專利名稱：：適于制備治療炎癥和/或自身免疫性疾病的藥物組合物的6,7－取代的2－氨基－1,2,3,4...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及適于預(yù)防和治療膿毒性休克和炎癥和/或自身免疫性疾病的6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘及其藥用鹽，其更好的定義如下，其中炎性細(xì)胞因子的發(fā)病機(jī)理已被充分認(rèn)識。對膿毒性休克有治療活性的6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘是已知的。EP-A-0730861(將其引入作為參考)描述了-類6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘，特別是化合物(R，S)-2-氨基-6-氟-7-甲氧基-1，2，3，4-四氫化萘(ST626)。本發(fā)明使用的6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘也是已知的化合物，但是其治療應(yīng)用完全不同。實(shí)際上，在JChemSoc(1997)，288-93中描述了其具有支氣管擴(kuò)張活性；在Tetrahedronlet，22/38，3707-10，1981中將其描述為具有多巴胺能活性的化合物。顯然此氨基-1，2，3，4-四氫化萘的已知支氣管擴(kuò)張和多巴胺能活性與其在膿毒性休克及在炎癥和/或自身免疫性疾病中的治療活性沒有聯(lián)系，其后者中炎性細(xì)胞因子的發(fā)病機(jī)理已被充分認(rèn)識。用本發(fā)明描述的化合物治療的炎癥和/或自身免疫性疾病為，例如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、炎性腸道疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎及腦脊髓炎。下文中，只參照膿毒性休克，應(yīng)理解由炎性細(xì)胞因子所致的其它疾病也可按照本發(fā)明有效地治療。膿毒性休克是極其嚴(yán)重的臨床癥狀，感染可導(dǎo)致其發(fā)作，該感染主要由革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒引起，且其特征為白細(xì)胞增多、發(fā)燒、心動(dòng)過速、低血壓及腎、呼吸系統(tǒng)、心臟和肝功能不全。但是，應(yīng)強(qiáng)調(diào)膿毒性休克的嚴(yán)重性不依賴于引起綜合征的微生物類型(ParrilloJ.E.，Pathogeneticmechanismsofsepticshock，NEnglJMed，3281471-1477，1993)，而是與對造成毒性后果的抗原的個(gè)體炎癥反應(yīng)有關(guān)。盡管在過去幾年中抗生素治療和特護(hù)方案的介入顯著改進(jìn)，但是休克是住院患者發(fā)病率和死亡率的主要原因。估計(jì)美國其每年引起約100000例死亡(GlauserM.P.，ZanettiG.，BaumgartnerJ.D.和CohenJ.，SepticShockPathogenesis，Lancet，338732-736，1991)。膿毒性休克的首要決定因素和特征是機(jī)體對細(xì)胞溶解或微生物代謝產(chǎn)物的反應(yīng)。這些物質(zhì)中第一個(gè)被鑒定的且是在實(shí)驗(yàn)研究中最常使用的是脂多糖(LPS)，一種革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分，從化學(xué)角度講，存在隨細(xì)菌種類不同而改變的多糖部分以及不變的脂部分(脂A)，并以微膠粒的形式存在于敗血癥患者的血液中。如果給動(dòng)物使用LPS，可重現(xiàn)休克中發(fā)生的所有心血管循環(huán)和神經(jīng)癥狀(OlsonC.，SalzerW.L.，McCallC.E.，Biochemical，Physiologicalandclinicalaspectsofendotoxaemia，MolecAspectsMed，10511-629，1988)。因此，將其鑒定為級聯(lián)反應(yīng)的原動(dòng)力，其通過激活凝血級聯(lián)的內(nèi)在和外在途徑并分泌細(xì)胞因子導(dǎo)致臨床癥狀的產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子主要來源于巨噬細(xì)胞，例如，TNF、IL-1和IL-6。在過去的幾年中對此癥狀愈加重視，其嚴(yán)重性和現(xiàn)有的不適當(dāng)?shù)闹委熓侄未偈谷藗兗铀匍_發(fā)能有效抗此疾病惡化的治療劑，并將此作為迫在眉睫的目標(biāo)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，一類已知的6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘在預(yù)防和治療上述疾病中具有有效的活性。本發(fā)明的6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘可以是如下通式(I)的游離堿以及如下通式(II)的藥用鹽其中R是甲氧基或羥基，而X-是藥用酸的單價(jià)陰離子。在通式(I)或(II)的6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘中下列化合物是特別優(yōu)選的R＝甲氧基(R，S)-2-氨基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氫化萘鹽酸鹽(此后稱為ST1213)R＝OH(R，S)-2-氨基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫化萘鹽酸鹽(此后稱為ST1236)。式(I)6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘的藥用鹽指其與不產(chǎn)生不利的毒性或副作用的酸形成的任何鹽。這些酸是藥劑師和藥學(xué)劑藥物學(xué)技術(shù)人員熟知的。這些鹽的非限制性實(shí)例為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乳清酸鹽、酸式天門冬氨酸鹽、酸式枸櫞酸鹽、酸式磷酸鹽、富馬酸鹽及酸式富馬酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽和酸式馬來酸鹽、酸式草酸鹽、酸式硫酸鹽、葡萄糖磷酸鹽、酒石酸鹽和酸式酒石酸鹽。FDA允許的鹽列于IntJPharm33(1986)，201-217，將其引入作為參考。在預(yù)臨床研究中，為了評價(jià)物質(zhì)對膿毒性休克可能的保護(hù)作用，最廣泛使用的方法是用毒性物質(zhì)(外毒素或內(nèi)毒素)造成的中毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，該物質(zhì)直接給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射或用大量的感染細(xì)胞給動(dòng)物接種。以下給出與對照化合物(R，S)-2-氨基-6-氟-7-甲氧基-1，2，3，4-四氫化萘鹽酸鹽(ST626)比較，本發(fā)明(R，S)-2-氨基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氫化萘鹽酸鹽(ST1213)和(R，S)-2-氨基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫化萘鹽酸鹽(ST1236)的結(jié)果。如上所述，化合物ST626是已知的與本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)最相近的化合物，并還已知其具有相同的藥理活性。這些結(jié)果表明了與已知化合物ST626比較本發(fā)明化合物(ST1213和ST1236)的預(yù)防和治療活性，還提供了這些化合物的有利藥理特性的可能機(jī)理之一急劇降低炎性細(xì)胞因子(TNF、IL-1β、IL-6、IFN-γ)的血液濃度并降低血清一氧化氮(NOx)水平。在膿毒性休克動(dòng)物模型中ST1213和ST1236作用的評價(jià)使用約6周齡的雄性BALB/C小鼠(C.River)，每實(shí)驗(yàn)組10只動(dòng)物。將這些動(dòng)物置于常溫22±2℃和50±15％相對濕度下，光照12小時(shí)(早7點(diǎn)至晚7點(diǎn))，12小時(shí)黑暗(晚7點(diǎn)至早7點(diǎn))的籠中，不嚴(yán)格限制食物和飲用水。被測化合物為ST1213、ST1236和ST626(參考化合物)。如果需要，用0.1N氫氧化鈉校正化合物溶液的pH(維持溶液冷卻并攪拌)，使pH不低于5.5。用下列物質(zhì)LPS(大腸埃希氏桿菌血清型026B6)，批號73570JB(Difco)、LPS(傷寒沙門氏菌)，批號81H4018(Sigma)、SEB(金黃色葡萄球菌)，批號144H4024(Sigma)和D-半乳糖胺批號031EE002485(Merck)。大腸埃希氏桿菌和傷寒沙門氏菌引起的死亡用得自大腸埃希氏桿菌和傷寒沙門氏菌的LPS處理動(dòng)物。用內(nèi)毒素前，先將其溶解于滅菌鹽水中，然后腹膜內(nèi)(i.p.)注射，注射量為200μL，劑量為10.0-12.5mg/kg(大腸埃希氏桿菌)和23.0-27.0mg/kg(傷寒沙門氏菌)，大約相應(yīng)于LD80。在用LPS處理30分鐘前以及5分鐘后，或在內(nèi)毒素刺激5分鐘或30分鐘后，將被測化合物靜脈內(nèi)給藥(i.v.)，體積為200μL滅菌鹽水，相當(dāng)于相應(yīng)LD50的約1/10。D-半乳糖胺致敏小鼠被大腸埃希氏桿菌LPS引起的死亡用D-半乳糖胺(1000mg/kg，i.p.)將動(dòng)物致敏，同時(shí)用大腸埃希氏桿菌LPS(0.30mg/kg，i.p.)處理，總量為200μL。使用的LPS的劑量約相當(dāng)于被D-半乳糖胺致敏動(dòng)物的內(nèi)毒素LD80。在用LPS處理30分鐘前以及5分鐘后，或在內(nèi)毒素刺激5分鐘或30分鐘后，將被測化合物靜脈內(nèi)給藥(i.v.)，體積為200μL滅菌鹽水，相當(dāng)于相應(yīng)LD50的約1/10。D-半乳糖胺致敏小鼠被SEB(金黃色葡萄球菌)引起的死亡用D-半乳糖胺(1000-1500mg/kg，i.p.)將動(dòng)物致敏，同時(shí)用腸毒素SEB(3mg/kg，i.p.)處理，總量為200μL。使用的LPS的劑量約相當(dāng)于LD80并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定。在用SEB處理30分鐘前以及5分鐘后，或在內(nèi)毒素刺激5分鐘或30分鐘后，將被測化合物靜脈內(nèi)給藥(i.v.)，體積為200μL滅菌鹽水，相當(dāng)于相應(yīng)LD50的約1/10。在所有實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物被觀察10天，每天記錄死亡情況。用單尾Fisher′s精確檢驗(yàn)評價(jià)被測化合物保護(hù)作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)果大腸埃希氏桿菌LPS引起的死亡表1(A和B)報(bào)告了大腸埃希氏桿菌LPS休克實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭兴玫慕Y(jié)果。當(dāng)LPS刺激前30分鐘和后5分鐘給藥時(shí)，化合物ST1213顯著降低了LPS引起的死亡(p＜0.001)(表1A)。在刺激后處理方案中也得到了這種保護(hù)，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性較低(p＜0.05)(表1B)。表1靜脈使用ST1213對注射大腸埃希氏桿菌LPS誘發(fā)的死亡的保護(hù)作用。刺激前和后處理(-30和+5分鐘)(A)或只在刺激后處理(+5和+30分鐘)(B)。Aa＝與LPS對照相比被治療動(dòng)物存活率(％)的增加。b＝用單側(cè)Fisher′s精確檢驗(yàn)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Ba＝與LPS對照相比被治療動(dòng)物存活率(％)的增加。b＝用單側(cè)Fisher′s精確檢驗(yàn)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。由傷寒沙門氏菌LPS引起的死亡在傷寒沙門氏菌LPS內(nèi)毒素休克的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校?dāng)刺激前(p＜0.001)和后(p＜0.05)給藥時(shí)，化合物ST1213和ST1236顯著降低了死亡率(表2)。當(dāng)在第二刺激后治療方案中給藥時(shí)，ST1213保持了其保護(hù)效果，但是程度降低(表3)。表2ST1213和ST1236靜脈給藥對注射傷寒沙門氏菌LPS小鼠死亡的保護(hù)作用。刺激前和后治療(-30分鐘和+5分鐘)。a＝與LPS對照相比被治療動(dòng)物存活率(％)的增加。b＝用單側(cè)Fisher′s精確檢驗(yàn)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。表3ST1213靜脈注射對注射傷寒沙門氏菌LPS小鼠誘發(fā)死亡的保護(hù)作用。刺激后治療(+5分鐘和+30分鐘)。a＝與LPS對照相比被治療動(dòng)物存活率(％)的增加。b＝用單側(cè)Fisher′s精確檢驗(yàn)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在用D-半乳糖胺致敏的小鼠中大腸埃希氏桿菌LPS誘發(fā)的死亡用D-半乳糖胺致敏動(dòng)物，同時(shí)用大腸埃希氏桿菌處理。化合物ST1236顯著降低了死亡率(p＜0.001)(表4)。表4ST1236靜脈給藥對用D-半乳糖胺致敏小鼠中注射大腸埃希氏桿菌LPS誘發(fā)的死亡的保護(hù)作用。刺激前和后(-30和+5分鐘)。a＝與LPS+D-GalN對照相比被治療動(dòng)物存活率(％)的增加。b＝用單側(cè)Fisher′s精確檢驗(yàn)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在用D-半乳糖胺致敏的小鼠中由腸毒素SEB(金黃色葡萄球菌)誘發(fā)的死亡在用D-半乳糖胺致敏的小鼠中腸毒素SEB休克實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退媒Y(jié)果，見表5和6。當(dāng)刺激前30分鐘和后5分鐘，與對照組相比化合物ST1213和ST1236降低了死亡率(分別增加存活率46％和90％)(表5)。刺激后處理后保護(hù)作用仍存在，但是不能證實(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(表6)。表5ST1213和ST1236靜脈給藥對D-半乳糖胺致敏小鼠中由注射腸毒素SEB的LPS引起的死亡的保護(hù)作用。刺激前和刺激后治療(-30和+5分鐘)。</tables>a＝與LPS+D-GalN對照相比被治療動(dòng)物存活率(％)的增加。b＝用單側(cè)Fisher′s精確檢驗(yàn)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。表6ST1213和ST1236靜脈給藥對D-半乳糖胺致敏小鼠中由注射腸毒素SEB的LPS引起的死亡的保護(hù)作用。刺激后治療(+30和+5分鐘)。</tables>a＝與LPS對照相比被治療動(dòng)物存活率(％)的增加。b＝用單側(cè)Fisher′s精確檢驗(yàn)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。評價(jià)ST1213和ST1236對鼠全血培養(yǎng)物中LPS誘發(fā)的血清TNF(腫瘤壞死因子)水平的作用近幾年來，已經(jīng)使用LPS刺激的全血細(xì)胞培養(yǎng)物作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其雖然存在一定的局限性，來模擬內(nèi)毒素血癥的病生理狀況，該情況下革蘭氏陰性菌的脂多糖釋放到血流中，于是與免疫系統(tǒng)細(xì)胞接觸。實(shí)際上，此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥罱挥脕碓u價(jià)TNF和IL-1釋放的潛在抑制劑(GCRice等，Shock，4254-266，1994；AJHGearing等，Nature，370555-557，1994；KTschaikowsky，BiochimBiophysActa，1222113-121，1994；AHaziot等，JImmunol，1525868-5876，1994)。在此實(shí)驗(yàn)中，使用重175-200克的雄性Wistar鼠(C.River)。將這些動(dòng)物置于常溫22±2℃和50±15％相對濕度下，光照12小時(shí)(早7點(diǎn)至晚7點(diǎn))的籠中，不嚴(yán)格限制食物和飲用水。被測化合物是ST1213和ST1236。使用的內(nèi)毒素是得自傷寒沙門氏菌的LPS，批號81H4018(Sigma)。斷頭處死Wistar鼠，收集肝素抗凝的血樣(0.45ml/試管)。將溶解于滅菌鹽水中的體積為0.025ml(20×溶液)的被測化合物(最終濃度0.050mM)，加入到裝有血樣的試管中。向在37℃下在5％二氧化碳濕空氣中孵育1小時(shí)的上述試管中，加入得自傷寒沙門氏菌的LPS0.025ml(20×溶液)(最終LPS濃度＝1μg/ml)。將這些試管在相同的條件下孵育4小時(shí)，然后以10000rpm離心5分鐘，并將上清液在-80℃下保存以備TNF實(shí)驗(yàn)。在加了1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中測定TNF生物活性。在TNF檢測中，將含TNF(標(biāo)準(zhǔn)TNF，培養(yǎng)上清液，血清、生物流體等)的樣本(50μL)系列稀釋，并直接加入到96孔Primaria微量板中。在含1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中制備最終濃度為4μg/ml的放線菌素D-甘露醇(50μl)，將其加入到這些孔中。此抑制劑提高了細(xì)胞對TNF的敏感性。向每個(gè)孔中，加入100μlL929(對TNF毒性作用敏感的鼠纖維肉瘤)的標(biāo)準(zhǔn)化懸液，濃度為4×105/ml。還制備適當(dāng)?shù)膶φ占捶啪€菌素D對照(細(xì)胞+放線菌素但是沒有TNF)以及細(xì)胞對照(培養(yǎng)基中只存在細(xì)胞)。在37℃，5％二氧化碳?xì)夥障?，進(jìn)一步孵育18小時(shí)后，用新制備的1mg/mlXTT(3′-[1-[(苯基氨基)-羰基]-3，4-四唑]-雙)4-甲氧基-6-硝基)苯-磺酸鈉水合物)和125μMPMS(甲基硫酸吩嗪)的溶液染色，染色方法如下。PMS母液為100mM(在+4℃黑暗中穩(wěn)定約20天)，并通過將PMS溶解于PBS制備，然后通過簡單的聲波處理使PMS徹底溶解。然后，在XTT中將100mM的PMS溶液1∶800稀釋，這樣在1mg/mlXTT中PMS濃度就為125μM。XTT-PMS染色混合物使用前必須過濾。完成18小時(shí)孵育后，向每個(gè)孔中加入50μL的XTT-PMS染色溶液，于是最終體積為250μL，其中XTT和PMS的最終濃度分別為0.2mg/ml和25μM。還制備了“空白”孔，其中含200μL培養(yǎng)基+50μL的XTT-PMS染色溶液。將微量板在37℃，5％二氧化碳下孵育2-2.5小時(shí)(總孵育時(shí)間＝約20小時(shí))。用微量板讀數(shù)器在450nm波長和620參考波長檢測每個(gè)樣本的吸收值(比色微量板讀數(shù)器從樣本值中自動(dòng)扣除“空白”吸收值)。TNF滴度計(jì)算如下。按照定義，由放線菌素-D吸收值的半最大值(＝50％)給出生物活性的1個(gè)單位。樣本稀釋給出了吸收值曲線，其直線部分由方程y＝ax+b描述。插入a和b值后(由計(jì)算機(jī)線性回歸分析得到)并用放線菌素-D對照的半最大吸收值(相應(yīng)于一個(gè)生物單位)代替y后，就從此方程中解出x，x代表了樣本稀釋度的倒數(shù)。所得此值給出了以U/ml表示的TNF滴度。用雙側(cè)Student’st檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果由此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫降牟?bào)告于表7的結(jié)果，表明被測化合物不同程度地降低了LPS刺激血液培養(yǎng)物的TNF產(chǎn)生。事實(shí)上，化合物ST1236和ST1213將TNF水平分別降低了59％和31％。表7化合物ST1213和ST1236對由傷寒沙門氏菌LPS(1μg/ml)刺激鼠血液培養(yǎng)物(n0＝5)誘發(fā)TNF產(chǎn)生的作用。這些化合物的實(shí)驗(yàn)濃度是50μM。實(shí)驗(yàn)條件描述于“材料和方法”中<p>大腸埃希氏桿菌和傷寒沙門氏菌引起的死亡完全按照上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。D-半乳糖胺致敏小鼠被大腸埃希氏桿菌LPS引起的死亡實(shí)驗(yàn)條件完全如上所述。在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在刺激90分鐘后采集血樣(TNF血清峰濃度)。將乙醚麻醉的小鼠通過后眼眶竇穿刺放血。將血樣在室溫下孵育2小時(shí)并將所得血清在3000rpm離心20分鐘，并在-80℃下保存以備TNF實(shí)驗(yàn)。在含1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中檢測TNF生物活性。將連續(xù)稀釋的含TNF樣本50ul/孔加入到Primaria微量板中。使用與上述相同的實(shí)驗(yàn)條件。數(shù)據(jù)用單側(cè)Student’st檢驗(yàn)分析。結(jié)果大腸埃希氏桿菌和傷寒沙門氏菌LPS引起的死亡這些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退媒Y(jié)果表明化合物ST1213顯著降低大腸埃希氏桿菌誘發(fā)的TNF水平(p＜0.01)(表8)并在傷寒沙門氏菌LPS實(shí)驗(yàn)中實(shí)質(zhì)性降低了血清TNF水平(p＜0.0001)(表9)。表8在小鼠大腸埃希氏桿菌膿毒性休克模型中ST1213給藥(6mg/kg，i.v.)對血清TNF水平的作用。刺激前和后治療(-30和+5分鐘)。表9在小鼠傷寒沙門氏菌膿毒性休克模型中ST1213給藥(6mg/kg，i.v.)對血清TNF水平的作用。刺激前和后治療(-30和+5分鐘)。D-半乳糖胺致敏小鼠中由大腸埃希氏桿菌LPS誘發(fā)的死亡D-半乳糖胺致敏小鼠中由大腸埃希氏桿菌LPS誘發(fā)TNF產(chǎn)生的此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退媒Y(jié)果報(bào)告于表10。化合物ST1236顯著降低了D-半乳糖胺致敏小鼠中LPS誘發(fā)的TNF釋放(p＜0.0001)。表10ST1236給藥(19mg/kg，i.v.)對D-半乳糖胺致敏小鼠中大腸埃希氏桿菌LPS誘發(fā)的血清TNF水平的作用。刺激前和后治療(-30和+5分鐘)。評價(jià)ST1213對大腸埃希氏桿菌或SEB腸毒素誘發(fā)的鼠血清介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和干擾素-γ水平的作用使用約6周齡的雄性BALB/C小鼠(C.River)，每實(shí)驗(yàn)組10只動(dòng)物。將這些動(dòng)物置于常溫22+2℃和50+15％相對濕度下，光照12小時(shí)(早7點(diǎn)至晚7點(diǎn))，12小時(shí)黑暗(晚7點(diǎn)至早7點(diǎn))的籠中，不嚴(yán)格限制食物和飲用水。被測化合物是ST1213。用下列物質(zhì)LPS(大腸埃希氏桿菌血清型026B6)，批號73570JB(Difco)、LPS(傷寒沙門氏菌)，批號81H4018(Sigma)、SEB(金黃色葡萄球菌)，批號144H4024(Sigma)和D-半乳糖胺批號031EE002485(Merck)。大腸埃希氏桿菌LPS引起的死亡完全按照上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。D-半乳糖胺致敏小鼠被金黃色葡萄球菌的SEB引起的死亡實(shí)驗(yàn)條件完全如上所述。在這兩個(gè)模型中，采集血樣的時(shí)間IL-6為刺激后2小時(shí)、IL-1β為刺激后4小時(shí)及IFN-γ為刺激后6小時(shí)。將乙醚麻醉的小鼠通過后眼眶竇穿刺放血。將血樣在室溫下孵育2小時(shí)并將所得血清在3000rpm離心20分鐘，并在-80℃下保存至檢測。按照所用檢測試劑盒中說明的方法進(jìn)行生物檢測。具體地講，用如下物質(zhì)—小鼠IL-1β免疫檢測(MLB00，R&amp;D系統(tǒng))—小鼠IL-6EIA試劑盒(8-6706，PerSeptiveDiagnostics)—小鼠IFN-γEIA試劑盒(8-6716，PerSeptiveDiagnostics)。數(shù)據(jù)用單側(cè)Student’st檢驗(yàn)分析。結(jié)果由大腸埃希氏桿菌LPS誘發(fā)的死亡此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫降慕Y(jié)果報(bào)告于表11?；衔颯T1213顯著降低(p＜0.0001)IFN-γ的產(chǎn)生，但是不降低其它被分析的兩種細(xì)胞因子的水平。表11ST1213給藥(6mg/kg，i.v.)對用大腸埃希氏桿菌LPS刺激小鼠IL-1β、IL-6和IFN-γ血清水平的作用。刺激前和后給藥(-30和+5分鐘)。D-半乳糖胺致敏的小鼠中金黃色葡萄球菌SEB引起的死亡此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕Y(jié)果見表12。化合物ST1213顯著降低了血清IL-1β和IL-6水平，而不降低血清IFN-γ水平。表12ST1213給藥(6mg/kg，i.v.)對用金黃色葡萄球菌SEB刺激小鼠IL-1β、IL-6和IFN-γ血清水平的作用。刺激前和后給藥(-30和+5分鐘)。評價(jià)ST1213對大腸埃希氏桿菌LPS引起小鼠血清一氧化氮(NOx)的作用使用約6-7周齡的雄性BALB/C小鼠(C.River)，每實(shí)驗(yàn)組6-9只動(dòng)物。將這些動(dòng)物置于常溫22±2℃和50±15％相對濕度下，光照12小時(shí)(早7點(diǎn)至晚7點(diǎn))，12小時(shí)黑暗(晚7點(diǎn)至早7點(diǎn))的籠子中，不嚴(yán)格限制食物和飲用水。被測化合物為ST1213。使用的外毒素為得自大腸埃希氏桿菌O26B6的LPS，批號73570，Difco，先將其溶解于滅菌鹽水中，以5mg/kg腹膜內(nèi)注射?；衔颯T1213和ST626(參考化合物)以6mg/kg靜脈內(nèi)給藥，相應(yīng)于LD50的約1/10，LPS刺激后+5分鐘和+30分鐘。當(dāng)小鼠體內(nèi)NOx達(dá)到其血清峰值時(shí)，將乙醚麻醉的小鼠通過后眼眶竇穿刺放血，LPS刺激后20小時(shí)采集血樣。將血放入肝素抗凝的試管中，以2200rpm離心10分鐘，并在-80℃下保存以備NOx檢測。實(shí)驗(yàn)前，用蒸餾水將樣本作1∶3稀釋，然后以4700g在Ultrafree-MC，10000NMWLMillipore過濾器上離心90分鐘(Cat.No.UFC3LGC00)。對Nox的樣本檢測用最近面市的檢測試劑盒進(jìn)行，該試劑盒由Cabru制備(硝酸鹽/亞硝酸鹽檢測試劑盒，Cat.No.780001)。用雙側(cè)Student’st檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果由此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫降慕Y(jié)果報(bào)告于表13。當(dāng)刺激后給藥后，化合物ST1213顯著降低了BALA/c小鼠中大腸埃希氏桿菌LPS引起的NOx水平(降低42％)。在同一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑓⒖蓟衔颯T626不顯著降低NOx血清水平(降低21％)。表13ST1213給藥(6mg/kg，i.v.)的作用。腹膜內(nèi)LPS刺激(5mg/kg)后5和30分鐘后治療。a＝與對照組相比被處理動(dòng)物NOx水平的降低。b＝用雙側(cè)Student’st檢驗(yàn)評價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。權(quán)利要求1.通式(I)的6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘或通式(II)的其藥用鹽其中R是甲氧基或羥基，而X-是藥用酸的單價(jià)陰離子，在制備治療炎性細(xì)胞因子引起的炎癥和/或自身免疫性疾病的藥物組合物中的用途。2.權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物組合物適于預(yù)防和治療膿毒性休克。3.權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物組合物適于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、炎性腸疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎和腦脊髓炎。4.權(quán)利要求1-3的用途，其中藥用酸的單價(jià)陰離子選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乳清酸鹽、酸式天門冬氨酸鹽、酸式枸櫞酸鹽、酸式硫酸鹽、富馬酸鹽及酸式富馬酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽和酸式馬來酸鹽、酸式草酸鹽、酸式磷酸鹽、葡萄糖磷酸鹽、酒石酸鹽和酸式酒石酸鹽。5.權(quán)利要求1-3的用途，其中6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘是(R，S)-2-氨基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氫化萘鹽酸鹽。6.權(quán)利要求1-3的用途，其中6，7-取代的2-氨基-1，2，3，4-四氫化萘是(R，S)-2-氨基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫化萘鹽酸鹽。全文摘要公開了6,7－取代的2－氨基－1,2,3,4－四氫化萘在制備治療炎性細(xì)胞因子引起的炎癥和/或自身免疫性疾病的藥物組合物中的用途。文檔編號A61P1/00GK1276721SQ98810460公開日2000年12月13日申請日期1998年9月18日優(yōu)先權(quán)日1997年9月22日發(fā)明者P·福雷斯塔,V·路吉羅申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司