專利名稱：一類具有治療胃腸炎疾病的新型補(bǔ)身烷類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一類新補(bǔ)身烷類化合物及其在治療 腸胃炎方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸胃炎又稱腸胃感冒，是消化系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，一般認(rèn)為是胃粘膜和腸粘 膜發(fā)炎引起的，常常表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉，帶有腹部陣痛性痙攣及絞痛，伴有發(fā)燒、出汗等癥 狀。隨著年齡的增長，發(fā)病率不斷地增加?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為是由于進(jìn)食微生物感染的食物導(dǎo) 致，多通過使用抗生素(例如諾氟沙星)來調(diào)節(jié)胃腸道失衡的菌群來達(dá)到治療的目的；中醫(yī) 理論則認(rèn)為是由于人體感受風(fēng)、寒、暑、濕之邪，以及穢濁之氣，侵犯脾胃，使胃腸功能障礙 所致，其本質(zhì)為清濁之分，升降失常，癥狀為氣機(jī)阻滯，傳化失常，為痛為瀉，胃失和降，氣機(jī) 上逆，為惡為吐，在治療方面以調(diào)節(jié)脾胃目的，通過顧護(hù)胃氣、調(diào)節(jié)升降、調(diào)節(jié)陰陽、注重平 衡等四個方面達(dá)到治療的目的，如使用黎藥復(fù)方-腸胃康等。黎藥復(fù)方-腸胃康顆粒是國家保護(hù)中藥品種(保護(hù)品種號ZYB2072004057)，由牛 耳楓和辣蓼兩味藥組成，清熱除濕化滯，用于急性胃腸炎，屬傷食泄瀉型及濕熱泄瀉型者， 證見腹痛腹?jié)M、泄瀉臭穢、惡心嘔腐或有發(fā)熱惡寒苔黃脈數(shù)等。該復(fù)方的臨床效果較好，但是其中的活性成分并不知曉。因此在制藥領(lǐng)域中需要 知道該復(fù)方中的活性成分，從而對腸胃炎的治療研究產(chǎn)生積極的推動作用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量研究。在前期的研究中證實(shí)該復(fù)方中的總 黃酮類成分為其活性成分之一。通過深入研究，從該復(fù)方中分離得到了一組補(bǔ)身烷類化合物，其中兩個為新化合 物。這類補(bǔ)身烷化合物屬于倍半萜類，具有多種藥理活性。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了新的補(bǔ)身烷類化合物，所述化合物具有治療 腸胃炎的作用。本發(fā)明的補(bǔ)身烷類化合物為具有如下結(jié)構(gòu) 本發(fā)明的補(bǔ)身烷類化合物屬于倍半萜類化合物，具有多種藥理活性，其中的抗炎 活性是我們關(guān)注的焦點(diǎn)，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對其藥理活性尤其是胃腸炎相關(guān)的活性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的化合物具有抗炎和解痙的作用，對腸胃炎具有確切的療效。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種制備本發(fā)明化合物的方法，所述方法包括如下步驟(1)沸水提取粉碎后的牛耳楓和辣蓼的混合物；(2)濃縮提取液，得到浸膏；(3)將步驟(2)中所得的浸膏懸浮于水中，用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷萃取 物；(4)濃縮步驟(3)中所得的二氯甲烷萃取物并上樣至硅膠色譜柱上，用石油醚 乙酸乙酯的體積比為100 0至0 100的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，按照所使用的不同梯 度的洗脫液收集流份；(5)將步驟(4)中使用石油醚乙酸乙酯體積比為60 40的混合溶劑洗脫下來 的流份上樣至硅膠色譜柱上，用石油醚丙酮為4 1 (ν/ν)的混合溶劑進(jìn)行洗脫，對所得 的流份進(jìn)行重結(jié)晶純化，得到純化的化合物1 ；(6)將步驟(4)中使用石油醚乙酸乙酯體積比為80 20的混合溶劑洗脫下來 的流份上樣至硅膠色譜柱上，用正己烷丙酮的體積比為90 10至60 40的混合溶劑 進(jìn)行梯度洗脫，按照所使用的不同梯度的洗脫液收集流份；(7)將步驟(6)中使用正己烷丙酮體積比為80 20的混合溶劑洗脫下來的流 份上樣至凝膠色譜柱上，用氯仿甲醇的體積比為1 1的混合溶劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫體 積為56-64ml之間的流份，濃縮得到化合物2。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，其中上述步驟(4)中所使用的混合溶劑中石油醚 乙酸乙酯的體積比例依次為100 0、98 2、95 5、90 10,85 15,80 20,70 30、 60 40,50 50和0 100。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方案，其中上述步驟(6)中所 使用的混合溶劑中正己烷丙酮的體積比例依次為90 10,85 15,80 20,70 30和 60 40。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述方法還包括使用薄層色譜和/或高效液相色譜 檢驗(yàn)所得的各化合物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，其中上述步驟(4)中所述的硅膠色譜柱為粒徑 50-74 μ m的硅膠色譜柱。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方案，其中所述步驟(5)和(6)中 所述的硅膠色譜柱為粒徑10-40 μ m的硅膠色譜柱。根據(jù)本發(fā)明的又另一個具體實(shí)施方案，其中上述步驟(7)中所述的凝膠色譜柱為 Sephadex LH-20柱。根據(jù)本發(fā)明的其他具體實(shí)施方案，其中上所述步驟(5)中所述的重結(jié) 晶過程中使用的溶劑為甲醇。本發(fā)明還提供了一種用于治療腸胃炎的藥物組合物，所述組合物含有至少一種本 發(fā)明的化合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明化合物用于制備治療腸胃炎的藥物的用途。根據(jù)本發(fā)明的具 體實(shí)施方案，所述腸胃炎可為慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、急慢性腸炎或者結(jié)腸炎等等。


圖1為制備本發(fā)明化合物的方法的示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.本發(fā)明的化合物的制備制備本發(fā)明的化合物的步驟示于圖1。取牛耳楓10_14kg，辣蓼5_7Kg，粉碎后用水煎3_10次，每次用5倍體積的水煎 1-6小時(共使用15-50倍體積的水)。將提取液合并，過濾，減壓蒸干水分，得到浸膏(約 IOOOg)。將浸膏懸浮于100000ml蒸餾水中，用二氯甲烷萃取(2500ml X 5_10次)。將所得 萃取液合并濃縮，得到二氯甲烷萃取物(50ml)。取二氯甲烷萃取物(40ml)，上樣至硅膠色 譜柱上(青島海洋化工有限公司柱層析硅膠，粒徑50-74 μ m)。使用不同梯度的石油醚-乙 酸乙酯混合溶劑(石油醚乙酸乙酯=100 0-0 100, ν/ν)進(jìn)行洗脫，流速為6-10ml/ min。每種梯度的混合溶劑用量為20000ml，按照所用不同梯度的洗脫液收集流份。每種梯 度的洗脫液的配比以及所得流份的命名如下所示 將其中的Fr. 8流份經(jīng)過薄層色譜硅膠(青島海洋化工有限公司薄層色譜硅膠，粒 徑10-40 μ m)填裝的柱色譜進(jìn)行分離.使用不同梯度的石油醚-丙酮混合溶劑(石油醚 丙酮=4 1或1 1，ν/ν)進(jìn)行洗脫，流速為3-5ml/min。每種梯度的混合溶劑用量為 2000ml，按照所用不同梯度的洗脫液收集細(xì)分流份。每種梯度的洗脫液的配比以及所得細(xì)
分流份的命名如下所示 其中在subFr. a流份中析出無色片狀晶體，溶解于甲醇，溶劑揮發(fā)后重新析出結(jié) 晶，除去剩余的部分母液，反復(fù)以上重結(jié)晶操作后得到化合物1，經(jīng)薄層色譜檢識(10%硫 酸乙醇顯色劑顯色)，在多種展開條件(石油醚-丙酮，氯仿-丙酮，氯仿-甲醇)下展開后 為單一斑點(diǎn)，經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)檢識化合物1的純度達(dá)到95%以上。將上述的Fr. 6流份經(jīng)過薄層色譜硅膠(青島海洋化工有限公司薄層色譜硅膠， 粒徑10-40 μ m)填裝的柱色譜分離。使用不同梯度的正己烷-丙酮混合溶劑(正己烷 丙酮=90 10-60 40，v/v)進(jìn)行洗脫，流速為3-5ml/min。每種梯度的混合溶劑用量為 2000ml，按照所用不同梯度的洗脫液收集細(xì)分流份。每種梯度的洗脫液的配比以及所得細(xì) 分流份的命名如下表所示 將其中的subFr. III部分上樣至S印hadex LH-20凝膠柱色譜上，用氯仿-甲醇 (1 1)洗脫，流速為l-2ml/min，收集洗脫液，每瓶8ml，其中將按序洗脫的第8個接受瓶中 的洗脫液濃縮后得到化合物2的片狀結(jié)晶。同樣，經(jīng)薄層色譜檢識(10%硫酸乙醇溶液顯 色)，在多種展開條件下(石油醚_丙酮，氯仿_丙酮等)化合物2為單一斑點(diǎn)，經(jīng)HPLC檢 識其純度達(dá)到95%以上。實(shí)施例2.本發(fā)明化合物的表征經(jīng)過測試化合物1和2的理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)確定了其結(jié)構(gòu)?；衔?和2的波譜數(shù)據(jù)見表1。表1.化合物1和2的波譜數(shù)據(jù)a a. 1H-WR 測試條件為 600MHz，d6_DMS0 ； 13C-WR 測試條件為 I25MHz，d6_DMS0化合物1和2的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2 ；表2.化合物1和2的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù) 實(shí)施例3.本發(fā)明化合物對一氧化氮合酶活性的抑制大量研究表明，通過抑制一氧化氮合酶可以治療炎癥。本實(shí)施例通過體外酶活性 測試，對本發(fā)明的兩個化合物抑制一氧化氮合酶的活性進(jìn)行評價。1.實(shí)驗(yàn)材料將化合物1和2用蒸餾水配制為一定濃度的溶液，iNOS (重組酶，Cayman Chemical 公司)，BH4( 二鹽酸鹽)，iNOS試劑盒(Cayman Chemical公司)。2.實(shí)驗(yàn)儀器電熱恒溫水浴箱，分析天平，TU21800紫外可見光分光光度計(jì)。3.實(shí)驗(yàn)方法在試管中加入氨基苯磺酸、磷酸鹽緩沖溶液、N-(l-萘基)-乙二胺和iNOS樣品， 不加入BH4和受試藥物，反應(yīng)后測得空白管吸光度；另取數(shù)個試管，各試管中分別加入氨基 苯磺酸、磷酸鹽緩沖溶液、N-(l-萘基)-乙二胺、iNOS樣品和不同濃度的BH4,不加入受試藥物，反應(yīng)后測定各管吸光度，計(jì)算出iNOS活性達(dá)到最大時所需BH4最小有效濃度，此濃度 下所測得的吸光度為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度。在試管中加入3種試劑、iNOS樣品、BH4和化合物1或 2，反應(yīng)后所測得的吸光度為測定管吸光度，按公式抑制率(％ )=(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-測定管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光 度)X 100%計(jì)算出化合物1或2在指定濃度下對iNOS活性的抑制百分率。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，化合物1和2抑制具有顯著一氧化氮合酶的活性，其中化合物2呈現(xiàn)明 顯的量效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3 表3.化合物1和化合物2對一氧化氮合酶活性的抑制 實(shí)施例4.用二甲苯誘導(dǎo)的炎癥模型評估本發(fā)明化合物的抗炎活性通過選擇化合物1和2對二甲苯誘導(dǎo)的炎癥模型的改善作用，對以上化合物抗炎 活性進(jìn)行評價。1.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)施例1中獲得的化合物1和2，小鼠，昆明種，一級，體重18_22g，雌雄各半。 FINNPIPETTE可調(diào)式移液器(量程20-200 μ 1)，熱電(上海)儀器有限公司；BS200S電子 天平(感量0. OOlg)，德國Sartorius公司二甲苯(分析純)。2.實(shí)驗(yàn)方法(1)給藥劑量設(shè)計(jì)化合物1和2制成0. 3mg/ml (低劑量)、0· 6mg/ml (中劑量)、 1. 2mg/ml (高劑量)的藥液，按0. 4ml/只的劑量灌胃給藥。(2)分組及給藥將小鼠按性別、體重隨機(jī)分成8組，每組10只，其中陰性對照組 (蒸餾水)、陽性對照組(醋酸地塞米松，劑量0. 2mg/只)各1組，化合物1和化合物2按 高、中、低劑量各3組。動物按0.4ml/只的劑量灌胃給藥，1日1次，連續(xù)3天。(3)小鼠耳廓致炎實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥Ih后，用微量移液器吸取二甲苯20 μ 1均勻涂 布于小鼠右耳廓引起炎癥。致炎1小時后處死小鼠，同時剪下左右兩側(cè)耳廓，用直徑8mm的 打孔器分別在左右兩耳廓的相同部位打下圓形耳片，精密稱取兩耳片重量。以右耳片重量 減去左耳片重量的差值(mg)作為炎癥腫脹度。按照下述公式計(jì)算炎癥抑制率抑制率(％) =[(空白組腫脹度-給藥組腫脹度)/空白組腫脹度]X 100 %(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，采用DPS 3. 1統(tǒng)計(jì)分析軟件處 理，組間比較用Durmett T檢驗(yàn)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明化合物1和2在給藥量為0. 6和1. 2mg/ml時均對二甲苯致炎的模型具有顯著的抑制作用，且均呈劑量依賴關(guān)系(見表4)表4.化合物1和化合物2對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 注各給藥組與陰性對照組比較，*為P < 0. 05，#為P < 0. 01實(shí)施例5.本發(fā)明化合物的解痙作用的評估本實(shí)施例中通過選擇化合物1和2對小鼠腸推進(jìn)作用的影響，對以上化合物的解 痙作用進(jìn)行評價。1.實(shí)驗(yàn)材料硫酸阿托品片，規(guī)格0. 3mg/片，批號060204，用蒸餾水制成0. 015mg/ml藥液，備用。羧甲基纖維素鈉、藥用淀粉、注射用活性炭。營養(yǎng)性半固體糊的制備取IOg羧甲 基纖維素鈉，溶于250ml蒸餾水中，分別加入16g奶粉、8g糖、8g淀粉和2g活性炭末，攪拌 均勻，配制成300ml約300g的黑色半固體糊狀物。冰箱冷藏，用時恢復(fù)至室溫。小鼠，昆明種，一級，體重18_22g，雌雄各半。
實(shí)施例1中獲得的化合物1和2。
2.實(shí)驗(yàn)方法(1)給藥劑量設(shè)計(jì)化合物1和2制成0. 3mg/ml (低劑量)、0· 6mg/ml (中劑量)、 1. 2mg/ml (高劑量)的藥液，按0. 4ml/只的劑量灌胃給藥。(2)分組及給藥將小鼠按性別、體重分層隨機(jī)分成9組，每組10只，其中陰性對 照組(蒸餾水)、陽性對照組(硫酸阿托品，劑量0. 3mg/只)各1組，化合物1號和 化合物 2均為高、中、低劑量各3組。動物按0.4ml/只的劑量灌胃給藥，1日1次，連續(xù)3天。(3)小鼠腸推進(jìn)測定末次給藥Ih后，小鼠灌胃給予營養(yǎng)性半固體糊0. 8ml/只， 20min后脫頸椎處死小鼠，開腹，迅速取出小腸，輕輕剝離后直鋪于白紙上，測量幽門至回盲 腸部全長及幽門至黑色半固體糊前沿的距離，以幽門至黑色半固體糊前沿的距離占幽門至 回盲部全長的百分率為小腸推進(jìn)率，并計(jì)算抑制率。抑制率(％)=[(陰性組推進(jìn)率-給藥組推進(jìn)率)/陰性組推進(jìn)率]X100%(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，采用DPS 3. 1統(tǒng)計(jì)分析軟件處 理，組間比較用Durmett T檢驗(yàn)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物1和2的高劑量組具有抑制小腸推進(jìn)的作用，說明在給濃度為1. 2mg/ml時 兩個化合物均具有解痙的作用(見表5)。表5.化合物1和2對小鼠體內(nèi)腸推進(jìn)的影響 注各給藥組與陰性對照組比較，*為P < 0. 05，#為P < 0. 01。從本發(fā)明的各實(shí)施例的結(jié)果可以看出，本發(fā)明中的化合物具有抗炎和解痙的作 用，對腸胃炎具有確切的療效。
權(quán)利要求
具有下式結(jié)構(gòu)的化合物FSA00000018646400011.tif
2.一種制備權(quán)利要求1的化合物的方法，包括下述步驟(1)沸水提取粉碎后的牛耳楓和辣蓼的混合物；(2)濃縮提取液，得到浸膏；(3)將步驟(2)中所得的浸膏懸浮于水中，用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷萃取物；(4)濃縮步驟(3)中所得的二氯甲烷萃取物并上樣至硅膠色譜柱上，用石油醚乙酸 乙酯的體積比為100 0至0 100的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，按照所使用的不同梯度的 洗脫液收集流份；(5)將步驟(4)中使用石油醚乙酸乙酯體積比為60 40的混合溶劑洗脫下來的流 份上樣至硅膠色譜柱上，用石油醚丙酮為4 l(v/v)的混合溶劑進(jìn)行洗脫，對所得的流 份進(jìn)行重結(jié)晶純化，得到純化的化合物1 ；(6)將步驟(4)中使用石油醚乙酸乙酯體積比為80 20的混合溶劑洗脫下來的流 份上樣至硅膠色譜柱上，用正己烷丙酮的體積比為90 10至60 40的混合溶劑進(jìn)行 梯度洗脫，按照所使用的不同梯度的洗脫液收集流份；(7)將步驟(6)中使用正己烷丙酮體積比為80 20的混合溶劑洗脫下來的流份上 樣至凝膠色譜柱上，用氯仿甲醇的體積比為1 1的混合溶劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫體積為 56-64ml之間的流份，濃縮得到化合物2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟(4)中所使用的混合溶劑中石油醚乙酸 乙酯的體積比例依次為100 0、98 2、95 5、90 10,85 15,80 20,70 30、 60 40,50 50和0 100 ；和/或其中所述步驟(6)中所使用的混合溶劑中正己烷丙 酮的體積比例依次為90 10,85 15,80 20,70 30和60 40。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，還包括使用薄層色譜和/或高效液相色譜檢驗(yàn)所得的各化 合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟(4)中所述的硅膠色譜柱為粒徑50-74ym的 硅膠色譜柱；和/或其中所述步驟(5)和(6)中所述的硅膠色譜柱為粒徑10-40 u m的硅膠 色譜柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟(7)中所述的凝膠色譜柱為S印hadexLH-20柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟(5)中所述的重結(jié)晶過程中使用的溶劑為甲
8.一種用于治療腸胃炎的組合物，含有至少一種權(quán)利要求1的化合物。
9.權(quán)利要求1的化合物用于制備治療腸胃炎的藥物的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述腸胃炎為慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、急 慢性腸炎或結(jié)腸炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有下述結(jié)構(gòu)式的新補(bǔ)身烷類倍半萜化合物體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述化合物具有治療腸胃炎疾病的效果。本發(fā)明的化合物制備成藥物制劑，可用于治療慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、急慢性腸炎或者結(jié)腸炎等。
文檔編號C07C62/36GK101870647SQ20101011273
公開日2010年10月27日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者劉明生, 康勝利, 張俊清, 張小坡, 盛琳, 符乃光, 羅海燕 申請人:海南醫(yī)學(xué)院