專利名稱:在酵母中生產(chǎn)乙型肝炎病毒蛋白質(zhì)的方法
乙型肝炎病毒(HBV)是與若干種人類肝臟疾病有關(guān)的傳染因子。許多被HBV感染的人都經(jīng)歷一個急性的階段，然后恢復(fù)。然而，有許多人不能根絕感染，從此成為慢性乙型肝炎病毒的攜帶者。HBV感染在世界的許多地方流行，有很高的感染發(fā)生率是在圍產(chǎn)期由患慢性感染的母親傳染給她們的新生兒。全世界的慢性感染(肝炎病毒)攜帶者據(jù)估計超過三億人。在這些攜帶者中，每年有成千上萬的人死于慢性乙型肝炎引起的病變(肝硬化或肝細胞腫瘤)。
HB病毒粒子是由兩組結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成的，即核蛋白與外殼或外表(“S”)蛋白。S蛋白除了作為病毒顆粒即Dane顆粒的主要外表蛋白外，它是澳大利亞抗原即22nm顆粒的唯一的組成要素。“S”蛋白質(zhì)為一個編碼389-400個氨基酸(具體數(shù)字視血法型而定)的大的開放閱讀框架(ORF)的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物。ORF被分成三個區(qū)域其中每個區(qū)域以ATG密碼子開頭，具有在體外作為轉(zhuǎn)譯起始位點的作用。這些區(qū)域在基因上相應(yīng)的從5′至3′的順序上分別被稱為pre S-1(108-119氨基酸)、pre S-2(55氨基酸)及S(226氨基酸)。從ORF中得出的六種蛋白質(zhì)產(chǎn)物有以下的成份1)gp42(42，000道爾頓糖蛋白)＝pre S-1/pre S-2/S(表示pre S-1與pre S-2相鄰，再與S相鄰)2)p39(p＝蛋白質(zhì))＝pre S-1/pre S-2/S
3)gp36＝pre S-2/S(兩個糖基化位點)4)gp33＝pre S-2/S(一個糖基化位點)5)gp27＝S(一個糖基化位點)6)p24＝S在HBVDane顆粒中所有六種蛋白質(zhì)大約都是等克分子的范圍。在22nm顆粒中，4個較少的蛋白大約是等克分子的范圍，而gp42及p39在每個顆粒中最多只出現(xiàn)一個或幾種分子。
22nm顆?；騂B表面抗原(HBs Ag)顆粒已從慢性感染(病毒)攜帶者的胞漿中提純。由于它們的胞漿(血漿)為陽性顆粒的，這些慢性感染的攜帶者被稱為HBs+。當這些攜帶者發(fā)動一次足夠的免疫反應(yīng)時能夠清除感染而成為HBs-。由于他們體內(nèi)形成了抗HBs的抗體，這些人是抗HBs+的。因此，抗HBs+與疾病的痊愈是相互關(guān)聯(lián)的。因而，希望能夠通過HB疫苗來刺激或形成抗體-HBs+以提供抵抗HBV感染的保護作用。
通過實驗來對這種假設(shè)進行驗證。除人之外，黑猩猩是唯一的對HBV感染完全敏感的種，這可以通過黑猩猩的諸如HBs+、肝酶的血清水平的提高等可以數(shù)量衡量的標志反映出來。黑猩猩被用三種劑量的提純的HBs Ag顆粒接種之后，用大劑量的傳染性HBV對其進行襲擊。當模擬接種的黑猩猩出現(xiàn)患有急性HBV感染的征兆時，用HBs Ag接種的黑猩猩得到了完全的保護而不出現(xiàn)任何感染的征兆。因此，在該實驗系統(tǒng)中，由gp27及p24(僅為S區(qū)域)組成的HBs Ag顆粒已足以引起保護性的免疫。在這些現(xiàn)察結(jié)果的激勵下，有人生產(chǎn)出了由HBs Ag顆粒組成的HB疫苗。
最近的實驗結(jié)果表明pre S-1及pre S-2區(qū)域能在抵抗HBV感染的免疫中擔當重要的角色。針對pre S-1的抗體(用一個由pre S-1的10至32個氨基酸殘基組成的肽通過免疫作用誘導(dǎo)而得)及針對pre S-2的抗體(用一個pre S-2的1至26個氨基酸殘基組成的肽通過免疫作用的誘導(dǎo)而得)在體外實驗中都同樣具有阻斷HBV與人類肝癌細胞之間的連接的功能?？笻Bs(從用缺少pre S-1或pre S-2的HBs Ag接種的病人身上的血清中獲得)不能產(chǎn)生阻斷連接的作用。如果在體外模仿體內(nèi)感染pre-S(即pre S1及pre S2全都連接起來)區(qū)域可以代表HBV與其肝細胞受體之間的連接位點，抗pre S可以阻斷HBV的連接從而阻斷感染的發(fā)生。此外，還發(fā)現(xiàn)在從急性的HBV感染痊愈的階段中抗pre S的滴定度增加，表明這些抗體對痊愈所起的作用。最終，還證明用108氨基酸的pre S多肽(27-119個pre S-1殘基與1-16個pre S-2殘基鄰接)對黑猩猩進行接種在某種程度具有抵抗HBV挑戰(zhàn)的保護作用?？傊@些實驗現(xiàn)象表明pre-S區(qū)域是目前的HB疫苗的有用的成分。
為了擴大HB疫苗的產(chǎn)量，生產(chǎn)者經(jīng)利用重組技術(shù)來表達“S”蛋白質(zhì)。在各種微生物系統(tǒng)中，大腸桿菌及酵母屬釀酒酵母最普遍地用于表達許多重組得來的蛋白質(zhì)。很多在大腸桿菌中表達具有免疫學(xué)活性的HBs Ag顆粒的企圖都沒有獲得成功。但是，酵母屬釀酒酵母在表達免疫學(xué)活性的HBs Ag顆粒方面顯出極大的適應(yīng)性。這些顆粒所制成的疫苗，已經(jīng)證明具有完全保護黑猩猩抵抗有強活性HBV的挑戰(zhàn)的作用。而且，酵母中提得的HBs Ag在人類臨床試驗中具有與從胞漿中提得的HBs Ag一樣有效的免疫學(xué)作用。因而，用酵母屬釀酒酵母種作為直接合成重組HBs Ag的宿主的效用是完全確定的。由于這一事實，人們希望在免疫原顆粒中表達與S區(qū)域連接的整個pre-S區(qū)域。
在一些重組體微生物表達系統(tǒng)中，合成許多不同的多肽表明對宿主細胞是有害的。因此，對于表達這些多肽產(chǎn)生有透擇性的壓力，按比例擴大重組培養(yǎng)物積累的細胞是那些停止對外來多肽進行表達或極少對外來多肽進行表達的那些細胞，從而使培養(yǎng)物變成不實用的多肽源。在某些情況下，有害作用是如此之強，以致當表達由一個強的組成啟動子起動時，新轉(zhuǎn)化的細胞不能繁殖而不能在選擇板上形成菌落。這種有害作用可以通過采用誘導(dǎo)啟動子合成這些多肽而得到克服。在酵母屬釀酒酵母中有許多誘導(dǎo)基因。三種富有特征的可誘導(dǎo)系統(tǒng)為半乳糖(GAL)利用基因、醇脫氫酶2(ADH2)基因及χ雜交因子基因。
酵母屬釀酒酵母有三個編碼與利用半乳糖作為生長碳源有關(guān)的酶的基因。GAL1、GAL7及GAL10基因分別編碼半乳糖激酶、α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)化酶及尿苷二磷酸半乳糖-4-差向異構(gòu)酶。在半乳糖不存在時，這些酶的表達極少。在葡萄糖中生長細胞培養(yǎng)中加入乳糖后，在RNA轉(zhuǎn)錄水平上，這三種酶被協(xié)調(diào)地誘導(dǎo)，增加至少1.000倍。GAL1及GAL10基因已經(jīng)被分子克隆并進行了順序測定。分別針對各自的編碼區(qū)域的5′端的調(diào)節(jié)及啟動了順序被置于LacZ基因的編碼區(qū)域的鄰近。這些實驗確定了那些對于半乳糖誘導(dǎo)是必需的而且是充分有效的啟動子及調(diào)節(jié)順序。
酵母屬釀酒酵母還有三個基因，每一個都編碼一個ADH的同功酶。其中之一為ADHⅡ，與酵母屬釀酒酵母在氧化生長階段利用乙醇作為碳源的能力有關(guān)。編碼ADHⅡ同功酶的ADH2基因的表達被葡萄糖產(chǎn)物抑制，因而，在有0.1%(w/v)水平的葡萄糖存在時的發(fā)酵生長階段，實際上不存在ADH2基因的轉(zhuǎn)錄。在葡萄糖耗盡并有其他非抑制性碳源存在的情況下，ADH2基因的轉(zhuǎn)錄被誘導(dǎo)提高100至1000倍。該基因已經(jīng)作了分子克隆及順序測定，并對那些對于轉(zhuǎn)錄的去抑制作用是必需的而且是有效的調(diào)節(jié)順序及啟動子也都得到了明確的確定。
α雜交因子是MATα及MATa細胞之間的雜交所需要的酵母屬釀酒酵母的性外激素。這種α雜交因子被表達為前體性外激素導(dǎo)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)過糖基化及蛋白裂解步驟而成為最終的成熟形式，從細胞分泌出來。這個生化途徑被用作對外來多肽的表達。χ雜交因子基因已經(jīng)被分子克隆并利用其具有pre-pro引導(dǎo)順序的啟動子以表達和分泌多種多肽。從外來蛋白能夠穿過粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體推斷，它們能夠經(jīng)受N-及O-聯(lián)接的糖基化作用。α雜交因子啟動子僅能在表現(xiàn)型為α的細胞中顯示活性。在酵母屬釀酒酵母中存在4個基因位點稱為SIR，它合成抑制其它正常a及χ信息靜拷貝所需要的蛋白質(zhì)。干擾這種抑制的溫敏損份存在于這四個位點中至少一個基因產(chǎn)物之中。在這個突變體中，35℃的生長解除了這種抑制，產(chǎn)生a/α表現(xiàn)型的細胞，其中的α雜交因子啟動子是失活的。溫度移動到23℃時，細胞的表現(xiàn)型轉(zhuǎn)化成為α，從而使啟動子成為有活性啟動子。業(yè)已證明，使用溫敏(ts)SIR損傷株可以對幾種外源多肽的表達進行控制。
本發(fā)明一個目的提供表達載體及其方法，用以在酵母中表達可使之與S區(qū)域連接的pre S-1及pre S-2區(qū)域以作為免疫原顆粒。另一個目的是提供在酵母中表達pre S-1及pre S-2區(qū)域的載體及方法。再一個目的是指明由這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞重組體的擴大生長的條件，以便可以大體積及高濃度地獲得含有pre S的多肽的最大產(chǎn)量以供提純這種多肽之用。本發(fā)明的這些目的及其它的目的通過下列的說明將會更明顯。
在酵母屬釀酒酵母中對在一條連續(xù)的閱讀框架與乙型肝炎病毒的表面抗原基因相連的完整的乙型肝炎病毒pre S抗原基因進行了表達。被表達的蛋白質(zhì)聚集成為顆粒的形狀，顯示了由兩個區(qū)域編碼的主要的抗原位點，從而突出表明了酵母作為表達pre S區(qū)域的宿主的可利用性。這種蛋白質(zhì)可用于體外診斷系統(tǒng)及作為一種疫苗用于乙型肝炎病毒引起的疾病及/或感染的治療及預(yù)防。
圖1A、1B及1C是質(zhì)粒PYGAP/PSS△，PYGAP/PSSC，PYGAL/PSS△，PYGAL/PSSC，PYADH2/PSS△，PYADH2/PSSC，及PUC13/PSSC的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2及圖3是α雜交因子載體pJC197的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4A及4B是表示質(zhì)粒pYαMF/pS△S的結(jié)構(gòu)的示意圖。
本發(fā)明旨在提供在酵母種中表達與S區(qū)域連接的pre-S區(qū)域(或其部分)作為一個連續(xù)的多肽或者表達pre S區(qū)域本身(或其部分)的方法。更具體地說，本發(fā)明是利用一可由半乳糖誘導(dǎo)的啟動子、一種可由葡萄糖抑制的啟動子及一種可由溫度誘導(dǎo)的啟動子，在酵母屬的種中表達這些區(qū)域以便克服當用一個強的組成啟動子對該區(qū)域進行表達時pre-S區(qū)域?qū)λ拗鳟a(chǎn)生的毒性作用。此外，本發(fā)明還揭示了表達包含pre S的呈顆粒狀的多肽的重組體細胞的規(guī)模擴大到相當大的體積時的操作條件。
對于熟悉本技術(shù)領(lǐng)域：
的人員來說，那些活性可以在生理上進行調(diào)節(jié)(即可誘導(dǎo)的)的其他啟動子也可以用于在酵母種中進行包含pre S的多肽的表達以克服上面提及的pre S區(qū)域的毒性作用。
Dane顆粒被用作分離pre S1/pre S2/SORF的HBV核酸的來源。采用了內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)以由自然存在于HB病毒粒中的缺失來產(chǎn)生共價封閉的環(huán)狀雙股HBV基因組的DNA。對修復(fù)的DNA進行分離并用EcoRⅠ進行消化。大腸桿菌克隆載體pBR322同樣用EcoRⅠ消化并與HBV DNA連接，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。選出重組體質(zhì)粒，這些質(zhì)粒包括變更成為環(huán)將的HBV基因組，在該HBV基因組中，EcoRⅠ位點將完全的pre S1/pre S2/S編碼區(qū)域分隔成一個0.4千堿基對的5′區(qū)域及一個0.8千堿基對的3′區(qū)域。這兩個區(qū)域通過亞克隆以進行完整基因的最終的組裝。對于3′區(qū)域，用EcoRⅠ及BamHⅠ對pUC19進行消化，然后連接到由該編碼區(qū)的最后5個核苷酸、終止密碼、一個HindⅢ位點及一個BamHⅠ末端組成的合成寡核苷酸上。pre S1/pre S2/S基因的由一個0.8Kb PEcoRⅠ-AccⅠ段組成的3′部份被克隆進入該載體中。由一個0.3Kb PBamHⅠ-EcoRⅠ片段組成的5′部份被亞克隆進入到pUC18中。根據(jù)情況這可以通過在兩種方法中任選一種方法來加以實現(xiàn)。方法的選擇取決于(1)是要表達完全的ORF還是(2)要消除被公認的憎水信號順序(2-15個氨基酸)。第一種方法，用HindⅢ及EcoRⅠ消化pUC18然后連接到一個72bp的合成寡核苷酸上，從BamHⅠ位點向上游，通過未端ATG及一個10bp的非轉(zhuǎn)譯引導(dǎo)順序至一個可以和HindⅢ相容的末端，重新構(gòu)成完整的ORF。對于第2種方法，則連接到一個具有相同功能但消除了2-15氨基酸編碼區(qū)域的30bp的寡核苷酸上。然后，將5′區(qū)域的0.3Kbp BamHⅠ-EcoRⅠ片段連接到這些與寡核苷酸相連的克隆載體中的任一個中。5′pUC18及3′pUC19克隆通過在大腸桿菌中生長而放大，然后克隆區(qū)域被從分離的質(zhì)粒中消化為HindⅢ-EcoRⅠ片段。接著，連接5′片段與3′片段，用HindⅢ進行消化，然后將具有HindⅢ末端的完全的ORF克隆進入預(yù)先用HindⅢ消化的pUC13中。完全的ORF作為一個HindⅢ片段用瓊脂糖凝膠電泳進行提純，以克隆到GAPDH、ADH2或GAL10啟動子表達系統(tǒng)中。
含有GAPDH表達盒的PBR322質(zhì)粒在GAPDH啟動子與ADH1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)之間擁有一個唯一的HindⅢ位點，上述的來自于pUC13的完全的ORF以適當?shù)姆较虿迦朐贕APDH啟動子與ADH1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)之間的HindⅢ位點中。然后，用SphⅠ消化分離這個3.0Kb P的表達盒并且連接至穿梭載體pcl/l上以取代小的SphⅠ片段。用此方式組建的載體用于轉(zhuǎn)化酵母屬釀酒酵母的2150-2-3株(參見Valenzuela等.，Biotechnology3∶317-320，April1985);然而，在選擇板上對轉(zhuǎn)化混合物進行載培時，不形成穩(wěn)定的菌落。對于表達產(chǎn)物的毒性作用的猜疑，通過將pre S1-pre S2/S編碼區(qū)域的大部分去除并用BamHⅠ消化及與質(zhì)粒重新連接而產(chǎn)生移碼突變的方式作了進一步的確定措施用這樣的方法制備的DNA可以有效地轉(zhuǎn)化酵母細胞。YEP52大腸桿菌/酵母屬釀酒酵母穿梭載體驅(qū)動插入唯一的HindⅢ位點上的外源基因從可被葡萄糖誘導(dǎo)的GAL10啟動子開始進行表達。上述pre S1/pre S2/SORF(具有HindⅢ末端)被連接到載體的HindⅢ位點上。將這種重組體質(zhì)粒導(dǎo)入酵母屬釀酒酵母株BY-19(也稱為DCO4，參見Broach等.，Cell21∶501-508，1980)并選擇轉(zhuǎn)化的克隆。細胞在含有甘油乳酸的合成選擇性培養(yǎng)基中生長。然后，在培養(yǎng)中加入半乳糖以誘導(dǎo)表達。制備溶胞產(chǎn)物，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行柝分，并在硝基纖素上進行Western blot測試。由于僅僅存在于誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體中及根據(jù)與恢復(fù)期病人HB血清的反應(yīng)性，p39產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)是pre S1/pre S2/S所特有的產(chǎn)物。此外，轉(zhuǎn)化體的胞溶物(而非野生型的酵母屬釀酒酵母)，通過放射免疫測定法證實HBs Ag，并基于與聚合的人類白蛋白之間的連接(這種連接對pre S區(qū)域?qū)Ｒ恍缘?這樣一個事實而證實確是pre S。利用一個連接有識別顆粒狀的HBs Ag的山羊抗體的免疫親和層析柱從轉(zhuǎn)化的酵母屬釀酒酵母中純化pre S1/pre S2/S。洗脫的產(chǎn)物經(jīng)放射免疫測定證實是HBs Ag，因其與聚合的人類白蛋白相連接而確定為pre S，并且在電子顯微鏡下呈現(xiàn)顆粒狀。這些實驗數(shù)據(jù)表明在酵母屬釀酒酵母中，完整的pre S1/pre S2/S蛋白質(zhì)是表達成為顆粒狀的p39蛋白。這種同時包括HBs及pre S抗原的顆粒狀蛋白可以有效地作為HB疫苗及診斷試劑。
pADH2△67(-1)大腸桿菌克隆載體含有能夠在酵母屬釀酒酵母中驅(qū)動對插入ADH2(可由葡萄糖抑制)的啟動子的獨特的HindⅢ位點的外源基因進行表達。用BamHⅠ及EcoRⅠ消化p ADH2△67(-1)，并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段產(chǎn)生平端，并用預(yù)備的瓊脂糖凝膠電泳提純包含有ADH2啟動子及終止區(qū)的49Kb P片段。用PstⅠ消化pUc7，用T4 DNA聚合酶產(chǎn)生平端，然后連接到4.9Kb P片段上。產(chǎn)生的質(zhì)粒用SalⅠ進行消化，用預(yù)備的瓊脂糖凝膠電泳提純4.9Kb P片段。用HindⅢ消化p Uc 18，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段產(chǎn)生平端，然后進行自身連接。所產(chǎn)生質(zhì)粒用SalⅠ進行消化并連接到4.9Kb P SalⅠ片段上。上述的1.2Kb Ppre S1/pre S2/SORF(具有HindⅢ末端)被連接到該載體的HindⅢ位點上。用SalⅠ消化產(chǎn)生的質(zhì)粒，并將6.1Kb P片段連接到穿梭載體pCl/l的SalⅠ位點上。質(zhì)粒pCl/l是pJDB219的衍生物，pJDB219中與pJDB219中細菌質(zhì)粒pMB9對應(yīng)的片段被pBR322所取代。將這樣的重組體質(zhì)粒導(dǎo)入酵母屬釀酒酵母中，并選擇轉(zhuǎn)化的克隆。細胞生長在含有0.3%(w/v)葡萄糖的合成的選擇性的培養(yǎng)基中。48小時之后，當葡萄糖耗盡時，制備胞溶產(chǎn)物然后用SDS-PAGE進行柝分并對硝基纖維素進行Western blot分析。有一個p39產(chǎn)物因其僅僅存在于轉(zhuǎn)化體中及其與恢復(fù)期病人的HB血清的反應(yīng)性被發(fā)現(xiàn)是專一于pre S1/pre S2/S的。此外，轉(zhuǎn)化體而非野生型的酵母屬釀酒酵母通過放射免疫測定確證為HBs Ag并因其與聚合的人類白蛋白之間的連接而確證為pre S。利用一個有可以識別顆粒狀的HBs Ag的山羊抗體的免疫親和層析柱從轉(zhuǎn)化了的酵母屬釀酒酵母中提純pre S1/pre S2/S。洗脫產(chǎn)物通過放射免疫測定而確認為HBs Ag，因其與人類聚合白蛋白之間的連接而被確認為pre S，并在電子顯微鏡下呈現(xiàn)顆粒狀。
α雜交因子基因MFα1被克隆在取自于酵母屬釀酒酵母DNA基因組的質(zhì)粒載體上。產(chǎn)生的pKH2質(zhì)粒用EcoRⅠ進行消化并用預(yù)備的瓊脂糖凝膠電泳提純含有α雜交因子的1.7Kb P片段。用EcoRⅠ消化質(zhì)粒pRJ148(缺乏HindⅢ位點的修飾的pBR322)并與1.7Kb P片段連接以產(chǎn)生質(zhì)粒p RJ159。用HindⅢ消化該DNA并自身連接以形成此時具有一個獨特的HindⅢ位點的質(zhì)粒pRJ167。質(zhì)粒pRJ167用HindⅢ消化并通過插入一個合成的寡核苷酸轉(zhuǎn)接體進行修飾以產(chǎn)生一個含有位于啟動子及pre-pro引導(dǎo)物的3′端，以及位于所有閱讀框架的轉(zhuǎn)譯終止信號的5′端的獨特的HindⅢ位點的新的質(zhì)粒(pRJ178)。HindⅢ位點用HindⅢ消化而轉(zhuǎn)化成為BamHⅠ位點，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段產(chǎn)生平端，加上BamHⅠ連接子并自身連接以形成質(zhì)粒pJC193。該質(zhì)粒用EcoRⅠ消化，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段產(chǎn)生平端，加入BclⅠ連接子進行修飾，用BclⅠ消化，并用預(yù)備的凝膠電泳分離含有α雜交因子基因的1.5Kb P片段。所產(chǎn)生的該BclⅠ片段用小生腸道的堿性磷酸酶進行處理，然后插入到pCl/l的獨特的BamHⅠ位點上，在此步驟中破壞原先的BamHⅠ位點(質(zhì)粒pJC194)。該DNA用BamHⅠ進行消化并自身連接以去除多余的BamHⅠ連接子，以產(chǎn)生新的表達α雜交因子表達質(zhì)粒pJC197。上述的pUc13中的pre/pre S2/SORF用HinfⅠ及AvaⅠ消化，并用預(yù)備的瓊脂糖凝膠電泳提純0.5Kb PORF。用SalⅠ及BamHⅠ消化pUc18并連接到二個含成的寡核苷酸上。5′寡核苷酸包括一個SalⅠ末端、一個HindⅢ位點、編碼一個KEX2劈開位點的核苷酸、編碼pre S1的2及3氨基酸的核苷酸以及一個HinfⅠ末端。3′寡核苷酸包括一個AvaⅠ位點、編碼pre S2最終的8個氨基酸的核苷酸、終止密碼子、一個HindⅢ位點及一個BamHⅠ末端。0.5Kb PORF被克隆進入到與寡核苷酸連接的p Uc 18載體中。所產(chǎn)生的載體用HindⅢ消化并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段產(chǎn)生平端。產(chǎn)生的被修飾的0.5Kb Ppre S1/pre S2 ORF通過預(yù)備瓊脂糖凝膠電泳被提純并被克隆進入預(yù)先用BamHⅠ消化并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段產(chǎn)生平端的p Jc197中以產(chǎn)生可通過操作而與χ雜交因子的pre-pro引導(dǎo)物順序相連的pre SORF。
α雜交因子的啟動子僅在表現(xiàn)型為χ的細胞中才有活性。在酵母屬釀酒酵母中有4個稱為SIR的位點它合成抑制通常情況下靜止的a及α信息的拷貝所必需的蛋白質(zhì)。JRY188株細胞(MATα、Sir3-8、leu2-3、leu2-112trpl、ura3-52、his4)在SIR3基因產(chǎn)物中含有一個ts(溫敏)損傷。結(jié)果，生長135℃的TRY188表現(xiàn)型為a/α α雜交因子啟動子是沒有活性的;另一方面，在23℃生長的細胞的表現(xiàn)型為α，因而能夠誘導(dǎo)由α雜交因子啟動子指導(dǎo)的表達作用。含有pre S1/pre S2的的重組體χ雜交因子質(zhì)粒被用于轉(zhuǎn)化酵母屬釀酒酵母JRY188株(Brake等.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA81∶4642-4646，1984)并選擇轉(zhuǎn)化的克隆。在35℃下細胞在合成的(leu)選擇性培養(yǎng)基中生長。接著將A600＝0.5的細胞在23℃下于同樣的培養(yǎng)基中生長。制備胞溶產(chǎn)物，用SDS-PAGE拆分，并對硝基纖維素進行Western blot分析。一個p21產(chǎn)物因其僅存在于轉(zhuǎn)化體中及其與恢復(fù)期的人類HB血清的反應(yīng)性而被發(fā)現(xiàn)是專一于pre S1/pre S2的組成啟動子GAPDH。指導(dǎo)pre S1/pre S2/S表達的載體不能穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化酵母屬釀酒酵母這一點，表明組成性及高水平pre S表達對酵母屬釀酒酵母產(chǎn)生不良的生理影響。從同一個啟動子指導(dǎo)S多肽表達的質(zhì)粒pHBS56-GAP347/33可以有效地轉(zhuǎn)化酵母屬釀酒酵母，并且，如此轉(zhuǎn)化的酵母屬釀酒酵母可以有效地生長至生產(chǎn)的規(guī)模。這一現(xiàn)象突出了利用一個可誘導(dǎo)的、可以去阻遏的、或具有較低活性組成啟動子在酵母屬釀酒母中指導(dǎo)含有pre S的多肽的表達的穿梭質(zhì)粒的可利用性。該現(xiàn)象特別地突出了利用GAL10啟動子指導(dǎo)在酵母屬釀酒酵母中表達pre S1/pre S2/S的表達載體的可利用性。以起同樣作用的可調(diào)節(jié)的GAL10啟動子，或GAL1、GAL2、GAL7或MEL1啟動子可以使重組體酵母屬釀酒酵母培養(yǎng)在開始合成重組體蛋白之前放大到生產(chǎn)規(guī)模的大體積，藉此，使對于宿主細胞產(chǎn)生的不利影響減到最小，對于本技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的人來說這一點是明顯的。此外，含有ADH2及χ雜交因子(但不限于ADH2及α雜交因子)等可由其它方式生理地進行誘導(dǎo)或去阻遏的別的可調(diào)節(jié)啟動子的表達載體也能夠用于指導(dǎo)含pre S的多肽的表達，這一點對于本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域：
的人員也是明顯的。再有，可利用一個活性低于GAPDH的組成性啟動子，例如CYCl(但不限于CYCl)啟動子，以一個較低的細胞蛋白質(zhì)比例驅(qū)動表達包含pre S的多肽，以便避免過度表達所產(chǎn)生的生理上的不利影響，這一點對于本技術(shù)領(lǐng)域：
的人員亦是明顯的。應(yīng)該利用合適的測定系統(tǒng)，例如Western blot或者放射免疫測定法對本系統(tǒng)中含有pre S的多肽的表達情況進行測定，以便確定一個最佳的時候以獲得最多的增養(yǎng)物，這一點對于本技術(shù)領(lǐng)域：
的人員也是明顯的。
酵母屬包括許多的種。最通常地用作重組DNA媒介的外源多肽表達的宿主的是酵母屬釀酒酵母或面包酵母。但是，它和酵母屬中的其它各個種之間的區(qū)別不總是那么明確的。其中有許多的種可以與酵母屬的釀酒酵母雜交并可能類似于或相同于酵母屬釀酒酵母中的啟動子，其中包括，但不限于，GAL10、ADH2及/或χ雜交因子啟動子。因此，可以選擇酵母屬的其它的種包括但不限于Carlsbergensis、Uvarum、rouxii、montanus、kluyveri、elongisporus、norbensis、oviformis及diastaticus，用于表達含有pre S的多肽，這一點對于本技術(shù)領(lǐng)域：
的人員也是明顯的。
有若干個酵母的屬，諸如Hansenula、Candida、Torulopsis及Pichia表明有利用甲醇作為生長的唯一碳源的類似的代謝途徑。已經(jīng)從Pichia pastoris中分離出了一種編碼參與該代謝途徑的醇氧化酶的基因。已經(jīng)分離出了P.Pastoris的醇氧化酶的啟動子，并且表明該啟動子對于甲醇誘導(dǎo)表達是敏感的。這樣的可誘導(dǎo)的啟動子可用于在酵母中表達那些不被選擇的多肽。在顆粒狀的P.Pastoris中這樣的啟動子特別地在可誘導(dǎo)表達S區(qū)域的質(zhì)粒中顯示出活性。這一現(xiàn)象表明其它的酵母屬可以作為宿主而起到以免疫活性形式表達重組體DNA媒介的S多肽的能力。對于本技術(shù)領(lǐng)域：
的人員應(yīng)該是明白的另一點是對于含有pre S的多肽的表達，對宿主菌株的選擇可以擴展至Saccharomycetaceae及Cryptococcaceae科的其它的酵母屬中的種，包括但并不限于Pichia、Candida、Hansenula、Torulopsis、Kluyveromyces及Saccharomycopsis。
近年來，在比酵母高等的真核生物的細胞，尤其是在哺乳動物細胞系及用桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)染的昆蟲細胞中進行的重組體蛋白質(zhì)表達有一些成功的例子。作為免疫原顆粒成功地表達了S區(qū)域本身以及與S區(qū)域相連的pre S2區(qū)域。因此，在酵母中作為免疫原顆粒而表達完全的pre S1/pre S2/S區(qū)域的概念很容易地擴展至在較高等的真核生物的細胞，例如但不限于哺乳動物細胞系如Vero、GH3、It K及CHO中進行連接區(qū)域的表達，這一點對于本技術(shù)領(lǐng)域：
的人員的明顯的。
下列的例子作為舉例對本發(fā)明進行描述但并不限于這些例子。以下例子提及的內(nèi)容在此用作參考。
例1克隆pre S1/pre S2/S基因Dane顆粒(亞類ayw)是已告成熟的技術(shù)[Landers et al.，J.Virology 23∶368(1977)]從受感染的病人的血漿中提純得到的。乙型肝炎病毒基因組的DNA以切口、缺口的形式存在于病毒顆粒中[Hruska et al.，J.Virology 21∶666(1977)]。為制備分子克隆用的DNA，利用內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)產(chǎn)生共價閉環(huán)狀雙股DNA[Landers et al.，J.Virology 23∶368(1977)]。DNA通過在含有十二烷基硫酸鈉和蛋白酶K的緩沖液培育，然后用酚、氯仿和異戊醇(依次按25∶24∶1的比例)配制而成的溶液萃取，并再用乙醇沉淀法濃縮而進行去蛋白作用。提純后的DNA用大腸桿菌消化完全。大腸桿菌克隆載體PBR322也用Eco RⅠ消化，并連接到消化后的乙型肝炎病毒DNA上，以用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將含有圍繞著單一Eco RⅠ位點(PHBV/AYW-1，圖1A)成環(huán)狀排列取向的乙型肝炎病毒基因組的重組體質(zhì)粒分離出來，將整個pre S1/pre S2/S編碼區(qū)分成0.4千堿基對(kbp)的5′結(jié)構(gòu)域(區(qū)域)和0.8千堿基對的3′結(jié)構(gòu)域[Galibert et al.，Nature 281∶646(1979)]。這兩個結(jié)構(gòu)域(區(qū)域)進行亞克隆，以最終重新組合整個基因。PUC19用Eco RⅠ和Bam HⅠ消化，然后被連接到密碼區(qū)、終止密碼子、HindⅢ位點和Bam HⅠ終端的最后5個核苷酸所組成的一個合成寡核苷酸上。該寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為ATACATTTAAAGCTTGTGTAAATTTCGAACCTAG由0.8千堿基對EcoRⅠ-AccⅠ片段所組成的pre S1/pre S2/S基因的3′部分被克隆到此載體中(PUC19/DSD，圖1A和1B)。
5′部分以兩種方式中的任一種方式克隆到PUC18上，采用何種方法取決于是否需表示整個ORF，還是消除推想的疏水信號順序(氨基酸2-15)。第一個對策是用HindⅢ和Eco RⅠ消化PUC18，然后將其連接到72堿基對的合成寡核苷酸上，后者從遠側(cè)ATG上方的Bam HⅠ位點，通過一個10堿基對的未轉(zhuǎn)譯的前導(dǎo)順序，至可與HindⅢ相容的末端以重組全部ORF。上述寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為AGCTTACAAAACAAAATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTTTTATGTTTTGTTTTACCCCGTCTTAGAAAGGTGGTCGTTAGGAGACCCTAAAAATCCCGACCACCAGTTGAGGGCTGGTGGTCAACCTAG。
(＊自然順序包括C，而不是T;上述變化破壞了HinfⅠ位點，但未改變編過碼的氨基酸)。第二種對策是連接一個30堿基對寡核苷酸，后者起72堿基對寡核苷酸相同的作用，但消除了氨基酸2-15的密碼區(qū)。此種寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為AGCTTACAAAACAAAATGGACCACCAGTTGATGTTTTGTTTTACCTGGTGGTCAACCTAG。
然后將5′結(jié)構(gòu)域(區(qū)域)的0.4千堿基對Bam HⅠ-Eco RⅠ片段連接到這些寡核苷酸連接的克隆載體中的任一個(PUC18/USD△，PUC18/USDC，圖1A和1B)。5′PUC18和3′PUC19克隆通過在大腸桿菌中生長而擴增，而密碼區(qū)從離體質(zhì)粒中被消化為HindⅢ-Eco RⅠ片段。這些片段用HindⅢ連接和消化，并將具有HindⅢ末端的整個ORF克隆到業(yè)已用HindⅢ消化的PUC13上(PUC13/PSS△，PUC13/PSSC圖1B和1C)。如例2、3和4所述，通過制備瓊脂糖凝膠電泳法提純上述載體的整個ORF，以將其克隆到GAPDH或GAL10啟動子(YEp52)，或者ADH-2啟動子表達系統(tǒng)中。
例2
利用GAPDH啟動區(qū)指導(dǎo)表達酵母屬釀酒酵母中pre S1/pre S2/S包含GAPDH表達盒[Holland and Holland，J.Biol.Chem.255∶2596(1980)]PBR322質(zhì)粒具有一個單一的HindⅢ克隆位點，帶有HindⅢ末端(如例1所述)的1.1千堿基對pre S1/pre S2/S ORF被克隆到該位點(PEGAP/PSS△，PEGAP/PSSC，圖1C)。通過SphⅠ消化和制備瓊脂糖凝膠電泳法從PBR322質(zhì)粒中除去表達盒(包含HBV基因)，然后將該表達盒克隆到預(yù)先用SphⅠ(PYGAP/PSS△，PYGAP/PSSC，圖1C)消化的穿梭載體PCl/1中[Beggs，Nature 275∶104(1978);Rosenberg et al.，Nature 312∶77(1984)]。具有表達盒的PCl/1質(zhì)粒被用于轉(zhuǎn)化酵母屬釀酒酵母菌株2150-2-3;然而在轉(zhuǎn)化混合物平板培養(yǎng)后的選擇平板培養(yǎng)中幾乎回收不到穩(wěn)定的重組體酵母克隆。通過BamHⅠ消化和再連接質(zhì)粒，而除去pre S1/pre S2/S密碼區(qū)，并產(chǎn)生移碼突變，證實了含有產(chǎn)物的pre S對酵母屬釀酒酵母的推測毒性;用這種方式制備的DMA能有效地轉(zhuǎn)化酵母。
例3利用GAL10啟動子指導(dǎo)表達酵母屬釀酒酵母中pre S1/pre S2/SYEP52大腸桿菌/酵母屬釀酒酵母穿載體驅(qū)動對嵌在半乳糖-誘發(fā)的GAL10啟動子中一個單一HindⅢ位點的外來基因的表達[Broach et al.，In Experimental Manipulation of Gene Expression，p83，Academic Press(1983)]。而且，該載體包含有關(guān)在酵母屬釀酒酵母中繁殖的部分2∑循環(huán)順序、(ori和一個反向重復(fù))、在酵母屬釀酒酵母中選擇用的LEU2、以及分別用于大腸桿菌中擴增和選擇的ori和bla順序。具有HindⅢ末端(見例1所述)的1.1千堿基對pre S1/pre S2/S ORF被克隆到單一HindⅢ位點(PYGAP/PSS△，PEGAL/PSSC，圖1C)，并將所產(chǎn)生的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化從普林斯頓(Princeton)大學(xué)的J.R勃羅契(Broach)博士實驗室中得到的酵母屬釀酒酵母菌株BY-19。分離重組體克隆，并檢驗它的pre S1/pre S2/S多肽的表達。然后使克隆在合成選擇(leu-)甘油-乳酸培養(yǎng)基[0.67%(重量/體積)無氨基酸的酵母氮堿、0.004%腺嘌呤、0.004%尿嘧啶、1%琥珀酸、0.005%酪氨酸、0.002%精氨酸、0.006%異亮氨酸、0.004%賴氨酸、0.001%甲硫氨酸、0.006%苯基丙氨酸、0.006%蘇氨酸、0.004%色氨酸、0.001%組氨酸、0.6%氫氧化鈉、2%(體積百分比)乳酸和3%(體積百分比)甘油]中生長。在酵母生長達到A600＝0.3后，加入半乳糖，并使之濃度達到2%(重量/體積)，由此誘發(fā)該基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。通過AusriaR(Abbot)反應(yīng)性、聚合人體清蛋白結(jié)合活性[Machida et al.，Gastroentrology 86∶910(1984)]和用Western檢驗法(Western blots)測到的P39而撿出HBs Ag，以驗證所需抗原的表達，其中P39是用恢復(fù)期人體血清和放射性標記的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A顯現(xiàn)的。這些重組體克隆用作例6中所述的大規(guī)模發(fā)酵和分離的種子培養(yǎng)物。
例4利用ADH2啟動子指導(dǎo)表達酵母屬釀酒酵母中pre S1/pre S-2/SPADH2△67(-1)大腸桿菌克隆載體具有能在酵母屬釀酒酵母中驅(qū)動嵌在ADH2去阻遇啟動子[Russell et al.，J.Biol.Chem.258∶2674(1983);E.T.Young，submitted for publication]中一個單一HindⅢ位點的外來基因的表達。上述單一HindⅢ位點位于5′未轉(zhuǎn)譯的側(cè)翼順序的核苷酸-1和ADH2基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)之間。用BamHⅠ和EcoRⅠ消化PADH2△67(-1)，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段使之成為平端，并用制備瓊脂糖凝膠電泳法提純含有ADH2啟動子和終止區(qū)的4.9千堿基對片段。用PstⅠ消化PUC7，用T4 DNA聚合酶使之成為平端，并將其連接到4.9千堿基對ADH2片段上。所產(chǎn)生的質(zhì)粒用SalⅠ消化，并用制備瓊脂糖凝膠電泳法提純4.9千堿基對片段。用HindⅢ消化PUC18，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段使之成為平端，并自相連接。所生成的質(zhì)粒用SalⅠ消化，并連接到4.9千堿基對SalⅠ片段上，產(chǎn)生載體用PUC18△HindⅢ-ADH2(圖1C)。將兩個具有HindⅢ末端(見例1所述)的不同的1.1千堿基對pre S1/pre S-2/S ORF連接到上述載體的HindⅢ位點上，所生成的質(zhì)粒(PEADH2/PSS△，PEADH2/PSSC，圖1)用SalⅠ消化，并將此6.1千堿基對片段連接到PCl/1的SalⅠ位點，產(chǎn)生質(zhì)粒PYADH2/PSS△，PYADH2/PSSC(圖1C)。這些重組體質(zhì)粒被用于轉(zhuǎn)化從華盛頓大學(xué)的L.赫脫威爾(L.Hartwell)博士實驗室中得到的酵母屬釀酒酵母菌株2150-2-3。分離重組體克隆，并檢驗它的pre S1/pre S-2/S多肽的表達。然后使克隆在含有0.3%(重量/體積)葡萄糖的合成選擇(leu-)培養(yǎng)基中生長。細胞在30℃溫度下經(jīng)48小時生長至A600＝1.5，在此段時間內(nèi)，葡萄糖的耗盡業(yè)已去阻遇ADH2啟動子?；蛘?，使克隆在含有作為碳來源的2%葡萄糖合成選擇(leu-)培養(yǎng)基中生長。細胞在30℃溫度下經(jīng)24小時生長至A600為0.1或1.0，此時，對盛有復(fù)合培養(yǎng)基的較大燒瓶或發(fā)酵器進行接種[接種量為10%(體積百分數(shù))]，基中復(fù)合培養(yǎng)基內(nèi)含有1.6%葡萄糖作為碳源。細胞如上所述那樣再經(jīng)45小時生長至A600＝12.0-14.0，其間葡萄糖的耗盡業(yè)已去阻遇ADH2啟動子。通過AUSRIAR(Abbott)反應(yīng)性、聚合人體清蛋白結(jié)合活性、以及用Western檢驗法測到的P39而檢出HBs A9，以驗證所需抗原的表達，其中P39系用恢復(fù)期人體血清和放射性標記的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)顯現(xiàn)一個選出的重組體克隆用作例7中所述的按比例擴大的發(fā)酵和分離的種子培養(yǎng)物。
例5利用α雜交(交配)因子啟動子和(pre-pro)引導(dǎo)物(引導(dǎo))指導(dǎo)表達在酵母屬釀酒酵母中的pre S1/pre S-2/Sα雜交(交配)因子基因MFχ1已被克隆到酵母屬釀酒酵母基因組DNA的質(zhì)粒載體上[Kurjan et al.，Cell 30∶933(1982);Singh et al.，Nucleic Acids Res.11∶4049(1983)].所產(chǎn)生的質(zhì)粒p KH2用EcoRⅠ消化，并用制備瓊脂糖凝膠電泳法提純具有χ雜交(交配)因子基因的1.7千堿基對片段。質(zhì)粒pRJ148(無HindⅢ位點的一個改變的pBR322)用EcoRⅠ消化，并與1.7千堿基對片段連接，而產(chǎn)生質(zhì)粒pRJ159。該DNA用HindⅢ消化，并自行連接，而形成具有一個單一HindⅢ位點的質(zhì)粒pRJ167。質(zhì)粒pRJ167用HindⅢ消化，并通過嵌入一個合成寡核苷酸結(jié)合體而改變，由此產(chǎn)生一個具有一個單一HindⅢ位點的新質(zhì)粒(pRJ178)，其中HindⅢ位點在所有三個閱讀框架中均位于啟動子和pre-pro腱(引導(dǎo))的3′側(cè)，以及轉(zhuǎn)譯終止信號的的5′側(cè)(圖2)。通過用HindⅢ消化、用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端、添加聯(lián)結(jié)子以及自相連接，將HindⅢ位點轉(zhuǎn)化成BamHⅠ位點，從而形成質(zhì)粒pJC193。該質(zhì)粒用EcoRⅠ消化、用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端、添加BclⅠ聯(lián)結(jié)子而改變，用BclⅠ消化、以及用制備瓊脂糖凝膠電泳法分離具有α雜交(交配)因子基因的1.5千堿基對片段。所產(chǎn)生的BClⅠ片段用小牛腸堿性磷酸酶處理，并被嵌入PCl/1的單一BamHⅠ位點，在此過程中破壞了原來的BamHⅠ位點(質(zhì)粒pJC194)。該DNA用BamHⅠ消化，并自相連接，以除去過量的BamHⅠ聯(lián)接子，產(chǎn)生新的χ雜交(交配)因子表達質(zhì)粒pJC197(圖3)。PUC13/PSSC質(zhì)粒(見例1所述)用HinfⅠ和AvaⅠ消化，并用制備瓊脂糖凝膠電泳法提純0.45千堿基對ORF(圖4A)。用SalⅠ和BamHⅠ消化PUC18，然后將其連接到2個合成寡核苷酸中。5′寡核苷酸由一個SalⅠ末端、一個HindⅢ位點、編碼KEX2切開位點的核苷酸、編碼pre S-1的氨基酸2和3的核苷酸，以及一個HinfⅠ終端組成，其結(jié)構(gòu)為TCGACAAGCTTGGATAAGAGAGGGCAGGTTCGAACCTATTCTCTCCCGTCTTA3′寡核苷酸包括一個AvaⅠ位點、編碼pre S-2中最后8個氨基酸的核苷酸、終止密碼子、一個HindⅢ位點和一個BamHⅠ終端，其結(jié)構(gòu)為TCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACTAAAGCTTGCCTAACCCCTGGGACGCGACTTGATTTCGAACCTAG將0.4千堿基對ORF克隆到這個寡核苷酸聯(lián)接的PUC18載體中(圖4A和4B)，所產(chǎn)生的載體(PUC18/PS△S)用HindⅢ消化，并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端，由此產(chǎn)生一個含有與χ因子pre pro(引導(dǎo)物)相聯(lián)結(jié)的pre S1/pre S2/ORF的表達盒。然后用制備瓊脂糖凝膠電泳法提純該表達盒，并將其克隆到業(yè)已用BamHⅠ消化，且用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端、(PY αMF/PS△S，圖4B)的pJC19中，由此產(chǎn)生與χ因子pre-pro(引導(dǎo)物)相聯(lián)結(jié)的pre S1/pre S2/ORF。
α雜交(交配)因子啟動子僅在表型上是α的細胞中具有活性[Brake et al.，Mol.Cell Biol.3∶1440(1983)]。在酵母屬釀酒酵母中有4個稱為SIR的位點，它們合成用于阻遇其他通常靜靜地復(fù)制a或χ信息所需的蛋白質(zhì)[Rine et al.，Genetics 93∶877(1979)]。菌株JRY188細胞(MATχ，Sir 3-8，leu 2-3，leu 2-112，trpl，ura 3-52，his 4)在SIR3基因產(chǎn)物中具有一個溫度敏感損傷，因此在35℃溫度下生長的JRY188細胞在表型上是a/α，而且α雜交(交配)因子啟動子沒有活性;另一方面，在23℃溫度下生長的細胞在表型上是α，因此能夠誘導(dǎo)由α雜交(交配)因子啟動子控制的表達[Brake el al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81∶4642(1984)]。將含有重組體pre S1/pre S2/的α雜交(交配)因子質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化從伯克利的加利福尼大學(xué)吉斯柏·賴因博士實驗室中得到的酵母屬釀酒酵母菌株JRY188，并選出轉(zhuǎn)化克隆。在37℃溫度下，使細胞在合成選擇(leu)培養(yǎng)基中生長，接著讓A600＝0.5的細胞在相同培養(yǎng)基中，但溫度為23℃的條件下生長。然后制備溶胞產(chǎn)物，用SDS-PAGE分析，并用Western測定法在硝化纖維素上測定。根據(jù)P21產(chǎn)物僅在轉(zhuǎn)化突變型中存在，以及它與恢復(fù)期人體HB血清的反應(yīng)性，因而認為這種產(chǎn)物是pre S1/pre S2特有的。
例6用免疫親和色譜提純顆粒狀pre S1/pre S2/S如例3所述的方式產(chǎn)生的重組體酵母屬釀酒酵母(包括氨基酸2-15在內(nèi)的完整的pre S順序)在裝有9升合成選擇甘油-乳酸培養(yǎng)基(組成與例3所述的相同)的新布魯斯威克科學(xué)(New Brunswick Scientific)發(fā)酵器中生長。發(fā)酵條件如下250轉(zhuǎn)/分的攪拌速率，2.5升空氣/分，30℃。生長至A660＝0.25后，通過加入半乳糖(2%(重量/體積)]而誘導(dǎo)產(chǎn)物合成，發(fā)酵過程再繼續(xù)進行33小時，直至最后A660＝2.40。然后在Amicon DC-10裝置中進行微過濾，以采集酵母細胞，接著使其懸浮在30毫升緩沖液A中(0.1MNa2HPO4，PH7.2，0.5MNa Cl)中，并在75-85磅/英寸2的Stansted高壓室中斷裂。用120毫升緩沖液A稀釋斷裂細胞懸浮液(濕細胞重31克)，并加入Triton X-100，至最終濃度為0.5%(重量/體積)，爾后將懸浮液在10，000Xg和4℃溫度下離心分離20分鐘，使其澄清。去澄清后液體培養(yǎng)基的上層清液，并用含有對付HBs Ag的抗體[Mc Aleer et al.，Nature 307∶178(1984)]的瓊脂糖(Sepharose)4B在4℃溫度下培養(yǎng)19小時，以使抗原吸附到樹脂上。培養(yǎng)期結(jié)束后，將漿液加溫至室溫(其后的操作步驟均在室溫下進行)，并在真空下除氣15分鐘。將除氣后的漿液傾入2.5×40厘米柱中，俟柱充滿后，用緩沖液A洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，爾后用3MKSCN的緩沖液A洗提抗原。使含有抗原的部分在4℃溫度下對PH為7的0.007M Na2HPO4-0.15MNa Cl溶液透析，并匯集成20毫升含有1.08毫克蛋白質(zhì)的透析親和液(Dialyzed Affinity Pool)，接著將16毫升上述親如液用5.6毫升，PH為7.2的0.06MNa HPO，0.15MNa Cl溶液稀釋到40毫升。所得產(chǎn)物通過Millex-GV0.22∑m膜過濾而滅菌。最后用Ausria
反應(yīng)性和聚合人體清蛋白結(jié)合活性檢測HBs Ag，從而鑒定和證實透析親和液中的產(chǎn)物。
例7用免疫親和色譜法提純顆粒狀pre S1/pre S2/S按例4所述方式產(chǎn)生的重組體酵母屬釀酒酵母(包括氨基酸2-15在內(nèi)的整個pre S順序)在充有9.0升復(fù)合培養(yǎng)基的新布魯斯威克科學(xué)發(fā)酵器中生長，其配制方法與文獻中描述的相同，但用Hy Soy(琥珀)代替蛋白胨。發(fā)酵條件如下攪拌速率為500轉(zhuǎn)/分，充氣量每分鐘5.0升空氣，溫度30℃，時間44小時，其間A600從0.65增加到9.50。然后采集酵母細胞，并使之溶解，接著按例6所述方法提純pre S1/pre S2/S產(chǎn)物。最后采用Ausria
反應(yīng)性、聚合人體清蛋白結(jié)合活性和用western測定法測得的p39而檢測HBs Ag，由此鑒定和證實所得的產(chǎn)物，其中p39系用恢復(fù)期人體血清和放射性標記的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A顯現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒表達載體，它包括在從族系酵母科或隱球酵母科中衍生得到的酵母菌科中選擇和擴增質(zhì)粒的酵母衍生順序、酵母啟動子、完整的HBVpre S2基團、至少對一部分HBVpre S1基因編碼的DNA區(qū)段、以及酵母轉(zhuǎn)錄終止順序。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的質(zhì)粒表達載體，其中所說區(qū)段相當于與HBV基因組中pre S2基因鄰接的pre S1中的核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的質(zhì)粒表達載體，其中所說區(qū)段對所有pre S1肽編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的質(zhì)粒表達載體，它還包括所有HBVS基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的質(zhì)粒表達載體，它還包括所有HBVS基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的質(zhì)粒表達載體，其中所說區(qū)段對除了pre S1肽的N末端15個氨基酸外的所有pre S1肽編碼。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的質(zhì)粒表達載體，其中所說酵母啟動子是GAL10、ADH2、χ雜交(交配)因子、GAL1、GAL7、MEL1或一種將表達產(chǎn)物的合成控制在對引入質(zhì)粒的宿主無毒性水平上的啟動子。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的質(zhì)粒表達載體，其中酵母啟動子是GAL10、ADH2或χ雜交(交配)因子。
9.一種包括權(quán)利要求
1所述的質(zhì)粒，且從酵母族系酵母科或隱球酵母科中衍生得到的酵母物種。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的酵母物種，其中所說物種系來自屬酵母。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的酵母物種，其中所說物種是酵母屬釀酒酵母。
12.一種至少包括一部分pre S1肽和pre S2肽的HBV多肽，而所說多肽中不存在其他HBV肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的HBV多肽，它包括所有pre S1肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的HBV多肽，它還至少包括一部分S肽，而所說肽中無其他HBV肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的HBV多肽，它包括所有S肽，而所說的肽中無其他HBV肽。
16.一種制備權(quán)利要求
12所述肽的方法，它包括(1)用權(quán)利要求
1的質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化選自族系酵母科或隱球酵母科之菌株的細胞;(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞;和(3)從所產(chǎn)生的培養(yǎng)細胞或生長培養(yǎng)基中回收肽。
17.一種制備權(quán)利要求
13所述肽的方法，它包括(1)用權(quán)利要求
1的質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化選自族系酵母科或隱球酵母科之菌株的細胞;(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞;和(3)從所產(chǎn)生的培養(yǎng)細胞生長培養(yǎng)基中回收肽。
18.一種制備權(quán)利要求
14所述的肽的方法，它包括(1)用權(quán)利要求
1的質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化選自族系酵母科或隱球酵母科之菌株的細胞;(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞;和(3)從所產(chǎn)生的培養(yǎng)細胞或生長培養(yǎng)基中回收肽。
19.一種制備權(quán)利要求
15所述顆粒狀形式肽的方法，它包括(1)用權(quán)利要求
1的質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化選自族系酵母科或隱球酵母科之菌株的細胞;(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞;和(3)從所產(chǎn)生的培養(yǎng)細胞或生長培養(yǎng)基中回收肽。
20.一種包括權(quán)利要求
12所述的多肽，并用生理學(xué)可接受的稀釋劑進行稀釋的疫苗。
21.一種包括權(quán)利要求
13所述的多肽，并用生理學(xué)可接受的稀釋劑進行稀釋的疫苗。
22.一種包括權(quán)利要求
14所述的多肽，并用生理學(xué)可接受的稀釋劑進行稀釋的疫苗。
23.一種包括權(quán)利要求
15所述的多肽，并用生理學(xué)可接受的稀釋劑進行稀釋的疫苗。
專利摘要
與乙型肝炎病毒表面抗原基因在一條連續(xù)的閱讀框架上相連的完整的乙型肝炎病毒pre S抗原基因在酵母屬釀酒酵母中進行了表達。表達的蛋白質(zhì)聚集成顆粒狀，展示了由兩個區(qū)域編碼的主要的抗原位點，從而，突出表明了酵母作為表達pre S區(qū)域的宿主的可利用性。該蛋白質(zhì)可用于體外診斷系統(tǒng)及作為疫苗用于治療及預(yù)防由乙型肝炎病毒引起的疾病及/或感染。
文檔編號C12N1/16GK87100465SQ87100465
公開日1987年10月14日 申請日期1987年1月28日
發(fā)明者羅納德·W·愛利思, 阿匹·哈郭拼, 彼特·J·肯尼斯肯 申請人:默克有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan