專利名稱：泡狀復(fù)合物及其制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含局部麻醉藥的分子復(fù)合物、含有該復(fù)合物的藥物組合物及其制備和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
局部麻醉藥一個(gè)大類的化合物，它包括幾類化合物。生理上有活性的天然或合成的化學(xué)物質(zhì)或生物物質(zhì)及其衍生物在體內(nèi)或體外作用于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞膜shang huo中的特異性受體分子。De-Paula，E和S.Schreier(1996)Braz.J.Med.Res.29877-894以及Ritchie，J.M.和N.M.Greene的“局部麻醉藥”第15章302-321，中描述了局部麻醉藥，這兩篇文獻(xiàn)均描述了局部麻醉藥及其用途，它們均被納入本文作為參考。
另外，美國(guó)專利No.5,593,972(1997年1月14日授予Weiner等人)和PCT申請(qǐng)PCT/US94/00899中描述了局部麻醉藥與用于體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的核酸分子的組合應(yīng)用，這通常且特別用于保護(hù)性和治療性接種方法以及基因治療和反義方法，這兩篇文獻(xiàn)均納入本文作參考。本申請(qǐng)要求了1997年4月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/045,122的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)被納入本文作參考。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含層狀泡囊(lamellar vesicle)的組合物，該層狀泡囊包含局部麻醉藥和核酸分子。在一些實(shí)例中，泡囊中的局部麻醉藥與核酸的比例為0.01-2.5％(重量/體積，w/v)局部麻醉藥比1μg/ml-10mg/ml核酸。在一些實(shí)例中，泡囊中的局部麻醉藥與核酸的比例為0.05-1.25％(w/v)局部麻醉藥比100μg/ml-1mg/ml核酸。在一些實(shí)例中，泡囊中的局部麻醉藥與核酸的比例為0.1-0.5％(w/v)局部麻醉藥比500μg/ml-1500μg/ml核酸。在一些實(shí)例中，層狀泡囊的直徑經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)定達(dá)約200nm。在一些實(shí)例中，層狀泡囊的直徑經(jīng)掃描電鏡測(cè)得為50-150nm。在一些實(shí)例中，經(jīng)掃描電鏡測(cè)得，50％以上的所述泡囊的直徑高于300nm。在一些實(shí)例中，經(jīng)掃描電鏡測(cè)得，50％以上的所述泡囊的直徑小于400nm。在一些實(shí)例中，局部麻醉藥是布比卡因、依替卡因、丁卡因、普魯卡因酰胺、氯普魯卡因、羅哌卡因、丙胺卡因、甲哌卡因、利多卡因、普魯卡因、卡波卡因、甲基布比卡因或可卡因。在一些實(shí)例中，核酸是DNA。在一些實(shí)例中，核酸是質(zhì)粒DNA。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含一種或多種選自陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)、陽離子型表面活性劑、中性表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽離子型洗滌劑、中性洗滌劑和陰離子型洗滌劑的化合物。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含一種或多種選自蛋白質(zhì)、多肽、肽和非蛋白類藥物/治療性化合物的化合物。在一些實(shí)例中，核酸是包含編碼免疫原的DNA序列的DNA。
本發(fā)明還涉及制備包含層狀泡囊的組合物的方法。該方法包括通過在存在0-2M鹽、pH4-8.5下混合0.01-2.5％(w/v)局部麻醉藥與1μg/ml-10mg/ml核酸來形成層狀泡囊的步驟。在一些實(shí)例中，通過在0-500mM鹽、pH6-7.5下混合0.05-1.25％(w/v)局部麻醉藥和100μg/ml-1mg/ml核酸來形成層狀泡囊。在一些實(shí)例中，通過在0-500mM鹽、pH6-7.5下混合0.1-0.5％(w/v)局部麻醉藥和500μg/ml-1500μg/ml核酸來形成層狀泡囊。在一些實(shí)例中，通過在高于2M的鹽、pH6-7.5下混合0.1-0.5％(w/v)局部麻醉藥和500μg/ml-1500μg/ml核酸、然后除去鹽使鹽濃度低于500mM來形成層狀泡囊。在一些實(shí)例中，蛋白、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物也可與局部麻醉藥及核酸混合，以產(chǎn)生包括蛋白、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物的層狀泡囊。
本發(fā)明還涉及一種將蛋白(包括多肽和肽)輸送給個(gè)體的細(xì)胞的方法。該方法包括下列步驟給予該個(gè)體一種組合物，該組合物包含含有局部麻醉藥和核酸分子的層狀泡囊。層狀泡囊包含核酸分子，該核酸分子包含的核苷酸序列編碼了與調(diào)控序列操作性相連的蛋白。核酸分子被個(gè)體的細(xì)胞攝取并表達(dá)產(chǎn)生蛋白。
本發(fā)明還涉及向個(gè)體的細(xì)胞輸遞蛋白、多肽、肽、非蛋白類藥物/治療性化合物、完整的病毒顆粒或其片段或微生物的方法。該方法包括下列步驟給予個(gè)體一種組合物，該組合物包含的層狀泡囊含有局部麻醉藥、核酸分子以及蛋白、多肽、肽、或非蛋白類藥物/治療性化合物。
本發(fā)明還涉及一種在個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。該方法包括下列步驟給予個(gè)體一種組合物，該組合物包含的層狀泡囊含有局部麻醉藥和核酸分子。層狀泡囊所含核酸分子含有編碼免疫原、與調(diào)控序列操作性相連的核苷酸序列。核酸被個(gè)體的細(xì)胞攝取，表達(dá)產(chǎn)生該免疫原，個(gè)體對(duì)該免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含一種免疫原性蛋白或肽。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含一種有生理活性的蛋白。
本發(fā)明還涉及向個(gè)體的細(xì)胞遞送核酸分子的方法。該方法包括下列步驟給予個(gè)體一種組合物，該組合物包含的層狀泡囊含有局部麻醉藥和核酸分子。層狀泡囊含有的核酸分子包括編碼所述蛋白、與調(diào)控序列操作性相連的核苷酸序列，反義寡核苷酸、核酶或形成三聯(lián)體的核酸分子。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供包含局部麻醉藥和核酸分子的層狀泡囊。該層狀泡囊是局部麻醉藥和核酸分子在特定化學(xué)條件下按特定比例混合時(shí)自發(fā)形成的。泡囊可包括已知用于其膜形成性質(zhì)的其它化合物，如脂質(zhì)、表面活性劑和洗滌劑。而且，其它化合物如蛋白質(zhì)、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物可包封在泡囊內(nèi)。
本發(fā)明的層狀泡囊可用來在體外和體內(nèi)向細(xì)胞輸遞物質(zhì)。這些物質(zhì)包括核酸分子以及蛋白質(zhì)、多肽、肽、和非蛋白類藥物/治療性化合物。根據(jù)一些實(shí)例，本發(fā)明提供了向個(gè)體的細(xì)胞輸遞核酸和/或蛋白質(zhì)、多肽、肽、和/或非蛋白類藥物/治療性化合物的方法。
根據(jù)一些實(shí)例，本發(fā)明提供了向個(gè)體的細(xì)胞遞送編碼蛋白的核酸分子的方法，其中該核酸分子中編碼該蛋白的核酸序列被表達(dá)，以便將該蛋白體內(nèi)輸遞到這些細(xì)胞中。
根據(jù)一些實(shí)例，本發(fā)明提供了向個(gè)體的細(xì)胞遞送編碼免疫原性蛋白的核酸分子的方法，其中該核酸分子中編碼該免疫原性蛋白的核酸序列被表達(dá)，以便將免疫原性蛋白輸遞到這些細(xì)胞，其中個(gè)體體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抵抗該免疫原性蛋白的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)例中，核酸分子還編碼了免疫調(diào)節(jié)蛋白，其中編碼該免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸序列被表達(dá)，以便將免疫調(diào)節(jié)蛋白遞送給個(gè)體，并影響、增強(qiáng)或調(diào)節(jié)所誘導(dǎo)的針對(duì)免疫原性蛋白的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白、多肽、肽、或非蛋白類藥物/治療性化合物，以便將免疫調(diào)節(jié)蛋白、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物輸遞給個(gè)體，從而影響、增強(qiáng)或調(diào)節(jié)所誘導(dǎo)的針對(duì)免疫原性蛋白的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含一種或多種免疫原性蛋白和/或肽，以便將免疫原性蛋白或肽輸遞給個(gè)體，以提供附加的靶，針對(duì)該靶可誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答。在一些實(shí)例中，免疫原性蛋白或肽與核酸分子編碼的免疫原性蛋白相同或相關(guān)。
根據(jù)一些實(shí)例，本發(fā)明提供了向個(gè)體的細(xì)胞遞送核酸分子的方法，該核酸分子可編碼非免疫原性的在治療上有效的蛋白，其中核酸分子中編碼非免疫原性、在治療上有效的蛋白的核酸序列被表達(dá)，以便向這些細(xì)胞輸遞非免疫原性、在治療上有效的蛋白，其中該非免疫原性、在治療上有效的蛋白在個(gè)體內(nèi)提供了所需的生理效應(yīng)。在一些實(shí)例中，核酸分子編碼了上述免疫調(diào)節(jié)蛋白。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含了一種或多種蛋白、多肽、肽、或非蛋白類藥物/治療性化合物，以便與核酸分子上核酸序列所編碼的蛋白的輸遞相結(jié)合將蛋白、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物輸送給個(gè)體。
根據(jù)一些實(shí)例，本發(fā)明提供了輸遞核酸分子的方法，該核酸分子是反義、核酶或形成三聯(lián)體的核酸分子。
根據(jù)一些實(shí)例，本發(fā)明提供了向個(gè)體的細(xì)胞遞送蛋白、多肽、肽、和/或非蛋白類藥物/治療性化合物的方法，其中層狀泡囊用作一種載體/運(yùn)載體，以促進(jìn)這些蛋白、多肽、肽、和/或非蛋白類藥物/治療性化合物的輸遞并保護(hù)它們?cè)谳斶f過程中免受降解。
根據(jù)本發(fā)明，用包含局部麻醉藥和核酸分子的泡囊組合物對(duì)局部麻醉藥在轉(zhuǎn)基因方法中的應(yīng)用(如美國(guó)專利No.5,593,972和PCT/US94/00899中描述的那些)加以改進(jìn)。當(dāng)局部麻醉藥和核酸分子在有利于形成泡囊結(jié)構(gòu)的條件下混合時(shí)，會(huì)形成泡囊組合物。泡囊組合物提供了改進(jìn)的基因轉(zhuǎn)移方法，因此改善了免疫接種、基因治療和反義和核酶給藥的方法。而且，泡囊可用于并適合于同時(shí)輸遞蛋白、多肽、肽和/或非蛋白類藥物/治療性化合物以及編碼待轉(zhuǎn)移基因的核酸分子。或者，核酸分子可以只用作載體核酸分子，即核酸分子不被轉(zhuǎn)錄或翻譯，以形成包封蛋白、多肽、肽和/或非蛋白類藥物/治療性化合物的泡囊，該泡囊可作為這些物質(zhì)的改進(jìn)的輸遞載體。因此，根據(jù)本發(fā)明還可制備包含局部麻醉藥、核酸分子以及其它類型的治療性或免疫原性物質(zhì)(如藥物、激素和免疫原)的泡囊組合物。
局部麻醉藥是高度親脂性/疏水性分子，它們?cè)诜肿拥囊欢送ǔ?但不總是)含有叔氮原子，它能攜帶正電荷作為質(zhì)子化的物質(zhì)。這在等于或低于氮的pKa(對(duì)于大多數(shù)局部麻醉藥來說pKa通常在7-9的范圍內(nèi))的水溶液中發(fā)生。因此，局部麻醉藥具有這樣的性能，它可作為中性物質(zhì)(高于pKa)而有非常高的疏水性，而在等于或低于pKa下時(shí)是電荷極化的(即有一個(gè)帶正電荷末端和一個(gè)疏水端)。本文所用的術(shù)語“局部麻醉藥”指可用來制備本發(fā)明的層狀泡囊的那些局部麻醉藥。因此，本文所用的術(shù)語“局部麻醉藥”指含有帶陽離子氮、pKa約為7-9、與DNA結(jié)合并含有疏水性基團(tuán)的那些局部麻醉藥。
局部麻醉藥通常含有內(nèi)部酰胺鍵(酰胺類局部麻醉藥)或內(nèi)部酯鍵(酯類局部麻醉藥)。酰胺類局部麻醉藥的例子包括布比卡因、利多卡因和依替卡因；酯類局部麻醉藥包括普魯卡因和丁卡因。苯佐卡因是不具有叔氮原子末端的一例酯類局部麻醉藥。在PCT/US94/00899；De-Paula，E.和S.Schreier,同上；Ritchie，J.M.和N.M.Greene，同上；和Strichartz等人(1990)，Anesth.Analg.，71158-170中提到了局部麻醉藥結(jié)構(gòu)的例子，這些文獻(xiàn)均納入本文作參考。
局部麻醉藥具有作為中性或帶電荷物質(zhì)從水溶液分配入有機(jī)相中的性能(Strichartz等人，同上和Schlieper P.和Steiner，R.(1983)＂脂質(zhì)的化學(xué)和物理學(xué)＂3481-92，這些文獻(xiàn)均納入本文作參考)。布比卡因是能以帶電荷及中性物質(zhì)分配到正辛醇中的一例局部麻醉藥。已經(jīng)報(bào)道，局部麻醉藥可分配到脂質(zhì)、脂質(zhì)混合物以及脂質(zhì)體中。
在體內(nèi)，酰胺類局部麻醉藥具有更長(zhǎng)的生物半衰期，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)象酯類局部麻醉藥那樣在血液內(nèi)迅速降解，并且通常會(huì)與血清蛋白(尤其是α-1-糖蛋白)締合，產(chǎn)生貯存效應(yīng)。酰胺類局部麻醉藥由肝臟緩慢降解。酯類局部麻醉藥在血液或組織中被血清酯酶迅速降解。
在低于酰胺pKa的pH下(例如在生理pH下)，局部麻醉藥帶陽離子電荷的末端與核酸分子上的陰離子基團(tuán)結(jié)合。在這些條件下，局部麻醉藥-核酸復(fù)合物變得更具電荷中性、疏水性和親脂性，并且能分配進(jìn)入/通過細(xì)胞脂質(zhì)膜，將核酸輸送給細(xì)胞。已經(jīng)顯示局部麻醉藥具有更高的脂質(zhì)分配系數(shù)作為中性種類。
本發(fā)明一些實(shí)例的層狀泡囊包含一種或多種局部麻醉藥，它們選自布比卡因、依替卡因、丁卡因、普魯卡因酰胺、氯普魯卡因、羅哌卡因、丙胺卡因、甲哌卡因、利多卡因、普魯卡因、卡波卡因、甲基布比卡因和可卡因。在一些實(shí)例中，層狀泡囊包含一種局部麻醉藥，包括外消旋混合物及其純的異構(gòu)體。在一些實(shí)例中，層狀泡囊包含兩種或多種不同種類的局部麻醉藥。
在本發(fā)明的一些較佳的實(shí)例中，一種或多種不同的陽離子型疏水性局部麻醉藥通過與核酸分子復(fù)合形成了泡囊結(jié)構(gòu)。一種或數(shù)種局部麻醉藥形成的泡囊膜可能包括“輔助劑(co-agent)”脂肪、洗滌劑和/或表面活性劑兩親性分子。在一些實(shí)例中，泡囊可進(jìn)一步包裹與形成泡囊復(fù)合物的化合物結(jié)合的“其它制劑”或“活性劑”。這些其它活性劑包括蛋白質(zhì)、多肽、肽、或非蛋白類藥物/治療性化合物。由于陽離子型兩親性局部麻醉藥的高度無極性特征，當(dāng)局部麻醉藥與核酸分子結(jié)合時(shí)，它能單獨(dú)或與其它化合物(如脂質(zhì)、兩親性物質(zhì)、親脂性/疏水性化合物、表面活性劑、洗滌劑和/或脂溶性維生素如維生素A、D和K(本文稱為“輔助劑”))混合形成自身裝配的結(jié)構(gòu)(包括薄層和泡囊)。Radler,J.O.等人1997年在Science275,810-814(該文納入本文作參考)中討論了脂質(zhì)自裝配結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可通過強(qiáng)烈的分子內(nèi)疏水堆積型相互作用(例如芳族基團(tuán)之間的相互作用)來進(jìn)一步穩(wěn)定化。在本發(fā)明的一些實(shí)例中，局部麻醉藥和一種或多種脂質(zhì)、兩親性物質(zhì)、親脂性/疏水性化合物、表面活性劑、和/或洗滌劑、尤其是陽離子型或中性脂質(zhì)、陽離子型或中性兩親性物質(zhì)、陽離子型或中性親脂性/疏水性化合物、陽離子型或中性表面活性劑、和/或陽離子型或中性洗滌劑一起使用，以形成包括核酸分子的層狀泡囊。
由于陽離子型局部麻醉藥種類的無極性特征，用局部麻醉藥的和輔助劑的混合物來形成結(jié)合核酸分子的較大的自裝配結(jié)構(gòu)。使單種或數(shù)種局部麻醉藥的混合物與陽離子型、中性或陰離子型脂質(zhì)以及核酸分子混合，以形成類似于脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)。泡囊可用多種局部麻醉藥與一種或多種化合物的混合來形成，這些化合物選自陽離子型、中性或陰離子型脂質(zhì)；陽離子型、中性或陰離子型兩親性物質(zhì)；陽離子型、中性或陰離子型親脂性/疏水性化合物；陽離子型、中性或陰離子型表面活性劑；和/或陽離子型、中性或陰離子型洗滌劑。在一個(gè)實(shí)例中，一種陽離子型局部麻醉藥(如布比卡因)與一種不同的陽離子型兩親性物質(zhì)(如合成的化合物如DOTMA)組合；或與一種中性的合成化合物(如DOPE)和/或中性脂質(zhì)(如膽固醇)混合。在另一個(gè)實(shí)例中，一種陽離子型局部麻醉藥與陰離子型和/或中性脂質(zhì)混合。
本發(fā)明的層狀泡囊可用來包封活性劑以便輸遞至組織和細(xì)胞。治療性和/或免疫原性和/或顯影劑(在本文稱為“活性劑”)(包括蛋白類和非蛋白類化合物)可以與這些薄層結(jié)構(gòu)締合或包封到這些結(jié)構(gòu)中，以便在體外或體內(nèi)輸送至組織和細(xì)胞?；钚詣┓肿影ㄖ委熜院?或免疫原性蛋白質(zhì)、多肽和肽以及非蛋白類藥物/治療性化合物。其它分子也可與這些結(jié)構(gòu)締合，以減少它們的免疫原性(如PEG的免疫原性)、改進(jìn)它們與細(xì)胞融合的能力或在細(xì)胞攝取后破壞細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)體(融合的脂質(zhì)、肽、聚合物)。
在本發(fā)明的一些實(shí)例中，核酸分子可以是質(zhì)粒DNA基因構(gòu)建物，它是編碼免疫原或編碼有生物活性的、治療上需要的蛋白質(zhì)的DNA疫苗或基因治療構(gòu)建物，其中編碼序列與序列在給予泡囊復(fù)合物的個(gè)體內(nèi)細(xì)胞中表達(dá)所需的調(diào)控元件操作性相連(即DNA可操作性編碼待表達(dá)的蛋白)。DNA構(gòu)建物在美國(guó)專利No.5,593,972(1997年1月14日授予Weiner等人)和PCT申請(qǐng)PCT/US94/00899中有所描述。重要的是，如果編碼序列有待轉(zhuǎn)錄和翻譯，則它必須與能在DNA分子所遞送的細(xì)胞內(nèi)起作用的調(diào)控元件操作性相連。
本發(fā)明的一些方面涉及將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)以便誘導(dǎo)出針對(duì)該遺傳物質(zhì)編碼的蛋白質(zhì)或肽的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括下列步驟將層狀泡囊給予所述個(gè)體的組織，該層狀泡囊包括局部麻醉藥以及一種核酸分子，該核酸分子包含編碼一種或多種所需肽或蛋白(包括至少一種免疫原性肽或蛋白)的核苷酸序列。另外，在一些實(shí)例中，提供了這樣一種核酸分子，它包含編碼一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。核酸分子可以質(zhì)粒DNA的形式提供。在一些實(shí)例中，層狀泡囊進(jìn)一步還包含一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物和/或一種或多種免疫原性蛋白或肽。
根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體以抗變應(yīng)原、致病原或異常的疾病相關(guān)細(xì)胞的組合物和方法。遺傳物質(zhì)編碼的免疫原可在個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)出抗變應(yīng)原、病原或異常細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
遺傳物質(zhì)由個(gè)體的細(xì)胞表達(dá)，并作為免疫原性靶引發(fā)針對(duì)其的免疫應(yīng)答。產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是非常廣泛的除了體液免疫應(yīng)答外，還引發(fā)了兩種細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的方法可用來提供預(yù)防性和治療性免疫力。因此，免疫接種方法包括兩種方法針對(duì)免疫原的免疫接種從而(例如)保護(hù)個(gè)體免受病原攻擊，或阻止特異性細(xì)胞產(chǎn)生或增殖的方法；以及治療患有病原感染、過度增殖疾病或自身免疫疾病的個(gè)體的方法。
本文所用的術(shù)語“免疫原”和“靶蛋白”指本發(fā)明中的基因構(gòu)建物所編碼的、作為免疫應(yīng)答的靶蛋白的肽和蛋白。術(shù)語“靶蛋白”和“免疫原”可以互換使用，指可以引發(fā)針對(duì)該蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白。靶蛋白是一種免疫原性蛋白，它具有來自病原體或不希望的細(xì)胞類型(例如癌細(xì)胞或涉及自身免疫疾病的需要對(duì)其免疫的細(xì)胞)的變應(yīng)原或蛋白的至少一個(gè)表位。針對(duì)靶蛋白的免疫應(yīng)答將保護(hù)個(gè)體并抵御治療個(gè)體的特異性感染或與靶蛋白有關(guān)的疾病。
本發(fā)明可用來引發(fā)針對(duì)靶蛋白(即與病原體、變應(yīng)原或個(gè)體自身的“異?！奔?xì)胞特異性相關(guān)的蛋白)的廣泛的免疫應(yīng)答。本發(fā)明可用來免疫個(gè)體抵抗病原性因子和生物體，這樣，針對(duì)病原體蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)就提供了抵抗病原體的免疫力。通過引發(fā)針對(duì)與過度增殖細(xì)胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答，本發(fā)明可用來抵抗過度增殖疾病和失調(diào)(如癌癥)。通過引發(fā)針對(duì)與涉及自身免疫疾病的細(xì)胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答，本發(fā)明可用來抵抗自身免疫疾病和失調(diào)。
本發(fā)明的一些方面涉及將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)、以便將該遺傳物質(zhì)編碼的非免疫原性蛋白和肽輸遞至個(gè)體中的方法。該方法包括下列步驟將層狀泡囊給予所述個(gè)體的組織，該層狀泡囊包含局部麻醉藥以及一種核酸分子，該核酸分子包含的核苷酸序列編碼了一種或多種所需的元免疫原性、有生物活性的肽、多肽或蛋白(對(duì)個(gè)體有非免疫原性的生理效應(yīng))。本文所用的術(shù)語“有生理活性的蛋白”指有生物活性的肽、多肽或蛋白，它們對(duì)于個(gè)體有非免疫原性的生理效應(yīng)。在一些實(shí)例中，提供的核酸分子所包含的核苷酸序列編碼了選自下列的一種或多種蛋白細(xì)胞因子、凝血因子、趨化因子、共同刺激因子、轉(zhuǎn)錄因子、激素、生長(zhǎng)因子和替換基因。細(xì)胞因子的例子包括IL-12、GM-CSF和促紅細(xì)胞生成素。凝血因子的例子包括因子XIII和因子IX。替換基因的例子包括肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(用來治療肌肉營(yíng)養(yǎng)不良)和CFPR(用來治療囊性纖維化)。激素的例子包括leptin。核酸分子可以質(zhì)粒DNA形式提供。在一些實(shí)例中，層狀泡囊還包含一種或多種蛋白、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物。
根據(jù)本發(fā)明，將編碼免疫原或有生理活性的蛋白的DNA或RNA導(dǎo)入個(gè)體的組織細(xì)胞內(nèi)在其中表達(dá)，從而產(chǎn)生了免疫原或有生理活性的蛋白。編碼免疫原或有生理活性的蛋白的DNA或RNA序列與其在個(gè)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所需的調(diào)控元件相連接。DNA表達(dá)的調(diào)控元件包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。另外，基因構(gòu)建物中還可包含其它元件，如Kozak區(qū)。
本文所用的術(shù)語“基因構(gòu)建物”指DNA或RNA分子，其包含的核苷酸序列編碼了免疫原或有生理活性的蛋白，并且還包括與調(diào)控元件操作性相連的啟動(dòng)和終止信號(hào)(包括能指導(dǎo)在個(gè)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào))。在一些實(shí)例中，在遞送給個(gè)體的相同核酸分子上發(fā)現(xiàn)了編碼一種或多種免疫原和/或一種或多種有生理活性的蛋白的可表達(dá)形式的序列。在一些實(shí)例中，層狀泡囊包括兩種或多種不同的核酸分子，它包括編碼一種或多種不同免疫原和/或一種或多種不同的有生理活性的、待輸遞給個(gè)體的蛋白的可表達(dá)形式的序列。
本文所用的術(shù)語“可表達(dá)形式”指含有所需調(diào)控元件的基因構(gòu)建物，該調(diào)控元件與編碼免疫原或有生理活性的蛋白的序列操作性相連，這樣當(dāng)其存在于個(gè)體的細(xì)胞中時(shí)，該編碼序列會(huì)表達(dá)。
基因構(gòu)建物可包含編碼免疫原或有生理活性的蛋白的核苷酸序列，該序列與基因表達(dá)所需的調(diào)控元件操作性相連。當(dāng)其被細(xì)胞攝取時(shí)，基因構(gòu)建物可保留在細(xì)胞內(nèi)作為功能性的染色體外分子和/或整合到細(xì)胞染色體DNA內(nèi)。DNA可導(dǎo)入細(xì)胞中，并在其中以一個(gè)或數(shù)個(gè)質(zhì)粒的形式保留，成為分離的遺傳物質(zhì)。另外，可將能整合入染色體中的線性DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可能要加入促進(jìn)DNA整合到染色體上的試劑。DNA分子中也可包括用來促進(jìn)整合的DNA序列。另外，可將RNA給予細(xì)胞。還可考慮提供基因構(gòu)建物作為包括著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起點(diǎn)的線性微型染色體?；驑?gòu)建物可保留減毒活微生物或生長(zhǎng)在細(xì)胞內(nèi)的重組微生物載體的一部分遺傳物質(zhì)?；驑?gòu)建物可以是重組病毒疫苗的基因組的一部分，其中遺傳物質(zhì)或整合到細(xì)胞染色體中或保留在染色體外。
基因構(gòu)建物包括核酸分子基因表達(dá)所需的調(diào)控元件。這些元件包括啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號(hào)。另外，編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的基因表達(dá)通常還需要增強(qiáng)子。這些元件必需和編碼所需蛋白的序列操作性相連，且調(diào)控元件在所給予的個(gè)體中可以操作。
起始密碼子和終止密碼子通常被認(rèn)為是編碼所需蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，這些元件需在給予基因構(gòu)建物的個(gè)體內(nèi)有功能。起始密碼子和終止密碼子必需位于編碼序列的讀框中。
所用的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)必須在個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)有功能。
用來實(shí)施本發(fā)明、尤其是用來生產(chǎn)人用基因疫苗的啟動(dòng)子例子包括(但不局限于)人啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子(如來自皰疹病毒、痘病毒、乳頭瘤、細(xì)小病毒或肝炎病毒)、來自猿病毒40(SV40)的啟動(dòng)子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人免疫缺陷病毒(HIV)(如HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列)啟動(dòng)子、Moloney病毒、ALV、巨細(xì)胞病毒(CMV)如CMV立即早期啟動(dòng)子、EB病毒(EBV)、Rous肉瘤病毒(RSV)以及人基因(如人延伸因子1A、人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和人金屬硫蛋白)的啟動(dòng)子。
用來實(shí)施本發(fā)明、尤其是用來生產(chǎn)人用基因疫苗的聚腺苷酸化信號(hào)的例子包括(但不局限于)牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)、SV40聚腺苷酸化信號(hào)和LTR聚腺苷酸化信號(hào)。特別是，采用在pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen，San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸化信號(hào)(稱為SV40聚腺苷酸化信號(hào))。
除了DNA表達(dá)所需的調(diào)控元件外，DNA分子中還可包括其它元件。這些附加的元件包括來自Mason-Pfizer猴病毒的組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件和/或增強(qiáng)。增強(qiáng)子可選自(但不局限于)人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和病毒增強(qiáng)子如來自CMV、RSV和EBV的增強(qiáng)子。
為了使蛋白生產(chǎn)最大化，可以選擇非常適合基因在給予了構(gòu)建物的細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控序列。而且，可以選擇在細(xì)胞中最有效地轉(zhuǎn)錄的密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能制得在細(xì)胞中起作用的DNA構(gòu)建物。
本發(fā)明可用來對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫以抵抗所有的病原體如病毒、原核和致病真核生物(如單細(xì)胞病原生物和多細(xì)胞寄生蟲)。本發(fā)明特別適用于免疫個(gè)體以抵抗感染細(xì)胞的那些病原體(如病毒、原核生物如淋病菌屬、李斯特菌屬和志賀氏菌屬)。另外，本發(fā)明還可用來免疫個(gè)體以抵抗原生動(dòng)物病原體，它們?cè)谏芷趦?nèi)有一個(gè)階段是細(xì)胞內(nèi)病原體。本文所用的術(shù)語“胞內(nèi)病原體”指在其至少?gòu)?fù)制部分或生命周期中存在于宿主細(xì)胞內(nèi)并在其中產(chǎn)生或?qū)е庐a(chǎn)生病原體蛋白的病毒或病原性生物。表1提供了根據(jù)本發(fā)明可以制備疫苗的一些病毒家族和病毒屬的清單。以下DNA構(gòu)建物可用于疫苗該DNA構(gòu)建物包含的DNA序列所編碼的肽包含至少一個(gè)與病原體抗原(例如表1中列出的那些抗原)上顯示的相同或基本相似的表位。而且，本發(fā)明還可用來免疫個(gè)體以抵抗其它病原體(包括原核和真核原生動(dòng)物病原體以及多細(xì)胞寄生蟲(例如表2所列出的那些))。
為了產(chǎn)生基因疫苗以抵抗病原體感染，基因構(gòu)建物中必須包括編碼免疫原性蛋白(針對(duì)該蛋白可以產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答)的遺傳物質(zhì)作為靶的編碼序列。無論病原體在細(xì)胞內(nèi)(本發(fā)明對(duì)此是特別有用的)還是在細(xì)胞外感染，不可能所有的病原體抗原都能引發(fā)保護(hù)性應(yīng)答。本發(fā)明允許用多種病原體抗原進(jìn)行接種。用于基因疫苗的基因構(gòu)建物可包括編碼許多病原體抗原的遺傳物質(zhì)。例如，一個(gè)構(gòu)建物中可包括幾種病毒基因，以提供多個(gè)靶?；蛘?，含有一種或多種病原體基因的多個(gè)構(gòu)建物可包括在不同的DNA分子上，然后組合DNA分子用于制備泡囊復(fù)合物。這些泡囊含有兩種或多種不同的DNA分子，在一個(gè)泡囊結(jié)構(gòu)中可以有不同的基因構(gòu)建物。
表1和2包括一些病原性因子以及病原生物體的清單，它們可用來制備基因疫苗以保護(hù)個(gè)體免受它們的感染。在一些較佳的實(shí)例中，免疫個(gè)體抵抗病原體的方法針對(duì)的是人免疫缺陷病毒HIV、人T細(xì)胞白血病病毒HTLV、流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒HPV、單純皰疹病毒1型HSV1、單純皰疹病毒2型HSV2、巨細(xì)胞病毒CMV、EB病毒EBR、鼻病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和呼吸道合胞病毒。
本發(fā)明的另一方面提供了賦予廣泛的保護(hù)性免疫應(yīng)答以抵抗過度增殖細(xì)胞(是過度增殖疾病中特征性的)的方法，以及治療患有過度增殖疾病的個(gè)體的方法。本文所用的術(shù)語“過度增殖疾病”指特征為細(xì)胞過度增殖的那些疾病和紊亂。過度增殖疾病的例子包括所有形式的癌，如淋巴瘤或黑色素瘤和牛皮癬。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將包括核酸序列(該序列編碼免疫原性的與“過度增殖的”細(xì)胞相關(guān)的蛋白)的基因構(gòu)建物導(dǎo)入個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)會(huì)導(dǎo)致在個(gè)體被接種細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生那些蛋白。本文所用的術(shù)語“過度增殖相關(guān)的蛋白”指與過度增殖疾病有關(guān)的蛋白。為了免疫抵抗過度增殖疾病，將一基因構(gòu)建物給予個(gè)體，該構(gòu)建物包括的核苷酸序列所編碼的蛋白與過度增殖疾病有關(guān)。
盡管本發(fā)明可用來免疫個(gè)體以抵抗一種或多種數(shù)種形式的癌癥，但是本發(fā)明特別適用于對(duì)易發(fā)生特定癌癥或已患過癌癥因而易復(fù)發(fā)的個(gè)體進(jìn)行預(yù)防性免疫。遺傳學(xué)和技術(shù)以及流行病學(xué)的發(fā)展使得能夠?qū)€(gè)體內(nèi)發(fā)生癌癥進(jìn)行可能性和危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)測(cè)定。利用基因篩查和/或家族健康史，就可能對(duì)特定個(gè)體產(chǎn)生數(shù)種癌癥中任何一種的可能性的進(jìn)行預(yù)測(cè)。
同樣，已經(jīng)產(chǎn)生癌癥和已經(jīng)治療除去癌癥或癌癥正在緩解的那些個(gè)體特別容易復(fù)發(fā)和重新發(fā)生。作為治療方案的一部分，可對(duì)已經(jīng)診斷出患有癌癥的這些個(gè)體進(jìn)行抗癌癥免疫，以戰(zhàn)勝?gòu)?fù)發(fā)。因此，一旦知道某個(gè)體曾患一種癌并有復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)，就可對(duì)他們免疫以使它們的免疫系統(tǒng)作好準(zhǔn)備以防止癌癥再出現(xiàn)。
本發(fā)明提供了治療患過度增殖疾病的個(gè)體的方法。在這些方法中，導(dǎo)入基因構(gòu)建物作為免疫治療劑，指導(dǎo)并促進(jìn)個(gè)體的免疫系統(tǒng)抵抗產(chǎn)生靶蛋白的過度增殖細(xì)胞。
本發(fā)明提供了治療患自身免疫疾病和紊亂的個(gè)體的方法，該方法是賦予廣泛的保護(hù)性免疫應(yīng)答以抵抗與自身免疫力有關(guān)的靶(包括細(xì)胞受體和產(chǎn)生“自身”靶向抗體的細(xì)胞)。
T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)、Sjogren′s綜合征、肉樣瘤病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲狀腺炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、牛皮癬、脈管炎、Wegener′s肉芽腫病、Crohn′s疾病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病每一種的特征均是T細(xì)胞受體與內(nèi)源性抗原結(jié)合，并引發(fā)了與自身免疫疾病有關(guān)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。針對(duì)T細(xì)胞可變區(qū)的接種會(huì)引發(fā)包括CTL的免疫應(yīng)答從而清除那些T細(xì)胞。為了治療患T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病(尤其是TCR的可變區(qū)還未經(jīng)特性分析的那些)的患者，可以進(jìn)行滑液活檢。可以取出存在T細(xì)胞的樣品并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定那些TCR的可變區(qū)。用該信息可制備基因疫苗。
B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病包括狼瘡(SLE)、Grave′s疾病、重癥肌無力、自身免疫溶血性貧血、自身免疫血小板減少、哮喘、冷球蛋白血癥、原發(fā)性膽硬化和惡性貧血。這些疾病每一個(gè)的特征均為抗體與內(nèi)源性抗原結(jié)合并啟動(dòng)了與自身免疫疾病有關(guān)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。針對(duì)抗體可變區(qū)的接種會(huì)引發(fā)包括CTL的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而消除產(chǎn)生這些抗體的那些B細(xì)胞。為了治療患B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的患者，必須鑒定涉及自身免疫活性的那些抗體的可變區(qū)。可以進(jìn)行活檢并取出發(fā)炎部位存在的抗體樣品。那些抗體的可變區(qū)可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來鑒定。用此信息可以制得基因疫苗。
根據(jù)一些較佳的實(shí)例，泡囊是疫苗制劑，DNA是操作性編碼免疫原的質(zhì)粒DNA，可以誘導(dǎo)出針對(duì)該免疫原的抗病原體免疫應(yīng)答。較佳實(shí)例包括的質(zhì)粒編碼了誘導(dǎo)抗表1和2所列出的病原體的免疫應(yīng)答反應(yīng)的免疫原。根據(jù)一些較佳的實(shí)例，免疫原是病原體抗原。在一些實(shí)例中，泡囊中可包括免疫調(diào)節(jié)蛋白，和/或由質(zhì)粒編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白。在一些較佳的實(shí)例中，泡囊中可包括免疫原性蛋白和肽，特別是與質(zhì)粒編碼的免疫原有關(guān)的那些蛋白和肽。
根據(jù)一些較佳的實(shí)例，質(zhì)粒是可操作編碼有治療活性的蛋白(如免疫調(diào)節(jié)蛋白)或有生理活性的蛋白的質(zhì)粒DNA。將此DNA輸遞至個(gè)體會(huì)導(dǎo)致這些蛋白表達(dá)，并在個(gè)體內(nèi)有活性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，核酸分子可以是用來形成泡囊復(fù)合物的載體DNA，以攜帶其它活性劑，但不編碼在給予泡囊復(fù)合物的個(gè)體的細(xì)胞中表達(dá)的蛋白。載體DNA的例子包括質(zhì)粒DNA、鮭精DNA、人DNA、細(xì)菌DNA和噬菌體DNA。在本發(fā)明的一些實(shí)例中，核酸分子可以是RNA。
在本發(fā)明的一些實(shí)例中，其它活性劑可以是蛋白多肽、肽、RNA或其它非蛋白類分子如治療性化合物/藥物。蛋白的例子包括作為所需免疫應(yīng)答反應(yīng)靶的抗原/免疫原、細(xì)胞因子(如IL-2)、GM-CSF、共同刺激因子、趨化因子(如MCP-1和RANTES)、轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、激素和生長(zhǎng)因子。RNA的例子包括反義RNA、核酶和形成三聯(lián)體的RNA。蛋白、多肽和肽的例子包括作為所需免疫應(yīng)答反應(yīng)靶子的抗原/免疫原性蛋白、多肽和肽，以及有生物活性的肽如促生長(zhǎng)素抑制素(somatastatin)和IGF-1。非蛋白類分子(例如治療性化合物/藥物)的例子包括抗腫瘤化合物如三苯氧胺、阿霉素、紫衫醇、順-鉑(platin)；抗病毒化合物如ddI和ddA、抗炎化合物如NSAID和類固醇；抗生素化合物如抗真菌和抗細(xì)菌化合物，以及降低膽固醇的藥物。
局部麻醉藥/核酸復(fù)合物由局部麻醉藥產(chǎn)生了層狀結(jié)構(gòu)。核酸分子與局部麻醉藥的親水性部分相互作用，而其親脂性部分形成一個(gè)膜結(jié)構(gòu)。復(fù)合物在特定的條件下形成，這些條件包括局部麻醉藥與核酸的特定摩爾比、特定的鹽濃度以及特定pH。另外，取決于加工的步驟，不同大小的泡囊會(huì)產(chǎn)生不同的巨大分子結(jié)構(gòu)。
關(guān)于pH，pH應(yīng)高于局部麻醉藥的pKa以確保胺基帶正電荷。在較佳的實(shí)例中，pH為4-8.5，更佳的為6-7.5。
關(guān)于鹽濃度，鹽濃度應(yīng)足夠低，以允許局部麻醉藥的正電荷與核酸磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷復(fù)合。在一些實(shí)例中，局部麻醉藥/核酸泡囊配方的鹽濃度在形成復(fù)合物后有所增加。在較佳的實(shí)例中，鹽濃度為0-2M，更佳的為0-500mM。
給藥途徑包括腸胃外以及外用或粘膜途徑。在一些實(shí)例中，泡囊通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、經(jīng)皮膚、腹膜內(nèi)、外用、鼻內(nèi)、口服(包括腸衣保護(hù)的口服輸藥)、吸入、或外用或灌洗粘膜組織(選自陰道、直腸、尿道、頰和舌下)來給藥。本發(fā)明的組合物的給藥裝置包括(但不局限于)傳統(tǒng)的注射器、無針注射裝置或“微粒(miroprojectile)轟擊基因槍”。微粒轟擊過程由Sanford等人在美國(guó)專利4,945,050(1990年7月31日授權(quán))中有所描述，該專利納入本文作參考，可對(duì)其作改進(jìn)用于將本發(fā)明的組合物給予個(gè)體。
本文所用的術(shù)語“藥物組合物”和“可注射藥物組合物”指具有通常的、完全了解和接受的含義，這些含義是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所完全認(rèn)同的。作為藥物組合物給予患者的組合物通常是無菌的無熱原的組合物。適用于注射的藥物組合物(即可注射的藥物組合物)是無菌、無熱原的，基本上沒有外來物質(zhì)并且調(diào)節(jié)到適宜的等滲性和pH，能安全有效地注射到個(gè)體內(nèi)。
關(guān)于局部麻醉藥/核酸之比，顆粒復(fù)合物的大小取決于比例。因此，通過調(diào)節(jié)局部麻醉藥/核酸之比可以確定顆粒大小。根據(jù)轉(zhuǎn)基因所靶向的細(xì)胞類型，可能希望有不同的顆粒大小。
局部麻醉藥/核酸泡囊的大小或高級(jí)結(jié)構(gòu)可由幾個(gè)因素來控制，它們包括如果使用長(zhǎng)鏈脂肪酸類脂質(zhì)，脂質(zhì)和局部麻醉藥組分的疏水鏈的長(zhǎng)度，以及局部麻醉藥與脂質(zhì)相互的確切比例。另外，對(duì)用于輸遞核酸的泡囊來說，局部麻醉藥的濃度或局部麻醉藥以及陽離子型脂質(zhì)的濃度與核酸的濃度之比對(duì)于顆粒的大小和結(jié)構(gòu)是很重要的。改變顆粒大小(直徑從10nm變?yōu)?00μm，通過掃描電鏡測(cè)得)將導(dǎo)致不同的組織分布和分布動(dòng)力學(xué)，這也可能會(huì)受顆粒注射或輸遞的方式/方法影響。例如，直徑為50-200nm(經(jīng)掃描電鏡測(cè)得)的顆粒靜脈內(nèi)注射可能會(huì)被肝細(xì)胞優(yōu)先攝取。0.1-10μm的顆粒靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)注射可能會(huì)被吞噬細(xì)胞(如Kupfer細(xì)胞)和/或免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如不同類型的樹突細(xì)胞，包括Langerhahn細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)優(yōu)先攝取。不同大小(直徑為50nm-100μm，經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的顆?？赏ㄟ^經(jīng)皮膚輸送技術(shù)、或通過局部施用于皮膚或粘膜表面、或通過單獨(dú)口服或與其它片劑、膠囊等中的其它組分聯(lián)合被吸收。
在一些較佳的實(shí)例中，局部麻醉藥提供以最終濃度為0.01-2.5％(w/v)，更佳的為0.05-1.25％(w/v)。在一些較佳的實(shí)例中，最終濃度為0.25％(w/v)。
在一些較佳的實(shí)例中，核酸提供以最終濃度為1μg/ml-10mg/ml，更佳的為100μg/ml-3mg/ml。在一些較佳的實(shí)例中，最終濃度為1mg/ml。
在一些較佳的實(shí)例中，核酸與局部麻醉藥的濃度比為[1μg/ml-10mg/ml]∶
，較佳的為[100μg/ml-3mg/ml]∶
。在一些較佳的實(shí)例中，核酸與局部麻醉藥濃度比為[800μg/ml-1000μg/ml]∶
。
局部麻醉藥在與核酸分子混合時(shí)自發(fā)形成泡囊。局部麻醉藥的電荷可通過選擇有利于形成電荷的條件來確定。在一些較佳的實(shí)例中，局部麻醉藥帶正電荷，并與帶負(fù)電荷的核酸(在一些較佳的實(shí)例中為DNA)混合。將帶正電荷的局部麻醉藥與DNA混合導(dǎo)致形成泡囊結(jié)構(gòu)。單個(gè)泡囊結(jié)構(gòu)可聚集成較大的較高級(jí)結(jié)構(gòu)。一些聚集物呈棒狀結(jié)構(gòu)，它呈現(xiàn)出單個(gè)泡囊結(jié)構(gòu)象豆莢中的豌豆那樣排列，即泡囊被包封在較大的層狀泡囊結(jié)構(gòu)中。
如果局部麻醉藥(如布比卡因)直接與核酸(如DNA)混合(例如迅速混合)，則形成的直徑為100-150nm(經(jīng)掃描電鏡測(cè)得)的泡囊結(jié)構(gòu)可聚集成較大的泡囊，在一些情況下，可聚集成直徑大于300nm(經(jīng)掃描電鏡測(cè)得)的不規(guī)則形狀的結(jié)構(gòu)。放慢混合速度可用透析來獲得；或?qū)⒕植柯樽硭幫肝龅胶怂岱肿尤芤褐?，或混合局部麻醉藥、核酸分子和鹽并透析除去鹽。通過緩速混合(例如用相對(duì)于局部麻醉藥的低濃度的DNA透析)混合局部麻醉藥和核酸有利于形成直徑為50-150nm(經(jīng)掃描電鏡測(cè)得)的更小的結(jié)構(gòu)。用相對(duì)于局部麻醉藥濃度而言更高濃度的DNA混合局部麻醉藥和核酸有利于形成直徑高達(dá)1微米或更高(經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的更大的結(jié)構(gòu)。一種較佳的緩慢混合方法是在高鹽存在下混合組分然后透析數(shù)小時(shí)除去高鹽。在除鹽時(shí)，條件向自身裝配和形成泡囊結(jié)構(gòu)的條件移動(dòng)。
如上所述，可用透析來控制泡囊形成速度。在一些方法中，在高鹽濃度的溶液中在透析膜中混合局部麻醉藥和核酸分子。然后將膜置于一個(gè)含有低鹽濃度(通常是含泡囊溶液最終所需的濃度)的容器內(nèi)。膜中溶液內(nèi)的鹽遷移通過和離開膜進(jìn)入周圍溶液中，因此膜內(nèi)的鹽濃度減少。隨著鹽濃度的降低，膜內(nèi)的溶液逐漸有利于泡囊的形成。當(dāng)待包封到泡囊內(nèi)的附加試劑是疏水性時(shí)，該方法是特別適用的。
在一些方法中，核酸分子放在透析膜內(nèi)的溶液中。然后將膜置于一個(gè)容器中，該容器內(nèi)含有用于形成泡囊濃度的局部麻醉藥(通常是含泡囊溶液的最終濃度)。周圍溶液內(nèi)的局部麻醉藥遷移通過膜進(jìn)入膜內(nèi)溶液中。隨著膜內(nèi)溶液中的局部麻醉藥的濃度逐漸增加，膜內(nèi)的溶液逐漸有利于形成泡囊。通常，采用截留值為10,000-100,000kD的透析膜，膜內(nèi)局部麻醉藥濃度變成與膜外局部麻醉藥濃度相等的平衡時(shí)間約為2-3小時(shí)。采用截留值為3,000kD的透析膜，膜內(nèi)局部麻醉藥濃度變成與膜外局部麻醉藥濃度相等所需的平衡時(shí)間約為5小時(shí)。待包封在泡囊內(nèi)的附加試劑可包含在膜內(nèi)核酸溶液中，只要這些試劑可溶于溶液中。
在一個(gè)實(shí)例中，通過直接混合在水溶液中混合布比卡因(最終濃度為0.25％(w/v))和100-1000μg/ml DNA。pH低于8，較佳的為6.5-7。鹽濃度低于200mM。形成直徑約為100-150nm(經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的泡囊結(jié)構(gòu)，這些泡囊的聚集物形成了直徑大于300nm(經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的更大的結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)實(shí)例中，布比卡因以最終濃度為0.25％(w/v)與一種有機(jī)溶劑(如氯仿)混合，然后蒸發(fā)干燥。將水溶液配的100-1000μg/ml的DNA與蒸發(fā)物混合。pH低于8，較佳的為6.5-7。鹽濃度低于500mM。形成直徑約為100-150nm(經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的泡囊結(jié)構(gòu)，這些泡囊的聚集物形成了直徑大于300nm(經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的更大的結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)實(shí)例中，布比卡因以最終濃度為0.25％(w/v)在水溶液中與低于100μg/ml DNA的混合。pH低于8，較佳的為6.5-7。鹽濃度低于500mM。形成直徑約為50-150nm(經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的泡囊結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)實(shí)例中，布比卡因以最終濃度為0.25％(w/v)在水溶液中與高達(dá)1000μg/ml DNA的水溶液混合。透析1小時(shí)以上，使兩種物質(zhì)緩慢混合。pH低于8，較佳的為6.5-7。鹽濃度高于2M。將鹽萃取出溶液，在除去鹽時(shí)泡囊發(fā)生自身裝配。形成直徑約為50-150nm(經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得)的泡囊結(jié)構(gòu)?？捎藐栯x子(如Ca++)或陰離子(如PO4-)來使最終結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化。
在另一個(gè)實(shí)例中，局部麻醉藥、脂質(zhì)和核酸的混合物在高鹽濃度下在透析時(shí)緩慢自身裝配成泡囊。
在一個(gè)實(shí)例中，局部麻醉藥以及任選的脂質(zhì)如上所述混合在有機(jī)溶劑中。溶劑用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來蒸發(fā)。在干燥的物質(zhì)中加入含有核酸分子的緩沖水溶液，混合中泡囊自身裝配。為了輸遞疏水性活性劑，活性劑可在干燥前加入脂質(zhì)中。含有核酸分子的緩沖液中可以包含蛋白質(zhì)、多肽、肽和非蛋白類親水性化合物。隨后可包封活性劑。
在另一個(gè)實(shí)例中，可如上所述制得陽離子型泡囊，只是它們形成時(shí)沒有核酸分子，該核酸分子是后來加入的。例如，如上所述將局部麻醉藥和任選地脂質(zhì)混合在有機(jī)溶劑中。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)蒸發(fā)溶劑。在干燥的物質(zhì)中加入不含核酸分子的緩沖水溶液，混合時(shí)“空”泡囊自裝配。重建后的第二步是將含有核酸分子的緩沖液加入溶液中。這對(duì)于核酸來說是特別適用的，可能會(huì)產(chǎn)生更大的更高級(jí)的顆粒多層結(jié)構(gòu)。
在另一個(gè)實(shí)例中，上調(diào)pH至局部麻醉藥的pKa，在混合物中產(chǎn)生作為顆?；蚓w沉淀的與核酸結(jié)合的固體泡囊。
在一些實(shí)例中，局部麻醉藥核酸泡囊還包含蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子和/或免疫原性蛋白或肽。因此免疫調(diào)節(jié)蛋白可作為局部麻醉藥核酸復(fù)合物的一部分給予，其中核酸編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白和/或一種免疫原性蛋白。在一些實(shí)例中，核酸是基因疫苗，輔助劑蛋白質(zhì)是免疫調(diào)節(jié)蛋白如細(xì)胞因子，例如GMCSF或IL-12。在一些實(shí)例中，核酸是基因疫苗，輔助劑蛋白質(zhì)是免疫原性蛋白或肽。根據(jù)這些實(shí)例，輸遞的疫苗同時(shí)是引物/強(qiáng)化劑。
泡囊可以混合形成更大的結(jié)構(gòu)/復(fù)合物，包括1-5微米結(jié)構(gòu)。
在一些實(shí)例中，經(jīng)掃描電子顯微術(shù)測(cè)得，泡囊的直徑大于400nm。當(dāng)這些泡囊給予個(gè)體(例如通過靜脈內(nèi)給藥)時(shí)，它們可用來將物質(zhì)輸遞到肺。
本發(fā)明的組合物和方法適用于人和獸醫(yī)領(lǐng)域。因此，本發(fā)明的組合物和方法可用來治療性和預(yù)防性治療個(gè)別哺乳動(dòng)物、鳥類或魚。本發(fā)明的組合物和方法特別可用作治療哺乳動(dòng)物個(gè)體的組合物和方法，這些哺乳動(dòng)物包括人、牛、山羊、豬、馬、犬和貓。
本發(fā)明不想受任何特定理論的限制。下面給出的實(shí)施例涉及本發(fā)明方面的某些實(shí)例。這些實(shí)施例并不意味著限制了本發(fā)明的范圍，而只是起列舉作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解本發(fā)明的其它方面和實(shí)例。
實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明的一些較佳的實(shí)例，當(dāng)將局部麻醉藥和DNA組合并作為含有DNA的局部麻醉藥泡囊進(jìn)行輸遞時(shí)，受局部麻醉藥促進(jìn)的DNA疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可得到改善。在一些較佳的實(shí)例中，局部麻醉藥是布比卡因。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)局部麻醉藥與輔助劑以及DNA組合形成泡囊時(shí)，局部麻醉藥易化的DNA疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以得到改善。
陰離子型分子(如DNA)與自裝配結(jié)構(gòu)的帶正電荷的親水性部分結(jié)合。該復(fù)合物與細(xì)胞結(jié)合，其高親脂性的性質(zhì)使得其容易被細(xì)胞攝取。用途包括基因治療和基因免疫。
在一些實(shí)例中，產(chǎn)生了較大的泡囊，它們的大小足以被細(xì)胞通過胞飲或吞噬機(jī)制作為顆粒而攝取。這些大的顆粒泡囊用于免疫或免疫治療的疫苗領(lǐng)域、或用于基因治療領(lǐng)域，以靶向免疫系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞(如表達(dá)MHC-II的抗原呈遞細(xì)胞，如樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)。這種大復(fù)合物的附加優(yōu)點(diǎn)是局部麻醉藥還促使細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)體和溶酶體釋放。
在一些實(shí)例中，凍干/脫水的局部麻醉藥/DNA泡囊可用于基因輸送和基因免疫。一個(gè)例子是，它們單獨(dú)或與其它固體成分混合用于制備DNA口服輸藥用片劑，或制備用來輸遞DNA的納顆?；蛭㈩w粒。局部麻醉藥復(fù)合物或顆粒用于經(jīng)口遞送疫苗或基因治療，因?yàn)樗鼈儽Ｗo(hù)有關(guān)的活性分子以免在胃中降解，并促使腸相關(guān)淋巴組織吸收。
在另一個(gè)實(shí)施例中，將疏水性、可溶性差的藥物包封在泡囊核心的疏水性環(huán)境內(nèi)，而該結(jié)構(gòu)的表面帶正電荷，從而改善了藥物的溶解度。帶正電荷的物質(zhì)對(duì)富含磷脂的帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面有天然的吸引力。在吸引后，結(jié)構(gòu)的高親脂性特征使得其容易輸送通過細(xì)胞膜。用途包括輸送溶解度差的或全身毒性癌癥藥物(如將紫衫醇或長(zhǎng)春花新堿輸送至乳房癌細(xì)胞/腫瘤)。
在另一個(gè)實(shí)例中，泡囊保護(hù)相關(guān)的生物分子免受血液中的酶促降解，或不與血液成分產(chǎn)生相互作用，或不產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這些復(fù)合物中所用的酰胺類局部麻醉藥可能比酯類局部麻醉藥有更特別的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谘簝?nèi)不會(huì)降解。
在另一個(gè)實(shí)例中，泡囊被配制成乳膏、凍膠、洗液、油膏用于局部輸送藥物、DNA等到粘膜部位和通過皮膚。
表1小RNA病毒家族屬 鼻病毒(醫(yī)學(xué))導(dǎo)致大約50％普通感冒病例。
腸道病毒(醫(yī)學(xué))包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾可病毒、和人腸道病毒如甲型肝炎病毒。
Aptho病毒(獸醫(yī))這些是口蹄疫病病毒。靶抗原 VP1、VP2、VP3、VP4、VPGCalci病毒家族屬 病毒Norwalk組(醫(yī)學(xué))這些病毒是流行腸胃炎的重要的致病因子。披膜病毒家族屬 α病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))例子包括Sindbis病毒，RossRiver病毒和Eastern & Western馬腦炎R(shí)ubi病毒(醫(yī)學(xué))Rubella病毒黃病毒家族例子包括(醫(yī)學(xué))登革熱、黃熱病、日本腦炎、St.Louis腦炎和蜱攜帶腦炎病毒。丙型肝炎病毒(醫(yī)學(xué))這些病毒還未歸在一個(gè)家族內(nèi)，但是認(rèn)為是披膜病毒或黃病毒。大多數(shù)與披膜病毒家族相似。冠狀病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))感染性支氣管炎病毒(家禽)豬可傳播性腸胃炎病毒(豬)豬凝血性腦脊髓炎病毒(豬)貓感染性腹膜炎病毒(貓)貓腸道冠狀病毒(貓)犬冠狀病毒(狗)人呼吸道冠狀病毒引起大約40例普通感冒EX.224E，0C43注意-冠狀病毒可能會(huì)引起非甲、非乙型或丙型肝炎靶抗原 E1-也稱為M或基質(zhì)蛋白E2-也稱為S或刺突蛋白E3-也稱為HE或血凝素-elterose糖蛋白(不存在于全部冠狀病毒中)N-核衣殼棒狀病毒家族屬 水泡性病毒水泡口炎病毒狂犬病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))狂犬病靶抗原G蛋白N蛋白纖絲病毒家族(醫(yī)學(xué))出血熱病毒如馬爾堡和埃博拉病毒副粘病毒家族屬 1型副流感病毒3型副流感病毒牛3型副流感病毒Rubula病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))腮腺炎病毒，2型副流感病毒，4型副流感病毒，新城堡病病毒(小雞中重要的病原體)麻疹病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))麻疹，犬熱病肺病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))呼吸道合胞病毒正粘病毒家族(醫(yī)學(xué))流感病毒布尼亞病毒家族屬布尼亞病毒(醫(yī)學(xué))加利福尼亞腦炎，La Crosse白嶺熱病毒(醫(yī)學(xué))裂谷熱病毒漢坦病毒Puremala是hemahagin熱病毒納伊羅病毒(獸醫(yī))內(nèi)羅畢綿羊病還有許多未歸類的布尼亞病毒沙粒病毒家族(醫(yī)學(xué))LCM，拉沙熱病毒呼腸病毒家族屬呼腸病毒一種可能的人病原體輪狀病毒兒童的急性腸胃炎環(huán)狀病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))Culti病毒科羅拉多蜱熱病毒、Lebombo(人)馬器質(zhì)性腦病、藍(lán)舌頭逆轉(zhuǎn)錄病毒家族亞家族腫瘤病毒(獸醫(yī))(醫(yī)學(xué))貓白血病病毒、HTLVI和HTVLII慢病毒(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))HIV、貓免疫缺陷病毒、馬感染病毒、貧血病毒泡沫病毒乳多空病毒家族亞家族多瘤病毒(醫(yī)學(xué))BKU和JCU病毒亞家族乳頭瘤病毒(醫(yī)學(xué))許多病毒類型與癌癥或乳頭瘤惡性進(jìn)展有關(guān)腺病毒(醫(yī)學(xué))EX AD7，ARD.，O.B.-引起呼吸道疾病-一些腺病毒如275引起腸炎細(xì)小病毒家族(獸醫(yī))貓細(xì)小病毒引起貓腸炎貓瘟病毒犬細(xì)小病毒豬細(xì)小病毒皰疹病毒家族亞家族α皰疹病毒屬單純皰疹病毒(醫(yī)學(xué))HSVI，HSVII水痘病毒(醫(yī)學(xué)-獸醫(yī))假性狂犬病毒-水痘-帶狀皰疹病毒亞家族-β皰疹病毒屬巨細(xì)胞病毒(醫(yī)學(xué))HCMV鼠巨細(xì)胞病毒(muromegalovirus)亞家族γ皰疹病毒屬淋巴隱病毒(醫(yī)學(xué))EBV-(伯基特淋巴病毒)Rhadino病毒痘病毒家族亞家族脊索動(dòng)物痘病毒亞科(醫(yī)學(xué)-獸醫(yī))屬正痘病毒天花病毒牛痘病毒副痘病毒-獸醫(yī)Auipox病毒-獸醫(yī)山羊痘病毒野兔痘病毒豬痘病毒亞家族內(nèi)阿米巴痘病毒肝DNA病毒家族 乙型肝炎病毒未分類 δ肝炎病毒表2細(xì)菌病原體病原性革蘭陽性球菌包括肺炎球菌、葡萄球菌和鏈球菌。病原性革蘭陰性球菌包括腦膜炎球菌和淋球菌。
病原性腸革蘭陰性桿菌包括腸桿菌、假單胞菌、不動(dòng)細(xì)菌和eikenella、類鼻疽、沙門氏菌、志賀氏菌、嗜血桿菌、莫拉桿菌、軟下疳、布魯氏菌、土拉菌、耶爾森(巴斯德菌)、念珠狀鏈桿菌和螺菌、李斯特單細(xì)胞基因(monocytogene)、丹毒絲rhusiopathiae、白喉毒素、霍亂、炭疽、杜諾萬氏菌(性病性肉芽腫)和巴爾通氏體。
病原性厭氧菌包括破傷風(fēng)、肉毒中毒、其它梭菌、結(jié)核、麻風(fēng)和其它分枝桿菌。病原性螺旋體疾病包括梅毒、密螺旋體、雅司病、品他病和地方性梅毒、和鉤端螺旋體病。
由高等病原性細(xì)菌和病原性真菌引起的其它感染包括放線菌病、諾卡菌病、隱球菌病、酵母病、組織胞漿菌病和球孢子菌病、念珠菌病、曲霉病、和毛霉病、孢子絲菌病、副球孢子病、petriellidiosis、球擬酵母菌病、足分枝菌病和著絲芽生菌病、和皮膚真菌病。
立克次體感染包括立克次體和立克次體病。
支原體和衣原體感染的例子包括支原體肺炎、性病淋巴肉芽腫、鸚鵡熱和圍生期衣原體感染。
病原性真核細(xì)胞病原性原生動(dòng)物和蠕蟲及其感染包括阿米巴病、瘧疾、利什曼病、錐蟲病、弓形體病、肺囊蟲病(carinii)、巴倍蟲病、賈弟蟲病、旋毛蟲病、絲蟲病、血吸蟲病、線蟲病、吸蟲病、和絳蟲感染。
權(quán)利要求
1.一種組合物，該組合物包含層狀泡囊，該層狀泡囊包含局部麻醉藥和核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中局部麻醉藥與核酸之比為0.01-2.5％w/v的局部麻醉藥比1μg/ml-10mg/ml核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中局部麻醉藥與核酸之比為0.05-1.25％w/v的局部麻醉藥比100μg/ml-1mg/ml核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中局部麻醉藥與核酸之比為0.1-0.5％w/v的局部麻醉藥比500μg/ml-1500μg/ml核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述層狀泡囊的直徑為50-150nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中超過50％的所述層狀泡囊大于300nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中超過50％的所述層狀泡囊小于400nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述局部麻醉藥是布比卡因。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核酸是DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述核酸是質(zhì)粒DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述層狀泡囊還包含一種或多種選自陽離子型脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、陰離子型脂質(zhì)、陽離子型表面活性劑、中性表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽離子型洗滌劑、中性洗滌劑和陰離子型洗滌劑的化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述層狀泡囊還包含一種或多種選自蛋白質(zhì)、多肽、肽和非蛋白類化合物的化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述層狀泡囊還包含一種免疫原性蛋白或肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述層狀泡囊還包含一種有生物活性的蛋白，該蛋白選自細(xì)胞因子、共同刺激因子、轉(zhuǎn)錄因子、激素和生長(zhǎng)因子。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述層狀泡囊還包含一種非蛋白類的化合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核酸是DNA，DNA包含的DNA序列編碼了病原體抗原。
17.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述核酸是DNA，該DNA包含的DNA序列編碼病毒抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核酸是DNA，該DNA包含的DNA序列編碼過度增殖疾病相關(guān)蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述核酸是DNA，該DNA包含的DNA序列編碼過度增殖疾病相關(guān)蛋白，其中所述過度增殖疾病是癌。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核酸是DNA，該DNA包含的DNA序列編碼自身免疫疾病相關(guān)蛋白。
21.一種制備權(quán)利要求1所述的組合物的方法，該方法包括下列步驟在0-2M鹽存在下、pH4-8.5下混合0.01-2.5％w/v局部麻醉藥和1μg/ml-10mg/ml核酸，形成層狀泡囊。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中在0-500mM鹽存在下、pH6-7.5下混合0.05-1.25％w/v局部麻醉藥和100μg/ml-1mg/ml核酸，形成層狀泡囊。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中在0-500mM鹽存在下、pH6-7.5下混合0.1-0.5％w/v局部麻醉藥和500μg/ml-1500μg/ml核酸，形成層狀泡囊。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中在高于2M鹽存在下、pH6-7.5下混合0.1-0.5％w/v局部麻醉藥和500μg/ml-1500μg/ml核酸，然后除去鹽使其低于500mM，形成層狀泡囊。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中層狀泡囊還包含蛋白質(zhì)、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物，層狀泡囊這樣來形成在高于2M鹽存在下、pH6-7.5下混合0.1-0.5％w/v局部麻醉藥和500μg/ml-1500μg/ml核酸以及所述蛋白質(zhì)、多肽、肽或非蛋白類藥物/治療性化合物，然后除去鹽使其低于500mM。
26.一種將蛋白質(zhì)送給個(gè)體的細(xì)胞的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述組合物給予所述個(gè)體的步驟，其中所述層狀泡囊包含核酸分子，核酸分子含有編碼所述蛋白、與調(diào)控序列操作性相連的核苷酸序列，其中所述核酸分子被所述個(gè)體的細(xì)胞攝取，并表達(dá)產(chǎn)生所述蛋白。
27.一種將蛋白質(zhì)、多肽、肽和/或非蛋白類藥物/治療性化合物輸遞給個(gè)體細(xì)胞的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述組合物給予所述個(gè)體的步驟，其中所述層狀泡囊還包含所述蛋白質(zhì)、多肽、肽和/或非蛋白類化合物。
28.一種誘導(dǎo)個(gè)體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述組合物給予所述個(gè)體的步驟，其中所述層狀泡囊包含核酸分子，核酸分子含有編碼免疫原、與調(diào)控序列操作性相連的核苷酸序列，其中所述核酸分子被所述個(gè)體的細(xì)胞攝取，表達(dá)產(chǎn)生所述免疫原，并且所述個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)所述免疫原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述層狀泡囊還包含免疫原性蛋白或肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述層狀泡囊還包含有生理活性的蛋白。
31.一種向個(gè)體輸送核酸分子的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的組合物給予所述個(gè)體的步驟，其中所述層狀泡囊包含的核酸分子選自下列含有編碼所述蛋白的核苷酸序列與調(diào)控序列操作性相連的核酸分子、反義寡核苷酸、核酶和形成三聯(lián)體的核酸分子。
32.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1所述的組合物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物是可注射的藥物組合物。
全文摘要
公開了包含層狀泡囊的組合物,該層狀泡囊包含局部麻醉藥和核酸分子。公開了制備這種組合物的方法。公開了向個(gè)體的細(xì)胞遞送蛋白質(zhì)的方法。公開了在個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。公開了向個(gè)體的細(xì)胞遞送核酸分子的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1277549SQ98810484
公開日2000年12月20日 申請(qǐng)日期1998年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月30日
發(fā)明者R·B·西卡雷利, C·薩蒂什錢德拉, C·J·帕丘克 申請(qǐng)人:美國(guó)家庭用品有限公司