專利名稱：診斷和預防萊姆病用的組合物的表面抗原和蛋白質(zhì)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總地涉及用于診斷、治療和預防萊姆疏螺旋體病(Lyme borreliosis)的藥物和診斷組合物領域。更具體地說，本發(fā)明提供了用于診斷、治療或預防萊姆病的分離的疏螺旋體天然表面抗原及其抗體。
背景技術：
Borrelia burgdorferi(廣義)是一個類屬術語，它包括幾個與萊姆疏螺旋體病(萊姆病)有關且認為是主要病因的疏螺旋體種屬B.burgdorferi(狹義的)、B.garinii、和B.afezlii。該疾病通過攜帶螺旋體的各種硬蜱屬(Ixodes)蜱的叮咬而傳播。在美國，感染的主要宿主是白腿小鼠(Peromyscus leucopus)，感染可傳播給許多哺乳動物，包括狗、貓和人[J.G.Donahue等人，Am.J.Trop.Med.Hyg.，3692-96(1987)；R.T.Green等人，J.Clin.Micro.，26648-654(1988)]。盡管患者體內(nèi)存在主動性免疫應答，但是該疾病仍在患者體內(nèi)持續(xù)多年。推測這種持續(xù)存在(至少部分)是細菌蛋白抗原性變異的結(jié)果[J.R.Zhang等人，Cell，89275-285(1997)]。
由于缺少能迅速準確測試的權威性血清學方法，診斷人和動物體內(nèi)萊姆病存在困難。目前的診斷試驗的缺點是靈敏度和特異性低，正如威斯康星州衛(wèi)生實驗室最近公布的實驗室診斷調(diào)查中所描述的那樣[L.Bakken等人，J.Clin.Microbiol.35537(1997)]。本領域需要早期檢測萊姆病的簡單、靈敏和特異的診斷組合物和方法。
關于Borrelia burgdorferi蛋白和多肽的出版物提議，它們可用作診斷或藥物制劑。這些蛋白和多肽包括外表面蛋白A和B(OspA和OspB)、鞭毛蛋白和根據(jù)估計分子量命名的其它蛋白P212、P39、P66和P83[A.G.Barbour等人，Infect.Immun.，4594-100(1984)；W.J.Simpson等人，J.Clin.Microbiol.，281329-1337(1990)；K.Hansen等人，Infect.Immun.，562047-2053(1988)；K.Hansen等人，Infect.J.Clin.Microbiol.，26338-346(1988)；B.Wilske等人，Zentral，Bakteriol Parasitenkd.Infektionshkr.Hyg.Abt.1 Orig.Reihe.A.，26392-102(1986)；D.W.Dorward等人，J.Clin.Microbiol.，291162-1170(1991)；公開的NTIS美國專利申請?zhí)?85,551；歐洲專利申請No.465,204，1992年1月8日公開；國際專利申請No.PCT/US91/01500，1991年9月19日公開；國際專利申請No.PCT/EP90/02282，1991年7月11日；國際專利申請No.PCT/DK89/00248，1990年5月3日公開；國際專利申請No.WO92/00055，1992年1月9日公開]。
一種用作疫苗的較佳的蛋白候選物是OspA[M.Philipp等人，J.Spirochetal andTich-bome Diseases，367-79(1996)]。在食血時，螺旋體在蜱中腸到唾液腺的途徑中，OspA的表達停止或下調(diào)[A.DeSilva等人，J.Exp.Med.，183271-275(1996)]。該現(xiàn)象可能會產(chǎn)生OspA疫苗效率降低的潛在問題。螺旋體損耗(attrition)可能只發(fā)生在蜱中腸內(nèi)[A.DeSilva等人，上文所述]，而不發(fā)生在脊椎動物宿主感染時。由于肩突硬蜱(Ixodes scapularis)的唾液含有去補體因子[T.Mather等人，＂硬蜱屬唾液Borreliaburgdorferi的感受態(tài)載體和可能的疫苗策略＂，萊姆病第VII次國際議會，San Francisco，CA(1996)]，蜱中腸中螺旋體損耗可能通過僅有抗體參與而補體不參與的機制發(fā)生。
盡管對依賴抗體的殺傷作用方式還不完全了解，但是看來殺傷機制不如抗體和補體一起作用所介導的那樣有效[M.Sole等人，Infect.Immunol.，662540-2546(1998)]。因此，可能讓具有低表面密度OspA的那些螺旋體從中腸中逃脫。實際上，盡管OspA是一種豐富的B.burgdoferi蛋白，但是只有很少部分的OspA分子暴露在螺旋體的外表面上[D.Cox等人，Proc.Natl.Acad.Sci.937973-7978(1996)]。因此，OspA表面分子絕對數(shù)量的變化很少可能會導致螺旋體損耗率明顯不同，并使殘余的螺旋體有可能潛逃至唾液腺。
OspA逃逸突變體很容易避開被一起殺死，并且如果它們對脊椎宿主有感染性的話，它們甚至將更進一步降低OspA疫苗的效率。在允許體外生長的B.burgdorferi的克隆群體中，能抵抗OspA抗體殺傷作用的突變體的盛行度在10-5和10-2之間[A.Sadziene等人，J.Exp.Med.176799-809(1992)]。如果該頻率在攝食若蟲中再現(xiàn)(螺旋體數(shù)量在附著15小時內(nèi)可達到平均值7848)[A.Desilva等人，Am.J.Trop.Med.Hyg.，53397-404(1995)]，那么在單個蜱內(nèi)可能存在幾種突變體。典型的突變表型包括不表達OspA和OspB的那些，和通常是OspA N端片段和OspB C端片段融合的嵌合分子的表達物?，F(xiàn)已在多株B.burgdorferi[P.Rosa等人，Mol.Microbiol.，63031-3040(1992)]和加利福尼亞的幾個蜱分離物[T.Schwan等人，J.Clin.Microbiol.，313096-3108(1993)]中發(fā)現(xiàn)了這些缺失型突變體。能抵抗OspA抗體單獨殺傷作用的嵌合(缺失)突變體可被抗體和補體的聯(lián)合作用殺死。由于在蜱體內(nèi)補體看來沒有功能[T.Mather等人，同上]，且在感染后短時間內(nèi)脊椎動物宿主不表達OspA(可能是其嵌合形式)，嵌合性OspA逃逸型突變體能感染脊椎動物宿主。另外，估計多達20％的硬蜱屬只是部分攝食，因此仍要繼續(xù)調(diào)查[Y.Lobet，個人通訊]。如果這些蜱已經(jīng)從感染B.burgdorferi的宿主攝取了部分食物，它們的唾液腺將含有不表達OspA并容易感染接種過OspA疫苗的宿主的螺旋體。
在螺旋體攻擊接種過OspA疫苗的宿主時，沒有觀察到加強接種效應[M.Philipp等人，同上]，預計也不應有該效應。因此，可能需要反復給予OspA疫苗來維持有效的抗體滴度。
因此，本領域中還需要有一種改進的方法和組合物來預防和治療人和動物的萊姆病。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供預防萊姆病的方法和組合物滿足了本領域中的需求，該方法根據(jù)的是螺旋體在寄生在脊椎動物宿主體內(nèi)時所表達的螺旋體抗原。這些方法和組合物可用來治療萊姆病。
一方面，本發(fā)明提供了分離的廣義B.burgdorferi表面抗原，它由脊椎動物宿主中的螺旋體在體內(nèi)表達。該抗原(本文稱為P39.5)經(jīng)進一步性質(zhì)分析具有39.5kD的相對分子量。該抗原的片段也可用于本發(fā)明的組合物和方法。
另一方面，本發(fā)明提供了新的疏螺旋體彈夾串(cassette string)多肽/蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還有一個方面提供了編碼P39.5或其片段(如P7-1)的核酸序列以及編碼其它疏螺旋體彈夾串蛋白或其片段的核酸序列。這些核酸序列包括在嚴謹條件下和上述序列雜交的序列、它們的等位基因變體和缺失型突變體。
另一方面，本發(fā)明提供了新的蛋白，該蛋白含有的上述P39.5蛋白序列或彈夾串蛋白序列的片段任選地和第二種所選多肽或蛋白融合或混合，該第二多肽或蛋白的氨基酸序列與P39.5或其它疏螺旋體抗原(如OspA)以及衍生自其它微生物體的蛋白或多肽序列的相同性可高達大約90％。
還有一方面，本發(fā)明提供了新的蛋白組合物，該組合物所含的上述抗原的蛋白序列或其片段任選地和第二種所選的多肽或蛋白混合，該第二多肽或蛋白的氨基酸序列與P39.5或其它疏螺旋體抗原(如OspA)以及衍生自其它微生物的蛋白或多肽序列的相同性可高達大約90％。
還有一方面，本發(fā)明提供了重組生產(chǎn)上述P39.5蛋白、其片段或含有這些片段的融合蛋白的方法，該方法是在選定的宿主細胞中表達編碼蛋白、片段或融合蛋白的DNA序列，從中分離出蛋白。本文還提供了用這些DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
本發(fā)明還有一方面提供了針對上述P39.5抗原、其片段、彈夾串蛋白或片段、或含這些片段的融合蛋白的分離的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)這些抗體的方法，該方法包括用上述分離的抗原、或用其一個或一個以上片段的混合物、或用含有本發(fā)明的一個或多個片段的融合蛋白免疫接種人或動物。從免疫動物中可以制得其它類型的抗體，例如重組抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人化抗體等。
另一方面，本發(fā)明提供了用于治療患萊姆病的人和/或動物的治療性組合物和方法。治療性組合物含有上述抗體、蛋白或片段以及合適的藥物載體。
另一方面，本發(fā)明提供了疫苗組合物以及用上述組合物接種人或動物抵抗萊姆病的方法。該組合物含有有效量的至少一種本發(fā)明的疏螺旋體抗原，例如由疏螺旋體屬螺旋體體外表達的抗原(所述抗原的相對分子量為39500道爾頓)，或是該抗原的抗原性片段或含有此類片段或彈夾串蛋白的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。疫苗組合物可含有上述的P39.5蛋白、其片段、融合蛋白或蛋白混合物。
本發(fā)明還有一個方面提供了用核酸組合物(如DNA疫苗)接種人或動物患者抵抗萊姆病的疫苗組合物和方法。該組合物含有有效量的DNA序列，該序列編碼至少一種本發(fā)明疏螺旋體抗原或其抗原性片段、彈夾串抗原或含有此類片段的融合蛋白，以及任選的藥學上可接受的載體。
在還有一方面，本發(fā)明提供了診斷人或動物萊姆疏螺旋體病的方法。該方法包括將本發(fā)明的抗原或抗體(最好用常規(guī)方法標記用于檢測)和待診斷的人或動物的生物學液體樣品培育的步驟。當人或動物患者存在B.burgdorferi感染時，形成抗原-抗體復合物。隨后分析反應混合物以確定這些抗原-抗體復合物的存在與否。在另一個實例中，診斷試驗采用抗原或其片段的DNA序列(較佳的是反義序列)，通過患者生物學液體中存在能與其雜交的序列來診斷感染。還可利用本發(fā)明確定的試劑進行其它常規(guī)試驗。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于診斷人或動物患者樣品中B.burgdorferi感染的試劑盒，該試劑盒含有至少一種能結(jié)合至少一種本發(fā)明抗原或其抗原性片段的抗體，或是編碼本發(fā)明的一種或多種抗原的DNA序列或其反義序列。抗體和序列可作任意標記以便檢測，或者試劑盒中可包括一種檢測系統(tǒng)。
在下列本發(fā)明較佳實例詳細描述中將進一步描述本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點。
附圖簡述

圖1表示通過蜱(叮咬)接種了JD1螺旋體的獼猴血清對B.burgdorferi JD1株(○)，B31株(△)和B.garinii IP90株(口)螺旋體的依賴抗體的、補體介導的殺傷(ADCK)滴度。
圖2示出了新的編碼一個開放讀框的P39.5的DNA序列，它編碼37.7kDa的推定蛋白。該DNA片段命名為7-1，推定的蛋白稱為P7-1。黑色區(qū)域是唯一的跨越SEQID NO1 bp769至bp854的區(qū)域。標為IA的區(qū)域跨越SEQ ID NO1的bp1至bp309；IB跨越SEQ ID NO1的bp855至bp1189。區(qū)域IA和IB具有70％的相同性。橫跨SEQ ID NO1的bp310至bp494的區(qū)域IIA和橫跨SEQ ID NO1的bp595至bp769的區(qū)域IIB具有91％的相同性。橫跨SEQ ID NO1的bp208至bp309的區(qū)域A和橫跨SEQ ID NO1的bp495至bp595的區(qū)域B具有84％的相同性。共同橫跨SEQ ID NO1的bp1090至bp1189的區(qū)域B和C具有90％的相同性。
圖3的條狀圖描述了IP90螺旋體被下列物質(zhì)體外殺傷的結(jié)果條1用JD1螺旋體感染的猴血漿和猴補體；條2來自同一血漿、經(jīng)天然P39.5親和純化的抗體和猴補體；條3如條2所述的相同抗體但沒有補體；條4單用補體；條5單用BSK-H培養(yǎng)基。誤差條代表兩次測定平均值的標準偏差。
圖4的條狀圖表示用下列物質(zhì)獲得的對IP90株螺旋體的ADCK結(jié)果感染B.burgdorferi JD1的猴血漿合并液(1∶10稀釋)(條1、5)；用1∶10的重組型P7-1(rP7-1)和Ribi佐劑免疫接種的小鼠的血清合并液(條2、6)；用1∶50的重組型P7-1(rP7-1)和Ribi佐劑免疫接種的小鼠的血清合并液(條3)；和單用Ribi佐劑免疫接種的小鼠的血清合并液(條4、7)。在條1-4的ADCK試驗中采用猴補體，而在條5-7的ADCK中采用豚鼠補體。誤差條代表兩次測定的平均值的標準誤差。
圖5描述了長約8kb的DNA序列中一串沉默的VLS彈夾(從J.R.Zhang等人，Cell，89275-285(1997)復制得到)。
圖6是B.burgdorferi JD1株和B31株以及B.garinii IP90株螺旋體裂解液的Western印跡，用JD1螺旋體通過針(頭注射)接種(泳道1)和蜱(叮咬)接種(泳道2)的猴血清以及后一血清經(jīng)親和純化除去全部活的JD1螺旋體后所得的抗體(泳道3)顯象。
序列表命名SEQ ID NO1是克隆7-1的核酸序列。
SEQ ID NO2是克隆7-1的推定蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO3是克隆1-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO4是在克隆1-1核酸序列中部發(fā)現(xiàn)的部分核酸序列。
SEQ ID NO5是克隆1-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO6是克隆3-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO7是克隆3-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO8是克隆6-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO9是克隆6-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO10是克隆9-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO11是克隆12-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO12是克隆12-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO13是從克隆14獲得的部分核酸序列，當加到克隆7-1的5′端[SEQ IDNO1]時，形成較大的P39.5片段，即P7-1。5′端前6個堿基來自質(zhì)粒載體。
SEQIDNO14是SEQIDNO13的推定的蛋白質(zhì)序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種新的疏螺旋體表面抗原P39.5，該抗原由螺旋體居留在脊椎動物宿主中(“體內(nèi)”)時表達。該抗原是依賴抗體的、補體介導的體外殺傷作用(ADCK)針對的靶標。這種新的抗原、其片段、針對它們的抗體、編碼它們的核酸序列、這些抗原、抗體和核酸序列在治療或預防萊姆病的診斷、治療和預防性組合物和方法中的用途提供了比用于此目的的已知組合物和方法中的其它疏螺旋體蛋白和抗體更好的優(yōu)點。
I.本發(fā)明的P39.5抗原在一個實例中，本發(fā)明提供了一種新的分離的疏螺旋體抗原，稱為P39.5。該抗原由疏螺旋體屬螺旋體(例如B.garinii IP90株螺旋體)在體外和體內(nèi)表達。該抗原或其同源物也由B.burgdorferi(狹義)JD1株、B31株和NT1株螺旋體在體內(nèi)表達。該抗原在IP90螺旋體中的表觀分子量為39.5kDa，經(jīng)功能上鑒定，能在疏螺旋體屬螺旋體自然感染期間在動物體內(nèi)誘導抗體。這些誘導的抗體通過體外ADCK能殺死IP90螺旋體。引發(fā)的抗體還殺死了B.burgdorferi廣義)NT1株螺旋體(一種從美國患者腦脊髓液體中分離的株系，但是在廣義的種屬復合物中未作進一步鑒定)。該株系由紐約的紐約州立大學Patricia Coyle博士提供。
用插入pBluescript II質(zhì)粒的B.burgdorferi廣義株B.garinii IP90株)的基因片段(命名為7-1)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并于1997年6月27日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland＂ATCC＂)中，保藏號為No.98478。當大腸桿菌表達該基因片段、分離純蛋白并將該蛋白用作小鼠的免疫原時，這樣產(chǎn)生的抗體能和IP90的P39.5反應。類似地，將Borrelia garinii IP90株的其它基因片段(命名為1-1、3-1、6-1、9-1和12-1)各自插入pBluescript II質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并保藏。后者的保藏日在1998年6月25日或之前，保藏號為No.＿(1-1)，＿＿(3-1)，＿＿(6-1)，＿ (9-1)，＿(12-1)。所有保藏均為了滿足國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，并完全符合美國專利商標局用于專利目的的保藏要求。從這些保藏機構可以獲得用于本發(fā)明的序列。
A.核酸序列本發(fā)明提供了編碼P39.5片段的哺乳動物核酸序列。本發(fā)明的核酸序列分離自與其天然伴隨的細胞物質(zhì)。如下文實施例所述，克隆編碼疏螺旋體P39.5基因部分編碼區(qū)的1190bp的節(jié)段并測序。它包括編碼推定的37.7kDa蛋白的單個開放讀框。SEQ ID NO13和1中報道了該部分DNA序列。SEQ ID NO13是緊靠SEQ ID NO1第一個堿基5′的序列。這些序列總共形成了1189bp和約396個氨基酸的部分蛋白。測序的片段由主要是親水性的結(jié)構域組成，結(jié)構域含有一些內(nèi)部的重復區(qū)域以及唯一的跨越SEQ ID NO1 bp627至bp712的區(qū)域。見圖2，該圖確定了重復序列并確定了這些序列的同源性和相同百分率。
在文章中，蛋白和/或DNA序列通過它們與確定序列的同源性或相同百分率來確定，計算相同百分率或相似性百分數(shù)的算法包括如下Smith-Waterman算法[J.F.Collins等人，1988，Comput.Appl.Biosci.，467-72；J.F. Collins等人，MolecularSequence Comparison and Alignment，(M.J.Bishop等人編輯)＂實踐方法系列核酸和蛋白系列分析(Practical Approach SeriesNucleic Acid and Protein Sequence Analysis)XVIII，IRL PressOxford，England，UK(1987)417頁]，以及BLAST和FASTA程序[E.G.Shpaer等人，1996，Genomics，38179-191]。這些參考文獻納入本文作參考。
本發(fā)明還包括其它疏螺旋體核酸片段，例如彈夾串片段以及P39.5的片段。這些片段稱為1-1(編碼蛋白/肽P1-1)、3-1(編碼蛋白/肽P3-1)、6-1(編碼蛋白/肽P6-1)、9-1(編碼蛋白/肽P9-1)和12-1(編碼蛋白/肽P12-1)。較佳的，這些片段的特征是編碼P39.5的生物學活性部分，例如一個表位。通常，這些寡核苷酸片段至少長15個核苷酸。然而，可以按需選擇大小不同的寡核苷酸片段。這些片段可用于某些目的，例如在活檢組織樣品上進行聚合酶鏈反應(PCR)。例如，有用的P39.5DNA片段和對應的序列包含在SEQ ID NO1 bp793-816之間以及在SEQ ID NO13的bp59-85之間的序列。圖2中鑒定了其它有用的片段。1-1的片段包括SEQ ID NO3、4和5的序列。3-1的片段包括SEQ ID NO6和7的序列；6-1的片段包括SEQ ID NO8和9的序列。9-1的片段包括SEQ ID NO10的序列。12-1的片段包括SEQ ID NO11和12的序列。本領域技術人員很容易借助常規(guī)DNA測序技術應用于上述ATCC保藏的DNA來獲得1-1、3-1、6-1、9-1和12-1的完整序列和其它有用的片段。
本領域技術人員利用SEQ ID NO1和3-12的DNA序列以及上述保藏物很容易獲得對應于這些DNA序列的反義鏈。另外，利用已知的技術，本領域技術人員容易獲得側(cè)接所述DNA序列或其對應RNA序列的其它所需的基因組和cDNA序列。類似地，在常規(guī)的技術(例如聚合酶鏈反應)中，將本發(fā)明的核酸序列作為探針，本領域技術人員能從已得到的本發(fā)明的SEQ ID NO1和3-12以及保藏物中獲得其它種類的P39.5類似物、B.garinii肽及其片段。憑借本發(fā)明提供的該序列信息，還很容易獲得種屬中這些序列的等位基因變體(即含有一些與種屬中更常見序列有個別核苷酸差異的序列)(例如P39.5的其它變體，SEQ ID NO2)。
本發(fā)明還包括能在嚴謹條件[見J.Sambrook等人，分子克隆實驗指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)]下與SEQ ID NO1的序列、它們的反義鏈或生物活性片段雜交的核酸序列。高度嚴謹雜交條件的一個例子是在65℃、2×SSC下雜交，然后用65℃、0.1×SSC洗滌一小時?；蛘撸湫偷母叨葒乐旊s交條件是在50％甲酰胺、4×SSC、42℃下。中等高度嚴謹條件也是適用的如在55℃、4×SSC中雜交，然后在37℃、0.1×SSC中洗滌1小時。另一個典型的適中的高嚴謹性雜交條件是在30℃、50％甲酰胺、4×SSC下。
根據(jù)本發(fā)明，可對此核酸序列作修飾。利用SEQ ID NO1和3-12的序列信息，本領域技術人員能獲得或合成或重組制備編碼本發(fā)明全長蛋白或有用片段的其它多核苷酸序列或經(jīng)修飾的多核苷酸序列。在核酸水平上的這些修飾例如包括修飾沉默的或改變氨基酸的核苷酸序列，來改進分泌或表達。修飾還包括由遺傳密碼天然簡并引起的等位基因變化。
本發(fā)明還包括本文提供的P39.5片段以及彈夾串序列1-1、3-1、6-1、7-1、9-1和12-1的突變體。這些突變體包括基本上保留了全長P39.5或其它蛋白或片段抗原性的氨基端、羧基端或內(nèi)部缺失?？杀磉_這些截短的或缺失型突變體，以便達到影響全長或野生型基因或基因片段活性的目的。
這些核酸序列可用于各種診斷、預防和治療用途。較佳的，核酸序列可用來開發(fā)診斷性探針和反義探針，以便利用各種已知的核酸試驗(例如Northern和Southern印跡、聚合酶鏈反應(PCR)和本領域技術人員已知的其它測定技術)來檢測和診斷萊姆病。本發(fā)明的核酸序列還可用于生產(chǎn)P39.5蛋白及其同源物以及B.garinii的其它蛋白。
用常規(guī)的聚合酶鏈反應或克隆技術(例如上述Sambrook等人的常規(guī)課本中所述的那些)可分離出本發(fā)明的核苷酸序列。例如，用DNA引物和探針和PCR技術，可從B.garinii DNA制備或分離出本發(fā)明抗原的核酸序列。另外，可從衍生自B.garinii全基因組DNA的基因庫獲得抗原。運用常規(guī)的基因工程方法或化學合成技術或PCR等利用本文提供的信息可以重組構建這些序列、其片段、修飾序列和全長序列。
B.蛋白序列本發(fā)明還提供了B.burgdorferi(廣義)蛋白，例如B.garinii蛋白和肽，包括P39.5多肽或蛋白以及用本發(fā)明名為P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1的肽/蛋白。這些蛋白和它們在自然狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)的其它污染性蛋白或物質(zhì)不結(jié)合在一起。由于天然的P39.5在Triton-X114抽提時被全部抽提到洗滌劑相中，因此它可能是脂蛋白。經(jīng)Western免疫印跡(見實施例2和圖6)確定，P39.5抗原的相對分子量為39500道爾頓。在一個實例中，本發(fā)明提供了約354個氨基酸的部分P39.5多肽[SEQ ID NO2]，它可能是脂蛋白，具有預計的大約37.7kDa的相對分子量(即“P7-1片段”)。該推定的氨基酸序列[SEQ ID NO2]與Borrelia hermsii外表面脂蛋白的可變主要蛋白(variable major protein(Vmp))家族成員的相同性高達22％(見實施例6)。它和B.burgdorferi B31株的Vmp樣序列(vls)VlsE[J.-R.Zhang等人，上文]、B.burgdorferi的其它vls序列[即Vls-6 Genbank No.U76406(190個氨基酸內(nèi)的相同性為53％)；VlsEGenbank號U84553(210個氨基酸內(nèi)的相同性為58％)和U84566(209個氨基酸內(nèi)的相同性為58％)和U84555(210個氨基酸內(nèi)的相同性為58％)]的相同性約為50％。
VlsE是B.burgdorferi抗原的一部分，它通過重組機制發(fā)生抗原性變化，表達的拷貝(VlsE)的中間片段和位于表達拷貝上游的一串15個“彈夾”的片段重組[J.Zhang，上文]。每個彈夾的平均長度為500bp，整個一串彈夾占據(jù)的DNA序列約為8kb。該彈夾串的一個顯著特征是，在B.burgdorferi B31中，彈夾以幾乎毗鄰的開放讀框排列，只是在彈夾vls11中間隔有終止密碼子，在彈夾vls14和vls16中有兩個讀框移位。例如見圖6，它是Zhang等人(上文)確定的相似結(jié)構的一個拷貝。
P39.5的較長部分的蛋白序列通過克隆14的部分序列[SEQ ID NO14]和SEQ IDNO2的5′端序列直接融合而形成。得到鑒定的克隆14的序列，是序列P7-1和克隆14這兩個克隆之間重疊序列的5′序列。這些重疊序列證實它們是同一開放讀框的一部分。因此，在較大的P39.5推定氨基酸序列中，Leu(SEQ ID NO14的氨基酸47)后面緊跟了Lys(SEQ ID NO2的氨基酸1)。
本發(fā)明提供了看來是B.garinii IP90彈夾串部分的幾個片段的部分DNA和推定的氨基酸序列。這些片段命名為1-1、3-1、6-1、9-1和12-1(可能包括7-1)，長度在1-2kb之間。它們每一個均表達了大小和插入物相稱并和受感染猴抗體反應的肽(除去pBluaescript的lacZ啟動子)。這些片段[SEQ ID NO1、3、6、8、10和11]的5′端均不含具有細菌脂蛋白特征的疏水性引導序列或信號肽酶II共有序列。因此，這些片段一定是IP90的彈夾串，象B31的彈夾串一樣，它們是在讀框內(nèi)的。這些vls樣蛋白通過部分5′和3′序列而得以確定[例如參見SEQ ID NO1、3、5至12]。本領域技術人員能利用本文提供的部分5′和3′序列以及B.garinii的DNA序列(或DNA文庫)或保藏在ATCC的上述各彈夾串蛋白材料，通過常規(guī)技術(如PCR)來鑒別其全部序列。這些方法是常規(guī)的，相信在給予本文所提供的信息后不需要作過多的試驗。
本發(fā)明的抗原可通過免疫學試驗來作性質(zhì)分析，這些試驗包括(但不局限于)Western印跡、通過生物物理學測定法作大分子量測定(例如SDS-PAGE/染色、HPLC等)、抗體識別試驗、T細胞識別試驗、MHC結(jié)合試驗、通過細胞、蛋白或抗體過繼性轉(zhuǎn)遞賦予免疫保護或免疫病理學的試驗。
本發(fā)明的P39.5表面抗原蛋白(及其天然存在的變體或其它疏螺旋體中的類似物或本文確定的其它Vls-樣蛋白)能以完整蛋白或其多肽或片段的形式分離。在一個實例中，P39.5根據(jù)其各自分子量通過免疫印跡程序分離獲得(如下文實施例5所述)。這種分離提供了基本上不含微生物和蜱載體的其它蛋白和非蛋白物質(zhì)的抗原。包含本發(fā)明的疏螺旋體多肽和抗原的分子可從螺旋體中分離獲得，并用各種常規(guī)方法進一步純化，這些純化方法包括液體層析(例如正相或反相)，用HPLC、FPLC等；親和層析(例如用無機配體或單克隆抗體)；體積排阻層析；固定化金屬螯合層析；凝膠電泳等。在不脫離本發(fā)明的范圍下，本領域技術人員可選擇最合適的分離和純化技術。
另外，本發(fā)明的P39.5的氨基酸序列或其它疏螺旋體蛋白可按照常規(guī)基因工程技術[例如參見Sambrook等人，上文和下文制備蛋白的詳細描述]用重組方法生產(chǎn)。
i.類似物/經(jīng)修飾的抗原本發(fā)明還包括本文提供的P39.5蛋白或vls樣蛋白P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1的類似物或修飾版本。通常，這些類似物和具體確定的蛋白只有1至4個密碼子變化的差異。例子包括所述部分氨基酸序列(例如P7-1[SEQ ID NO2])具有少量氨基酸變化(特別是保守性氨基酸替代)的多肽。保守性替代發(fā)生在側(cè)鏈和化學性質(zhì)相關的氨基酸家族中。本發(fā)明還提供了本發(fā)明蛋白的同源物，其特征是和SEQ ID NO2或vls樣蛋白序列的相同性至少為85％。根據(jù)本文提供的序列信息，本領域技術人員很容易獲得全長P7-1或P7-1同源物和類似物，以及其它細菌種屬的全長vls樣1-1、3-1、6-1、9-1和12-1蛋白同源物和類似物。
還可對本發(fā)明的抗原進行修飾來提高其免疫原性。例如，抗原可以與化學化合物或免疫原性載體偶聯(lián)，只要該偶聯(lián)不干擾抗原或載體的所需的生物活性。關于偶聯(lián)策略一些通用問題的綜述可見“抗體實驗手冊”(Cold Spring Harbor Laboratory，E.Harlow和D.Lane編輯，(1988))。本領域已知的有用的免疫原性載體包括(但不局限于)匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BAS)、卵白蛋白、PPD(純化的結(jié)核菌素衍生物)、紅血細胞、破傷風類毒素、霍亂類毒素、瓊脂糖珠、活性炭、或膨潤土。用于偶聯(lián)的有用的化學化合物包括(但不局限于)二硝基酚基團和胂酸(arsonilic acid)。
抗原還可用其它技術(例如加熱和/或SDS變性)來修飾。
ii.片段/缺失型突變體本發(fā)明還包括本文鑒定的P39.5多肽、P7-1肽或其它vls-樣蛋白的其它片段。這些片段的理想特征是具有類似于完全蛋白所展示的生物活性，例如包括誘導針對萊姆病病原體的抗體的能力?？稍O計或得到任何所需長度的這些片段，包括長度小至5-8個氨基酸的片段。該片段可代表該蛋白的一個表位。
P39.5的內(nèi)部重復序列(見圖2)表明，該蛋白象OspA一樣，可能經(jīng)歷了疏螺旋體中的同源重組，該重組可能導致產(chǎn)生表達基因截短的、部分缺失的突變體。因此，可修飾本發(fā)明的P7-1蛋白[SEQ ID NO2]以產(chǎn)生缺失型突變體，例如將氨基或羧基端截短，或除去一個或多個氨基酸。本發(fā)明還包括通過其重復序列同源重組產(chǎn)生的P7-1的缺失型突變體(圖2)，以及編碼它們的DNA序列。在某些缺失型突變體中，缺失了上文P39.5編碼區(qū)的部分(例如區(qū)域IIA、IIB和B)。
P39.5抗原的缺失型突變體(象P39.5而不象OspA)在體內(nèi)表達，在感染脊椎動物宿主時可能會被殺死。大多數(shù)OspA缺失型突變體在補體不存在時能逃脫抗OspA抗體的殺傷作用，但是會被該抗體和補體共同作用殺死。由于抗OspA抗體能在蜱中腸內(nèi)殺死螺旋體(OspA在中腸內(nèi)表達，但是補體可能沒有活性)，OspA缺失型突變體可能避開了由OspA疫苗誘導的抗OspA抗體的作用。相反，因為P39.5在體內(nèi)表達，而抗P-39.5抗體和補體均存在于體內(nèi)，因此P39.5缺失型突變體不可能躲過P39.5為基礎的疫苗的效力。
還有其它的P39.5、P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1或P12-1的修飾片段可用現(xiàn)在的常規(guī)技術制得，以提高其產(chǎn)量、增強蛋白穩(wěn)定性或其它特征(例如結(jié)合活性或生物利用率、或賦予蛋白其它一些所需的性質(zhì))。本領域技術人員很容易用已知的技術(例如缺失誘變和表達)制備這些多肽的其它有用的片段。
iii.融合或多聚(multimeric)蛋白和組合物用常規(guī)的基因工程技術還可將本發(fā)明的P39.5蛋白或其片段以及vls樣彈夾串蛋白或其片段構建成較大的和/或多聚蛋白或蛋白組合物的一部分。本發(fā)明的抗原可以和B.burgdorferi外表面蛋白(例如OspA，OspB，OspC)以及BmpA，B，C組合，或本文描述的抗原的各種片段可以相互組合。在這種組合情況下，抗原可以是融合蛋白形式。本發(fā)明的抗原可以任選地和選定的多肽或蛋白融合，這些多肽或蛋白例如是疏螺旋體抗原OspA，OspB，OspC，BmpA，BmpB，BmpC、其它疏螺旋體抗原以及衍生自其它微生物的蛋白或多肽。例如，本發(fā)明的抗原或多肽的N端或C端可以和OspA多肽、OspB多肽、OspC多肽、或非OspA非OspB多肽或其組合物融合。可用于此目的的OspA和OspB多肽包括現(xiàn)有技術(例如見PCT/US91/04056)確定的多肽及其變體?？捎糜诖四康牡姆荗spA、非OspB多肽包括本發(fā)明的多肽以及現(xiàn)有技術確定的那些多肽，包括B.burgdorferi OspC蛋白、鞭毛相關蛋白及其片段、其它B.burgdorferi蛋白及其片段以及非B.burgdorferi蛋白及其片段。
通過表達P39.5DNA序列或其片段和同源于P39.5的DNA片段(25-95％相同性)融合形成的DNA分子，提供了本發(fā)明的另一個融合蛋白。這種蛋白的一個例子包括使SEQ ID NO2的氨基酸序列和與該序列相同性高達95％的氨基酸片段融合。這些片段可以任何次序插入，并可含有例如圖2所示的重復序列。這些形成單個開放讀框的長串DNA可從P39.5同源物(包括P39.5)構建獲得，或衍生自天然存在的長的開放讀框(例如一個或多個vls彈夾蛋白)。B.garinii的vls彈夾蛋白(例如命名為P1-1、P3-1、P6-1、P9-1和/或P12-1的蛋白)可以相互融合和/或插入到P39.5或P7-1的DNA序列中，從而產(chǎn)生大的DNA分子，該分子表達的蛋白質(zhì)可能刺激各種抗體特異性。
構建包含本發(fā)明多個多肽的這些融合蛋白用于本發(fā)明的方法和組合物中。這些融合蛋白或多聚蛋白可用重組方法產(chǎn)生或用化學方法合成。它們還可包括和本發(fā)明的多肽與氨基酸以外的物質(zhì)(包括脂質(zhì)和糖類)融合或偶聯(lián)。而且，本發(fā)明的抗原可以和現(xiàn)有技術描述的其它疏螺旋體疫苗制劑和衍生自其它病毒的其它種疫苗制劑組合使用。這些蛋白能有效地預防、治療和診斷由廣譜B.burgdorferi分離物引起的萊姆病。
可替換上述融合蛋白的較佳的蛋白組合物是含有不同P39.5蛋白或片段、或本發(fā)明彈夾串蛋白的不同混合物的＂雞尾酒＂(即簡單的混合物)。這些蛋白或其抗原性片段的這種混合物可用來產(chǎn)生針對B.garinii的所需抗體。
iv.鹽本發(fā)明的抗原還可以藥學上可接受的鹽的形式使用。能和本發(fā)明的多肽形成鹽的合適的酸和堿是本領域技術人員所熟知的，它們包括無機和有機酸和堿。
II.制備本發(fā)明的抗原和核酸序列的方法A.體外表達為了生產(chǎn)本發(fā)明的重組體P7-1和/或其它彈夾串蛋白或P39.5的其它片段，將本發(fā)明的DNA序列插入合適的表達系統(tǒng)中。希望的是，構建重組分子或蛋白，其中編碼選定蛋白(例如P7-1)的多核苷酸序列與允許該蛋白表達的異源表達控制序列操作性相連。本領域中已知有許多種合適的表達載體可通過標準分子生物學技術來表達蛋白。這些載體選自常規(guī)的載體類型，包括昆蟲(例如桿狀病毒表達系統(tǒng))、或酵母、真菌、細菌或病毒表達系統(tǒng)。眾多種本領域已知的表達載體中其它合適的載體也可用于此目的。獲得這些表達載體的方法是眾所周知的。參見Sambrook等人，“分子克隆實驗指南”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；Miller等人，＂基因工程＂8277-298(Plenum Press 1986)和其中引用的文獻。
用該方法轉(zhuǎn)染的合適的宿主細胞或細胞系包括細菌細胞。較佳的，至少對據(jù)信是脂蛋白(例如參見實施例5)的P39.5蛋白來說，此選定的蛋白宜在細菌中表達，因為它具有附著脂質(zhì)的細胞機制。在所表達的蛋白用作疫苗或治療藥物時該表達系統(tǒng)是特別佳的。例如，各種大腸桿菌菌株(例如HB101、MC1061和下文實施例所用的菌株)是生物技術領域中眾所周知的宿主細胞?？莶菅堪麠U菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和其它菌屬等的各種菌株也可用于該方法。
本領域技術人員已知的許多酵母細胞菌株也可用作宿主細胞來表達本發(fā)明的多肽。其它真菌細胞也可用作表達系統(tǒng)。盡管酵母也能脂化(lipidate)蛋白，但是該脂化方式可能和細菌不同，即與天然蛋白不同。
可采用的哺乳動物細胞例如是人293細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、猴COS-1細胞系或鼠3T3細胞(衍生自瑞士、Balb-C或NIH小鼠)。另一個合適的哺乳動物細胞系是CV-1細胞系。其它合適的哺乳動物細胞系以及轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)、擴增、篩選、生產(chǎn)和純化方法是本領域已知的[例如參見Gething和Sambrook，Nature，293620-625(1981)或Kaufman等人，Mol.Cell.Biol.5(7)1750-1759(1985)或Howley等人，美國專利4,419,446]。
另外，可采用的昆蟲細胞例如是草地夜蛾(Spodoptera frugipedera)(Sf9)細胞。
因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組疏螺旋體蛋白(如P7-1或其它彈夾串蛋白)的方法，該方法包括(例如)用至少一個表達載體通過常規(guī)手段(如電穿孔)轉(zhuǎn)染宿主細胞，該表達載體所含本發(fā)明的多核苷酸在轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的控制下。然后在允許蛋白表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細胞。用本領域技術人員已知的合適的手段從細胞(或培養(yǎng)基，如果是胞外表達的話)中回收、分離和任選地純化表達的蛋白。
例如，在細胞裂解后，分離可溶形式蛋白或用已知技術(例如在鹽酸胍中)抽提。如果需要，以融合蛋白形式產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白或片段。這些融合蛋白是上述的那些。另外，例如，可能希望產(chǎn)生融合蛋白來增強該蛋白在所選宿主細胞中的表達、改善純化或用來監(jiān)測組織、細胞或細胞抽提物中所需蛋白(例如P7-1)的存在。本發(fā)明蛋白的合適的融合伙伴是本領域技術人員所熟知的，它們包括β半乳糖苷酶、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶和多聚組氨酸。
B.體內(nèi)表達另外，當希望本發(fā)明的P7-1或其它彈夾串蛋白(無論是全長還是所需片段)在體內(nèi)表達時(例如來誘導抗體或作為DNA疫苗)，本領域技術人員很容易選擇用于輸遞的合適載體。用于體內(nèi)基因輸送的典型載體易從各學院和商業(yè)來源獲得，例如包括腺伴隨病毒[國際專利申請?zhí)朠CT/US91/03440]、腺病毒載體[M.Kay等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912352(1994)；S.Ishibashi等人，J.Clin.Invest.，92883(1993)]或其它病毒載體(例如各種痘病毒、牛痘等)。插入所需基因(如P7-1)并獲得編碼蛋白體內(nèi)表達的方法是本領域技術人員所知的。
III.本發(fā)明的抗體本發(fā)明還提供能識別并結(jié)合本發(fā)明分離的、或修飾的、或多聚抗原的抗體，包括從這些抗原或其片段的混合物衍生獲得的抗體。這些抗體可用來診斷萊姆病，和治療性組合物來治療測試陽性或在測試前表現(xiàn)出萊姆病癥狀的人和/或動物。抗體可單獨或和針對本發(fā)明其它抗原的抗體以及針對其它已知的B.burgdoferi抗原的抗體聯(lián)合用于診斷。這些抗體還可用于被動疫苗組合物。
利用本發(fā)明分離的、重組或修飾的抗原或這些抗原或抗原片段的混合物通過常規(guī)手段產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，可用常規(guī)方法產(chǎn)生多克隆抗體用本發(fā)明的分離的抗原或抗原性蛋白或肽的混合物刺激選定動物或人的免疫系統(tǒng)，使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對它們的天然抗體，并收集動物或人血液或其它生物學液體中的這些抗體。
例如，通過給予脊椎動物宿主本發(fā)明的抗原或抗原性組合物(如P7-1)，產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。較佳的是，用重組型P7-1(rP7-1)作為免疫原。一種針對P7-1抗原的合適的多克隆抗體通過依賴抗體、補體介導殺傷(ADCK)作用體外殺死IP90螺旋體，不論該抗體是通過(1)親和純化(用IP90螺旋體的天然P39.5抗原作為免疫吸附劑(分離在Western印跡上，見圖6)，用JD1螺旋體感染獼猴時產(chǎn)生的抗血清作為抗體來源)獲得的，還是通過(2)用IP90的重組型P7-1(rP7-1)免疫接種小鼠獲得的。
這樣，以IP90的天然P39.5抗原或本文鑒定的一種或多種彈夾串蛋白作為免疫吸附劑親和純化JD1螺旋體感染脊椎動物(例如獼猴)產(chǎn)生的抗血清，就分離得到了本發(fā)明的抗體。類似的，用本發(fā)明的純化的重組抗原或純化分離天然來源的P39.5免疫接種小鼠，分離獲得本發(fā)明的抗體。還可產(chǎn)生直接針對P39.5的單克隆抗體(MAb)。用眾所周知的常規(guī)技術(例如Kohler和Milstein的方法及其許多已知的改進方法)產(chǎn)生表達所需單克隆抗體的雜交瘤細胞系。類似地，將已知的重組技術用于開發(fā)針對這些抗原的單克隆或多克隆抗體，可產(chǎn)生高滴度抗體[例如參見，PCT專利申請?zhí)朠CT/GB85/00392；英國專利申請公開號GB2188638A；Amit等人，Science，233747-753(1986)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033(1989)；PCT專利申請?zhí)朠CT/WO9007861；和Riechmann等人，Nature，332323-327(1988)；Huse等人，Science，2461275-1281(1988)a]。
在給出了本文所含內(nèi)容后，本領域技術人員可借助已知的技術通過操作針對本發(fā)明抗原的人或動物抗體的互補決定區(qū)產(chǎn)生直接針對P39.5或彈夾蛋白、或其抗原性片段的嵌合性、人化抗體或完全的人抗體。例如參見，《實驗藥物學手冊》第113卷＂單克隆抗體的藥物學＂E.Mark和Padlin＂單克隆抗體的人化＂第4章，Springer-Verlag(1994年6月)。
另外，將抗原裝配成多價抗原性復合物[例如參見歐洲專利申請0339695，1989年11月2日公開]或抗原性蛋白/肽的簡單的混合物，并用來在抗原出現(xiàn)于受感染動物或人的生物學液體中時誘導高滴度的能結(jié)合所選抗原的抗體。
本發(fā)明還提供了抗獨特型抗體(Ab2)和抗-抗-獨特型抗體(Ab3)。Ab2對本發(fā)明的抗-P39.5抗體結(jié)合的靶有特異性，而Ab3與P39.5抗體(Ab1)在其結(jié)合特異性和生物活性上相似[例如參見，M.Wettendorff等人，＂用抗獨特型抗體調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫力＂，《獨特型網(wǎng)絡和疾病》J.Cemy和J.Hiemaux編輯，J.Am.Soc.Microbiol.，WashingtonDC203-229頁(1990)]。這些抗獨特型和抗抗獨特型抗體可用本領域技術人員熟知的技術產(chǎn)生。這些抗獨特型抗體(Ab2)可攜帶P39.5、彈夾蛋白、或其片段的內(nèi)部影像，因此可用于P39.5、彈夾蛋白或片段的相同目的。
通常，能結(jié)合所選抗原的多克隆抗血清、單克隆抗體和其它抗體(Ab1)可用來鑒定P39.5或彈夾蛋白的表位，以便將P39.5(或彈夾蛋白)及其類似物和活組織中的污染物分開(例如在層析柱等中)，通?？捎米魉褜すぞ吆烷_發(fā)上述其它類型抗體所必需的原料。抗獨特型抗體(Ab2)可用來結(jié)合相同的靶，并可代替原來的抗原(例如P39.5)誘導免疫應答。Ab3抗體是有用的，其理由和Ab1有用的理由一樣。例如，對于上述抗體，還考慮了用作搜尋工具和用于將P39.5或彈夾蛋白與其它污染物分離的組分等用途。
為了用于診斷性試驗，將抗體和單獨或和其它組合物或化合物一起能提供可檢測信號的常規(guī)標記相結(jié)合。當一個診斷方法中采用了多個抗體時，希望標記相互作用產(chǎn)生可檢測信號。更有利的是，標記可通過視覺(例如用比色計)檢測到。本領域中已經(jīng)描述了各種酶系統(tǒng)，這些酶系統(tǒng)會在試驗中運作并顯示比色信號。一個例子是，葡萄糖氧化酶(用葡萄糖作為底物)釋放過氧化物作為產(chǎn)物。和過氧化物以及氫供體(例如四甲基聯(lián)苯胺)(TMB)反應的過氧化物酶，產(chǎn)生了氧化的呈藍色的TMB。其它例子包括辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)、以及己糖激酶結(jié)合葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與ATP、葡萄糖和NAD+反應，產(chǎn)生的產(chǎn)物中的NADH在340nm波長下檢測到吸收值增加?？捎糜诒景l(fā)明方法的其它標記系統(tǒng)可用其它手段來檢測，例如著色的膠乳微粒[Bangs Laboratories，Indiana]，其中包埋的染料可用來代替和抗體形成偶聯(lián)物的酶，并提供視覺信號，此信號表示實施的試驗中存在產(chǎn)生的復合物。還有其它標記包括熒光化合物、放射性化合物或元素?？蛇B接用于本發(fā)明診斷試驗的抗體的可檢測標記易從已知的且診斷試驗領域技術人員容易獲得的眾多組合物中選出。本發(fā)明的方法和抗體不局限于所用的具體可檢測標記或標記系統(tǒng)。
IV.診斷方法和試驗本發(fā)明還提供了診斷萊姆病的方法。這些診斷方法可用來診斷呈現(xiàn)出萊姆病臨床癥狀或懷疑患有萊姆病的人或動物。
在一個實例中，該診斷方法涉及檢測天然抗-P39.5抗體的存在，該抗體由受感染的人或動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，存在其生物學液體中，它能結(jié)合本發(fā)明的抗原或其組合。該方法包括將本發(fā)明的P39.5抗原或彈夾串抗原和患者的生物學液體樣品一起培育的步驟。因B.burgdorferi感染而存在于液體中的抗體會和抗原一起形成抗體-抗原復合物。隨后分析反應混合物來測定這些抗原-抗體復合物的存在或不存在。分析反應混合物的步驟包括使反應混合物和標記的抗體特異性結(jié)合伙伴接觸。
在一個相似的實例中，診斷方法涉及檢測天然存在的抗P1-1、抗P3-1、抗P6-1、抗P7-1、抗P9-1和/或抗P12-1抗體的存在，這些抗體由受感染人或動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，存在其生物學液體中，能結(jié)合本發(fā)明的抗原或其組合。該方法包括使本發(fā)明的這些抗原中的一個或最好是混合物和患者的生物學液體樣品一起培育的步驟。因B.burgdorferi感染而存在于液體中的抗體將和抗原一起形成抗體-抗原復合物。隨后分析反應混合物以確定這些抗原-抗體復合物的存在或不存在。分析反應混合物的步驟包括使反應混合物和標記的抗體特異性結(jié)合伙伴接觸。
在該方法的一個例子中，將純化的抗原、片段或抗原混合物電泳印跡或斑點印跡到硝酸纖維素紙上。隨后，使生物學液體(例如血清或血漿)和印跡的抗原一起培育，使生物學液體中的抗體結(jié)合抗原。然后用標準免疫酶促方法檢測結(jié)合的抗體。
在該方法的另一個例子中，使膠乳珠和本發(fā)明的抗原偶聯(lián)。隨后，培育生物學液體和珠粒/蛋白偶聯(lián)物，從而形成反應混合物。然后分析該反應混合物以確定抗體的存在。
在另一個實例中，本發(fā)明的診斷方法涉及檢測受病原體感染的動物或人的生物學液體中天然存在的本身結(jié)合于疏螺旋體屬病原體的P39.5抗原或彈夾串抗原的存在。該方法包括一起培育本發(fā)明的抗體(例如，通過給予合適的人和/或動物本發(fā)明的抗原而產(chǎn)生，較佳的是用常規(guī)方法作標記以便檢測)和待診斷的人或動物的生物學液體的步驟。當人或動物患者存在疏螺旋體感染時，形成了抗原-抗體復合物(發(fā)生特異性結(jié)合)。隨后，任選地除去過量標記抗體，分析反應混合物以確定抗原-抗體復合物的存在與否以及其結(jié)合的標記量。
采用本發(fā)明蛋白抗原的試驗可以是異質(zhì)的(heterogenous)(即需要分離步驟)或同質(zhì)的。如果試驗是異質(zhì)的，則可采用各種分離手段，包括離心、過濾、層析或磁力。
篩選血制品或其它生理學或生物學液體的一種較佳的試驗是酶聯(lián)免疫吸附試驗，即ELISA。通常在ELISA中，將本發(fā)明的分離的抗原直接或通過捕獲基質(zhì)(即抗體)吸附在微量滴定孔表面。然后用合適的試劑(例如牛血清白蛋白(BAS)、熱滅活的正常山羊血清(NGS)或BLOTTO(脫脂干奶緩沖液，還含有防腐劑、鹽和消泡劑))封閉表面上殘余的蛋白結(jié)合部位。然后使孔和懷疑含有特異性抗B.burgdoferi抗體的生物學樣品一起培育。樣品可以原液使用，或更經(jīng)常的是，可作稀釋，通常是以含有少量(0.1-5.0％(重量))蛋白(如BSA、NGS或BLOTTO)的緩沖液稀釋。在培育足夠長時間來產(chǎn)生特異性結(jié)合后，洗滌孔除去未結(jié)合的蛋白，然后和標記的抗人免疫球蛋白(αHuIg)或針對其它種類(如狗)的標記抗體一起培育。標記可以選自各種酶，包括如上所述的辣根過氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。再次使特異性結(jié)合進行足夠長時間，然后再次洗滌孔除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，加入酶底物。使其顯色，用肉眼或儀器測定孔內(nèi)物質(zhì)的光密度。
另外，可將能結(jié)合抗原的本發(fā)明的單克隆抗體或其它抗體結(jié)合到ELISA板上。在另一個診斷方法中，在抗體結(jié)合的板上培育生物學液體并洗滌。如上所述用常規(guī)方法檢測抗原-抗體復合物并定量測定標記的單克隆抗體。
其它有用的試驗方式包括濾杯和測深尺。在前一個試驗中，將本發(fā)明的抗體固定在小蓋開口上的燒結(jié)玻璃濾膜上。使生物學液體或樣品(5毫升)通過濾膜。如果存在抗原(即有B.burgdorferi感染)，它會與濾膜結(jié)合，然后通過第二個抗體/檢測物來顯示。測深尺試驗涉及將抗原或抗體固定在濾膜上，然后將其浸入生物學液體中，干燥并用檢測物分子篩選。
其它診斷試驗可采用編碼本發(fā)明抗原或片段的DNA作為核酸探針或反義序列，它們能通過和生物學液體中病原體產(chǎn)生的互補序列雜交來鑒定生物學液體中感染的存在。這些技術，例如PCR、Northern或Southern雜交等，是本領域中熟知的。
本領域技術人員應當理解，可以設計出任意數(shù)量的常規(guī)蛋白試驗方式，尤其是免疫試驗方式或核酸試驗方式，通過利用本發(fā)明的分離的抗原和抗體或其核酸序列或反義序列來檢測動物和人體內(nèi)的疏螺旋體感染。因此，本發(fā)明不局限于特定試驗方式的選自，并且認為本發(fā)明包括了本領域技術人員已知的所有試驗方式。
V.診斷試劑盒為了方便起見，本發(fā)明的ELISA或其它測定的試劑可以試劑盒形式提供。這些試劑盒可用來診斷人或動物樣品中的疏螺旋體感染。這種診斷試劑盒含有本發(fā)明的抗原和/或能結(jié)合本發(fā)明抗原的至少一種抗體、或編碼它們的核酸序列、或它們的反義序列?；蛘撸@些試劑盒可含有這些抗原或序列的簡單混合物，或是制備該簡單混合物的方法。
這些試劑盒可包括已經(jīng)預先吸附了本發(fā)明的疏螺旋體抗原蛋白或抗體或核酸序列的微量滴定板、各種稀釋劑和緩沖液、用來檢測特異性結(jié)合的抗原、抗體或核酸的標記偶聯(lián)物，以及其它產(chǎn)生信號的試劑，例如酶底物、輔因子和色素原。這些試劑盒的其它組分很容易由本領域技術人員來確定。這些組分可包括多克隆或單克隆捕獲抗體、本發(fā)明的抗原、或兩種或多種抗體的簡單混合物、這些抗原的純化的或半純化的抽提物作為標準、單克隆抗體檢測抗體、偶聯(lián)了指示分子的抗小鼠或抗人抗體、準備用于吸附的ELISA板、色度比較用指示劑圖表、一次性手套、去污染說明書、施涂棒或容器、樣品備用杯。這些試劑盒為臨床實驗室診斷疏螺旋體感染提供了方便有效的手段。
VI.治療性組合物本發(fā)明的抗原、抗體、核酸序列或反義序列還能單獨用于或和其它抗原、抗體、核酸序列或反義序列組合用于治療患萊姆病的人和/或動物的治療性組合物以及方法中。例如，可配制這樣一種治療性組合物，它含有載體或稀釋劑以及一種或多種本發(fā)明的抗P7-1或其它抗彈夾串蛋白抗體。合適的藥學上可接受的載體有助于蛋白給藥，但是在生理學上是惰性的和/或無害的。
載體可由本領域技術人員來選擇。典型的載體包括無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和水。另外，載體或稀釋劑可包括時間延遲物質(zhì)，例如單用甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或和石蠟一起使用。另外，可采用緩釋聚合物配方。
該組合物還可任選地含有常規(guī)的藥物組分，例如防腐劑或化學穩(wěn)定劑。可與抗體結(jié)合用于治療性組合物的合適組分包括(例如)酪蛋白氨基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、磷酸二氫鉀、乳糖、乳白蛋白水解物和干奶。
另外，或是除了本發(fā)明的抗體外，用于治療萊姆病的其它試劑，例如抗生素或免疫刺激劑和細胞因子調(diào)節(jié)元件，預計可用來減少或消除疾病癥狀。能用來抑制或抵消蜱載體或螺旋體釋放的免疫阻遏物的試劑應發(fā)揮幫助受感染人或動物自然免疫力的作用。因此，這些試劑可以和本發(fā)明的治療性組合物共同作用。開發(fā)出含有這些試劑的治療性化合物是本領域技術人員在看了本發(fā)明的教導后力所能及的。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過給予有效量的此種治療性組合物來治療人或動物的萊姆病?！坝行Я俊笨赡茉诩s0.05至1000微克/毫升本發(fā)明抗體之間。合適的劑量可能約為1.0毫升的該有效量。這種組合物可在1天至12周期間每日給予1-3次。然而，主治醫(yī)師或獸醫(yī)可以根據(jù)人或動物患者的年齡、性別、體重和總體健康狀況來作適當?shù)膭┝空{(diào)整。較佳的，這種組合物可通過腸胃外給藥，較佳的是肌內(nèi)或皮下給藥。然而，也可配制成通過其它合適途徑(包括口服或局部外用)給藥。
VII.疫苗組合物使用以脊椎動物宿主中表達的抗原為基礎的疫苗沒有產(chǎn)生現(xiàn)有技術的潛在問題。通過包括加入本發(fā)明的P39.5抗原以及藥學上可接受的載體或稀釋劑，提供了一種用于預防人和其它動物中萊姆病的改進的以表面抗原為基礎的疫苗。該疫苗組合物可含有一種或多種分離的、重組的、修飾的或多聚形式的本發(fā)明P39.5抗原或其混合物。類似地，這些組合物中可采用抗原性蛋白的鹽。
本發(fā)明組合物的另一個實例的基礎是其它彈夾串抗原，即P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1。本發(fā)明者指出，vlsE抗原經(jīng)受的抗原性變異的機制表明，該抗原對螺旋體在脊椎動物宿主中的存活非常關鍵。根據(jù)本發(fā)明，一種新的疫苗接種方法涉及通過用彈夾串上表達的大組分表位(正是變異來源)免疫接種宿主來避開螺旋體的防御機制?？赡苓@樣做的唯一事實是該彈夾串大部分在讀框內(nèi)。本發(fā)明者已經(jīng)通過以彈夾串抗原P7-1免疫接種宿主并誘導殺死螺旋體的抗體證實了這一概念(如下文實施例所述)。因此，根據(jù)本發(fā)明，一種接種方法涉及給予宿主上述的幾種或全部克隆的和純化的蛋白，這些蛋白由IP90彈夾串的抗原性不相似的片段衍生獲得。盡管從這些蛋白可以制得各種免疫原性組合物，但是目前較佳的是將兩個或多個彈夾串蛋白或其肽片段簡單混合用于此目的。
本發(fā)明抗原和B.burgdorferi的其它抗原(如OspA、OspB和OspC蛋白、BmpA，B，C或D蛋白或它們的片段)的組合也包括在本發(fā)明內(nèi)。
典型的載體如上文治療性組合物所述。疫苗組合物還可任選地含有佐劑、防腐劑、化學穩(wěn)定劑或其它抗原性蛋白。通常，對穩(wěn)定劑、佐劑和防腐劑進行優(yōu)化以確定在人或動物目標上效率最佳的配方。合適的典型防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和對氯苯酚。
上述一種或多種疫苗組分可用常規(guī)佐劑混合或吸附。佐劑用來吸引白細胞或增強免疫應答。這些佐劑包括Ribi、礦物油和水、氫氧化鋁、白榴石(Amphigen)、阿利啶(Avridine)、L121/鯊烯、D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷、復合多元醇(pluronic plyois)、胞壁酰二肽，殺死的Bordetella和皂苷(如Quil A)。另外，本發(fā)明的疫苗組合物還可包含其它非B.burgdorferi抗原，包括Bordetella bronchiseptica、犬細小病毒、犬瘟熱病、狂犬病、Leptosporidia、犬冠狀病毒和犬腺病毒。這些組合物中還可包括源自其它種類的其它疫苗抗原，如貓冠狀病毒等。
本發(fā)明還包括一種預防方法，該方法需要給予動物或人有效量的這種組合物。P39.5和/或彈夾串蛋白抗原性組合物以“有效量”給予，也就是說，抗原的量在給藥途徑途徑中有效地提供了疫苗效果(即保護性免疫力)。合適量的抗原可由本領域技術人員根據(jù)所需的免疫應答水平來決定。然而，疫苗組合物通常含有1毫微克至1000毫克抗原，更佳的，是0.05微克到1毫克/毫升抗原。本領域技術人員很容易確定本發(fā)明疫苗組合物的合適劑量。通常，合適的劑量在0.1至5毫升疫苗組合物之間。另外，根據(jù)待治療的人患者或動物種類(即它的體重、年齡和總體健康水平)，本領域技術人員也容易確定劑量。
通常，疫苗每一季節(jié)給予一次。在每個蜱生長季節(jié)(通常在春季)應給予強化接種。疫苗可通過任何合適的途徑給予。然而，腸胃外給藥、尤其是肌內(nèi)和皮下給藥是較佳的途徑?？诜o藥途徑也是較佳的。如果需要，給藥途徑可以聯(lián)合使用或作調(diào)節(jié)。
另外，疫苗可以是DNA疫苗，它包括P7-1 DNA序列或其片段、另一種彈夾串蛋白或其片段，任選地在調(diào)控序列的控制下。因此，編碼抗原的DNA可攜帶于載體(如病毒載體)內(nèi)。通常，合適的載體為基礎的治療每劑含有1×10-3pfu至1×1012pfu。然而，給予這些組合物的劑量、時間和方式可由本領域技術人員確定。在確定給予本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物的劑量、時間和方式時，可能要考慮諸如受接種者的年齡、身體條件之類的因素。
VIII.藥物篩選和開發(fā)本發(fā)明的蛋白、抗體和多核苷酸序列還可用來篩選和開發(fā)可用作治療性藥物的化學化合物或蛋白或治療或診斷或預防萊姆病的疫苗。一個例子是，能結(jié)合P39.5并防止其生物活性的化合物可能是一種治療或預防萊姆病的有用藥物成分。本文描述的方法也適用于P39.5的片段。類似地，能結(jié)合彈夾串蛋白或其片段并防止其生物活性的化合物可能是一種治療或預防萊姆病的有用藥物成分。
本領域技術人員很容易確定合適的試驗方法。當需要時，根據(jù)所選的試驗，可將所選抗原(例如P39.5)直接或間接(例如通過抗P39.5抗體)固定在合適的表面上(例如在ELISA方式中)。這些固定化表面是熟知的。例如，可采用可潤濕的惰性珠粒。或者，所選抗原(例如P39.5)可用于不需要固定化的篩選試驗(例如篩選組合文庫)。篩選和開發(fā)能結(jié)合本發(fā)明抗原(如P39.5)的藥物的試驗和技術是現(xiàn)成的。它們包括用噬菌體展示系統(tǒng)來表達抗原性蛋白，用轉(zhuǎn)染的大腸桿菌或其它微生物的培養(yǎng)物來產(chǎn)生蛋白用于潛在的結(jié)合化合物的結(jié)合研究。例如參見G.Cesarini，F(xiàn)EBS Letters307(1)66-70(1992年7月)；H.Gram等人，J.Immunol.Meth.，161169-176(1993)；C.Summer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893756-3760(1992年5月)中描述的技術，這些文獻均納入本文作參考。
用本發(fā)明的蛋白、抗體或多核苷酸序列可進行其它常規(guī)藥物篩選技術。一個例子是，鑒別特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白(如P39.5)的化合物的方法可簡單地包括下列步驟使所選P39.5蛋白和測試化合物接觸，以允許測試化合物與P39.5結(jié)合；測定結(jié)合P39.5蛋白的測試化合物的量(如果有的話)。該方法可能涉及培育測試化合物和固定在固體載體上的P39.5蛋白。對于一種或多種彈夾串蛋白可采用類似的方法。
通常，使含有固定配體的表面和含有蛋白的溶液接觸，并用合適的檢測系統(tǒng)測定結(jié)合。合適的檢測系統(tǒng)包括鏈霉親和素辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，直接偶聯(lián)標記如熒光素。其它系統(tǒng)是本領域技術人員所熟知的。本發(fā)明不局限于所用的檢測系統(tǒng)。
鑒別特異性結(jié)合本發(fā)明的P39.5或其它蛋白的化合物的另一個方法可包括下列步驟使固定在固體載體上的蛋白(如P39.5)和測試化合物以及一蛋白序列(它是P39.5的受體，允許該受體和P39.5蛋白結(jié)合)接觸；測定結(jié)合P39.5蛋白的受體的量。因此，測試化合物對正常蛋白結(jié)合的抑制表明測試化合物和P39.5蛋白有結(jié)合。對于一種或多種彈夾串蛋白可采用類似的方法。
因此，通過采用這些方法，預計本發(fā)明將提供能與P39.5或其部分和/或彈夾串蛋白或其部分相互作用并能按需增強或減少蛋白生物活性的化合物。相信這些化合物均包括在本發(fā)明內(nèi)。另外，無論在上文還是下文提到P39.5蛋白時，它均可被P7-1或一種或多種其它彈夾串蛋白代替。
下列實施例描述了獲得本發(fā)明的抗原蛋白以及準備本發(fā)明的試驗和組合物的較佳方法。這些實施例明顯表明，本發(fā)明的P39.5抗原可用來診斷和預防萊姆病并可能改善萊姆病血清學。這些實施例僅僅起描述作用，并沒有限制本發(fā)明的范圍。
實施例1疏螺旋體菌株和抗體A.細菌菌株從疾病控制和預防中心(Center for Disease Control and Prevention)獲得B.burgdorferi(狹義)JD1菌株[J.Piesman等人，J.Clin.Microbiol.，25557-558(1987)和T.G.Schwan等人，J.Clin.Microbiol.，271734-1738(1989)]并保藏低傳代(＜7)冷凍原種。B31也是一株B.burgdorferi(狹義)，購自CDC并如上所述方式保藏。IP90是一株B.garinii，它也由CDC提供。
B.burgdorferi生物在34℃ BSK-H培養(yǎng)基(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)中培育。
B.猴抗體使獼猴血清抗體和活的螺旋體一起培育，該獼猴已經(jīng)肩突硬蜱蛹叮咬而感染了B.burgdorferi株JD1。從螺旋體上洗滌除去未結(jié)合的抗體，用低pH緩沖液除去結(jié)合的抗體。猴抗體得自三個來源a)通過針頭接種感染B.burgdorferi JD1株的獼猴，b)通過使動物和感染JD1的肩突硬蜱蛹接觸而感染了B.burgdorferi JD1株的獼猴，c)用通過蜱接種的動物收集得到的抗血清作為原料，通過在活的螺旋體上親和純化得到，方法如下將3個蜱接種動物合并的體積為800微升的稀釋(1/40，用BSK-H培養(yǎng)基)熱滅活血清樣品和總共1×109活菌室溫培育30分鐘。培育后，4℃、13000xg離心樣品15分鐘。然后，如上所述再重新吸附上清液兩次。用BSK-H洗滌第一次吸附后回收的細菌沉淀三次，以除去未結(jié)合的抗體。在最后一次洗滌后，將沉淀重懸于400-500微升0.2M甘氨酸-HCl，pH2.2，0.5M NaCl中并離心?；厥丈锨逡?，加入2.0M Tris堿使pH回到7.00。
實施例2IP90的P39.5的初步鑒定使實施例1部分B的抗體和JD1、B31以及IP90螺旋體的全抽提物的Western印跡反應。Western印跡如下進行使抗原制備物在15％丙烯酰胺微型凝膠(10×10×0.1cm)和5％丙烯酰胺濃縮膠上作電泳。每條泳道中分配20微升含有7×108細菌裂解液或25微克蛋白(測定280nm OD)(整個制備型泳道有16個單泳道；因此每一制備型凝膠上加了400微克蛋白)。在23mA恒壓下用U.Laemmli，Nature，227680-685(1970)中的緩沖液用微型膠裝置(Integrated Separation Systems，Hyde Park，MA)進行電泳。為進行免疫印跡，如H.Towbin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354(1979)所述的，在Mighty Small轉(zhuǎn)移單元(Hoeffer Scientific Instruments，SanFrancisco，CA)中22伏恒壓下過夜將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上(Schleicher和Schuell，Keene，NH)。用膠體金(Integrated Separation Systems)對部分硝酸纖維素染色，評價轉(zhuǎn)移效率。在室溫下用含0.05％吐溫-20(Integrated SeparationSystems)的PBS(PBS-T)配制的3％脫脂奶粉(Carnation)封閉硝酸纖維素膜2小時。
在封閉步驟后，按照生產(chǎn)商說明書將膜固定在Miniblotter 45(Immunetics，Cambridge，MA)上，將110微升各血清樣品(用PBS-T 1/50稀釋)加入Miniblotter通道中，使其在振動平臺上室溫下和硝酸纖維素膜相互作用1小時。培育后，用多頭管系統(tǒng)以PBS-T洗滌膜。此時拆開Miniblotter，取出印跡。其余的培育步驟在小碟中進行。洗滌后，使膜和生物素化的抗人IgM(μ-鏈特異性)和IgG(γ-鏈特異性)抗體(Vector Laboratories，Burlingame，CA)(1/200稀釋在PBS-T中)培育1小時。用按照生產(chǎn)商說明書制備的親和素/生物素化的辣根過氧化物酶復合物(Vector)探測生物素化的抗體。用試劑4-氯-1-萘酚(Sigma)作為色原。用蒸餾水洗滌膜終止顏色反應。
從B.burgdorferi株JD1和B31以及B.garinii IP90株螺旋體裂解液制得Western印跡(圖6)，該印跡用經(jīng)JD1螺旋體針頭接種和蜱接種的猴血清以及后一血清經(jīng)親和純化除去全部活JD1螺旋體后獲得的抗體來顯影。親和純化的抗體識別B.burgdorferiJD1螺旋體全裂解液的Western印跡上的四種抗原。這些抗原被命名為P1(相對分子量(Mr)39-40,000)、P2(Mr35-37,000)、P3(Mr22-24,000)和P4(Mr18-19,000)。如所預計的那樣，這些抗原還被針頭接種動物的血清樣品以及蜱接種的猴血清識別。另外，該Western印跡表明，親和純化的抗體識別B31螺旋體上看來是P1、P2和P4的抗原、和B.garinii中看來是P1(相對分子量稍高)的抗原、以及一個相對分子量較高的額外抗原。這后兩種抗原也被針頭接種和蜱接種動物的血清專門識別。P1最后被鑒定為P39，也稱為BmpA。存在于IP90螺旋體上的相似抗原被暫時確定為P39.5，它顯示在上述Western印跡中。
實施例3依賴抗體的補體介導的JD1、B31和IP90螺旋體殺傷如下所述將蜱接種的猴血清用于ADCK試驗。37℃迅速融化冷凍的B.burgdorferi樣品，培育直至它們達到對數(shù)中期(大約3天，1-2×107螺旋體/毫升)，8000Xg離心2分鐘，重懸于BSK-H培養(yǎng)基中并固定。在96孔組織培養(yǎng)平板(Costar)中進行一式兩份的ADCK試驗。將25微升BSK-H培養(yǎng)基中總共5-6×105個螺旋體加入每個孔中，每個孔內(nèi)含有50微升熱滅活的(56℃、30分鐘)血清樣品(用相同的培養(yǎng)基1∶10稀釋)。在加入25微升補體(正常猴血清)之前，在3％CO2、5％O2及平衡量N2的氣體混合物中，34℃培育平板20分鐘。在相同條件下培育18-24小時后，在暗視野顯微鏡下定量測定死亡的(不動的)和活的(能動的)細菌的總數(shù)。以前已經(jīng)在類似試驗中確定了不運動和死亡之間的等效性[M.Aydintug等人，上文]。如果死亡螺旋體的平均百分數(shù)超過在正常血清存在時觀察到的殺傷平均百分數(shù)值的3倍，則認為殺傷作用是顯著的。
用JD1螺旋體蜱接種的動物的血清對B.burgdorferi株JD1和B31以及B.gariniiIP90株螺旋體進行ADCK。如實施例2所示，該血清僅僅識別IP90印跡上的兩個抗原，一個抗原的相對分子量與P1相似，另一個的相對分子量較高。如圖1所示，所有三種螺旋體株均被該血清殺死，這表明IP90 Western印跡中顯示的至少一種抗原是ADCK的靶。
實施例4P39.5的鑒定調(diào)查在IP90 Western印跡上看到的推定的BmpA(P39)條帶的身份。JD1和IP90裂解液的Western印跡用抗鞭毛蛋白單克隆抗體(Mab)、抗-P39單克隆抗體、抗-P39多克隆抗體、抗-P35單克隆抗體、抗BmpD多克隆抗體和用JD1螺旋體蜱接種的兩只猴子的血清顯象。在同一凝膠上進行的JD1和IP90抗原的比較性Western印跡分析中，兩種抗原抽提物和抗鞭毛蛋白單克隆抗體H9724反應。然而，抗BmpA單克隆抗體只和JD1 BmpA反應，用JD1的重組BmpA免疫接種的猴血清如所預計的那樣和JD1印跡強烈反應，但是和IP90的BmpA抗原的反應非常弱。而且，從兩只JD1感染猴獲得的血清樣品和前面一樣與IP90印跡上兩個相同的抗原反應，并且有時產(chǎn)生另一(更微弱)較高分子量條帶。兩者中分子量最低的條帶實際上對應于比IP90的BmpA更大的分子(用抗BmpA多克隆抗體鑒定)。此較高分子量條帶可能對應于鞭毛蛋白，因為它的分子量與和單克隆抗體H9724反應的IP-90的條帶相同。
產(chǎn)生的針對JD1 P35的單克隆抗體與JD1印跡上的該分子反應，但是不與IP90印跡上的該分子反應，而產(chǎn)生的針對JD1 BmpD的小鼠多克隆抗血清和JD1以及IP90兩者的BmpD反應(盡管IP90的BmpD條帶非常微弱)。因此，可能是ADCK的靶的IP90抗原的身份不是BmpA、BmpD或P35。它在后文被稱為P39.5。
然后使與下列物質(zhì)一起培育的JD1以及IP90螺旋體裂解液的Western印跡顯象蜱接種JD1的猴血清；針對P39的猴多克隆抗血清；針對鞭毛蛋白的小鼠單克隆抗體H9724；蜱接種JD1的猴血清樣品親和純化獲得的猴抗-P39.5抗體；和小鼠抗重組體P7-1(rP7-1)抗體。為了在JD1裂解液的Western印跡上鑒定P39.5，用附著IP90P39.5的硝酸纖維素條親和純化JD1感染猴中引發(fā)的抗-P39.5抗體。如所預計的那樣，該抗體和IP90裂解液的Western印跡上的P39.5抗原反應，但是令人驚奇的是，該抗體不能和JD1印跡反應。該結(jié)果暗示，JD1的P39.5或是不能在體外表達，或是表達稀疏而不能被親和純化的抗P39.5抗體在JD1印跡上檢測到，或是JD1體外表達的方式與經(jīng)親和純化除去IP90 P39.5的抗體不發(fā)生抗原性交叉反應。
顯然，JD1螺旋體必定在體內(nèi)表達P39.5，且表達量高得足以具有免疫原性，不然首先就不會誘導出經(jīng)親和純化的抗-P39.5抗體。在上述Western印跡中，BmpA的位置通過其和抗BmpA多克隆抗血清反應而得到表明，鞭毛蛋白的位置通過該分子和單克隆抗體H9724反應來表明。
因此，鑒定出一種由B.garinii IP90株豐富地體外表達和B.burgdorferi(狹義)株JD1體內(nèi)豐富表達的新的疏螺旋體抗原。該抗原P39.5是IP90螺旋體的ADCK試驗中的靶。
實施例5P39.5的克隆A.在噬菌體中克隆用λZAPII噬菌體載體[Stratagene，La Jolla，CA]構建B.burgdorferi IP90的隨機切割的總DNA文庫，并用感染B.burgdorferi JD1株的獼猴收集的混合血漿篩選。選出用與混合的血漿樣品，使得它們所含的抗體只識別某些IP90 Western印跡上所見的P39.5、假定的鞭毛蛋白和1或2個其它未鑒定的較高分子量的微弱條帶。
幾輪篩選后，將11個克隆拯救到pBluescript噬菌粒[Stratagene]中，純化重組質(zhì)粒并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE株的細胞。從每個原始克隆選出幾個轉(zhuǎn)化子，確認插入物的存在，使每個克隆的這樣一個轉(zhuǎn)化子生長，誘導表達，裂解并用原始的混合血漿作Western印跡分析。11個克隆的片段在斑點印跡雜交中相互雜交。
根據(jù)表達的蛋白和血漿抗體的強反應性，從11個克隆中選出1個(命名為7-1)進行過量表達和純化。7-1插入物的長度為950bp。
由于原始血漿樣品中的抗體用克隆作為免疫吸附劑作親和純化后所得抗體顯示能與B.garinii裂解液Western印跡上的P39.5反應，因此確認了所表達蛋白的身份是在抗原性上和P39.5相同或和P39.5交叉反應。使IP90螺旋體的Western印跡和感染了JD1螺旋體的猴血漿反應而顯影、該血漿經(jīng)B.garinii克隆1-1和克隆7-1表達的重組抗原親和純化獲得了抗體。在印跡中證實了IP90裂解液和合并猴血漿具有反應性。IP90裂解液顯示和重組1-1蛋白親和純化的抗體有反應性，并和重組7-1蛋白親和純化的抗體有反應性。
獲得P7-1的部分DNA序列[SEQ ID NO1]。從克隆7-1衍生獲得約950bp。另外，從克隆14獲得約140kb的上游區(qū)域[SEQ ID NO13]。5′SEQ ID NO13序列和SEQ ID NO1序列形成的DNA片段長1189bp，如圖2所示。它包括編碼37.7kDa的推定蛋白的一個開放讀框。其丙氨酸高含量導致了這一相當?shù)偷姆肿恿?。由于該蛋白氨基酸的平均分子量?5，因此丟失完整編碼區(qū)的約57個bp。由于沒有觀察到疏水性引導序列且P39.5具有脂蛋白的溶解性(見下文)，因此P7-1與P39.5在抗原性上有交叉，但是它不是完整的P39.5本身。
P7-1的推定氨基酸序列[SEQ ID NO14和2]以外的數(shù)據(jù)表明P39.5是脂蛋白。首先，在IP90全細胞抽提物中存在的天然形式的P39.5是完全可以抽提的，即它在Triton-X114相分離試驗中分配到洗滌劑相中。第二，其大部分序列由親水性結(jié)構域組成，非常類似于OspA，但是它必定是表達在外表面上的，因為它是抗體的靶標。第三，它和Borrelia hermsii脂蛋白Vmp家族幾個成員的相同百分率非常高，例如和Vmp4為22％，和Vmp23為19％，和Vmp17為18％，和Vmp21為17％。這些序列從GENBANK數(shù)據(jù)庫獲得。
其核苷酸序列的一個令人感興趣的特征是存在幾個內(nèi)部重復區(qū)域(如圖2所示)。方塊IA和IB有70％相同。方塊IIA和IIB的相同性高達91％，方塊A、B和C的相同性在84-90％之間。內(nèi)部僅有的唯一片段用黑色方塊表示。顯然，這種分子易經(jīng)歷在具有同源區(qū)域的OspA和OspB基因之間和內(nèi)部發(fā)生[P.Rosa等人，上文]的相同類型的同源重組。然而，如同參照OspA情況所證明的那樣[Sole等人，上文]，這些潛在的逃逸型突變體可能不能逃脫抗體和補體的聯(lián)合作用。
B.用QIAEXPRESSTM系統(tǒng)表達和純化重組P7-1Qiagen，Inc.(Chatsworth，CA)的QiaexpressTM系統(tǒng)利用了6連串組氨酸殘基對二價陽離子(如Ni)的高親和力。將后者偶聯(lián)于氮川三乙酸(NTA)，再和瓊脂糖連接。因為親和尾非常小(最小為6個殘基)，它可留在融合蛋白中而對蛋白的抗原性質(zhì)不會有嚴重后果。6個His的親和尾可以插入N端或C端。很多載體(pQE載體)均可用來構建兩種類型的融合。
首先篩選重組體以確定質(zhì)粒中預計插入物的存在。然后用Western印跡確認這些重組體中的蛋白表達。Western印跡用感染了對應株螺旋體的對照小鼠血清、或是特異性檢測MGRS(His)6表位(Qiagen)(是一些pQE載體[N端融合]中的親和標記序列)的小鼠抗體顯影。同樣靈敏的備選方案是用購自Qiagen的Ni-NTA-堿性磷酸酶偶聯(lián)物。
使含有融合構建物的大腸桿菌細胞生長至對數(shù)中期，用0.3mM IPTG誘導3小時，沉淀，用超聲處理緩沖液[50mM NaPO4，pH8.0，300mM NaCl]洗滌一次，-20℃貯藏過夜。第二天，將細胞重懸于超聲破碎緩沖液，于冰上用15秒脈沖超聲破碎共2分鐘。超聲破碎后立即加入絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF(苯基-甲基-磺酰氟(sulfonidefluoride))以防止該蛋白酶的降解作用。離心沉淀細胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管內(nèi)。同時，用10倍柱體積(cv)的超聲破碎緩沖液洗滌Ni-NTA樹脂一次。使融合蛋白在試管內(nèi)和Ni-NTA樹脂結(jié)合1小時。離心沉淀樹脂，棄去上清。將樹脂重懸于10倍柱體積的超聲破碎緩沖液中，倒入柱中，用10倍柱體積相同緩沖液洗滌3次，然后用10倍柱體積洗滌緩沖液[50mM NaPO4，pH6.3，300mM NaCl]洗滌3次。最后，用10倍柱體積洗脫緩沖液[50mM NaPO4，pH4.5，300mM NaCl]洗脫融合蛋白，并收集各級分。測定各級分中的蛋白含量，合并含有最高蛋白濃度的級分并用磷酸氫二鈉中和至pH7.0。計算合并樣品中的蛋白濃度，取一等份在SAS-PA凝膠上跑電泳，銀染檢查純度。典型的得率為4-5毫克/升培養(yǎng)物。
實施例6P7-1在猴中的體外保護性潛力通過吸收并從克隆7-1表達的含有重組P7-1蛋白(rP7-1)的硝酸纖維素條上酸洗脫下，從同一猴血漿合并物純化獲得抗P7-1抗體并用來篩選DNA文庫。如實施例2和4所述，在Western印跡上確認抗體的單特異性，如實施例3所述將該抗體用于ADCK。
已死IP90螺旋體的級分在和親和純化的抗P7-1抗體培育24小時后有55％(圖3，條2)。重建抗體其濃度等價于其血漿濃度的1∶10稀釋液。該殺傷率與1∶10稀釋的同一血漿觀察到的(67％，圖3，條1)相當。補體是實現(xiàn)殺傷作用所必需的，因為沒有補體時只有12％的螺旋體被殺死(圖3，條3)。在猴補體單獨存在時的殺傷作用稍高于平時，其值為25％(圖3，條4)，而最通常獲得的數(shù)值是10-15％，盡管用的是JD1螺旋體[M.Aydintug等人，Infect.Immun.，624929-4937(1994)]。在單用BSK-H培養(yǎng)基時，有12％的螺旋體死亡(條5)。
這些結(jié)果表明，在JD1螺旋體天然感染期間在猴體內(nèi)引發(fā)的針對IP90重組P7-1(P39.5的一個片段)抗原的抗體，能通過ADCK殺死IP90螺旋體。
這些試驗證明了P7-1的保護性潛力，并形成了選擇該抗原作為疫苗候選物的基礎。
實施例7P7-1在小鼠體內(nèi)的保護性潛力本實施例表明小鼠可用重組P7-1直接免疫接種。用rP7-1和Ribi佐劑免疫接種產(chǎn)生的小鼠抗體能通過依賴于抗體的補體介導的殺傷作用(ADCK)在體外殺死高達60％的IP90螺旋體。為了更直接地評價P7-1的保護性潛力，如實施例5所述將克隆7-1的DNA片段亞克隆到pQE中，純化毫克量的表達蛋白并用來免疫接種C3H/HeJ小鼠。對小鼠注射4次各含30微克重組P7-1的0.2毫升Ribi R-700佐劑(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)。R-700配方包括0.25毫克/毫升MPLTM、0.25毫克/毫升合成的海藻糖二棒桿菌分枝菌酸、20微升/毫升鯊烯(六甲基二十四烷六烯)和2微升/毫升單油酸(吐溫80)。每隔三周腹膜內(nèi)注射。末次免疫后兩周，將小鼠放血，用IP90螺旋體全細胞抽提物作為抗原通過Western印跡確認引發(fā)抗體的特異性，合并血清樣品。
單用Ribi佐劑免疫接種的小鼠血清不能識別IP90印跡上的抗原。用rP7-1和Ribi免疫接種的小鼠血清如所預計的那樣識別了IP90裂解液的P39.5條帶，但是還識別在41kDa鞭毛蛋白條帶稍稍上方的較弱的條帶以及較高分子量的條帶。令人感興趣的是，該同一小鼠抗體識別JD1裂解液Western印跡上的41kDa條帶，還有稍高分子量的抗原。
該結(jié)果與前述實施例中用親和純化的抗-rP7-1猴抗體獲得的結(jié)果不同，這可能是由于小鼠抗體親和力的成熟時間(12周)比猴抗體(4-5周)長得多。因此，其結(jié)合親和力更高，但其特異性更低，并且它能結(jié)合交叉反應的但不相同的表位。
在額外的強化注射后，在相同類型的試驗中，產(chǎn)生殺死60％IP90螺旋體的抗-P7-1抗體的小鼠，產(chǎn)生了殺死100％這些螺旋體的抗血清。另外，此同一抗血清能殺死50％的NT1株螺旋體(一種還未歸類的菌株，但可能是狹義的，因為它從美國東北部患者的腦脊髓液分離出)。相反，在蜱攻擊以rP7-1和Ribi佐劑免疫接種的小鼠的試驗中，沒有JD1株螺旋體能在體外(通過ADCK)或體內(nèi)被殺死。
用猴和豚鼠補體評價ADCK。用正常豚鼠血清(購自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)作為后一種情況時的補體來源。用感染了B.burgdorferi JD1的動物的同一合并猴血漿作為陽性對照。在1∶10的稀釋度下，該合并血漿在培育24小時后殺死了57％的IP90螺旋體(圖3，條1)。針對rP39.5的小鼠抗血清在1∶10的稀釋度下殺死了73.5％的螺旋體，在1∶50的稀釋度下殺死了60.5％的螺旋體(分別是條2和3)。單用Ribi佐劑免疫接種的小鼠血清殺死21％的螺旋體(條4)。豚鼠補體在ADCK試驗中的效果較差。在1∶10的稀釋度下，陽性對照血漿殺死了37％的螺旋體(條5)，而在同一稀釋度下，小鼠抗P39.5抗血清在豚鼠補體存在時殺死了48％的螺旋體(條6)。存在1∶10稀釋僅注射Ribi的小鼠血清時，12％的螺旋體被殺死(條7)。令人感興趣的是，當和1∶10稀釋的小鼠抗rP39.5抗血清培育時，只有6％的JD1螺旋體被殺死，該數(shù)值與只用對照血清殺死的數(shù)值沒有不同(未顯示)。因此，JD1印跡上被識別的條帶可能代表了亂真的交叉反應性，但不是JD1 P39.5。
實施例8 P7-1在人類的診斷用途從疾病控制和預防中心(CDC)獲得19份人血清樣品。四份樣品來自沒有萊姆病史且從未居住在該疾病流行區(qū)域的獻血者。其它15份樣品來自生活在萊姆病流行地區(qū)、具有該疾病體征和/或癥狀的患者，除一位患者外，根據(jù)CDC建議的標準，這些患者的血清呈陽性。該標準提出，患者對靈敏的萊姆病ELISA測試呈陽性，另外還對IgM或IgG Western印跡呈陽性，因此陽性IgM印跡中存在下列三條條帶(24、39或41kDa)中的至少兩條，陽性IgG印跡中存在下列10條條帶(18、21、28、30、39、41、45、58、66和93kDa)中的至少5條。
根據(jù)IgG抗體檢測為基礎的測試，方法是將1∶200稀釋的血清樣品和電泳印跡了純化的P39.5抗原的硝酸纖維素條一起培育，隨后用實施例2所述的免疫酶促方法檢測結(jié)合的抗體，產(chǎn)生了以下結(jié)果。來自沒有萊姆病史且從未居住在該疾病流行區(qū)域的獻血者的四份血清樣品沒有可檢測的抗-P39.5抗體。在其余15份樣品中，14份呈陽性。僅有的一份陰性樣品在CDC建議的標準下也未顯示出抗體。因此，通過這種初步評價，本文描述的根據(jù)P39.5抗原作為抗B.burgdorferi抗體的診斷性探針的簡單步驟和CDC目前建議的更復雜的兩步驟方法一樣靈敏和特異。
在另一個診斷試驗中，測試了7-1DNA片段表達的抗原性蛋白rP7-1作為探針用于獼猴萊姆病早期血清學診斷。從經(jīng)B.burgdorferi三種不同株B31、JD1和NT1分別感染的三對獼猴獲得的血清樣品，經(jīng)Western印跡檢測，至感染2周含有針對純化的rP7-1的可檢測抗體。同時測試IgM和IgG抗體。結(jié)果表明，針對P7-1的抗體于感染早期出現(xiàn)，不論引發(fā)抗體應答的B.burgdorferi是什么株。
再次用從CDC獲得的一組43份人血清樣品通過上述Western印跡評價抗體檢測的靈敏度。試驗以盲試驗方式進行。臨床診斷為萊姆病的患者的CDC樣品符合CDC定義該病的嚴格標準。在43份臨床陽性患者的樣品中，CDC通過MarDx Diagnostics.Inc.(萊姆病MarBlot)的Western印跡測試用Dressler標準[Dresslar，F(xiàn).等人，1993 J.Infect.Dis.，167392-40]判斷，報道說有34位呈陽性。利用P7-1抗原的診斷性Western印跡，相同數(shù)量的樣品(34)呈陽性，但是兩個試驗中的陰性或陽性結(jié)果并不始終相符。因此，在以P7-1為基礎的Western中檢測到單條帶(或未檢測到)，這是一種便于解釋的試驗，其靈敏度和目前市場上最好的但是難以解釋的萊姆病診斷測試的靈敏度相同。
在抗原特異性測試中，12份梅毒患者血清樣品中11份試驗呈陰性，盡管事實是所有樣品所含抗體和Western印跡上的全B.burgdorferi抗原的多種抗原有交叉反應。提供陽性結(jié)果的單份血清樣品來自還患有HIV感染以及幾種AIDS相關感染的患者。
實施例9彈夾串蛋白如上所述，從7-1片段的核苷酸序列預計的氨基酸序列與B.burgdorferi B31株的VlsE有大約50％的相同性。它是經(jīng)歷了抗原性變異的B.burgdorferi抗原的一部分，該抗原性變異的重組機制是表達拷貝的中心片段(VlsE)和位于表達拷貝上游的一串15個“彈夾”的片段重組而致[J.Zhang，上文]。
已克隆了看來是B.garinii IP90彈夾串一部分的幾個DNA片段。除了7-1外，這些片段(命名為1-1、3-1、6-1、9-1和12-1)的長度在1至2kb間。當以重組形式表達時(基本上如上文P7-1所述那樣(除去pBluescript的lacZ啟動子))，各彈夾串片段表達的肽的大小和插入物相稱，并和受感染猴的抗體反應。這些片段的5′端均不含疏水性前導序列或具有細菌脂蛋白特征的信號肽酶II共有序列。因此，這些片段必定是IP90的彈夾串的一部分，并且和B31的彈夾串一樣，它們在讀框內(nèi)。SEQ ID NO3至12描述了每個片段的5′和3′端DNA序列(在約100-500bp間)。注意，在SEQ ID NO10中只描述了片段9-1的5′端。
已通過兩種方式分析了這些片段的抗原性。首先，在蜱接種B.burgdorferi JD1后48周內(nèi)研究這些片段的Western印跡和從獼猴縱向(longitudinally)收集的血清樣品的反應性。片段9-1和7-1表達的蛋白主要與感染后(IP)2和24周之間收集的血清樣品反應(早期反應物)，片段3-1和6-1表達的蛋白主要與感染后24和48周之間收集的血清樣品反應(晚期反應物)，而片段1-1和12-1的蛋白在調(diào)查的長達48周長的時間范圍內(nèi)表現(xiàn)出相當一致的反應性。這一結(jié)果提示，每個克隆片段含有唯一的表位。
為了證實這一想法，用上述Western印跡分析中采用的樣品構建血清庫，使該“時間”庫等份預先和過量的7-1表達的純化的抗原(rP7-1)培育。這樣，存在于血清庫中的抗P7-1抗體不再和Western印跡上的P7-1抗原反應。盡管如此，該血清庫仍然能和其它DNA片段表達的蛋白反應(12-1除外)。由于后者是“晚期”反應物，因此針對推定的12-1唯一的表位的抗體，可能已經(jīng)在血清庫中被稀釋。如上文P7-1所述的那樣，將所有上述片段亞克隆到pQE載體中，用常規(guī)方法進行表達。
本發(fā)明者提出這樣一個理論IP90 P39.5抗原憑借其與B31的vls E抗原的同源性而經(jīng)歷的抗原性變異的機制，表明該抗原對于脊椎動物宿主中螺旋體的存活非常關鍵。因此，將本發(fā)明的方法和組合物設計成通過用彈夾串上表達的、正是變異來源的大組分表位免疫接種宿主，來避開螺旋體的防御機制。這成為可能的唯一事實是大部分該彈夾串在讀框內(nèi)。因此，如上所述，一種疫苗接種方法涉及給予宿主上述幾種或全部克隆和純化的蛋白，這些蛋白由IP90彈夾串的抗原性不相似片段衍生獲得。例如參見當將P7-1導入宿主中并誘導殺死螺旋體的抗體時所獲得的結(jié)果。
所有上述文獻和優(yōu)先權文本均納入本文作參考。對本發(fā)明的眾多改進和變化也包括在上述確定的說明書中，并且是本領域技術人員顯然能預計到的。對本發(fā)明的組合物和方法所作的修飾和變化被認為包括在本文所附權利要求的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請人Adminis.of Tulane Educational，F(xiàn)undPhilipp，Mario T.
(ii)發(fā)明名稱診斷和預防萊姆病用的組合物的表面抗原和蛋白質(zhì)(iii)序列數(shù)目14(iv)通信地址(A)地址Howson and Howson(B)街道Spring House Corporate Cntr.，P.O.Box 457(C)城市Spring House(D)STATEPennsylvania(E)國家USA(F)郵編19477(v)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朩O(B)申請日(C)分類(vii)在先申請信息(A)申請?zhí)朥S60/051,271(B)申請日1997年6月30日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Bak，Mary E.
(B)登記號31,215(C)文獻/案卷號TUL2APCT(ix)電訊信息(A)電話215-540-9200(B)電傳215-540-5818(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1047堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知
(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關鍵字CDS(B)位置1.1047(xi)序列描述SEQ ID NO1AAG AAT AAT GAT CAT GAT AAT CAT AAG GGG ACT GTT AAG AAT GCT GTT 48Lys Asn Asn Asp His Asp Asn His Lys Gly Thr Val Lys Asn Ala Val1 5 10 15GAT ATG GCA AAG GCC GCT GAG GAA GCT GCA AGT GCT GCA AGT GCT GCT 96Asp Met Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala20 25 30ACT GGT AAT GCA GCG ATT GGG GAT GTT GTT AAG AAT AGT GGG GCA GCA 144Thr Gly Asn Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Lys Asn Ser Gly Ala Ala35 40 45GCA AAA GGT GGT GAG GCG GCG AGT GTT AAT GGG ATT GCT AAG GGG ATA 192Ala Lys Gly Gly Glu Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile50 55 60AAG GGG ATT GTT GAT GCT GCT GGA AAG GCT GAT GCG AAG GAA GGG AAG 240Lys Gly Ile Val Asp Ala Ala Gly Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys65 70 75 80TTG GAT GCT ACT GGT GCT GAG GGT ACG ACT AAC GTG AAT GCT GGG AAG 288Leu Asp Ala Thr Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Val Asn Ala Gly Lys85 90 95TTG TTT GTG AAG AGG GCG GCT GAT GAT GGT GGT GAT GCA GAT GAT GCT 336Leu Phe Val Lys Arg Ala Ala Asp Asp Gly Gly Asp Ala Asp Asp Ala100 105 110GGG AAG GCT GCT GCT GCG GTT GCT GCA AGT GCT GCT ACT GGT AAT GCA 384Gly Lys Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly Asn Ala115 120 125GCG ATT GGA GAT GTT GTT AAT GGT GAT GTG GCA AAA GCA AAA GGT GGT 432Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asp Val Ala Lys Ala Lys Gly Gly130 135 140GAT GCG GCG AGT GTT AAT GGG ATT GCT AAG GGT ATA AAG GGG ATT GTT 480Asp Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile Lys Gly Ile Val145 150 155 160GAT GCT GCT GAG AAG GCT GAT GCG AAG GAA GGG AAG TTG AAT GCT GCT 528Asp Ala Ala Glu Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys Leu Asn Ala Ala165 170 175GGT GCT GAG GGT ACG ACT AAC GCG GAT GCT GGG AAG TTG TTT GTG AAG 576Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Ala Asp Ala Gly Lys Leu Phe Val Lys180 185 190AAT GCT GGT AAT GTG GGT GGT GAA GCA GGT GAT GCT GGG AAG GCT GCT 624Asn Ala Gly Asn Val Gly Gly Glu Ala Gly Asp Ala Gly Lys Ala Ala195 200 205GCT GCG GTT GCT GCT GTT AGT GGG GAG CAG ATA TTA AAA GCG ATT GTT 672Ala Ala Val Ala Ala Val Ser Gly Glu Gln Ile Leu Lys Ala Ile Val210 215 220CAT GCT GCT AAG GAT GGT GGT GAG AAG CAG GGT AAG AAG GCT GCG GAT 720His Ala Ala Lys Asp Gly Gly Glu Lys Gln Gly Lys Lys Ala Ala Asp225 230 235 240CGT ACA AAT CCC ATT GAC GCG GCT ATT GGG GGT GCG GGT GAT AAT GAT 768Arg Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly Gly Ala Gly Asp Asn Asp245 250 255GCT GCT GCG GCG TTT GCT ACT ATG AAG AAG GAT GAT CAG ATT GCT GCT 816Ala Ala Ala Ala Phe Ala Thr Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala260 265 270GCT ATG GTT CTG AGG GGA ATG GCT AAG GAT GGG CAA TTT GCT TTG AAG 864Ala Met Val Leu Arg Gly Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys275 280 285GAT GCT GCT GCT GCT CAT GAA GGG ACT GTT AAG AAT GCT GTT GAT ATA 912Asp Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Thr Val Lys Asn Ala Val Asp Ile290 295 300ATA AAG GCT GCT GCG GAA GCT GCA AGT GCT GCA AGT GCT GCT ACT GGT 960Ile Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly305 310 315 320AGT GCA GCA ATT GGG GAT GTT GTT AAT GGT AAT GGA GCA ACA GCA AAA 1008Ser Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asn Gly Ala Thr Ala Lys325 330 335GGT GGT GAT GCG AAG AGT GTT AAT GGC ATT GCT AAG GGA 1047Gly Gly Asp Ala Lys Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly340 345(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度349氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID N02Lys Asn Asn Asp His Asp Asn His Lys Gly Thr Val Lys Asn Ala Val1 5 10 15Asp Met Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala20 25 30Thr Gly Asn Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Lys Asn Ser Gly Ala Ala35 40 45Ala Lys Gly Gly Glu Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile50 55 60Lys Gly Ile Val Asp Ala Ala Gly Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys65 70 75 80Leu Asp Ala Thr Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Val Asn Ala Gly Lys85 90 95Leu Phe Val Lys Arg Ala Ala Asp Asp Gly Gly Asp Ala Asp Asp Ala100 105 110Gly Lys Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly Asn Ala115 120 125Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asp Val Ala Lys Ala Lys Gly Gly130 135 140Asp Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile Lys Gly Ile Val145 150 155 160Asp Ala Ala Glu Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys Leu Asn Ala Ala165 170 175Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Ala Asp Ala Gly Lys Leu Phe Val Lys180 185 190Asn Ala Gly Asn Val Gly Gly Glu Ala Gly Asp Ala Gly Lys Ala Ala195 200 205Ala Ala Val Ala Ala Val Ser Gly Glu Gln Ile Leu Lys Ala Ile Val210 215 220His Ala Ala Lys Asp Gly Gly Glu Lys Gln Gly Lys Lys Ala Ala Asp225 230 235 240Arg Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly Gly Ala Gly Asp Asn Asp245 250 255Ala Ala Ala Ala Phe Ala Thr Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala260 265 270Ala Met Val Leu Arg Gly Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys275 280 285Asp Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Thr Val Lys Asn Ala Val Asp Ile290 295 300Ile Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly305 310 315 320Ser Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asn Gly Ala Thr Ala Lys325 330 335Gly Gly Asp Ala Lys Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly340 345(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度283堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCGCTGGAT GGTGGTGAGA AGCAGGGTAA GAAGGCTGCG GATCGTACAA ATCCCATTGA 60CGCGGCTATT GGGGGTGCGG GTGATAATGA TGCTGCTGCG GCGTTTGCTA CTATGAAGAA 120GGATGATCAG ATTGCTGCTG CTATGGTTCT GAGGGGAATG GCTAAGGATG GGCAATTTGC 180TTTGAAGGAT GCTGCTGCTG CTCATGAAGG GACTGTTAAG AATGCTGTTG ATATAATAAA 240GGCTGCTGCG GAAGCTGCAA GTGCTGCAAG TGCTGCTACT GGT 283(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度233堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4TTTATTATAT CAACAGATTC TTAACAGTCC CTTCATGAGC AGCAGCAGCA TCCTTCAAAG 60CAAATTGCCC ATCCTTAGCC ATTCCCCTCA GAACCATAGC AGCAGCAATC TGATCATCCT120TCTTCATAGT AGCAAACGCC GCAGCAGCAT CATTATCACC CGCACCCCCA ATAGCCGCGT180CAATCGGATT TGTACGATCC GCAGCCTTCT TACCCTGCTT CTCACCACCA TCC 233(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度194堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5CCGTGCAAGC TGGGTTGAAG AAGGTTGGGG ATGTTGTTAA GAATAGTGAG GCAAAAGATG 60GTGATGCGGC GAGTGTTAAT GGGATTGCTA AGGGGATAAA GGGGATTGTT GATGCTGCTG120AGAAGGCTGA TGCGAAGGAA GGGAAGTTGG TATGTGGCTG GTGCTGCTGG TGAAACTAAC180AAGGAAGCGG CCGC 194(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度369堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO6GCGGCCGCTT GAGGAAGCTG CAAGTGCTGC AAGTGCTGCT ACTGGTAATG CAGCGATTGG 60GGATGTTGTT AAGAATAGTG GGGCAGCAGC AAAAGGTGGT GAGGCGGCGA GTGTTAATGG120GATTGCTAAG GGGATAAAGG GGATTGTTGA TGCTGCTGGA AAGGCTGATG CGAAGGAAGG180GAAGTTGGAT GCTACTGGTG CTGAGGGTAC GACTAACGTG AATGCTGGGA AGTTGTTTGT240GAAGAGGGCG GCTGATGATG GTGGTGATGC AGATGATGCT GGGAAGGCTG CTGCTGCGGT300TGCTGCAAGT GCTGCTACTG GTAATGCAGC GATTGGAGAT GTTGTTAATG GTGATGTGGC360AAAACAAAA369(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度142堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7AAGGATGGTG ATGATAAGCA GGGTAAGAAG GCTGAGGATG CTACAAATCC GATTGACGCG 60GCTATTGGGG GTGCAGGTGC GGGTGCTAAT GCTGCTGCGG CGTTTAATAA TATGAAGAAG120GATGATCAGA TTGAGCGGCC GC 142(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度210堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8GGTGAAACTA ACAAGGATGC TGGGAAGTTG TTTGTGAAGA AGAATGGTGA TGATGGTGGT 60GATGCAGGTG ATGCTGGGAA GGCTGCTGCT GCGGTTGCTG CTGTTAGTGG GGAGCAGATA120TTAAAAGCGA TTGTTGATGC TGCTAAAGAT GGTGATAAGA CGGGGGTTAC TGATGTAAAG180GATGCTACAA ATCCGATTGA CGCGGCTATT 210(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度236堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9TATATAATAA AGGCTGCTGC GAAGCTGCAA GTGCTGCAAG TGCTGCTACT GGTAGTGCAG 60CAATTGGGGA TGTTGTTAAT GGTAATGGAG CAACAGCAAA AGGTGGTGAT GCGAAGTGTT120AATGGGATTG CTAAGGGGAT AAAGGGGATT GTTGATGCTG CTGAGAAGGC TGATGCGAAG180GAAGGGAAGT TGGATGTGGC TGGTGATGCT GGTGAAACTA ACAAGGAAGC GGCCGC236(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度199堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO10ATGAGAGGAT CTCATCACCA TCACCATCAC ACGGATCCCC CGGGCTGCAG GAATTCGCGG 60CCGCTGAAGG CTGATGCGAA GGAAGGGAAG TTGGATGTGG CTGGTGCTGC TGGTGAAACT120AACAAGGATG CTGGGAAGTT GTTTGTGAAG AAGAATAATG AGGGTGGTGA AGCAAATGAT180GCTGGGAAGG CTGCTGCTG 199(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度272堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11GCCGCTGGAT GATCAGATTG CTGCTGCTAT GGTTGTGAGG GGAATGGCTA AGGATGGGCA 60GTTTGCTTTG AAGGATGATG CTGCTAAGGA TGGAGATAAA ACGGGGGTTG CTGCGGATGT120GAAAATCCGA TTGACGCGGC TATTGGGGGT GCGGATGCTG ATGCTGCGGC GTTTAATAAG180GAGGGGATGA AGAAGGATGA TCAGATTGCT GCTGCTATGG TTCTGAGGGG AATGGCTAAG240GATGGGCAGT TTGCTTTGAC GAATAATGCT GC 272(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度289堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12ACTGTTAAGA ATGCTGTTGA TATAATAAAG GCTGCTGCGG AAGCTGCAAG TGCTGCAAGT 60GCTGCTACTG GTAGTGCAGC AATTGGGGAT GTTGTTAATG GTAATGGAGC AACAGCAAAA120GGTGGTGATG CGAAGAGTGT TAATGGGATT GCTAAGGGGA TAAAGGGGAT TGTTGATGCT180GCTGAGAAGG CTGATGCGAA GGAAGGGAAG TTGGATGTGG CTGGTGATGC TGGTGAAACT240AACAAGGATG CTGGGAAGTT GTTTGTGAAG AACAATGGTA ATGAGGGTA289(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征
權利要求
1.一種編碼和天然伴隨細胞物質(zhì)分離的P39.5或其片段的核酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其ATCC保藏號為No.98478。
3.一種編碼P39.5或其片段的核酸序列，它選自(a)SEQ ID NO1；(b)SEQ ID NO3；(c)SEQ ID NO4；(d)SEQ ID NO5；(e)SEQ ID NO6；(f)SEQ ID NO7；(g)SEQ ID NO8；(h)SEQ ID NO9；(i)SEQ ID NO10；(j)SEQ ID NO11；(k)SEQ ID NO12；(1)SEQ ID NO13；(m)在嚴謹條件下和(a)至(l)任一序列雜交的序列；(n)(a)至(m)任一序列的等位基因變體；(o)(a)至(m)任一序列的片段；(p)(a)的缺失型突變體。
4.一種分離的P39.5蛋白，它由疏螺旋體屬螺旋體體外表達，具有39,500道爾頓的相對分子量。
5.根據(jù)權利要求4所述的蛋白，它包含選自下列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2；(b)SEQ ID NO14；(c)(a)或(b)的片段；(d)(a)或(b)的類似物，其特征在于和SEQ ID NO2或14的同源性至少為80％；和(e)(a)或(b)的同源物，其特征在于和SEQ ID NO2或14的同源性至少為80％。
6.一種重組蛋白，它選自(a)含有SEQ ID NO2或14的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其類似物、同源物或片段；(b)一種融合蛋白，它包含SEQ ID NO2或14的氨基酸序列，或其類似物、同源物或片段和第二蛋白融合；(c)一種融合蛋白，它包含SEQ ID NO2或14的氨基酸序列，其中加入了與SEQID NO2或14相同性高達95％的片段；(d)一種缺失蛋白，它包含其中缺失了一個或多個氨基酸SEQ ID NO2或14的氨基酸序列。
7.一種載體，它包含在合適的調(diào)控序列控制下的編碼P39.5或其片段的核酸序列。
8.一種用權利要求7所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
9.一種重組表達P39.5基因或其片段的方法，該方法包括在允許該基因表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)P39.5核酸序列或其片段轉(zhuǎn)化的重組宿主細胞的步驟。
10.一種重組表達P39.5蛋白或其多肽或肽片段的方法，該方法包括在允許所述蛋白或肽表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)編碼所述蛋白或片段的核酸序列轉(zhuǎn)化的重組宿主細胞的步驟。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，它還包括從所述細胞或細胞培養(yǎng)基分離所述表達蛋白的方法。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述P39.5蛋白是融合蛋白。
13.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述P39.5蛋白是缺失突變型蛋白。
14.一種制備P39.5蛋白或其片段的方法，該方法包含化學合成所述蛋白或片段。
15.一種診斷試劑，該試劑包含選自下列的核酸序列(a)編碼和天然伴隨細胞物質(zhì)分離的P39.5的核酸序列；(b)SEQ ID NO1或其互補序列；(c)SEQ ID NO3或其互補序列；(d)SEQ ID NO4或其互補序列；(e)SEQ ID NO5或其互補序列；(f)SEQ ID NO6或其互補序列；(g)SEQ ID NO7或其互補序列；(h)SEQ ID NO8或其互補序列；(i)SEQ ID NO9或其互補序列；(j)SEQ ID NO10或其互補序列；(l)SEQ ID NO11或其互補序列；(m)SEQ ID NO12或其互補序列；(n)SEQ ID NO13或其互補序列；(o)在嚴謹條件下和(a)至(n)任一序列雜交的序列；(p)(a)至(o)任一序列的等位基因變體；(q)包含至少15個核苷酸長度的(a)至(o)任一序列的片段；(r)(a)，(b)或(n)的缺失型突變體；和(s)編碼P39.5或其片段并與編碼第二蛋白的序列融合的序列；以及與所述序列相連的可檢測標記。
16.一種分離的抗體，它針對P39.5或其片段。
17.根據(jù)權利要求16所述的抗體，它通過給予脊椎動物宿主選自P39.5、P7-1、P1-1、P3-1、P6-1、P9-1和P12-1的蛋白或片段而產(chǎn)生，所述抗體能通過依賴于抗體的補體介導的殺傷作用在體外殺死IP90螺旋體。
18.根據(jù)權利要求16所述的抗體，它通過用權利要求6所述的蛋白免疫接種所述宿主分離獲得。
19.根據(jù)權利要求16所述的抗體，它選自嵌合抗體、人化抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。
20.一種抗體，它通過用疏螺旋體P39.5蛋白或其片段作為免疫吸附劑，親和純化JD1螺旋體感染獼猴所產(chǎn)生的抗血清分離獲得。
21.一種對權利要求16所述的抗體有特異性的抗獨特型抗體。
22.一種診斷性試劑，它包含權利要求16所述的抗體以及可檢測的標記。
23.一種疫苗組合物，它包含有效量的P39.5蛋白、其融合蛋白或其片段以及藥學上可接受的載體。
24.根據(jù)權利要求23所述的組合物，其中所述片段選自P7-1、P1-1、P3-1、P6-1、P9-1和P12-1。
25.根據(jù)權利要求23所述的組合物，其中所述組合物包含至少一種其它B.burgdoferi抗原或其片段。
26.根據(jù)權利要求25所述的組合物，其中所述其它抗原選自OspA、OspB、OspC、BmpA、BmpB、BmpC、BmpD及其片段或變體。
27.根據(jù)權利要求23所述的組合物，其中所述組合物包含具有與P39.5或其片段同源序列的至少一種其它蛋白或其片段。
28.根據(jù)權利要求23所述的組合物，它包含各個蛋白的混合物。
29.根據(jù)權利要求25所述的組合物，其中所述P39.5蛋白或片段以及所述其它抗原是融合蛋白形式。
30.一種對人或動物接種疫苗抵抗萊姆病的方法，該方法包括給予所述人或動物一種組合物，該組合物包含有效量的權利要求23所述的組合物。
31.一種診斷人或動物萊姆疏螺旋體病的方法，該方法包括下列步驟將抗P7-1或抗39.5抗原或其同源物和待診斷的人或動物的生物學液體樣品一起培育，其中在B.burgdorferi存在下形成抗原-抗體復合物，隨后分析所述液體樣品中所述復合物的存在。
32.一種用來治療人或動物萊姆病的治療性組合物，該組合物包含至少一種抗P39.5或抗P7-1抗體以及合適的藥學載體。
33.一種治療脊椎動物宿主萊姆病的方法，該方法包括給予有效量的權利要求32所述的組合物。
34.一種用于診斷人或動物感染B.burgdorferi的試劑盒，該試劑盒包含P39.5蛋白或其片段或權利要求16所述的抗P39.5抗體。
35.一種用于預防萊姆病的疫苗，該疫苗包含由螺旋體在脊椎動物宿主體內(nèi)時表達的表面抗原。
36.一種鑒別特異性結(jié)合P39.5或其片段的化合物的方法，該方法包括下列步驟使所述P39.5蛋白或片段和測試化合物接觸，以使測試化合物與P39.5結(jié)合；和測定結(jié)合于P39.5的測試化合物的量。
37.一種用權利要求36所述的方法鑒定出的化合物。
38.一種核酸序列，它編碼從天然伴隨的細胞物質(zhì)分離出來的以及選自1-1、3-1、6-1、9-1和12-1的疏螺旋體彈夾串的蛋白或其片段。
39.一種疏螺旋體彈夾串的蛋白或其片段，它與其天然伴隨的細胞物質(zhì)分離，并選自P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1。
40.一種載體，它包含在合適調(diào)控序列控制下的編碼疏螺旋體彈夾串蛋白或其片段的核酸序列。
41.一種用權利要求40所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
42.一種重組表達B.garinii彈夾串蛋白或其片段的方法，該方法包括在允許所述序列表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)B.garinii彈夾串核酸序列或其片段轉(zhuǎn)化的重組宿主細胞的步驟。
43.一種重組表達B.garinii彈夾串蛋白或其肽片段的方法，該方法包括在允許所述蛋白或肽表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)編碼所述蛋白或片段的核酸序列轉(zhuǎn)化的重組宿主細胞的步驟。
44.根據(jù)權利要求43所述的方法，該方法還包括從所述細胞或所述細胞培養(yǎng)基分離所述表達的蛋白的步驟。
45.根據(jù)權利要求43所述的方法，其中所述疏螺旋體彈夾串蛋白或肽片段是融合蛋白或缺失突變型蛋白。
46.一種制備B.garinii彈夾串蛋白或肽片段的方法，該方法包括用化學方法合成所述蛋白或片段。
47.一種分離的抗B.garinii彈夾串蛋白的抗體。
48.根據(jù)權利要求47所述的抗體，它通過給予脊椎動物宿主B.garinii彈夾串蛋白或片段來產(chǎn)生。
49.根據(jù)權利要求48所述的抗體，它通過用疏螺旋體彈夾串蛋白作為免疫吸附劑親和純化JD1螺旋體感染獼猴產(chǎn)生的抗血清分離獲得。
50.根據(jù)權利要求47所述的抗體，它通過用權利要求39所述的蛋白或所述彈夾串蛋白的混合物免疫接種所述宿主來分離獲得。
51.根據(jù)權利要求47所述的抗體，它選自嵌合抗體、人化抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。
52.一種對權利要求47所述的抗體有特異性的抗獨特型抗體。
53.一種診斷性試劑，它包含權利要求47所述的抗體以及可檢測標記。
54.一種疫苗組合物，它包含有效量的至少一種疏螺旋體彈夾串蛋白、融合蛋白或其片段和藥學上可接受的載體。
55.根據(jù)權利要求54所述的組合物，它包含不同疏螺旋體彈夾串蛋白或片段的混合物。
56.根據(jù)權利要求54所述的組合物，它包含至少一種其它的B.burgdorferi抗原或其片段。
57.根據(jù)權利要求56所述的組合物，其中所述其它抗原選自OspA、OspB、OspC、BmpA、BmpB、BmpC、BmpD及其片段或變體。
58.根據(jù)權利要求54所述的組合物，該組合物包含P39.5或具有與P39.5同源的序列的至少一種其它蛋白或其片段。
59.一種對人或動物接種疫苗抵抗萊姆病的方法，該方法包括給予所述人或動物一種組合物，該組合物包含有效量的權利要求54所述的組合物。
60.一種診斷人或動物萊姆疏螺旋體病的方法，該方法包括下列步驟將抗疏螺旋體彈夾串蛋白的抗體和待診斷的人或動物的生物學液體樣品一起培育，其中在B.burgdorferi存在下形成抗原-抗體復合物，隨后分析所述液體樣品中所述復合物的存在。
61.一種用來治療人或動物萊姆病的治療性組合物，該組合物包含至少一種疏螺旋體彈夾串蛋白的抗體或其片段的抗體，以及合適的藥學載體。
62.一種治療脊椎動物宿主萊姆病的方法，該方法包括給予有效量的權利要求61所述的組合物。
63.一種用于診斷人或動物感染B.burgdorfei的試劑盒，該試劑盒包含疏螺旋體彈夾串蛋白或其片段或針對它們的抗體。
64.一種鑒定特異性結(jié)合疏螺旋體彈夾串蛋白或其片段的化合物的方法，該方法包括下列步驟使所述蛋白或片段和測試化合物接觸，以使測試化合物與所述彈夾串蛋白或片段結(jié)合；和測定結(jié)合于所述蛋白或片段的測試化合物的量。
65.一種用權利要求64所述的方法鑒定的化合物。
全文摘要
一種新的分離的Borrielia burgdorferi(廣義)表面抗原,其特征是相對分子量為39.5kDa。該抗原由廣義的B.burgdorferi株螺旋體體外表達。該抗原誘導出的抗體在體外通過ADCK殺死B.burgdorferi(廣義)株螺旋體。新的疏螺旋體彈夾串蛋白或其片段和P39.5蛋白一樣也可用于診斷萊姆病并用于治療或預防萊姆病的組合物中。
文檔編號A61P31/04GK1261896SQ98806699
公開日2000年8月2日 申請日期1998年6月29日 優(yōu)先權日1997年6月30日
發(fā)明者M·T·菲利浦 申請人:杜雷安教育基金會行政處