量20kg?；旌弦河脭嚢杵鲾嚢?0分鐘，用吸式過濾裝置過濾以分離樹脂。在濾膜上的樹脂用20kg的蒸餾水清洗，然后收集清洗過的樹脂。收集到的樹脂與0．8kg甲醇混合，用攪拌器攪拌30分鐘。得到的混合液通過尼龍纖維(200目)過濾，然后用硬質(zhì)濾紙吸取過濾后。獲得的濾液在55℃減壓條件下用蒸發(fā)器濃縮，以得到200g濃縮液。該液體和250ml離子交換樹脂混合(商業(yè)名“AmberliteIRA-400(OH型)”，由ORGANOCORP制造)，攪拌10分鐘，用硬質(zhì)濾紙吸取過濾。得到的濾液用1N鹽酸溶液調(diào)至pH7，然后真空冷凍干燥。由此純化和干燥的產(chǎn)物再均勻地溶于5ml蒸餾水中，加樣到分離柱上(商品名“葡聚糖凝膠G-25”，由PHARMACIA公司制造)，然后用蒸餾水抽提，收集三肽的溶出組分，真空冷凍干燥，得到50mg純化的三肽組分粉末。在50mg純化的三肽組分粉末中含有0．6mg的IPP和1．0mg的VPP。實(shí)施例3通過下列有機(jī)化學(xué)合成法合成IPP和VPP。根據(jù)固相法，用自動(dòng)肽合成裝置(PSSM-8型，由SHIMAD2V公司制造)進(jìn)行合成反應(yīng)。作為固相載體，使用芐氧基芐基乙醇型聚苯乙烯樹脂作為載體，使用了20μmol經(jīng)芴基甲氧羰基基團(tuán)(自此之后稱為Fmoc)保護(hù)了氨基的脯氨酸結(jié)合樹脂。根據(jù)上述氨基酸序列，通過常規(guī)方法，使用經(jīng)Fmoc基團(tuán)保護(hù)了氨基酸的Fmoc-Ile，F(xiàn)moc-Pro和Fmoc-Val各100μmol，按照肽序列依次反應(yīng)得到肽結(jié)合樹脂。接著，該肽結(jié)合樹脂懸浮在1ml反應(yīng)液中(含有1％重量比的乙烷二硫醇、5％重量比的苯甲醚和94％重量比的三氟乙酸)，在室溫反應(yīng)2小時(shí)，從樹脂上分離肽，同時(shí)從肽上移去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。反應(yīng)混合液通過玻璃濾器過濾，與10ml無水乙醚混合以沉淀純化的肽，然后在3000rpm離心5分鐘進(jìn)行分離。用無水乙醇清洗該沉淀物幾次，用吹氮?dú)夥ǜ稍?。由此獲得的未純化的合成肽全部溶于2ml0．1N鹽酸水溶液中，然后在C18反相柱上根據(jù)下列條件用HPLC純化泵L6200型智能泵(HITACHI，LTD)檢測器L4000型紫外檢測器(HITACHI，LTD)用于檢測215nm的紫外吸收柱MICROBONDASPHERE5μC18(由WATERSINC制造)流動(dòng)相液體A；0．1％重量比的TFA水溶液液體B；含有0．1重量比TFA的乙腈(B／A+B)×100(％)0～40％(60分鐘)流速1ml／min收集最大吸收處的流分，冷凍干燥以獲得目標(biāo)合成肽，即2．1g的IPP和0．9mg的VPP。用全自動(dòng)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析儀(PPSQ-10型，由島津制作所)從肽的N末端分析純化肽，進(jìn)而用氨基酸分析儀(800型系列，由日本分光社制造)，分析該純化的肽。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些肽符合設(shè)計(jì)要求。實(shí)施例4將24只雄性wistar大鼠(體重大約300g)預(yù)備飼養(yǎng)1周。在預(yù)備飼養(yǎng)期間和實(shí)驗(yàn)期間，用所購的飼料(商品名“CE-2”由NIHONCREA社制造)作為規(guī)定食物飼養(yǎng)大鼠，并且允許大鼠隨意飲水。在預(yù)備飼養(yǎng)結(jié)束后，大鼠被分為三組(每組8只大鼠)，即(1)無應(yīng)激負(fù)荷-給予接受生理鹽水組，(2)加應(yīng)激負(fù)荷-投與生理鹽水組，和(3)加應(yīng)激負(fù)荷-投與VPP和IPP組。(2)組和(3)組的動(dòng)物。每天一次4小時(shí)放在冷室(4℃)，共9天施加寒冷應(yīng)激。在第10天，(1)組和(2)組的大鼠給與1ml的生理鹽水，(3)組大鼠給與1ml含有在實(shí)施例3中合成的IPP和VPP的生理鹽水，兩種物質(zhì)在鹽水中的濃度調(diào)整到各3mg／kg體重。用口腔探測器強(qiáng)行投入到胃。投與后，(2)組和(3)組的大鼠接觸寒冷應(yīng)激4小時(shí)。結(jié)束應(yīng)激后2小時(shí)，用非保溫、非侵入性大鼠血壓計(jì)(PE300型，由CSI社制造)按斷尾法測定每組中大鼠的血壓。該結(jié)果在表1顯示。血壓的結(jié)果在表1顯示。如表1所示，在接觸應(yīng)激的(2)組中，收縮和舒張血壓兩者與未接觸應(yīng)激的(1)組相比均升高。相反，接受VPP和IPP的(3)組大鼠的收縮和舒張血壓比接受生理鹽水(2)組大鼠均變低，其血壓值接近于未給予應(yīng)激的(1)組大鼠的水平。表1<tablesid="table1"num="001"><table>實(shí)驗(yàn)組收縮性血壓舒張性血壓(mmHg)(mmHg)(1)無應(yīng)激，接受生理鹽水(2)應(yīng)激后，接受生理鹽水(3)應(yīng)激后，接受VPP和IPP12197136*107129101</table></tables>*與(1)組的顯著性差異達(dá)5％顯著水平冷應(yīng)激前后的血壓變化在表2顯示。如表2中所示，與未接觸寒冷應(yīng)激的(1)組相比較，接觸寒冷應(yīng)激的(2)組的收縮和舒張血壓的增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與接受生理鹽水的(2)組相比較，接受VPP和IPP的(3)組收縮和舒張血壓的升高受到抑制。收縮血壓的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)這些結(jié)果，確認(rèn)了在附加應(yīng)激負(fù)荷的情況下，通過投與IPP和VPP能得到抑制血壓升高的效果。表2*對于(1)組顯著性在危險(xiǎn)率5％時(shí)，有顯著差異＃對于(2)組在危險(xiǎn)率5％時(shí)，有顯著差異。實(shí)施例524只雄性wistar大鼠(體重大約300g)預(yù)備飼養(yǎng)1周。在預(yù)備飼養(yǎng)期和實(shí)驗(yàn)期間，作為規(guī)定食物投與固形飼料(商品名“CE-2”，由NIHONCREA社制造)并允許隨意飲水。預(yù)備飼養(yǎng)結(jié)束后，大鼠被分為3組(每組8只大鼠)，即(1)投與生理鹽水組，(2)投與VPP組和(3)投與IPP組。按實(shí)施例4的方法，(1)～(3)組的大鼠如實(shí)施例4一樣放在冷室(4℃)中每一天4小時(shí)，給予寒冷應(yīng)激9天。在第10天，(11)組的大鼠接受1ml生理鹽水而(2)組和(3)組的大鼠分別接受1ml含有3mg／ml體重的IPP或3mg／kg體重的VPP的生理鹽水，用口腔探測器強(qiáng)行灌胃，IPP或VPP在實(shí)施倒3中合成。投與后，(1)～(31組的大鼠與實(shí)施例4一樣接觸寒冷刺激4小時(shí)，投與測定血壓。該結(jié)果在表3顯示。血壓的測定結(jié)果在表3顯示。如表3所示，在給予三肽的(2)和(3)組中與給予生理鹽水的小組相比，收縮和舒張血壓的降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可以認(rèn)為三肽具有抑制因寒冷應(yīng)激出現(xiàn)的血壓上升的效果。表3*對于(1)組，危險(xiǎn)率為5％時(shí)，有顯著差異。表4<tablesid="table3"num="004"><table>實(shí)驗(yàn)組收縮血壓舒張血壓(mmHg)(mmHg)(1)生理鹽水(2)發(fā)酵奶(3)純化的三肽級(jí)分13510613299*128*101*</table></tables>*與(1)組的顯著性差異達(dá)5％顯著水平實(shí)施例724只雄性wistar大鼠(體重約300g)預(yù)飼養(yǎng)1周。在預(yù)飼養(yǎng)期間，給予大鼠限定的固形飼料(商品名“CE-2”，由NIHONCREA社制造)飼養(yǎng)，并允許隨意飲水。預(yù)飼養(yǎng)期結(jié)束后，大鼠被分為三組(每組8只大鼠)，即(1)未施加應(yīng)激-投與生理鹽水組，(2)施加應(yīng)激-投與生理鹽水組，和(3)施加應(yīng)激-給予VPP和IPP組。將(2)、(3)組動(dòng)物放在限制其活動(dòng)的鐵籠中并將它們浸在25℃的水浴中，讓它們的頭露出水面保持呼吸，每一天接觸浸水限制應(yīng)激6小時(shí)，連續(xù)5天。在進(jìn)行應(yīng)激期間，允許大鼠食用購得的飼料(商品名“CE-2”，由NIHONCREA社制造)并隨意飲水。在連續(xù)5天的刺激的過程中，作為樣品(1)和(2)組給與1ml生理鹽水，(3)組給與1ml含有在操作例3合成的IPP和VPP的生理鹽水，IPP和VPP在鹽水中含量為3mg／kg體重。用口腔探測器強(qiáng)行灌胃。從進(jìn)行應(yīng)激的第二天到第三天，用代謝籠收集尿液，并用HPLC測定兒茶酚胺和吲哚胺的量。在該分析中使用由日本分光社制造的硅膠反相柱(商品名“Catecholpack”)和由esa社制造的電化學(xué)檢測器(商品名“Coulochem”)。在進(jìn)行應(yīng)激的最后一天的應(yīng)激結(jié)束后，用斷頭法殺死大鼠，收集血液，取出胸腺和脾。用氨基酸分析儀(800型系列，由日本分光社制造)測定血清的氨基酸組成，以計(jì)算Fisher比值(支鏈氨基酸／芳香族氨基酸的摩爾比)。測定胸腺和脾的重量。按下面的方法制備脾細(xì)胞測定白介素2的生成能力和促分裂原反應(yīng)性。(脾細(xì)胞的制備)脾在勻漿器中均勻粉碎，進(jìn)行低滲處理以移去血細(xì)胞，用含2％的胎牛血清(FCS)的MEM清洗，然后懸浮在含有10％FCS的RPM1640培養(yǎng)基中，以制備含有1×107細(xì)胞的游離細(xì)胞懸浮液。(白介素2產(chǎn)生能力的測定)制備含有上面制備的2．5×106個(gè)脾細(xì)胞的、5μg／ml伴刀豆球蛋白A(ConA)和10％FCS的RPM1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)基上清液中的白介素2的量，通過用白介素2反應(yīng)細(xì)胞株的指數(shù)增殖的生物測定法測定。(促分裂原反應(yīng)性)將CoA或商陸有絲分裂原(PWM)作為促分裂原，取其中之一5μg／ml，在上面制備的5×106脾細(xì)胞和10％FCS的RPM1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后細(xì)胞的數(shù)目通過吸光法測定，用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)的吸收作為指標(biāo)，以與不含促分裂原的細(xì)胞數(shù)目的比值表示。進(jìn)行應(yīng)激的第二天到第三天分泌到尿液中的去甲腎上腺素和多巴胺的量在表5顯示。如表5所示，給予應(yīng)激的(2)組與未刺激的(1)組比較，分泌到尿液中的去甲腎上腺素和多巴胺明顯降低。投與三肽的(3)組中，與投與生理鹽水的(2)組相比較，去甲腎上腺素和多巴胺分泌的降低受到抑制。因此可以認(rèn)為對由于應(yīng)激誘導(dǎo)的分泌到尿液中的去甲腎上腺素和多巴胺的降低，IPP和VPP具有抑制效果。表5<tablesid="table4"num="005"><table>實(shí)驗(yàn)組去甲腎上腺素多巴胺(mg／day)(mg／day)(1)沒有應(yīng)激，接受生理鹽水(2)應(yīng)激后，接受生理鹽水(3)應(yīng)激后，接受VPP和IPP0．2960．4660．168*0．287*0．231*#0．396*#</table></tables>*對于(1)組，在5％的危險(xiǎn)率時(shí)，有顯著差異。#對于(2)組，在5％的危險(xiǎn)率時(shí)，有顯著差異。殺死動(dòng)物后血清氨基酸的Fisher比值在表6顯示。如表6所示，給予應(yīng)激的(2)組與未給予應(yīng)激的(1)組相比Fisher比值的降低有顯著差異。而投與三肽的(3)組與投與生理鹽水的(2)組相比Fisher比值的升高有顯著差異。表6<tablesid="table5"num="006"><table>實(shí)驗(yàn)組Fisher比值(1)沒有應(yīng)激，接受生理鹽水(2)應(yīng)激后，接受生理鹽水(3)應(yīng)激后，接受VPP和IPP3．342．97*3．27#</table></tables>*對于(1)組，在危險(xiǎn)率5％時(shí)，有顯著差異。#對于(2)組，在危險(xiǎn)率5％時(shí)，有顯著差異。殺死動(dòng)物后胸腺和脾的重量在表7顯示。給予應(yīng)激的(2)組與未給予應(yīng)激的(1)組相比，胸腺和脾的重量都降低很多。在投與三肽的(3)組中，胸腺和脾的重量比投與生理鹽水(2)組稍高。表7<tablesid="table6"num="007"><table>實(shí)驗(yàn)組胸腺重量脾重量(mg)(mg)(1)沒有應(yīng)激，接受生理鹽水(2)應(yīng)激后，接受生理鹽水(3)應(yīng)激后，接受VPP和IPP433769202*453*226*495*</table></tables>*與(1)組的顯著性差異達(dá)5％顯著水平脾細(xì)胞的促分裂原反應(yīng)性在表8顯示，而脾細(xì)胞的白介素2產(chǎn)生性在表9顯示。與未給予應(yīng)激的(1)組相比較，發(fā)現(xiàn)給予應(yīng)激的(2)組中促分裂原反應(yīng)性降低并且白介素2的產(chǎn)生有降低趨向。另一方面，與投與生理鹽水的(2)組相比較，投與三肽的(3)組中發(fā)現(xiàn)促分裂原反應(yīng)性提高并且白介素2產(chǎn)生性有增加的趨向。表8<tablesid="table7"num="008"><table>實(shí)驗(yàn)組促分裂原反應(yīng)性ConAPWM(1)沒有應(yīng)激，接受生理鹽水(2)應(yīng)激后，接受生理鹽水(3)應(yīng)激后，接受VPP和IPP1．911．451．56*1．26*1．80#1．37#</table></tables>*對于(1)組，在危險(xiǎn)率為5％時(shí)，有顯著的差異。#對于(2)組，在危險(xiǎn)率為5％時(shí)，有顯著性差異。表9<tablesid="table8"num="009"><table>實(shí)驗(yàn)組白介素2產(chǎn)生性(單位／ml)(1)沒有應(yīng)激，接受生理鹽水(2)應(yīng)激后，接受生理鹽水(3)應(yīng)激后，接受VPP和IPP609444317086#</table></tables>#對于(2)組，在危險(xiǎn)率為10％時(shí)，有顯著性差異。根據(jù)這些結(jié)果，可以認(rèn)為投與IPP和VPP后，對于因應(yīng)激引起的免疫功能指標(biāo)的降低有抑制效果。這些指標(biāo)如血液氨基酸平衡(Fisher比值)的變化，胸腺和脾萎縮，脾細(xì)胞反應(yīng)性的降低等。權(quán)利要求1．一種抗應(yīng)激劑，其中含有作為有效成分的具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的三肽和／或其鹽。2．權(quán)利要求1的抗應(yīng)激劑，其中所述的三肽是Ile-Pro-Pro或Val-Pro-Pro。3．具有血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶抑制活性的三肽和／或其鹽在制備抗應(yīng)激劑中的應(yīng)用。4．具有抗應(yīng)激功能的食品，包括權(quán)利要求1的抗應(yīng)激劑。5．具有血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶抑制活性的三肽和／或其鹽在制備具有抗應(yīng)激功能的食品中的應(yīng)用。6．一種生產(chǎn)權(quán)利要求4的抗應(yīng)激功能食品的方法，該方法包括用含有包括序列Ile-Pro-Pro和／或Val-Pro-Pro的肽和／或蛋白的培養(yǎng)基，并且在得到的培養(yǎng)液中能產(chǎn)生三肽Ile-Pro-Pro和／或Val-Pro-Pro等的條件下，用乳酸菌發(fā)酵。7．一種降低應(yīng)激的方法，該方法包括口服投與有效量的具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的三肽和／或其鹽。全文摘要本發(fā)明提供一種抗應(yīng)激劑和功能食品,它們能在日常中連續(xù)服用,不存在任何安全性問題,能緩和及預(yù)防由于應(yīng)激引起的精神上和機(jī)體上的癥狀。一種含有具血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的三肽(特別是Ile－Pro－Pro和/或Val－Pro－Pro)和/或其鹽的有效成分抗應(yīng)激劑和上述含有抗應(yīng)激劑的功能食品。文檔編號(hào)A61P43/00GK1279614SQ9881144公開日2001年1月10日申請日期1998年2月5日優(yōu)先權(quán)日1997年9月26日發(fā)明者增山明弘,高野俊明申請人:卡爾皮斯株式會(huì)社