專利名稱：：與卡波濟(jì)氏肉瘤和腹膜后纖維瘤病相關(guān)的γ皰疹病毒的DNA聚合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及病毒學(xué)領(lǐng)域，尤其是皰疹病毒家族的病毒。本發(fā)明更具體地涉及病毒亞族的DNA聚合酶的鑒定和特征描述，所述病毒亞族的成員與包括人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的纖維增殖性和腫瘤疾病相關(guān)。
背景技術(shù)：
：卡波濟(jì)氏肉瘤是一種損壞外形并潛在致命的出血性肉瘤形式，其特征在于在皮膚上以深色斑或小結(jié)出現(xiàn)的多發(fā)性脈管腫瘤。在組織學(xué)水平上，其特征在于相對(duì)一致的紡錘形細(xì)胞的增殖，形成束和脈管裂縫。在炎癥浸潤(rùn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)漿細(xì)胞，T細(xì)胞和單核細(xì)胞，胃腸損害處或相關(guān)的淋巴瘤處出血的最終結(jié)果可能是死亡(一般參見(jiàn)Martin等人，F(xiàn)inesmith等人)。一旦遇到相對(duì)而言起因不明的疾病，公眾的注意力立刻會(huì)轉(zhuǎn)向該疾病與AIDS的相關(guān)性。多達(dá)20％的某些感染了AIDS的群體在疾病過(guò)程中會(huì)患卡波濟(jì)氏肉瘤，卡波濟(jì)氏肉瘤也出現(xiàn)在與免疫缺損相關(guān)的其它疾病中，包括腎透析和治療級(jí)免疫抑制，然而此疾病的流行病學(xué)暗示免疫缺損不是唯一的引發(fā)因素。具體地說(shuō)，卡波濟(jì)氏肉瘤與某些性服務(wù)高水平的相關(guān)性暗示非人類免疫缺損病毒這一病原因子的介入(Berel等人)。已鑒定出得自AIDS病人卡波濟(jì)氏損害的組織樣品中皰疹病毒樣DNA序列(Chang等人，由Ambroziuk等人進(jìn)一步證實(shí))，通過(guò)表現(xiàn)度差異分析得到序列(Lisitsyn等人)，其中使用不相關(guān)的引物寡核苷酸擴(kuò)增了已感染和未感染組織中的DNA，然后使所述DNA與細(xì)胞之間最重要的差異部分雜交到一起。此序列與EpsteinBarr病毒和皰疹病毒saimiri的已知序列部分相同，它編碼兩個(gè)結(jié)構(gòu)組分-衣殼和外被蛋白。在概括研究多種來(lái)源的組織時(shí)發(fā)現(xiàn)不論病人的HIV狀況如何，95％的卡波濟(jì)氏肉瘤損害中都有此序列(Moore等人)。相同病人的21％未介入組織呈陽(yáng)性，而對(duì)照群體樣品中5％呈陽(yáng)性，樣品之間大約有0.5％的序列差異。在體腔淋巴瘤中也檢測(cè)到較高拷貝數(shù)的此序列，所述淋巴瘤的滲出物中所含B細(xì)胞的基因型只在AIDS病人中出現(xiàn)(Cesarman等人)。其它與AIDS相關(guān)的淋巴瘤為陰性。皰疹病毒家族含有很多大小約為100nm的多包膜病毒，所述病毒能夠感染脊椎動(dòng)物(一般性評(píng)論例見(jiàn)Emery等人，F(xiàn)ield等人)。雙鏈DNA基因組異乎尋常得大-長(zhǎng)度約為88-229個(gè)千堿基，它在病毒生命周期的不同時(shí)期可產(chǎn)生50個(gè)以上不同的轉(zhuǎn)錄本。在其中一個(gè)時(shí)期，產(chǎn)生了多種核苷酸和多核苷酸加工酶以供病毒復(fù)制的需要，包括DNA聚合酶，DNA酶，dUTP酶，核糖核苷酸還原酶，尿嘧啶-DNA糖基化酶和胸苷激酶。與外部的病毒成分相比，不同種間的這些功能性蛋白質(zhì)趨于相對(duì)較保守(Karlin等人)。皰疹病毒家族已被分成幾個(gè)亞族，對(duì)每一類目的劃分起先是基于生物學(xué)特性基礎(chǔ)，當(dāng)基因組序列數(shù)據(jù)出現(xiàn)時(shí)才得以精簡(jiǎn)。α亞族含有的病毒具有寬宿主范圍，短的復(fù)制周期，和對(duì)感覺(jué)神經(jīng)節(jié)的親和性，它們包括人單純皰疹病毒和水痘-帶狀皰疹病毒。β亞族含有的病毒的宿主范圍受到限制，它們包括巨細(xì)胞病毒和人皰疹病毒6型。γ亞族含有的病毒通常嗜淋巴細(xì)胞，其DNA的特征在于約110千堿基的低GC含量的片段旁側(cè)有多個(gè)高GC含量的串聯(lián)重復(fù)，此亞族包括EpsteinBarr病毒(EBV)，皰疹病毒saimiri，馬皰疹病毒2和5型，和牛皰疹病毒4型。皰疹病毒與具有復(fù)雜臨床進(jìn)程的疾病有關(guān)，很多皰疹病毒的特征是能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)入潛伏期達(dá)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。α亞族的病毒在感覺(jué)和植物性神經(jīng)節(jié)中保持潛伏狀態(tài)，而γ亞族的病毒在例如淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞中保持潛伏狀態(tài)。潛伏期與某些病毒基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，并可以持續(xù)幾十年直至身體狀況最適于病毒恢復(fù)活性復(fù)制，這種身體狀況可包括免疫缺損。另外，一些γ亞族的皰疹病毒能夠遺傳轉(zhuǎn)化它們感染的細(xì)胞，例如，EBV與B細(xì)胞淋巴瘤，口毛白斑病，淋巴組織間質(zhì)肺炎和鼻咽癌有關(guān)。在人和其它脊椎動(dòng)物中出現(xiàn)的許多其它疾病涉及纖維增殖和前-腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，出現(xiàn)在人中的疾病的例子是腹膜后纖維變性，小結(jié)狀纖維瘤病，假肉瘤纖維瘤病，和硬化腸系膜炎。在華盛頓大學(xué)的地區(qū)性靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中心的獼猴群體中已觀察到已知為地方性腹膜后纖維瘤病(RF)的另一種疾病(Giddens等人)。此疾病晚期的特征在于纖維組織圍繞腸系膜和腹膜腔的背面部分增殖，延伸至腹股溝內(nèi)，穿過(guò)隔膜，并進(jìn)入腹壁。一旦在臨床上出現(xiàn)此病的明顯癥狀，病人一律在1-2個(gè)月內(nèi)死亡。此病與由D型猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒SRV-2造成的猿猴免疫缺損(SAIDS)相關(guān)(Tsai等人)，但是在感染了SAIDS的其它猴群體中未顯示出相同的RF頻率，近年來(lái)華盛頓的RF頻率已有所降低。在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中研究這種疾病是重要的，這不僅是由于它可作為人疾病的模型，也是因?yàn)橐环N靈長(zhǎng)類動(dòng)可作為感染另一種靈長(zhǎng)類動(dòng)物的病毒的來(lái)源庫(kù)，例如，皰疹病毒saimiri在其天然宿主松鼠猴(Saimirisciureus)中似乎不會(huì)引起疾病，但它在其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是貓頭鷹(owl)猴中會(huì)引起多克隆的T-細(xì)胞淋巴瘤和急性白血病。有必要開(kāi)發(fā)試劑和方法以用于檢測(cè)和治療皰疹病毒感染。例如，有必要開(kāi)發(fā)能夠用于診斷和評(píng)價(jià)卡波濟(jì)氏肉瘤和類似疾病的試劑和方法。能夠檢測(cè)新病人的病原因子在鑒別診斷中會(huì)起作用；能夠評(píng)價(jià)正在發(fā)生的疾病病原因子的水平在臨床處理時(shí)會(huì)起作用。在此方面，Chang等人的編碼外被蛋白的多核苷酸的實(shí)用性已受到限制，需要得到能夠區(qū)分活動(dòng)感染和潛伏感染的標(biāo)記物，也需要得到免疫原性的標(biāo)記物，當(dāng)在抗體應(yīng)答中證明時(shí)，所述標(biāo)記物可用于評(píng)價(jià)對(duì)病原因子的免疫學(xué)暴露。第二，有必要開(kāi)發(fā)能夠用于開(kāi)發(fā)治療卡波濟(jì)氏肉瘤和類似疾病的新藥物的試劑和方法。對(duì)卡波濟(jì)氏肉瘤的最新治療方法是放射性療法與傳統(tǒng)的化學(xué)療法，如長(zhǎng)春新堿(Northfelt，Mitsuyasu)的聯(lián)合，盡管損害會(huì)對(duì)這些物理療法作出反應(yīng)，但反應(yīng)是暫時(shí)的，不好的臨床進(jìn)程一般會(huì)恢復(fù)，甚至實(shí)驗(yàn)性的療法，如用細(xì)胞因子治療也是針對(duì)疾病綜合征而不是病因?；诓≡蜃拥乃幬锖Y選和合理的藥物設(shè)計(jì)可直接針對(duì)對(duì)于具有長(zhǎng)期效力的臨床方案的長(zhǎng)期需要。第三，有必要開(kāi)發(fā)能夠用于鑒定可能與其它纖維增殖性疾病相關(guān)的病毒因子的試劑和方法。Chang等人使用的表現(xiàn)度差異分析技術(shù)非常復(fù)雜，可能不適于作為一般的篩選試驗(yàn)。在研究多種懷疑含有相關(guān)病原因子的組織樣品的更常規(guī)的試驗(yàn)中能用作試劑的一套引物或探針更加合乎需要，優(yōu)選此試劑能充分地交叉反應(yīng)以鑒定以前未描述過(guò)的病原因子，但此試劑要有足夠的特異性以避免鑒定出不需要的病毒或宿主的內(nèi)源成分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供分離的多核苷酸、多肽、和抗體，它們或得自新的DNA聚合酶基因，或能與所述基因的產(chǎn)物反應(yīng)，所述基因存在于皰疹病毒中，該病毒與尤其發(fā)生于人和非人靈長(zhǎng)類中的纖維增殖性疾病和腫瘤相關(guān)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供多核苷酸引物和探針以檢測(cè)和鑒定皰疹病毒家族，尤其是γ皰疹病毒亞族的任何成員中的DNA聚合酶基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供基于這些多核苷酸、多肽、和抗體的材料和方法以用于診斷和治療靈長(zhǎng)類，尤其是人中的γ皰疹病毒感染。本發(fā)明的實(shí)施方案包括下列內(nèi)容·含有編碼皰疹病毒DNA聚合酶之區(qū)域的分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有與選自SEQ.IDNO1和SEQ.IDNO3的核苷酸27-501至少有69％相同的序列(優(yōu)選長(zhǎng)度為475個(gè)核苷酸)?！ず猩鲜鰧?shí)施方案中的編碼DNA聚合酶的多核苷酸區(qū)中的至少18個(gè)，更優(yōu)選至少約35個(gè)，再更優(yōu)選約50個(gè)連串的核苷酸片段的分離的多核苷酸，其中SEQ.IDNOS110或111中不含所述片段的序列，優(yōu)選的例子是含有SEQ.IDNOS1，3，116，或118中所含的至少18個(gè)連串核苷酸片段的分離的多核苷酸?！ず芯幋a皰疹病毒DNA聚合酶之區(qū)域的分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有與寡核苷酸LSGGA(SEQ.IDNO107)至少有80％相同的26個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列?！ず芯幋a皰疹病毒DNA聚合酶之區(qū)域的分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有與寡核苷酸CTDPA(SEQ.IDNO108)至少有69％相同的29個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列?！ず芯幋a皰疹病毒DNA聚合酶之區(qū)域的分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有與寡核苷酸KMLEA(SEQ.IDNO22)至少有80％相同的32個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列?！ず芯幋a皰疹病毒DNA聚合酶之區(qū)域的分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有與寡核苷酸GISPA(SEQ.IDNO109)至少有69％相同的29個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列?！ず猩鲜鰧?shí)施方案中的編碼DNA聚合酶的多核苷酸區(qū)中的至少18個(gè)，更優(yōu)選至少約35個(gè)，更優(yōu)選約50個(gè)連串的核苷酸片段的分離的多核苷酸，其中SEQ.IDNOS110或111中不含所述片段的序列。任一個(gè)上述實(shí)施方案中的多核苷酸，其中所述皰疹病毒能夠感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選的例子是RFHV，KSHV，和RFHV2。·含有與SEQ.IDNO1所含的核苷酸27-501之間，或SEQ.IDNO3所含的核苷酸27-501之間，或SEQ.IDNO116所含的核苷酸36-2499之間，或SEQIDNO118所含的核苷酸1-454之間的線性序列至少有18個(gè)核苷酸相同，而不與SEQ.IDNO110或SEQ.IDNO111中所含線性序列相同的線性序列的分離的多核苷酸，分離的多核苷酸優(yōu)選含有基本上與SEQ.IDNO1的核苷酸27-501，或SEQ.IDNO3的核苷酸27-501，或SEQ.IDNO116的核苷酸36-2499，或SEQ.IDNO118的核苷酸1-454相同的線性序列?！け景l(fā)明包括的任一個(gè)多核苷酸編碼的分離的多肽。分離的多肽，含有基本上與SEQ.IDNO2所含氨基酸10-167之間，或SEQIDNO4所含氨基酸10-167之間，或SEQ.IDNO117所含氨基酸13-833之間的序列，或與SEQ.IDNOS119-123中的任一個(gè)所含的氨基酸序列至少有11個(gè)，優(yōu)選12個(gè)，更優(yōu)選15個(gè)氨基酸相同，而不與SEQ.IDNOS112或SEQ.IDNO113中所含氨基酸序列相同的線性序列。融合多肽，含有與第二個(gè)氨基酸序列相連的上述實(shí)施方案的分離多肽的氨基酸序列?！ど鲜鰧?shí)施方案的分離的多肽，具有核酸結(jié)合活性，核苷酸結(jié)合活性，或DNA聚合酶的活性。·分離的多肽，含有與選自SEQ.IDNO80，82，84，86，88，和90-103的氨基酸序列相同的線性序列?！ぞ幋a本發(fā)明中包括的多肽的分離的多核苷酸?！ぞ幋a本發(fā)明中包括的多肽的非天然產(chǎn)生的多核苷酸?！ぞ幋a融合多肽的多核苷酸，含有與編碼多肽的第二多核苷酸直接相連的本發(fā)明中包括的多核苷酸。·重組克隆載體，含有編碼與SEQ.IDNO2所含氨基酸10-167之間，或SEQIDNO4所含氨基酸10-167之間，或SEQ.IDNO117所含氨基酸13-833之間的序列，或與SEQ.IDNOS119-123中的任一個(gè)所含的氨基酸序列至少有11個(gè)，優(yōu)選12個(gè)，更優(yōu)選15個(gè)連串的氨基酸相同，而不與SEQIDNOS12或SEQ.IDNO113中所含氨基酸序列相同的多肽的多核苷酸序列。·重組表達(dá)載體，含有與調(diào)控多核苷酸序列有效相連的編碼與SEQ.IDNO2所含氨基酸10-167之間，或SEQIDNO4所含氨基酸10-167之間，或SEQ.IDNO17所含氨基酸13-833之間的序列，或與SEQ.IDNOS119-123中的任一個(gè)所含的氨基酸序列至少有11個(gè)，優(yōu)選12個(gè)，更優(yōu)選15個(gè)連串的氨基酸相同，而不與SEQIDNOS112或SEQ.IDNO113中所含氨基酸序列相同的多肽的多核苷酸序列?！ぶ亟M克隆載體，含有與SEQ.IDNOS1，3，116，或118中所含的，而不是SEQIDNOS110或111中所含的線性序列至少有18個(gè)核苷酸相同的線性序列?！ぴ谶z傳上被本發(fā)明的多核苷酸，克隆載體，或表達(dá)載體中的任一個(gè)所改變的宿主細(xì)胞?！ぬ禺愥槍?duì)本發(fā)明多核苷酸的所述編碼區(qū)所編碼的DNA聚合酶的單克隆或分離的多克隆抗體?！ぬ禺愥槍?duì)本發(fā)明多肽的單克隆或分離的多克隆抗體?！せ旧吓c選自SEQIDNOS5-16，21，22，104-109，和124-152的寡核苷酸相同的寡核苷酸?！さ玫骄幋aDNA聚合酶的多核苷酸的擴(kuò)增拷貝的方法，包括用本發(fā)明的寡核苷酸接觸多核苷酸并延伸已與多核苷酸形成雙螺旋的寡核苷酸的步驟，所述寡核苷酸可以是1型，2型或3型寡核苷酸，擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，PCR優(yōu)選包括退火和延伸的重復(fù)循環(huán)，退火在至少60℃的溫度下進(jìn)行?！CR優(yōu)選在含有10-30mM(NH4)2SO4和1-10mMMgCl2的緩沖液，如WB4緩沖液中進(jìn)行?！さ玫骄幋aDNA聚合酶的多核苷酸的擴(kuò)增拷貝的方法，其中被擴(kuò)增的多核苷酸首先得自生物樣品，所述生物樣品取自患有以成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積為特征的疾病的個(gè)體?！さ玫骄幋aDNA聚合酶的多核苷酸的擴(kuò)增拷貝的方法，其中被擴(kuò)增的多核苷酸首先得自生物樣品，所述生物樣品取自患有淋巴細(xì)胞譜系惡性腫瘤的個(gè)體，另外包括的方法中，被擴(kuò)增的多核苷酸首先得自生物樣品，所述生物樣品取自患有選自腹膜后纖維變性，小結(jié)狀纖維瘤病，假肉瘤纖維瘤病，纖維肉瘤，硬化腸系膜炎，急性呼吸病綜合癥，特發(fā)性肺纖維變性，擴(kuò)散增殖性腎小球腎炎，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)增生，白血病和淋巴瘤的疾病的個(gè)體?！z測(cè)來(lái)源于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括的步驟有將樣品中的DNA或RNA與含有本發(fā)明多核苷酸的探針接觸，所處條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在。涉及的條件是一單套滿足所有列出的標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)參數(shù)，如保溫時(shí)間，溫度，溶質(zhì)濃度和洗滌步驟。在這些條件下，多核苷酸如果與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸接觸，可以形成穩(wěn)定的雙螺旋，如果與具有SEQ.IDNO24-SEQ.IDNO29中任一個(gè)的序列的多核苷酸接觸，不能形成穩(wěn)定的雙螺旋。只要在檢測(cè)條件下穩(wěn)定雙螺旋的形成取決于所示序列，即可通過(guò)與僅由所示序列組成的多核苷酸接觸，或通過(guò)與含有與另外的核苷酸相連的所示序列的多核苷酸接觸非強(qiáng)制性地檢測(cè)反應(yīng)條件。使用本發(fā)明的其它多核苷酸的類似方法也包括在本發(fā)明中，它包括在與探針接觸之前，對(duì)樣品中的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可使用本發(fā)明的寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?！z測(cè)來(lái)源于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括的步驟有將樣品中的DNA或RNA與含有SEQ.IDNOS21，22，107，108，或109中所示序列的寡核苷酸探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和如果有的話，檢測(cè)形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在?！z測(cè)樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括的步驟有將樣品中的DNA或RNA與含有SEQ.IDNOS22，107，108，或109中所示序列的寡核苷酸探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS23-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和如果有的話，檢測(cè)形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在?！z測(cè)樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括的步驟有在反應(yīng)中使用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物對(duì)樣品中的多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；和如果有的話，檢測(cè)多核苷酸擴(kuò)增拷貝的存在?！つ芘c含有選自SEQ.IDNO107，SEQ.IDNO108和它們各自的互補(bǔ)序列的序列的寡核苷酸形成穩(wěn)定雙螺旋的分離的多核苷酸，所處的條件中寡核苷酸能與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS23-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋。分離的多肽含有由上述實(shí)施方案中多核苷酸編碼的至少11個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少12個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸的線性序列?！z測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括檢測(cè)得自個(gè)體的生物樣品中的病毒DNA或RNA，其中通過(guò)本發(fā)明中包括的方法檢測(cè)病毒DNA或RNA。另外包括的檢測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法中包括檢測(cè)得自個(gè)體的生物樣品中的病毒DNA或RNA，其中病毒DNA或RNA的檢測(cè)通過(guò)下列方法進(jìn)行a)將樣品中的DNA或RNA與含有本發(fā)明多核苷酸的探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有選自SEQ.IDNOS1，3，116，或118的至少一個(gè)序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在。另外包括的檢測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法中包括檢測(cè)得自個(gè)體的生物樣品中的病毒DNA或RNA，其中病毒DNA或RNA的檢測(cè)通過(guò)下列方法進(jìn)行a)將樣品中的DNA或RNA與含有本發(fā)明多核苷酸的探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO116中所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在?！z測(cè)生物樣品中皰疹病毒多核苷酸的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括本發(fā)明的多核苷酸。檢測(cè)生物樣品中皰疹病毒多核苷酸的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括本發(fā)明的寡核苷酸?！z測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括下列步驟將得自個(gè)體的樣品中的抗體與本發(fā)明的多肽接觸，所處的條件能允許穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物的形成；和如果有的話，檢測(cè)所形成的所述穩(wěn)定復(fù)合物?！z測(cè)生物樣品中存在的抗-皰疹病毒抗體的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括本發(fā)明的多肽?！z測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括下列步驟將得自個(gè)體的樣品中的抗體與本發(fā)明的多肽接觸，所處的條件能允許穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物的形成；和如果有的話，檢測(cè)所形成的所述穩(wěn)定復(fù)合物?！z測(cè)生物樣品中存在的抗-皰疹病毒抗體的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括本發(fā)明的多肽?！z測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括下列步驟將得自個(gè)體的樣品中的多肽與本發(fā)明的抗體接觸，所處的條件能允許穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物的形成；和如果有的話，檢測(cè)所形成的所述穩(wěn)定復(fù)合物?！z測(cè)生物樣品中存在的皰疹病毒多肽的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括本發(fā)明的抗體?！び糜谥委煱捳畈《靖腥镜慕M合物，包括本發(fā)明的多核苷酸，多肽，或抗體?！ご_定候選藥物是否能用于治療γ皰疹病毒感染的方法，包括下列步驟將本發(fā)明的多肽與候選藥物接觸；并確定候選藥物是否能改變多肽的生化功能。被確定的多肽生化功能可以是多肽與核酸的結(jié)合，或DNA聚合酶的活性?！ご_定候選藥物是否能用于治療γ皰疹病毒感染的方法，包括下列步驟使用本發(fā)明的多核苷酸在遺傳上改變細(xì)胞，并與未被多核苷酸在遺傳上改變的細(xì)胞相比確定候選藥物對(duì)細(xì)胞的影響?！さ玫接糜谥委煴话捳畈《靖腥局畟€(gè)體的化合物的方法，包括下列步驟產(chǎn)生能與涉及與核酸的相互作用的本發(fā)明多肽區(qū)結(jié)合的化合物；并確定化合物是否干擾多肽的生化功能。附圖簡(jiǎn)述圖1列出了從RFHV和KSHV的DNA聚合酶編碼區(qū)擴(kuò)增的多核苷酸序列，以及被編碼的多肽，下劃線部分是每個(gè)多核苷酸在引物DFASA和GDTD1B之間的475-堿基的片段。以小寫字母表示的是用作擴(kuò)增引物的寡核苷酸，它與DNA聚合酶基因的相應(yīng)區(qū)域排在一起。DFASA，VYGA和GDTD1B是含有共有的和簡(jiǎn)并的區(qū)段的寡核苷酸，它們可用于擴(kuò)增任何皰疹病毒DNA聚合酶基因。LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA是特異針對(duì)皰疹病毒RFHV/KSHV亞族的寡核苷酸。VASGA，ILPCA，PIEAB和PEARB是RFHV-特異性引物。SGILA，CLNIA，IEASB和EARFB是KSHV-特異性引物。在編碼序列的方向上起始擴(kuò)增的寡核苷酸(名稱以“A”結(jié)束)以5′→3′的方向被列出。以與編碼序列的方向相反的方向起始擴(kuò)增的寡核苷酸(名稱以“B”結(jié)束)以3′→5′的方向被列出以顯示出與RFHV和KSHV多核苷酸中的相應(yīng)序列的對(duì)比。圖2列出了以前已知的其它皰疹病毒DNA聚合酶的多肽序列，顯示出種之間相對(duì)保守的區(qū)域。圖3列出了以前已知的靠近保守的REGION2的皰疹病毒多核苷酸序列，顯示出排成行的寡核苷酸DFASA和DFQSA以及從中它們被設(shè)計(jì)的序列。圖4列出了以前已知的靠近保守的REGION3的皰疹病毒多核苷酸序列，顯示出排成行的寡核苷酸VYGA，VYGCA和VYGSQA以及從中它們被設(shè)計(jì)的序列。圖5列出了以前已知的靠近保守的REGION1的皰疹病毒多核苷酸序列，顯示出排成行的寡核苷酸GDTD1B和GDTDSQB以及從中它們被設(shè)計(jì)的序列。圖6列出了γ皰疹病毒亞族DNA聚合酶的多核苷酸序列的比較，所示片段是DFASA和GDTD1B雜交位點(diǎn)之間的475個(gè)堿基對(duì)。圖7列出了相同病毒DNA聚合酶有關(guān)圖6所示相同片段的多肽序列之間的比較。該圖也顯示了可能的抗體結(jié)合區(qū)的例子，包括特異針對(duì)RFHV、KSHV或RFHV/KSHV亞族的那些。圖8比較了較廣范圍的皰疹病毒中DFASA和GDTD1B之間編碼的片段的多肽序列，顯示出α，β，和γ亞族皰疹病毒，和內(nèi)源性哺乳動(dòng)物DNA聚合酶的序列。圖9是以圖8所示多肽序列為基礎(chǔ)的DNA聚合酶關(guān)系圖譜。圖10列出了γ皰疹病毒亞族成員與圖6所示相同區(qū)域有關(guān)的DNA聚合酶基因，此圖顯示出排成一行的寡核苷酸LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA以及從中它們被設(shè)計(jì)的序列，這些寡核苷酸特異針對(duì)RFHV/KSHV病毒亞族的DNA聚合酶。圖11是VYGA和GDTD1B之間編碼的RFHV多肽片段的Hopp-Woods抗原性圖，下面示出的是序列中疏水性和抗原性殘基的跨度。圖12是DFASA和GDTD1B之間編碼的KSHV多肽片段的Hopp-Woods抗原性圖，下面示出的是序列中疏水性和抗原性殘基的跨度。圖13列出了KSHV的估計(jì)約3000個(gè)核苷酸長(zhǎng)的DNA聚合酶編碼序列中的約2511個(gè)核苷酸，以及氨基酸翻譯，從圖1所示的PCR片段中以5′和3′方向提供另外的序列資料。圖14列出了KSHV的DNA聚合酶氨基酸序列部分與其它皰疹病毒的相應(yīng)部分的比較，星號(hào)(*)和圓點(diǎn)(·)表示保守的殘基或保守的取代，箭頭(↑)表示在其它皰疹病毒中保守，但在KSHV序列中有所不同的殘基。圖15列出了KSHVDNA聚合酶氨基酸序列已知的變體。圖16列出了從RFHVMm(此處被稱為RFMm)的DNA聚合酶編碼區(qū)擴(kuò)增的多核苷酸序列，RFHVMm是根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)鑒定的RFHV/KSHV皰疹病毒亞族的第三個(gè)成員，此圖顯示了RFHV(此處被稱為RFMn)的DNA聚合酶編碼區(qū)和KSHV的DNA聚合酶編碼區(qū)之間的比較。圖17列出了RFHVMm的DNA聚合酶編碼區(qū)所編碼的氨基酸序列與RFHVMn，KSHV和三種其它皰疹病毒的相應(yīng)序列之間的比較。圖18是圖17中的氨基酸行列的統(tǒng)計(jì)學(xué)的系統(tǒng)發(fā)育分析，所示數(shù)目是100次重復(fù)以外的自舉值。圖19是顯示RFHV/KSHV亞族成員的DNA聚合酶核苷酸序列中1型，2型，和3型寡核苷酸探針的大致雜交位置的圖。圖20是在使用病毒-特異性寡核苷酸引物的嵌套擴(kuò)增試驗(yàn)中有代表性地篩選豚尾猴(泳道A-D，I，和J)和獼猴(泳道G和H)中RFHVMn和RFHVMm皰疹病毒序列的流行。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式我們已從皰疹病毒RFHV/KSHV亞族的典型成員RFHV，RFHV2和KSHV中發(fā)現(xiàn)并鑒定了編碼DNA聚合酶的多核苷酸，所得多核苷酸，相關(guān)的多核苷酸，和相應(yīng)的多肽和抗體能用于診斷，臨床監(jiān)測(cè)和治療皰疹病毒感染以及相關(guān)疾病。RFHV和KSHV的上述多核苷酸分別來(lái)自取自患有腹膜后纖維瘤病(“RF”)的豚尾猴和患有卡波濟(jì)氏肉瘤(“KS”)的人的被感染組織的樣品。我們預(yù)測(cè)同這些疾病相關(guān)的病毒與引起任何同時(shí)期的免疫缺損的病毒有所不同。我們預(yù)先不知道會(huì)牽涉到RF和KS相關(guān)病毒。我們決定檢驗(yàn)這一前提，即與這兩種疾病都相關(guān)的病毒是皰疹病毒家族中的成員，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增反應(yīng)的寡核苷酸以得到大范圍的皰疹病毒中編碼DNA聚合酶的多核苷酸。將此前已描述過(guò)的皰疹病毒氨基酸序列進(jìn)行比較，鑒定出三個(gè)保守區(qū)。使用相應(yīng)的已知的多核苷酸序列構(gòu)建含有簡(jiǎn)并區(qū)段和共有區(qū)段的寡核苷酸。這些寡核苷酸在擴(kuò)增反應(yīng)中可用作引物，所述擴(kuò)增反應(yīng)可從兩種組織來(lái)源的每一種中產(chǎn)生編碼DNA聚合酶之區(qū)段的片段。擴(kuò)增反應(yīng)最后一步得到的多核苷酸片段的序列示于圖1(分別為SEQ.IDNO1和SEQ.IDNO3)，盡管這兩個(gè)序列含有與其它皰疹病毒DNA聚合酶序列區(qū)域高度同源的區(qū)域，但這兩個(gè)序列仍是新的。感染豚尾猴的病毒被稱為“腹膜后纖維瘤病皰疹病毒”(“RFHV”)，感染人患者的病毒被稱為“卡波濟(jì)氏肉瘤皰疹病毒”(“KSHV”)。所示多核苷酸序列包括的區(qū)段的每一末端對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增反應(yīng)中所用DFASA和GDTD1B引物的雜交區(qū)域。引物之間475個(gè)堿基對(duì)的片段表示RFHV和KSHV的DNA聚合酶基因的擴(kuò)增部分。鑒于設(shè)計(jì)引物是為了擴(kuò)增大范圍的DNA聚合酶，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)相對(duì)于任何其它已知的皰疹病毒DNA聚合酶而言，這兩個(gè)DNA聚合酶序列相互之間顯然更加密切相關(guān)(在核苷酸水平上有71％相同)。下一個(gè)最密切相關(guān)的多核苷酸序列來(lái)自馬皰疹病毒2(eHV2)，松鼠猴皰疹病毒1型(sHVI)和EpsteinBarr病毒(EBV)，因此我們預(yù)測(cè)RFHV和KSHV都是皰疹病毒γ亞族的成員。RFHV和KSHV與其它γ皰疹病毒的共有特征是與異常的細(xì)胞或纖維變性生長(zhǎng)的相關(guān)性，以及與包括免疫抑制和B細(xì)胞發(fā)育異常的免疫異常的相關(guān)性。然而RFHV和KSHVDNA聚合酶序列在CpG二核苷酸的頻率上與sHV1和EBV有所不同。RFHV和KSHVDNA聚合酶的核苷酸序列和以此為根據(jù)的寡核苷酸確定了下文所述的RFHV/KSHV亞族。還提供了感染獼猴的該亞族第三成員RFHV2的DNA聚合酶序列。DNA聚合酶之間保守的程度意味著本發(fā)明中包含的多核苷酸和多肽是RFHV和KSHV不同毒株中可靠的標(biāo)記物。由于DNA聚合酶是隱蔽抗原，因此它不在相同水平的免疫學(xué)壓力下形成逃逸突變體。另外，此序列受這些區(qū)域在DNA聚合酶催化活性中所起到的關(guān)鍵性作用的限制。因此，本發(fā)明中包含的多核苷酸，多肽和抗體在此應(yīng)用中可用于檢測(cè)個(gè)體中由屬相同亞族的RFHV，KSHV或其它皰疹病毒引起的病毒感染。本發(fā)明的實(shí)施方案也可用于鑒定皰疹病毒DNA聚合酶和設(shè)計(jì)藥物療法。由于DNA聚合酶在病毒復(fù)制中起關(guān)鍵性作用，因此它是藥理干涉的適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)。此分子中特別敏感的區(qū)域是那些涉及底物識(shí)別，模板結(jié)合，催化作用，與調(diào)節(jié)性亞單位結(jié)合的區(qū)域。在下文章節(jié)中將進(jìn)一步詳細(xì)描述RFHV/KSHV亞族的多核苷酸，相關(guān)的寡核苷酸探針和引物，相關(guān)的多肽和抗原，相關(guān)的特異性抗體，這些化合物的制備和用途和相關(guān)的方法及產(chǎn)品?？s寫本文使用的下列縮寫指的是皰疹病毒的種類，以及從中得到的編碼DNA聚合酶的多核苷酸和基因定義“RFHV”和“KSHV”分別是在被感染的豚尾猴和人的組織樣品中檢測(cè)到的皰疹病毒家族的病毒。被這些病毒感染的細(xì)胞含有編碼本文所述的各種DNA聚合酶的多核苷酸。“RFHV”是術(shù)語(yǔ)“RFHV1”，“RFHVMn”和“RFMn”的同義詞。RFHV/KSHV亞族的第三成員是在獼猴中鑒定出的病毒，本文中將此病毒稱作“RFHV2”，“RFHV2”是術(shù)語(yǔ)“RFHVMm”和“RFMm”的同義詞?！癛FHV/KSHV亞族”這一術(shù)語(yǔ)用于本文是指能感染脊椎動(dòng)物種類的皰疹病毒的總和，組成這一亞族的成員所具有的序列與RFHV或KSHV的相應(yīng)序列之間的相關(guān)性與這些病毒中的任一種與表1所列的其它任何病毒之間的相關(guān)性相比，前者更加密切。可以在多核苷酸水平上也可以在多肽水平上進(jìn)行序列比較，序列比較可以橫跨完整的基因或蛋白質(zhì)，或橫跨其片段。本文所用的亞族指的是這樣一些皰疹病毒，它們含有編碼DNA聚合酶的多核苷酸部分，所述多核苷酸與RFHV或KSHV的相應(yīng)區(qū)域較這些病毒中任一個(gè)與表1中病毒之間更加一致。優(yōu)選編碼聚合酶的多核苷酸含有在殘基27和501之間與RFHV(SEQ.IDNO1)或KSHV(SEQ.IDNO3)的相應(yīng)部分至少有69％相同的區(qū)段；或與寡核苷酸LSGGA至少有80％相同；或與寡核苷酸CTDPA至少有69％相同；或與寡核苷酸KMLEA至少有80％相同；或與寡核苷酸GISPA至少有69％相同。本文所用的“DNA聚合酶”是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類似物，在適當(dāng)條件下能夠催化DNA多核苷酸與序列的裝配，所述序列與用作模板的多核苷酸互補(bǔ)。DNA聚合酶也可以含有其它催化活性，如3′-5′外切核酸酶活性；任何一種活性都可能占優(yōu)勢(shì)。DNA聚合酶可能需要與附加的蛋白質(zhì)或輔-因子連接以行使其催化功能?！癉NA聚合酶活性”指的是針對(duì)DNA多核苷酸裝配的催化活性，“DNA聚合酶反應(yīng)”是核苷酸聚合途徑中反應(yīng)機(jī)理的任何步驟，包括與底物，輔因子和調(diào)節(jié)性亞單位的連接，中間體的形成，和反應(yīng)產(chǎn)物的形成。術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶基因”包括能編碼可催化DNA聚合酶反應(yīng)之多肽的任何基因。因其與其它DNA聚合酶基因的同源性或其相對(duì)于相鄰基因的位置，“DNA聚合酶基因”也包括據(jù)信衍生自編碼DNA聚合酶的原始基因的任何基因；這種基因可以編碼非功能性的DNA聚合酶類似物，DNA聚合酶片段或突變體，或此基因不能被轉(zhuǎn)錄或翻譯?！罢{(diào)節(jié)性的亞單位”對(duì)于具有DNA聚合酶活性的第一多肽而言是當(dāng)與第一多肽連接時(shí)能調(diào)節(jié)其DNA聚合酶活性的第二多肽。UL42是調(diào)節(jié)性亞單位的一例?！癠L42”或“UL42亞單位”是一些皰疹病毒基因組中編碼的輔助蛋白，它能與病毒的DNA聚合酶連接。在某些條件下，它可增強(qiáng)由DNA聚合酶基因編碼的多肽的DNA聚合酶活性，病毒可能需要它才能復(fù)制。本文所用的定義是功能性定義，不取決于相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)或基因組位置，因此RFHV或KSHV的UL42亞單位所具有的序列與其它病毒的UL42亞單位實(shí)質(zhì)上并不相同。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互換使用，它們指的是任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸或者是脫氧核糖核苷酸或者是核糖核苷酸，或者是它們的類似物。多核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，并可行使已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸非限制性的例子基因或基因片段，外顯子，內(nèi)含子，信使RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，核糖體RNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，分支多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列分離的DNA，任何序列分離的RNA，核酸探針和引物。多核苷酸可含有經(jīng)修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在修飾，則可在聚合物裝配之前或之后對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。非核苷酸成分可打斷核苷酸的序列，聚合之后可通過(guò)例如與標(biāo)記成分結(jié)合進(jìn)一步修飾多核苷酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸可互換地指雙鏈和單鏈分子。除非另有特別說(shuō)明或需要，本文所述發(fā)明的任何實(shí)施方案中的多核苷酸既包含雙鏈形式，也包含已知或預(yù)測(cè)組成此雙鏈形式的兩個(gè)互補(bǔ)單鏈形式中的每一種。在多核苷酸的上下文中，“線性序列”或“序列”是多核苷酸中5′至3′方向上的核苷酸順序，其中在序列中互為鄰居的殘基在多核苷酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中是鄰接的?！安糠中蛄小笔且阎谝粋€(gè)或兩個(gè)方向上含有額外殘基的多核苷酸之一部分的線性序列。“雜交”指的是一種或多種多核苷酸反應(yīng)形成復(fù)合物的反應(yīng)，所述復(fù)合物通過(guò)核苷酸殘基堿基之間的氫鍵得以穩(wěn)定。Watson-Crick堿基配對(duì)，Hoogsteen結(jié)合或任何其它序列-特異性方式都可能產(chǎn)生氫鍵鍵合。復(fù)合物可含有形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈，形成多鏈復(fù)合物的三條或更多條鏈，單條自身雜交鏈或任何它們的組合。在更加外延的方法，如PCR的起始，或通過(guò)核酶酶促裂解多核苷酸中，雜交反應(yīng)可構(gòu)成一個(gè)步驟。可在不同的“嚴(yán)緊”條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。增加雜交反應(yīng)嚴(yán)緊性的條件已廣為人知并已在本
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中公開(kāi)，例見(jiàn)SambrookFritsch&Maniatis。相關(guān)條件的例子包括(以增加嚴(yán)緊性的次序)保溫溫度為25℃，37℃，50℃和68℃；緩沖液濃度為10×SSC，6×SSC，1×SSC，0.1×SSC(其中SSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸緩沖液)和使用其它緩沖液系統(tǒng)的它們的等同物；甲酰胺濃度為0％，25％，50％和75％；保溫時(shí)間為5分鐘至24小時(shí)；和洗滌持續(xù)時(shí)間漸長(zhǎng)，頻率漸增或緩沖液濃度逐漸降低?！癟m”是實(shí)驗(yàn)條件下50％多核苷酸雙螺旋解離成單鏈時(shí)的攝氏溫度，所述雙螺旋由通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)在反平行方向以氫鍵鍵合的互補(bǔ)鏈組成。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)公式可預(yù)測(cè)Tm，例如Tm＝81.5+16.6log[Na+]+0.41(％G/C)-0.61(％F)-600/L其中Na+是以mol/L表示的陽(yáng)離子濃度(通常為鈉離子)；(％G/C)是以在雙螺旋中占總殘基的百分比表示的G和C殘基的數(shù)目；(％F)是溶液中甲酰胺的百分含量(wt/vol)；L是雙螺旋的每一鏈中核苷酸的數(shù)目。多核苷酸“穩(wěn)定的雙螺旋”或生化反應(yīng)中任何兩個(gè)或多個(gè)成分之間形成的“穩(wěn)定的復(fù)合物”指的是在雙螺旋或復(fù)合物的形成和其隨后的檢測(cè)之間能維持足夠長(zhǎng)時(shí)間的雙螺旋或復(fù)合物。雙螺旋或復(fù)合物無(wú)論在何種條件存在下都應(yīng)該能維持并在形成時(shí)刻和檢測(cè)時(shí)刻之間的某一時(shí)刻被導(dǎo)入，這些條件是所進(jìn)行的檢測(cè)或反應(yīng)的參數(shù)。非強(qiáng)制性存在的能破壞雙螺旋或復(fù)合物的有關(guān)條件包括洗滌，加熱，在反應(yīng)混合物中加入額外的溶質(zhì)或溶劑(如變性劑)，和與多余的反應(yīng)類別競(jìng)爭(zhēng)。穩(wěn)定的雙螺旋或復(fù)合物可以是不可逆的，也可以是可逆的，但必須滿足此定義的其它必需條件。因此，反應(yīng)混合物中可能形成瞬時(shí)復(fù)合物，但是如果它自動(dòng)解離或者由于在檢測(cè)前引入新增加的條件或操作而發(fā)生解離，就不能構(gòu)成穩(wěn)定的復(fù)合物。當(dāng)在兩個(gè)單鏈多核苷酸之間以反平行的構(gòu)型形成穩(wěn)定的雙螺旋時(shí)，特別是在高度嚴(yán)緊的條件下，鏈基本上是“互補(bǔ)的”。雙鏈多核苷酸可以與另一個(gè)多核苷酸“互補(bǔ)”，條件是第一多核苷酸中的一條鏈和第二多核苷酸中的一條鏈之間能形成穩(wěn)定的雙螺旋。從單鏈多核苷酸序列推測(cè)的互補(bǔ)序列是有望根據(jù)廣泛為人接受的堿基配對(duì)規(guī)則與單鏈多核苷酸形成氫鍵鍵合的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的最適序列。“有義”鏈和“反義”鏈當(dāng)用于相同的上下文中時(shí)指的是相互之間互補(bǔ)的單鏈多核苷酸。它們可以是雙鏈多核苷酸的相反鏈，或者根據(jù)廣泛為人接受的堿基配對(duì)規(guī)則由一條鏈推測(cè)另一條鏈。除非另有特別說(shuō)明或暗示，可任意地將一條鏈或其它鏈指定為“有義”或“反義”鏈。如果每一線性序列中的核苷酸順序相同，并且不存在取代，缺失或物質(zhì)替換，則核苷酸線性序列與另一個(gè)線性序列“相同”。應(yīng)理解就Watson-Crick堿基配對(duì)而言，具有類似結(jié)構(gòu)的嘌呤和嘧啶含氮堿基在功能上是等價(jià)的；類似的含氮堿基，特別是尿嘧啶和胸腺嘧啶的相互取代，或者例如通過(guò)甲基化作用對(duì)含氮堿基的修飾不會(huì)構(gòu)成物質(zhì)替換。當(dāng)RNA序列反映出多核糖核苷酸中含氮堿基的順序，DNA序列反映出多脫氧核糖核苷酸中含氮堿基的順序，且這兩個(gè)序列滿足此定義的其它需求時(shí)，RNA和DNA多核苷酸具有相同的序列。在至少一個(gè)序列是含有多義殘基的簡(jiǎn)并寡核苷酸時(shí)，如果簡(jiǎn)并寡核苷酸的至少一個(gè)可替換的形式與它所比較的序列相同，則這兩個(gè)序列是相同的，例如，如果AYAAA是ATAAA和ACAAA的混合物，則AYAAA與ATAAA相同。當(dāng)在多核苷酸之間進(jìn)行比較時(shí)，只能理解為容易產(chǎn)生互補(bǔ)鏈，選擇有義或反義鏈，或者預(yù)測(cè)它們能使被比較的多核苷酸之間的相同程度最大化。例如，當(dāng)被比較的多核苷酸中的一個(gè)或兩個(gè)是雙鏈時(shí)，如果第一多核苷酸的一條鏈與第二多核苷酸的一條鏈相同，則序列相同。類似地，當(dāng)多核苷酸探針被描述成與其靶相同時(shí)，應(yīng)理解它是靶的互補(bǔ)鏈，所述互補(bǔ)鏈參與了探針和靶之間的雜交反應(yīng)。如果兩個(gè)序列都能與相同的互補(bǔ)多核苷酸雜交形成雙螺旋，則其中一個(gè)核苷酸的線性序列與另一個(gè)線性序列“基本上相同”，更優(yōu)選能在較嚴(yán)緊的條件下雜交的序列。應(yīng)理解雜交反應(yīng)可容納核苷酸序列中的插入，缺失和取代。因此即使一些核苷酸殘基不能精確地對(duì)應(yīng)或匹配，核苷酸的線性序列也基本上相同，相比之下更優(yōu)選與本發(fā)明公開(kāi)的更加對(duì)應(yīng)或匹配的序列。通常約為25個(gè)殘基的多核苷酸區(qū)域與另一個(gè)區(qū)域基本上相同，條件是序列至少約80％相同；更優(yōu)選序列至少約90％相同；更優(yōu)選序列至少約95％相同；再更優(yōu)選序列為100％相同。在同源部分相互匹配之后，40或更多個(gè)殘基的多核苷酸區(qū)域與另一個(gè)區(qū)域基本上相同，條件是序列至少約75％相同；更優(yōu)選序列至少約80％相同；更優(yōu)選序列至少約85％相同；甚至更優(yōu)選序列至少約90％相同；再更優(yōu)選序列為100％相同。在測(cè)定多核苷酸序列是否基本上相同時(shí)，特別優(yōu)選保留了多核苷酸的功能性并以此進(jìn)行比較的序列。可通過(guò)不同的參數(shù)測(cè)定功能性，例如，如果多核苷酸用于涉及與另一個(gè)多核苷酸雜交的反應(yīng)中，則優(yōu)選的序列為那些在類似條件下與相同靶雜交的序列。通常，對(duì)于200或更多個(gè)殘基的雙螺旋而言，序列的同一性每減少1％，DNA雙螺旋的Tm約降低1℃；或?qū)τ谏儆?0個(gè)殘基的雙螺旋而言約降低5℃，這取決于錯(cuò)配殘基的位置(例見(jiàn)Meinkoth等人)。一般而言，約100個(gè)殘基的基本上相同的序列在低于Tm約20℃時(shí)能與彼此各自互補(bǔ)的序列形成穩(wěn)定的雙螺旋；優(yōu)選它們能在低于Tm約15℃時(shí)形成穩(wěn)定的雙螺旋；更優(yōu)選它們能在低于Tm約10℃時(shí)形成穩(wěn)定的雙螺旋，甚至更優(yōu)選它們能在低于Tm約5℃時(shí)形成穩(wěn)定的雙螺旋；再更優(yōu)選它們能在約Tm時(shí)形成穩(wěn)定的雙螺旋。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果由多核苷酸編碼的多肽是其功能性的重要部分，則優(yōu)選的序列為那些編碼相同或基本上相同的多肽的序列。因此能導(dǎo)致保守的氨基酸取代的核苷酸差異比那些導(dǎo)致非保守取代的核苷酸差異更加優(yōu)選，更優(yōu)選不會(huì)改變氨基酸序列的核苷酸差異，而甚至更優(yōu)選相同的核苷酸。導(dǎo)致多肽插入或缺失的多核苷酸插入或缺失比那些導(dǎo)致下游編碼區(qū)變得不能同時(shí)協(xié)調(diào)的多核苷酸插入或缺失更加優(yōu)選，甚至更優(yōu)選不含插入或缺失的多核苷酸序列。雜交特性和多核苷酸編碼的多肽序列的相對(duì)重要性取決于本發(fā)明的應(yīng)用。多核苷酸具有與另一個(gè)多核苷酸相同的“特性”，條件是這兩個(gè)多核苷酸在類似的最高嚴(yán)緊度的條件下，都能與特殊的第三個(gè)多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋。優(yōu)選除了類似的雜交特性外，多核苷酸也編碼基本上相同的多肽。多核苷酸序列的“保守”殘基是那些不變地出現(xiàn)在被比較的兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)序列的相同位置上的殘基。相對(duì)保守的殘基是那些相對(duì)于在序列別處出現(xiàn)的殘基而言，在更相關(guān)的序列中保守的殘基?！跋嚓P(guān)的”多核苷酸是共用相同殘基的有意義部分的多核苷酸。本文所用的“簡(jiǎn)并”寡核苷酸序列是按下述衍生自至少兩個(gè)相關(guān)的來(lái)源多核苷酸序列的經(jīng)設(shè)計(jì)的序列在來(lái)源序列中保守的殘基被保留在簡(jiǎn)并序列中，而在來(lái)源序列中不保守的殘基可以簡(jiǎn)并序列中的幾個(gè)可替代物提供。例如，可從來(lái)源序列ATACA和ACAGA出發(fā)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并序列AYASA，其中Y是C或T，S是C或G。Y和S是“多義”殘基的例子。簡(jiǎn)并區(qū)段是含有簡(jiǎn)并序列的多核苷酸區(qū)段。應(yīng)理解含有簡(jiǎn)并序列的合成寡核苷酸實(shí)際上是除了在多義位置以外共用相同序列的密切相關(guān)的寡核苷酸混合物。這種寡核苷酸通常被合成為多義位置處的核苷酸的所有可能的組合的混合物，混合物中每種寡核苷酸被稱作“可替換的形式”，混合物中該形式的數(shù)目等于Πi=1nki]]>其中ki是每個(gè)位置處允許的可替換核苷酸的數(shù)目。本文所用的“共有”寡核苷酸序列是按下述衍生自至少兩個(gè)相關(guān)的來(lái)源多核苷酸序列的經(jīng)設(shè)計(jì)序列；在所有來(lái)源序列中保守的殘基被保留在共有序列中；而在殘基不保守的位置處，從來(lái)源序列中選擇了一個(gè)替代物。通常選擇的核苷酸是在來(lái)源序列中以最高頻率出現(xiàn)的核苷酸。例如，可由來(lái)源序列CAAAA，AAGAA和AAAAT出發(fā)設(shè)計(jì)共有序列AAAAA，共有區(qū)段是含有共有序列的多核苷酸區(qū)段。本文所用的多核苷酸“片段”或“插入物”通常表示全長(zhǎng)形式的次分區(qū)域，但也可包括完整的全長(zhǎng)多核苷酸。如果一個(gè)多核苷酸最終衍生自另一個(gè)多核苷酸，那么不同的多核苷酸相互“對(duì)應(yīng)”。例如，信使RNA對(duì)應(yīng)于它所轉(zhuǎn)錄的基因，cDNA對(duì)應(yīng)于通過(guò)例如逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或基于RNA序列知識(shí)的DNA化學(xué)合成而產(chǎn)生它的RNA，cDNA也對(duì)應(yīng)于編碼RNA的基因。如果多核苷酸在被比較的不同種，株或變體中行使類似的功能，如編碼相關(guān)的多肽，則這些多核苷酸也相互“對(duì)應(yīng)”。在多核苷酸操作上下文中所用的“探針”指的是以試劑的形式提供以通過(guò)與靶雜交檢測(cè)受試樣品中潛在存在的靶的寡核苷酸。通常探針會(huì)含有標(biāo)記物或者使標(biāo)記物在雜交反應(yīng)之前或之后能被結(jié)合的物質(zhì)。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物包括但不限于放射性同位素，熒光染料，化學(xué)發(fā)光化合物，染料和包括酶的蛋白質(zhì)?！耙铩笔峭ǔ＞哂杏坞x的3′-OH基團(tuán)的寡核苷酸，它能通過(guò)與靶雜交來(lái)結(jié)合受試樣品中潛在存在的靶，然后促使與靶互補(bǔ)的多核苷酸聚合。產(chǎn)生相同多核苷酸的復(fù)制拷貝的方法，如PCR或基因克隆在本文中被統(tǒng)稱為“擴(kuò)增”或“復(fù)制”。例如，可以復(fù)制單鏈或雙鏈DNA以形成具有相同序列的另一個(gè)DNA。例如可通過(guò)RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，或通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄DNA然后進(jìn)行PCR來(lái)復(fù)制RNA。在后一種情況下，RNA的擴(kuò)增拷貝是具有相同序列的DNA?！熬酆厦告湻磻?yīng)”(“PCR”)是使用一種或多種引物和聚合作用催化劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶，特別是熱穩(wěn)定性的聚合酶由靶多核苷酸制成復(fù)制拷貝的反應(yīng)。通常PCR涉及反復(fù)形成的三個(gè)步驟“退火”，其中溫度被調(diào)節(jié)，以使寡核苷酸引物能與欲被擴(kuò)增的多核苷酸形成雙螺旋；“延伸”，其中溫度被調(diào)節(jié)，以使通過(guò)DNA聚合酶，使用它們已與之形成雙螺旋的多核苷酸為模板，使得已形成雙螺旋的寡核苷酸被延伸；和“解鏈”，其中溫度被調(diào)節(jié)，以使多核苷酸和被延伸的寡核苷酸解離。然后重復(fù)此循環(huán)直至得到所需量的經(jīng)擴(kuò)增的多核苷酸。PCR方法參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,683,195(Mullis)和4,683,202(Mullis等人)?；騼?nèi)的元件包括但不限于啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)子區(qū)域，阻遏物結(jié)合區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始位點(diǎn)，蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，內(nèi)含子和外顯子，和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止位點(diǎn)?！罢{(diào)控元件”或“調(diào)控序列”是涉及對(duì)多核苷酸的功能性調(diào)節(jié)有貢獻(xiàn)的分子相互作用的核苷酸序列，所述作用包括多核苷酸的復(fù)制，重復(fù)，轉(zhuǎn)錄，剪接，翻譯，或降解。調(diào)節(jié)可以影響到進(jìn)程的頻率，速度或特異性，也可以在性質(zhì)上逐漸增強(qiáng)或被抑制。調(diào)控元件是本
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中已知的。例如，“啟動(dòng)子”就是一例調(diào)控元件。啟動(dòng)子是能在某些條件下結(jié)合RNA聚合酶并起動(dòng)位于啟動(dòng)子下游(3′方向)的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。“有效連接”指的是遺傳元件的并列，其中元件的排列關(guān)系應(yīng)能允許它們以預(yù)期的方式起作用。例如，如果啟動(dòng)子幫助起動(dòng)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子與編碼區(qū)域有效地連接，在啟動(dòng)子和編碼區(qū)域之間應(yīng)存在有相關(guān)的殘基，只要這種功能關(guān)系能得以維持。術(shù)語(yǔ)“多肽”，“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，意指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，它可含有經(jīng)修飾的氨基酸，可被無(wú)氨基的酸打斷。此術(shù)語(yǔ)也包含已被修飾的氨基酸聚合物；修飾可包括例如，二硫鍵的形成，糖基化，脂化，乙?；?，磷酸化，或任何其它操作，如與標(biāo)記物成分綴合。在多肽的上下文中，“線性序列”或“序列”是多肽中N末端至C末端方向上的氨基酸順序，其中序列中互相鄰接的殘基在多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)中是鄰接的?！安糠中蛄小笔且阎谝粋€(gè)或兩個(gè)方向上含有額外殘基的多肽的一部分的線性序列。如果氨基酸的線性序列與另一個(gè)序列具有相當(dāng)大程度上的序列同一性，則這兩個(gè)序列“基本上相同”。應(yīng)理解蛋白質(zhì)的折疊和生化功能可容納氨基酸序列中的插入，缺失和取代。因此，即使一些殘基不能精確地對(duì)應(yīng)或匹配，氨基酸的線性序列也基本上相同，更加優(yōu)選與本發(fā)明未公開(kāi)的更緊密對(duì)應(yīng)或匹配的序列。還應(yīng)理解一些氨基酸的取代更容易忍受。例如由具有類似特性的側(cè)鏈的另一個(gè)氨基酸取代具有疏水側(cè)鏈，芳香側(cè)鏈，極性側(cè)鏈，具有正或負(fù)電荷的側(cè)鏈，或含有兩個(gè)或較少碳原子的側(cè)鏈的氨基酸不會(huì)影響兩個(gè)序列基本上相同的特性。測(cè)定同源區(qū)域和評(píng)價(jià)同源性程度的方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的；例見(jiàn)Altschul等人和Henikoff等人。較能忍受的序列差異指的是“保守的取代”，因此具有保守取代的序列比那些在相同位置具有其它取代的序列更加優(yōu)選；更優(yōu)選在相同位置處具有相同殘基的序列。通常約25個(gè)殘基的多肽區(qū)域與另一個(gè)區(qū)域基本上相同的條件是序列至少約80％相同；更優(yōu)選至少約85％相同；更優(yōu)選至少約90％相同；更優(yōu)選至少約95％相同；再更優(yōu)選序列100％相同。同源部分匹配之后40個(gè)或更多個(gè)殘基的多肽區(qū)域與另一區(qū)域基本上相同的條件是序列至少約70％相同；更優(yōu)選它們至少約70％相同，并含有至少另一個(gè)10％的相同或保守取代；更優(yōu)選它們至少約80％相同，并含有至少另一個(gè)10％的相同或保守取代；更優(yōu)選它們至少約90％相同；再更優(yōu)選序列100％相同。在測(cè)定是否多肽序列基本上相同時(shí)，特別優(yōu)選保留了與其進(jìn)行比較的多肽的功能性的序列?？赏ㄟ^(guò)不同的參數(shù)確定功能性，如酶活性，底物酶或受體-配體相互作用中的結(jié)合速率或親和性，與抗體的結(jié)合親和性和X-射線晶體結(jié)構(gòu)。如果多肽與另一個(gè)多肽顯示出相同的生化功能，如酶活性，配體結(jié)合或抗體反應(yīng)性，則這兩個(gè)多肽具有相同的“特性”。與DNA聚合酶或DNA聚合酶片段相關(guān)之多肽的優(yōu)選特性是DNA聚合酶活性，DNA模板結(jié)合和脫氧核糖核苷酸三磷酸的結(jié)合。也優(yōu)選與所比較的多肽顯示出相同生化功能的多肽，另外還優(yōu)選據(jù)信通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)或通過(guò)如X-射線晶體學(xué)這類技術(shù)測(cè)定，與所比較的多肽具有類似三維構(gòu)象的多肽?！吧δ堋被颉吧锘钚浴卑ㄍㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)研究可檢測(cè)到的多肽的任何特征?！案淖兊摹鄙δ苤傅氖峭ㄟ^(guò)例如分子量測(cè)定，圓二色性，抗體結(jié)合，差異光譜學(xué)或核磁共振可以檢測(cè)到的多肽一級(jí)，二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。它也可以指反應(yīng)性的改變，如催化某一反應(yīng)的能力，或結(jié)合輔因子，底物，抑制物，藥物，半抗原或其它多肽的能力。如果某物質(zhì)以這些方式中的任一種改變了多肽的生化功能，就可以說(shuō)此物質(zhì)“干擾”了多肽的生化功能?！叭诤隙嚯摹笔桥c天然出現(xiàn)的多肽相比，含有序列中不同位置處的區(qū)域的多肽。此區(qū)域可以在不同的蛋白質(zhì)中正常地存在，并在融合多肽中被連在一起；或者它們也可以正常地存在于相同的蛋白質(zhì)中，但在融合多肽中以新的安排被放置?？赏ㄟ^(guò)例如化學(xué)合成，或通過(guò)以所需的關(guān)系產(chǎn)生和翻譯編碼肽區(qū)域的多核苷酸來(lái)產(chǎn)生融合多肽?！翱贵w”是能夠通過(guò)位于免疫球蛋白分子可變區(qū)上的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)與靶(如多肽)特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)不僅包含完整的抗體，也包含其片段，其突變體，融合蛋白，人源化抗體，和含有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其它經(jīng)修飾的構(gòu)型?！懊庖咦R(shí)別”或“免疫反應(yīng)性”指的是通過(guò)免疫球蛋白或相關(guān)分子上的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，如B細(xì)胞受體或T細(xì)胞受體與靶特異性地結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗原”指的是抗體通過(guò)其抗原識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合的靶分子。抗原可以但不必需在化學(xué)上與刺激抗體生成的免疫原相關(guān)?？乖梢允嵌鄡r(jià)的或單價(jià)的半抗原?？杀豢贵w識(shí)別的多種抗原的例子包括多肽，多核苷酸，其它抗體分子，寡糖，復(fù)合脂，藥物和化合物。“免疫原”是當(dāng)注射到適當(dāng)宿主，通常為哺乳動(dòng)物體內(nèi)時(shí)能夠刺激抗體生成的抗原。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的各種技術(shù)可使化合物變成免疫原性的化合物，所述技術(shù)包括與載體交聯(lián)或綴合以增加價(jià)位，與促細(xì)胞分裂原混合以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，和與佐劑聯(lián)合以增強(qiáng)呈遞作用。“疫苗”是供人或動(dòng)物使用的藥物制品，施用疫苗的目的是賦予受體抗特殊靶或靶組一定程度的特異性免疫反應(yīng)性。免疫反應(yīng)性可以是對(duì)靶具有免疫反應(yīng)性的抗體或細(xì)胞(尤其是B細(xì)胞，漿細(xì)胞，T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和它們的前體)，或它們的任何組合。可能的靶包括外來(lái)的或病理性的化合物，如外源蛋白質(zhì)，病原性病毒或由癌細(xì)胞表達(dá)的抗原。免疫反應(yīng)性對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，治療特殊疾病，消除特殊物質(zhì)或預(yù)防特殊疾病或物質(zhì)是合乎需要的。“被動(dòng)疫苗”是不需要受體免疫應(yīng)答參與以產(chǎn)生其效果的疫苗。通常它由對(duì)靶反應(yīng)的抗體分子組成?？贵w可得自供體受試者，并被充分純化以施用給受體，或者它們也可在體外產(chǎn)生，例如來(lái)自雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，或者通過(guò)經(jīng)基因工程改造的編碼抗體分子的多核苷酸產(chǎn)生?！爸鲃?dòng)疫苗”是經(jīng)施用意欲在受體體內(nèi)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的疫苗，所述免疫應(yīng)答則具有合乎需要的針對(duì)靶的免疫反應(yīng)性。主動(dòng)疫苗含有適當(dāng)?shù)拿庖咴?。合乎需要的免疫?yīng)答可以是體液的或細(xì)胞的，全身性的或分泌性的，或它們的任何組合?！霸噭倍嗪塑账?，多肽或抗體是為反應(yīng)提供的物質(zhì)，此物質(zhì)具有一些已知的和合乎反應(yīng)需要的參數(shù)。反應(yīng)混合物中也可含有試劑能與之反應(yīng)的“靶”，如多核苷酸，抗體或多肽。例如在一些類型的診斷試驗(yàn)中，通過(guò)加入試劑，使試劑和靶反應(yīng)，并測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物的量可測(cè)定樣品中靶的量。在臨床處理的上下文中，“靶”也可以是被施用物質(zhì)，如藥物化合物之目標(biāo)的細(xì)胞、細(xì)胞集合、組織或器官?！胺蛛x的”多核苷酸，多肽，蛋白質(zhì)，抗體，或其它物質(zhì)指的是該物質(zhì)制品缺乏至少一些該物質(zhì)或類似物質(zhì)天然存在或最初取得時(shí)也可存在的其它成分。因此例如可通過(guò)使用純化技術(shù)從來(lái)源混合物中富集以制備分離的物質(zhì)?？稍诮^對(duì)的基礎(chǔ)(如每體積溶液的重量)之上測(cè)量富集，或者相對(duì)于來(lái)源混合物中存在的潛在干擾的第二物質(zhì)來(lái)測(cè)量富集。本發(fā)明實(shí)施方案中富集的增加更為優(yōu)選。因此，例如優(yōu)選2-倍富集，更優(yōu)選10-倍富集，更優(yōu)選100-倍富集，甚至更優(yōu)選1000-倍富集。通過(guò)人工裝配的方法，如通過(guò)化學(xué)合成或重組表達(dá)也可以分離的狀態(tài)提供物質(zhì)。反應(yīng)中使用的多核苷酸，如雜交反應(yīng)中使用的探針，PCR中使用的引物，或藥物制品中存在的多核苷酸為“特異性的”或“選擇性的”的條件是，相對(duì)于它與可替換的物質(zhì)雜交或反應(yīng)而言，它與想要的靶的雜交或反應(yīng)更加頻繁，更加快速，或者持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。類似地，多肽為“特異性的”或“選擇性的”的條件是相對(duì)于它與可替換的物質(zhì)的結(jié)合而言，它與想要的靶，如配體，半抗原，底物，抗體或其它多肽的結(jié)合更加頻繁，更加快速，或持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)?？贵w為“特異性的”或“選擇性的”的條件是相對(duì)于它與可替換的物質(zhì)的結(jié)合而言，它通過(guò)至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)與想要的靶的結(jié)合更加頻繁，更加快速，或持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。多核苷酸，多肽或抗體被說(shuō)成“選擇性地抑制”或“選擇性地干擾”反應(yīng)的條件是相對(duì)于它抑制或干擾可替換的底物之間的反應(yīng)而言，它抑制或干擾特殊底物之間的反應(yīng)的程度更高或持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)?！昂蜻x藥物”或“候選藥劑”是據(jù)信具有治療潛力的化合物，其效力有待檢測(cè)。候選藥物的“篩選”指的是進(jìn)行能夠評(píng)價(jià)候選藥物的效力和/或特異性的試驗(yàn)。在這一上下文中，“效力”指的是候選藥物以有利的方式影響細(xì)胞或它所施用的生物體的能力例如，限制因侵入病毒導(dǎo)致的病理學(xué)。藥物制品的“效應(yīng)物成分”是當(dāng)施用給提供細(xì)胞的受試者時(shí)，通過(guò)以合乎需要的方式改變靶細(xì)胞的功能以修飾靶細(xì)胞的成分。一些先進(jìn)的藥物制品也具有“靶向成分”，如抗體，它可協(xié)助將效應(yīng)物成分更有效地傳遞到靶位點(diǎn)。依據(jù)所需要的作用，效應(yīng)物成分可具有多種作用模式中的任何一種。例如，它可以恢復(fù)或增強(qiáng)細(xì)胞的正常功能，它可消除或抑制細(xì)胞不正常的功能，或者它可改變細(xì)胞的表型?；蛘咚墒咕哂胁±韺W(xué)特征的細(xì)胞，如被病毒感染的細(xì)胞被殺死或變成休眠狀態(tài)。以后的章節(jié)中會(huì)提供效應(yīng)物成分的例子。“細(xì)胞系”或“細(xì)胞培養(yǎng)物”表示在體外生長(zhǎng)或維持的較高級(jí)的真核生物的細(xì)胞。應(yīng)理解細(xì)胞的后代與母細(xì)胞不完全相同(無(wú)論是形態(tài)學(xué)，基因型還是表型)?！八拗骷?xì)胞”是通過(guò)施用外源多核苷酸已經(jīng)被轉(zhuǎn)化，或者能夠被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。“宿主細(xì)胞”包括原始轉(zhuǎn)化子的后代?！斑z傳改變”指的是不通過(guò)自然的細(xì)胞分裂而使遺傳因子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程。所述遺傳因子對(duì)于細(xì)胞而言可以是異源的，它也可以是細(xì)胞中已存在的遺傳因子的多余的拷貝或改良的形式。通過(guò)例如本領(lǐng)域中已知的任何方法用重組質(zhì)?；蚱渌嗪塑账徂D(zhuǎn)染細(xì)胞，所述方法如電穿孔，磷酸鈣沉淀，與多核苷酸-脂質(zhì)體復(fù)合物接觸，或者通過(guò)用DNA或RNA病毒或病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳改變。這種改變優(yōu)選、但并不必需由經(jīng)改變細(xì)胞的后代遺傳下去?！皞€(gè)體”指的是脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物種的成員，它包括但不限于家養(yǎng)動(dòng)物，野生動(dòng)物和包括人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“靈長(zhǎng)類動(dòng)物”指的是哺乳動(dòng)物中進(jìn)化地位最高的任何成員。它們包括(但不限于)原猴類，如狐猴和懶猴；跗猴類，如跗猴；新世界猴，如松鼠猴(Saimirisciureus)和；舊世界猴，如獼猴(包括豚尾猴，食蟹猴，和日本猴)；長(zhǎng)臂猿類，如長(zhǎng)臂猿和合趾猴；猩猩類，如馬來(lái)猩猩，大猩猩，和黑猩猩；和包括人的人科動(dòng)物。由皰疹病毒感染引起的“病理學(xué)”是損害宿主健康或正常生理學(xué)的一切事情。它可包括(但不限于)病毒破壞性地侵入先前未被感染的細(xì)胞，病毒在損害細(xì)胞正常代謝的情況下復(fù)制，病毒產(chǎn)生毒素或其它非天然的分子，細(xì)胞或細(xì)胞間結(jié)構(gòu)的不規(guī)則生長(zhǎng)(包括纖維變性)，被感染細(xì)胞的不尋常或受抑制的生物活性，惡性轉(zhuǎn)化，干擾鄰近細(xì)胞的正常功能，炎癥或免疫反應(yīng)的加重或抑制，對(duì)其它病原生物體和疾病的易感性增加。對(duì)個(gè)體或細(xì)胞的“治療”是試圖改變個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的任何形式的介入。例如，進(jìn)行對(duì)個(gè)體的治療可以降低或限制由感染個(gè)體的皰疹病毒引起的病理學(xué)。治療包括(但不限于)施用如藥物組合物的組合物，可以在病理事件開(kāi)始或與病原因子接觸之后預(yù)防性地，也可以治療性地進(jìn)行。應(yīng)理解臨床或生物“樣品”包含得自受試者并可用于體外步驟，如診斷試驗(yàn)的各種樣品類型。此定義包含以外科手術(shù)切除的方式得到的固體組織樣品，病理學(xué)樣本，或活體解剖樣本，從中得到的組織培養(yǎng)物或細(xì)胞及其后代，從這些來(lái)源中的任一個(gè)制備的切片或涂片。非限制性的例子是得自被感染的部位，纖維化的部位，未受影響的部位和腫瘤的樣品。此定義也包含血液，脊髓液和生物來(lái)源的其它液體樣品，也可以指其中懸浮的細(xì)胞或細(xì)胞片段，或指液體介質(zhì)及其溶質(zhì)。此定義也包括已經(jīng)被溶解或已經(jīng)富集了某些成分，如DNA，RNA，蛋白質(zhì)或抗體的樣品。本文所述的寡核苷酸引物和探針已經(jīng)按下述被命名名稱的第一部分是它們所根據(jù)的DNA聚合酶保守區(qū)部分的單個(gè)氨基酸密碼子，通常為4個(gè)殘基長(zhǎng)。緊隨其后的是字母A或B，分別表示寡核苷酸與DNA聚合酶編碼區(qū)的有義或反義鏈互補(bǔ)。用于測(cè)序的次級(jí)共有寡核苷酸在名稱末端具有字母SQ。一般技術(shù)除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的操作將使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的分子生物學(xué)，微生物學(xué)，重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的解釋，例見(jiàn)“MolecularCloningAlaboratoryManual”，第二版(Sambrook.Fritsch&amp;Maniatis，1989)，“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait，編，1984)，“AnimalCellCulture”(R.I.Freshney，編，1987)；系列“MethodsinEnzymology”(AcademicPress，Inc.)；“HandbookofExperimentalImmunology”(D.MWeir&amp;C.C.Blackwell，編)，“GeneTransferVectorsforMammalianCells”(J.M.Miller&amp;M.P.Calos，編，1987)，“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(F.M.Ausubel等，編，1987)；和“CurrentProtocolsinImmunology”(J.E.Coligan等，編，1991)。上文和下文提到的所有專利，專利申請(qǐng)，文章和出版物都已列入本文參考文獻(xiàn)。編碼皰疹病毒RFHV/KSHV亞族DNA聚合酶的多核苷酸本發(fā)明包括衍生自皰疹病毒中存在的DNA聚合酶基因和分離的多核苷酸區(qū)段，優(yōu)選編碼能進(jìn)行DNA聚合酶反應(yīng)之多肽片段的多核苷酸區(qū)段。所提供的多核苷酸來(lái)自皰疹病毒RFHV/KSHV亞族。優(yōu)選的多核苷酸是那些編碼RFHV或KSHV之DNA聚合酶片段的多核苷酸。優(yōu)選的片段是按下文實(shí)施例所述已經(jīng)由DNA聚合酶基因擴(kuò)增并分離的那些片段。片段的例子示于圖1，并分別被稱作SEQ.IDNO1和SEQ.IDNO3，特別優(yōu)選的多核苷酸含有RFHV序列殘基27和501之間的序列(SEQ.IDNO1)和KSHV序列殘基27和329之間的序列(SEQ.IDNO3)。RFHV和KSHV的殘基27和501之間的多核苷酸區(qū)段(圖1中下劃線的475個(gè)堿基對(duì)的片段)71％相同，共用殘基在圖1中由“*”表示，此區(qū)段內(nèi)RFHV和KSHV之間共用的連串堿基的最大數(shù)目為17。相對(duì)于它們中的任一個(gè)與以前已經(jīng)測(cè)序的表1中的任何皰疹病毒的相應(yīng)區(qū)段相比，RFHV和KSHV475個(gè)堿基對(duì)的片段相互之間更加一致。下一個(gè)最密切相關(guān)的序列是eHV2病毒的DNA聚合酶，它的此區(qū)域與RFHV或KSHV的相應(yīng)區(qū)域約68％相同。此區(qū)域內(nèi)含有第一個(gè)20個(gè)堿基對(duì)的亞片段(SEQ.IDNO110)和eHV2與RFHV共同享有的第二個(gè)20個(gè)堿基對(duì)的亞片段(SEQ.IDNO111)。RFHV或KSHV與得自能感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物的皰疹病毒，包括sHV1和EBV的其它已知DNA聚合酶序列相比，475個(gè)堿基對(duì)區(qū)域的同一性低于約65％。在RFHV或KSHV與sHV1之間共同享有的最長(zhǎng)亞片段長(zhǎng)約14個(gè)堿基。在RFHV或KSHV與EBV之間共同享用的最長(zhǎng)亞片段長(zhǎng)約15個(gè)堿基。據(jù)此推測(cè)皰疹病毒之間DNA聚合酶編碼區(qū)的多核苷酸序列比與其它多核苷酸之間似乎更保守。因此，除了與eHV2共用的兩個(gè)亞片段外，據(jù)信RFHV或KSHV序列18個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)的任何亞片段對(duì)于RFHV/KSHV亞族而言，或者對(duì)于此亞族內(nèi)特定的皰疹病毒種和變體而言是獨(dú)特的。本發(fā)明包括RFHV/KSHV亞族的DNA聚合酶基因中所含的亞片段，優(yōu)選包括對(duì)應(yīng)于如圖1所示殘基27-501之間的475個(gè)堿基對(duì)片段的區(qū)域中所含的亞片段。優(yōu)選亞片段至少約16個(gè)殘基長(zhǎng)；更優(yōu)選它們至少長(zhǎng)為18個(gè)殘基；更優(yōu)選它們至少長(zhǎng)為20個(gè)核苷酸；更優(yōu)選它們至少長(zhǎng)約為25個(gè)核苷酸；更優(yōu)選它們至少長(zhǎng)約35個(gè)核苷酸；再更優(yōu)選它們至少長(zhǎng)約50個(gè)核苷酸；更加優(yōu)選它們至少長(zhǎng)約75個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選它們?yōu)?00個(gè)核苷酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)。本發(fā)明中還包括含有每種獨(dú)自的皰疹病毒DNA聚合酶的整個(gè)開(kāi)放閱讀框的多核苷酸。為了預(yù)測(cè)被編碼的肽片段在DNA聚合酶的生物功能中所起的作用，可與其它DNA聚合酶進(jìn)行比較。多種皰疹病毒DNA聚合酶的氨基酸序列的保守區(qū)域示于圖2。被標(biāo)記為ExoI，ExoII，和ExoIII的區(qū)域已顯示出為金屬配體在3′-5′外切核酸酶活性位點(diǎn)處的重要結(jié)合位點(diǎn)(Derbyshire等，Bernard等，(1989)，Simon等，Soengas等)。被稱作REGION1的區(qū)域已顯示出對(duì)聚合活性和既作為藥物結(jié)合位點(diǎn)又作為聚合底物(脫氧核糖核苷酸三磷酸)結(jié)合位點(diǎn)之功能的重要性(Dorsky等，(1988，1990)，Bernard等，(1990))。單純皰疹病毒(HSV)1型DNA聚合酶的此區(qū)域中氨基酸G突變成A會(huì)抑制被病毒感染的細(xì)胞中聚合酶的活性。將F突變成C，Y或M會(huì)對(duì)如核苷和焦磷酸鹽類似物，和蚜腸霉素的藥物產(chǎn)生不同的敏感性。HSV1DNA聚合酶的REGION2和REGION3似乎涉及藥物和底物的識(shí)別(Gibbs等，(1988a，1988b)，Basco等，(1993))。REGION3涉及與DNA模板的結(jié)合(Basco等，(1992))。REGION7可能對(duì)聚合活性較重要(Basco等，(1993))。在一些皰疹病毒，如HSV1中，c-末端附近的氨基酸涉及與已知為UL42的調(diào)節(jié)性亞單位結(jié)合，所述亞單位在皰疹病毒基因組的別處編碼，對(duì)于與病毒復(fù)制相關(guān)的DNA聚合酶活性而言是必需的(Dignard等，Stow)。圖1所示的RFHV和KSHV多核苷酸是編碼DNA聚合酶重要功能部分的多核苷酸的鄰近區(qū)域。具體地說(shuō)，寡核苷酸DFASA，VYGA和GDTD1B分別對(duì)應(yīng)于REGION2，REGION3和REGION1。得自KSHVDFASA和GDTD1B之間的片段包含完整的REGION4和REGION3序列，并與REGION2和REGION1序列重疊。相對(duì)于RFHV或KSHV與表1所列的任何其它病毒的比較而言，組成RFHV/KSHV亞族的成員所具有的序列與RFHV或KSHV的相應(yīng)序列更加一致。根據(jù)圖1相應(yīng)區(qū)域中DNA聚合酶基因的序列可鑒定出此家族中優(yōu)選的成員。表2提供了此區(qū)域內(nèi)序列同一性的程度</tables>通過(guò)首先排列被編碼的氨基酸序列，進(jìn)行編碼多核苷酸的相應(yīng)對(duì)比，然后計(jì)算所比較的序列之間每個(gè)排列位置處共用的殘基數(shù)目即可計(jì)算出序列同一性的百分比。插入或缺失的存在不會(huì)產(chǎn)生不利的后果，但是只有在被排列的序列之一中需要容納數(shù)目明顯增加的氨基酸殘基的地方才允許插入或缺失。無(wú)論在多肽水平上還是在多核苷酸水平上都不允許僅為了改善序列排列的補(bǔ)償性插入。因此，多核苷酸序列中的任何插入的長(zhǎng)度均為3的倍數(shù)。給出了受試序列中與比較或參照序列中的殘基相同的殘基的百分比。已經(jīng)計(jì)算出表2病毒之間如圖1所示編號(hào)的RFHV和KSHV序列之區(qū)段的同一性水平。本發(fā)明優(yōu)選的編碼DNA聚合酶的多核苷酸序列是那些衍生自RFHV/KSHV皰疹病毒亞族的序列。它們包括那些與圖1所示的RFHV或KSHV序列的堿基27和501之間至少69％相同的序列；更優(yōu)選序列至少70％相同；更優(yōu)選序列至少約72％相同；更優(yōu)選序列至少約75％相同；更優(yōu)選序列至少約80％相同；更優(yōu)選序列至少約85％相同；更優(yōu)選序列至少約90％相同；甚至更優(yōu)選序列95％以上相同。也優(yōu)選與RFHV序列的堿基27和329之間至少69％相同的序列；更優(yōu)選它們70％相同；更優(yōu)選它們至少72％相同；更優(yōu)選它們至少75％相同；更優(yōu)選它們至少80％相同；更優(yōu)選序列至少90％相同；甚至更優(yōu)選序列至少95％相同。也優(yōu)選與KSHV序列的堿基27和329之間至少72％相同的序列；更優(yōu)選它們至少75％相同；更優(yōu)選它們至少80％相同；更優(yōu)選它們至少90％相同；甚至更優(yōu)選它們95％相同或更高程度地相同。下一章節(jié)將更詳細(xì)地描述，通過(guò)與RFHV/KSHV亞族特異性的寡核苷酸相比之下的同一性百分比可鑒定出其它優(yōu)選的編碼DNA聚合酶的多核苷酸序列。RFHV和KSHVDNA聚合酶與寡核苷酸實(shí)例之間的同一性百分比示于表3</tables>對(duì)于如圖6所示排列的病毒序列的相應(yīng)殘基，計(jì)算出如表3所示的同一性百分比。優(yōu)選的DNA聚合酶序列是那些所覆蓋的相應(yīng)區(qū)域與LSGGA至少約80％相同的序列；更優(yōu)選它們至少約83％相同；更優(yōu)選它們至少約86％相同；更優(yōu)選它們至少約90％相同；甚至更優(yōu)選它們至少95％相同。其它優(yōu)選的DNA聚合酶序列是那些所覆蓋的相應(yīng)區(qū)域與CTDPA至少約69％相同的序列；更優(yōu)選它們至少約72％相同；更優(yōu)選它們至少約75％相同；更優(yōu)選它們至少約80％相同；更優(yōu)選它們至少約85％相同；甚至更優(yōu)選它們至少約95％相同。其它優(yōu)選的DNA聚合酶序列是那些所覆蓋的相應(yīng)區(qū)域與PCLNA至少約95％相同的序列。其它優(yōu)選的DNA聚合酶序列是那些所覆蓋的相應(yīng)區(qū)域與KMLEA至少約80％相同的序列；更優(yōu)選它們至少約83％相同；更優(yōu)選它們至少約86％相同；更優(yōu)選它們至少約90％相同；甚至更優(yōu)選它們至少95％或95％以上相同。其它優(yōu)選的DNA聚合酶序列是那些所覆蓋的相應(yīng)區(qū)域與GISPA至少約69％相同的序列；更優(yōu)選它們至少約72％相同；更優(yōu)選它們至少約75％相同；更優(yōu)選它們至少約80％相同；更優(yōu)選它們至少約85％相同，甚至更優(yōu)選它們至少約95％相同。通過(guò)使用RFHV或KSHV序列，或者亞族特異性寡核苷酸的前述序列比較中的任一種鑒定出的RFHV/KSHV亞族成員的DNA聚合酶編碼序列同樣是優(yōu)選的。特別優(yōu)選RFHV和KSHV的DNA聚合酶編碼序列。本發(fā)明中還包括亞族的DNA聚合酶編碼序列的片段，和含有這種多核苷酸片段的較長(zhǎng)的多核苷酸。本章節(jié)描述的多核苷酸序列提供了得到以后章節(jié)中概述的合成的寡核苷酸，蛋白質(zhì)和抗體的基礎(chǔ)。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的一般性技術(shù)可制備這些化合物，如下文所述，所述化合物可用于各種研究，診斷和治療目的。多核苷酸的制備可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浔景l(fā)明的多核苷酸和寡核苷酸。例如，如下文實(shí)施例3和實(shí)施例5所述，在PCR擴(kuò)增得自被皰疹病毒感染之組織的DNA時(shí)，可以使用寡核苷酸引物?；蛘呷缦挛膶?shí)施例10所述，可以使用寡核苷酸鑒定DNA文庫(kù)中適當(dāng)?shù)募?xì)菌克隆。也可以通過(guò)化學(xué)合成由本文提供的序列出發(fā)直接制備多核苷酸。本領(lǐng)域中已知幾種合成方法，包括三酯法和亞磷酸酯法。在優(yōu)選的方法中，通過(guò)使用單核苷氨基亞磷酸酯偶聯(lián)單位的固相合成法制備多核苷酸，例見(jiàn)Horise等，Beaucage等，Kumar等，和U.S.專利號(hào)4,415,732。典型的固相合成包括重復(fù)進(jìn)行的四個(gè)步驟脫保護(hù)，偶聯(lián)，加帽和氧化。這可以導(dǎo)致在3′至5′方向上逐步合成寡核苷酸。在第一步中，其3′末端通過(guò)(-O-)基團(tuán)與固相支持物結(jié)合的逐漸增長(zhǎng)的寡核苷酸在其5′末端脫保護(hù)。例如，通過(guò)-ODMT基團(tuán)可以保護(hù)5′末端，所述-ODMT基團(tuán)是通過(guò)與吡啶中的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)反應(yīng)而形成的。此基團(tuán)在堿性條件下是穩(wěn)定的，但是在酸性條件下容易被除去，例如在二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)的存在下易被除去。脫保護(hù)提供了5′-OH反應(yīng)基團(tuán)。在第二步中，寡核苷酸與所需的核苷酸單體反應(yīng)，所述單體自身已先轉(zhuǎn)變成5′-保護(hù)的3′-氨基亞磷酸酯。單體的5′-OH可以例如-ODMT基團(tuán)的形式被保護(hù)，3′-OH基團(tuán)可以轉(zhuǎn)變成氨基亞磷酸酯，例如-OP(OR′)NR2；其中R是異丙基-CH(CH3)2；R′是例如-H(產(chǎn)生氨基亞磷酸酯二酯)，或-CH3，-CH2CH3，或β-氰乙基-CH2CH2CN(產(chǎn)生氨基亞磷酸酯三酯)。單體的3′-氨基亞磷酸酯基團(tuán)與逐漸增長(zhǎng)的寡核苷酸的5′-OH基團(tuán)反應(yīng)可產(chǎn)生亞磷酸酯連鍵5′-OP(OR′)O-3′。在第三步中，未與單體偶聯(lián)的寡核苷酸退出進(jìn)一步合成以防止不完全聚合物的形成。通過(guò)與乙酸酐(CH3C(O)-O-C(O)CH3)反應(yīng)，以乙酸酯(-OC(O)CH3)的形式給保持原狀的5′-OH基團(tuán)加帽可以做到這一點(diǎn)。在第四步中，新形成的亞磷酸酯基團(tuán)(即5′-OP(OR′)O-3′)被氧化成磷酸酯基團(tuán)(即5′-OP(＝O)(OR′)O-3′)；例如可通過(guò)與含水的碘和吡啶反應(yīng)做到這一點(diǎn)。由于在所述方法最后得到的寡核苷酸的5′端得到保護(hù)，并可用于第一步中，因此可重復(fù)進(jìn)行四步法。當(dāng)已得到合乎要求的全長(zhǎng)寡核苷酸時(shí)，可通過(guò)例如堿和熱處理從固相支持物上將它裂解下來(lái)。此步驟也可用于將磷酸三酯(即當(dāng)R′不是-H時(shí))轉(zhuǎn)變成磷酸二酯(-OP(＝O)2O-)，并使核苷酸堿基的堿基-不穩(wěn)定地被保護(hù)的氨基基團(tuán)脫保護(hù)?？梢酝ㄟ^(guò)任何一般性技術(shù)，如PCR擴(kuò)增或基因克隆來(lái)復(fù)制通過(guò)這些方法中的任一種而制備的多核苷酸，以提供較豐富的多核苷酸來(lái)源。含有編碼DNA聚合酶之多核苷酸的克隆和表達(dá)載體本發(fā)明中提供的克隆載體和表達(dá)載體含有編碼皰疹病毒DNA聚合酶的序列或其變異體或其片段?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建適當(dāng)?shù)目寺≥d體，或者也可從本領(lǐng)域中適用的大量克隆載體中選擇。盡管根據(jù)欲被使用的宿主細(xì)胞而選擇的克隆載體會(huì)有所不同，但有用的克隆載體一般應(yīng)具有自我復(fù)制的能力，對(duì)于特定的限制性核酸內(nèi)切酶具有單個(gè)作用位點(diǎn)，并攜有能用于選擇被轉(zhuǎn)染之克隆的標(biāo)記物的基因。適當(dāng)?shù)睦影ㄙ|(zhì)粒和細(xì)菌的病毒；如pUC18，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4，噬菌體DNA和如pSA3和pAT28的穿梭載體。表達(dá)載體通常為與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件有效連接的編碼多肽的可復(fù)制多核苷酸構(gòu)建體。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的例子是啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。翻譯調(diào)控元件的例子是核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始位點(diǎn)和終止密碼子。也可包括蛋白質(zhì)加工元件例如編碼前導(dǎo)或信號(hào)肽以及將多肽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或從細(xì)胞中分泌出來(lái)所需的蛋白酶裂解位點(diǎn)的區(qū)域。所用元件在用于表達(dá)的宿主細(xì)胞中可能是功能性的。調(diào)控元件可以得自與載體中所用的相同的DNA聚合酶基因，或者它們也可以是異源的(即衍生自其它基因和/或其它生物體)。可以通過(guò)本領(lǐng)域中任何已知方法將多核苷酸插入宿主細(xì)胞。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括如大腸桿菌，分枝桿菌的細(xì)菌細(xì)胞，其它原核微生物和真核細(xì)胞(包括真菌細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞)。通過(guò)直接攝入，胞吞作用，轉(zhuǎn)染，f-交配或電穿孔插入外源多核苷酸可以轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨后，外源多核苷酸在細(xì)胞內(nèi)以未-整合的載體，如質(zhì)粒的形式被維持，或者也可以被整合到宿主細(xì)胞基因組中?？寺≥d體可被用于得到它們所含的多核苷酸的復(fù)制拷貝，或者作為將多核苷酸貯存到倉(cāng)庫(kù)中以供將來(lái)回收的工具。表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可被用于得到由它們所含的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的多肽。它們也可以用于如藥物篩選試驗(yàn)的試驗(yàn)中，其中具有能合成多肽的完整細(xì)胞才合乎需要。皰疹病毒DNA聚合酶的用作雜交探針和擴(kuò)增引物的合成寡核苷酸本發(fā)明中包括的由皰疹病毒DNA聚合酶序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸可被用作鑒定相關(guān)序列的探針，或者在如PCR的擴(kuò)增反應(yīng)中用作引物。含R1基的母體脂肪酸的碘值優(yōu)選約20至約140，更優(yōu)選約50至約130，最優(yōu)選約70至約115；其中反離子X(jué)-可以是任何與軟化劑相配伍的陰離子，優(yōu)選為氯根，溴根，甲硫酸根，乙硫酸根，硫酸根，和/或硝酸根，優(yōu)選氯根。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的織物軟化活性物可以具有下列通式式中每個(gè)Y，R，R1和X(-)具有上述的意義。該化合物包括具有下列通式的化合物[CH3]3N(+)[CH2CH(CH2O(O)CR1)O(O)CR1]Cl(-)這里-O(O)CR1部分來(lái)自不飽和脂肪酸例如油酸，而且優(yōu)選每個(gè)R是甲基或乙基，優(yōu)選每個(gè)R1均在C15至C19范圍內(nèi)，而在烷基鏈中具有一定的支化度和取代度。也可以制備通式(1)和(2)的混合物。上述的反離子X(jué)(-)可以是任何可以與此軟化劑相配伍的陰離子，優(yōu)選為強(qiáng)酸的陰離子例如氯根，溴根，甲硫酸根，乙硫酸根，硫酸根，硝酸根等等，更優(yōu)選的是氯根。此陰離子也可以(但不優(yōu)選)是帶兩個(gè)電荷的，在這種情況下X(-)代表基團(tuán)的一半。此織物軟化劑活性物可以包括化合物的混合物，這些化合物分別含有支化化合物和不飽和化合物。優(yōu)選可生物降解季銨鹽織物軟化化合物用于制造這類混合物，它們可以含有-O-(O)CR1基團(tuán)，而此基團(tuán)得自不飽和和多不飽和的脂肪酸，例如油酸，和/或部分氫化的脂肪酸，后者又得<p>所示方向與多核苷酸的編碼區(qū)相關(guān)。5′→3′方向的寡聚體與編碼鏈的反義鏈雜交并以編碼序列的方向起動(dòng)擴(kuò)增。3′→5′方向的寡聚體與編碼鏈雜交并以與編碼序列相反的方向起動(dòng)擴(kuò)增。這些寡核苷酸已被設(shè)計(jì)成具有幾個(gè)希望有的特性1)即使當(dāng)來(lái)源材料中存在的靶DNA拷貝數(shù)很低時(shí)，對(duì)靶DNA仍有特異性；2)有足夠的特異性以避免與不需要的序列，如宿主中存在的內(nèi)源DNA聚合酶序列雜交；3)有足夠的交叉反應(yīng)性以使未知靶和用于設(shè)計(jì)它的序列之間的差異不會(huì)阻止寡核苷酸與靶形成穩(wěn)定的雙螺旋。對(duì)于一些應(yīng)用而言，特別有效的設(shè)計(jì)是在3′末端具有簡(jiǎn)并區(qū)段的寡核苷酸，所述寡核苷酸是從至少2個(gè)據(jù)信在某種程度上與多核苷酸靶有保守部分的已知多核苷酸的區(qū)域設(shè)計(jì)成的。多義殘基的各種變換有助于確保寡核苷酸的至少一個(gè)可替換的形式能與靶雜交。在寡核苷酸的5′末端與簡(jiǎn)并區(qū)段鄰接的是加強(qiáng)任何可能形成的雙螺旋或允許在較高溫度下進(jìn)行雜交或擴(kuò)增反應(yīng)的共有區(qū)段。簡(jiǎn)并區(qū)段位于分子的3′末端以增加寡核苷酸和靶之間在聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程中延伸開(kāi)始的位點(diǎn)處緊密匹配的可能性。根據(jù)下列密碼子表示序列簡(jiǎn)并部分中的多義殘基表4所示的Type1寡核苷酸通常用于與編碼DNA聚合酶的多核苷酸區(qū)段雜交?？梢赃M(jìn)行這種雜交以檢測(cè)多核苷酸的存在，或者引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)以使多核苷酸可以被進(jìn)一步鑒定。適當(dāng)?shù)陌邪ň幋a廣譜皰疹病毒DNA聚合酶區(qū)域的多核苷酸，所述病毒包括那些α，β和γ皰疹病毒中的成員，那些感染任何脊椎動(dòng)物，包括人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的病毒，不論聚合酶或病毒是否已知或已經(jīng)被描述。非限制性的例子包括編碼表1所列任何皰疹病毒的DNA聚合酶的多核苷酸。我們已經(jīng)使用這些寡核苷酸得到了一組包括α，β和γ亞族的代表RFHV，KSHV，EBV，HSV1，HHV6和HHV7之DNA聚合酶的區(qū)段。寡核苷酸可以特別地用于引發(fā)從寡核苷酸雜交的位點(diǎn)起向3′方向擴(kuò)增靶多核苷酸區(qū)域的反應(yīng)。DFASA，DFQSA，VYGA，VYGCA和GDTD1B是在鄰近簡(jiǎn)并區(qū)段處具有共有區(qū)段的寡核苷酸，可以用于那種目的，并且當(dāng)靶DNA序列未知時(shí)也可以使用。寡核苷酸DFASA和DFQSA之間的取舍取決于靶多核苷酸的序列。DFQSA在促進(jìn)HHV6-樣序列的擴(kuò)增方面某種程度上優(yōu)于其它序列；DFASA既可以促進(jìn)HHV6樣序列的擴(kuò)增，也可以促進(jìn)非-HHV6-樣序列的擴(kuò)增。VYGA具有寬的交叉反應(yīng)性，作為使用通過(guò)另一引物，如DFASA首次擴(kuò)增的多核苷酸進(jìn)行的第二次擴(kuò)增反應(yīng)的引物特別有用。VYGCA是VYGA富含GC的類似物，它產(chǎn)生較少的多重?cái)U(kuò)增混合物，并允許在較高溫度下進(jìn)行雜交反應(yīng)。VYGSQA和GDTDSQB是特異性的非簡(jiǎn)并寡核苷酸，它們可特別地用于測(cè)序分別由VYGA或GDTD1B制得的擴(kuò)增產(chǎn)物；或者用于在用簡(jiǎn)并引物初步擴(kuò)增之后更特異性地?cái)U(kuò)增靶多核苷酸。用作表4寡核苷酸的靶的優(yōu)選DNA來(lái)源是任何生物樣品(包括固形組織和組織培養(yǎng)物)，特別是已知或懷疑攜帶皰疹病毒的脊椎動(dòng)物來(lái)源的樣品。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法，包括用有機(jī)溶劑提取或在高鹽濃度下沉淀可從樣品來(lái)源中提取DNA。優(yōu)選的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)一般可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,683,195(Mullis)和4,683,202(Mullis等人)；對(duì)于病毒多核苷酸的應(yīng)用參見(jiàn)美國(guó)專利5,176,995(Sninsky等人)。通過(guò)將欲被擴(kuò)增的靶多核苷酸與能同靶雜交的短寡核苷酸結(jié)合，并用作聚合反應(yīng)的引物即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。還需加入底物單核苷酸和熱穩(wěn)定性的依賴于DNA的DNA聚合酶，如Taq。用于擴(kuò)增反應(yīng)的條件一般為本領(lǐng)域中已知的條件，使用已知病毒源，如RFHV，KSHV，EBV或HSV1憑經(jīng)驗(yàn)可使條件最優(yōu)化。條件也可以改變，例如可改變擴(kuò)增循環(huán)，尤其是雜交時(shí)相的時(shí)間和溫度；改變寡核苷酸引物的重量摩爾濃度；改變緩沖液濃度；改變擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目。細(xì)微調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)技術(shù)。在一個(gè)方法中，擴(kuò)增中使用了本發(fā)明的單個(gè)引物，可選擇使用第二個(gè)引物，如隨機(jī)引物以起動(dòng)相反方向上的第一引物下游的復(fù)制。在優(yōu)選的方法中，相同反應(yīng)中至少使用了兩個(gè)本發(fā)明的引物以起動(dòng)相反方向上的復(fù)制。至少兩個(gè)特異性引物的使用增強(qiáng)了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，并限定了樣品之間比較片段的大小。例如，使用引物DFASA和GDTD1B可以進(jìn)行擴(kuò)增。更優(yōu)選以嵌套方式使用所有三個(gè)引物以增強(qiáng)擴(kuò)增。通過(guò)使用包含中間體片段的引物進(jìn)行首次擴(kuò)增可實(shí)現(xiàn)嵌套，所述片段含有第三引物的結(jié)合位點(diǎn)。接著使用第三引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，從而提供最終的片段，此片段是中間體片段的亞片段。特別優(yōu)選使用引物DFASA和引物GDTD1B首次擴(kuò)增，再使用引物VYGA和引物GDTD1B第二次擴(kuò)增。當(dāng)對(duì)RFHV或KSHVDNA聚合酶基因的多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，片段的大小約為236個(gè)堿基。在擴(kuò)增反應(yīng)的任何階段，通過(guò)例如大小測(cè)定即可鑒定出經(jīng)擴(kuò)增的多核苷酸。優(yōu)選通過(guò)在約1-2％的瓊脂糖凝膠上電泳多核苷酸來(lái)進(jìn)行鑒定。如果凝膠中的多核苷酸以充足的量存在，即可用溴化乙錠染色并在紫外燈下檢測(cè)?；蛘咭部梢栽谏蠘拥郊s6％的聚丙烯酰胺凝膠之前，用如32P或35S的放射性同位素標(biāo)記多核苷酸，隨后可利用凝膠產(chǎn)生放射自顯影圖。優(yōu)選的標(biāo)記經(jīng)擴(kuò)增之多核苷酸的方法是使用多核苷酸激酶和γ-[32P]-ATP，連續(xù)擴(kuò)增約5-15個(gè)循環(huán)以用32P末端標(biāo)記如VYGA或VYGSQA的寡核苷酸引物。如果需要，在制備經(jīng)擴(kuò)增的多核苷酸時(shí)也可將大小分離用作一個(gè)步驟。當(dāng)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增混合物含有不同大小的假象多核苷酸，如可能是由于與不需要的靶的交叉反應(yīng)性而引起這一現(xiàn)象時(shí)，所述方法特別有用。如上一段落中描述的凝膠被放在其背后的紙上晾干并用于產(chǎn)生放射自顯影圖。切下凝膠中對(duì)應(yīng)于放射自顯影圖上所需帶的位置，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取。提取出的多核苷酸能被直接鑒定，克隆或用于下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。通過(guò)采用更特異的寡核苷酸引物也可以降低擴(kuò)增反應(yīng)混合物中不需要的多核苷酸的比例。例如，使用1/5至1/25正常量的引物VYGA和GDTD1B進(jìn)行最初的3-5個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，然后加入摩爾過(guò)量(例如50pmol)的GDTDSQB和/或VYGSQA，再繼續(xù)擴(kuò)增30-35個(gè)循環(huán)。這可以降低擴(kuò)增混合物中存在的寡核苷酸的復(fù)雜度，并使反應(yīng)溫度增高以減少不需要的多核苷酸的擴(kuò)增。優(yōu)選的Type2寡核苷酸的例子列于表6LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA是在5′末端具有共有區(qū)段的所有寡核苷酸，所述區(qū)段與3′末端的簡(jiǎn)并區(qū)段直接相連。所述寡核苷酸能與編碼RFHV，KSHV或RFHV/KSHV亞族中其它病毒之DNA聚合酶的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋。它們可被用于需要這種特異性的任何目的，如檢測(cè)或擴(kuò)增RFHV/KSHV亞族的多核苷酸。在一個(gè)應(yīng)用中，可單個(gè)使用或者組合使用這些Type2寡核苷酸作為擴(kuò)增引物。在此應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)得自組織樣品中的DNA直接使用寡核苷酸以得到衍生自RFHV，KSHV或密切相關(guān)之病毒，而不是如EBV，CMV或HSV的更不相關(guān)之病毒的DNA聚合酶區(qū)段。在另一個(gè)實(shí)施例中，用特異性較差的一套探針，如DFASA或VYGA聯(lián)合GDTD1B首次擴(kuò)增組織樣品中的DNA，然后在第二輪擴(kuò)增中使用表6寡核苷酸中的一個(gè)，從而提供RFHV，KSHV和RFHV/KSHV亞族的其它成員特異的敏感的嵌套擴(kuò)增試驗(yàn)。在另一個(gè)應(yīng)用中，Type2寡核苷酸，或含有這些序列的寡核苷酸或其片段被用作檢測(cè)試驗(yàn)中的探針。例如，它們可被提供成具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物，如32P，然后用于具有適當(dāng)靶，如使用DFASA和/或VYGA與GDTD1B一起擴(kuò)增的DNA的雜交試驗(yàn)中。優(yōu)選的Type3寡核苷酸的例子示于表7</tables>這些是非簡(jiǎn)并的寡核苷酸，它們被設(shè)計(jì)成特異性針對(duì)編碼特殊皰疹病毒，即RFHV或KSHV之DNA聚合酶的多核苷酸。選定的特殊序列來(lái)自編碼區(qū)域的區(qū)段，與相鄰區(qū)段相比，它與其它病毒的編碼區(qū)域的區(qū)段更不相同。VASGA，ILPCA，PIEAB和PEARB是RFHVDNA聚合酶的特異性非簡(jiǎn)并寡核苷酸，可被用于在高嚴(yán)緊條件下進(jìn)行的雜交反應(yīng)。例如，它們可以單獨(dú)或聯(lián)合用作引物以擴(kuò)增編碼RFHVDNA聚合酶的靶多核苷酸。優(yōu)選使用嵌套形式的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增例如使用VASGA和PEARB作為引物進(jìn)行首次擴(kuò)增；然后使用ILPCA和PIEAB作為引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。類似地，SGILA，CLNIA，IEASB和EARFB是KSHVDNA聚合酶的特異性非簡(jiǎn)并寡核苷酸，可以類似的方式被使用，包括作為擴(kuò)增反應(yīng)的引物。優(yōu)選使用嵌套形式的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增例如使用SGILA和EARFB作為引物進(jìn)行首次擴(kuò)增；然后使用CLNIA和IEASB作為引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。這可以提供特異針對(duì)KSHVDNA聚合酶的極度敏感的擴(kuò)增試驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)很快認(rèn)識(shí)到Type1，2和3寡核苷酸(尤其是那些表4，6和7中所示的)可以互相聯(lián)合用于PCR以擴(kuò)增編碼DNA聚合酶之多核苷酸的不同部分。擴(kuò)增反應(yīng)的特異性一般由具有最少量交叉反應(yīng)性的引物決定。擴(kuò)增片段的大小和位置由擴(kuò)增的最后一次循環(huán)所用的引物決定。例如，LSSGA與GDTD1B聯(lián)合使用會(huì)擴(kuò)增約361個(gè)堿基的編碼RFHV/KSHV亞族病毒DNA聚合酶的多核苷酸。類似地，VYGA與PEARB聯(lián)合使用會(huì)擴(kuò)增約444個(gè)堿基的編碼RFHVDNA聚合酶的多核苷酸。寡核苷酸的適當(dāng)聯(lián)合可被用作嵌套形式的擴(kuò)增引物。使用合成的寡核苷酸鑒定多核苷酸靶如前面章節(jié)所述，本發(fā)明中包含的寡核苷酸可被用作引物以擴(kuò)增編碼皰疹病毒DNA聚合酶的多核苷酸，尤其在聚合酶鏈反應(yīng)中更是如此。進(jìn)行PCR的條件取決于所使用寡核苷酸的特性。具體地說(shuō)，當(dāng)所用寡核苷酸含有的簡(jiǎn)并區(qū)段或共有區(qū)段與靶的相應(yīng)區(qū)段只部分相同時(shí)，和當(dāng)靶多核苷酸含有未知序列時(shí)，條件的選擇對(duì)于擴(kuò)增的成功會(huì)很重要。對(duì)于新引物或新多核苷酸靶的條件的最優(yōu)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)。下文是有助于此目的的指導(dǎo)性方案。首先，使PCR退火步驟的溫度最優(yōu)化以增加被擴(kuò)增的靶多核苷酸的量，使之大于被擴(kuò)增的不相關(guān)多核苷酸的量。理想狀態(tài)下，所述溫度允許引物與靶序列雜交，而不與其它序列雜交。對(duì)于含有共有區(qū)段的引物而言，退火步驟的溫度一般至少約為55℃；優(yōu)選至少約60℃。病毒特異性的引物更有選擇性，在較寬的溫度范圍，50℃至65℃之間都是有效的。第二，使緩沖液條件最優(yōu)化。我們已發(fā)現(xiàn)由Taq聚合酶的商購(gòu)制品提供的緩沖液有時(shí)難以使用，這部分是由于對(duì)鎂離子濃度的嚴(yán)格的依賴性。使用如M.Wigler(Lisitsynetal)推薦的緩沖液一般更容易進(jìn)行使用本發(fā)明的寡核苷酸進(jìn)行的PCR。優(yōu)選最終的PCR反應(yīng)混合物含有(NH4)2SO4代替KCl成為主要的離子源。優(yōu)選最終反應(yīng)混合物中(NH4)2SO4的濃度約為5-50mM，更優(yōu)選約10-30mM，甚至更優(yōu)選16mM。緩沖成分優(yōu)選為Tris，優(yōu)選其終濃度約67mM，pH約8.8。在這些條件下，MgCl2濃度不必嚴(yán)格限制。優(yōu)選其終濃度約1-10mM，更優(yōu)選約3-6mM，最佳約為4mM。反應(yīng)混合物也含有約10mMβ-疏基乙醇和0.05-1mg/ml牛血清白蛋白。特別優(yōu)選的緩沖液是WB4緩沖液(67mMTris緩沖液，pH8.8，4mMMgCl2，16mM(NH4)2SO4，10mMβ-疏基乙醇和0.1mg/ml白蛋白)。下文實(shí)施例3中提供了進(jìn)行此反應(yīng)的優(yōu)選條件。使用本發(fā)明的任何寡核苷酸作為引物的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生了編碼DNA聚合酶部分的多核苷酸片段。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量技術(shù)可以鑒定這些片段。一些鑒定片段的非限制性方法如下所述在一個(gè)方法中，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何序列測(cè)定法測(cè)定片段的序列，所述方法包括Maxam&amp;Gilbert法，或者Sanger&amp;Nicholson法。或者也可以將片段提交給任何提供多核苷酸測(cè)序服務(wù)的商業(yè)機(jī)構(gòu)。在測(cè)序前可任選將片段克隆和/或擴(kuò)增。核苷酸序列可被用于預(yù)測(cè)由此片段編碼的氨基酸序列。可使用序列資料或者在多核苷酸水平上或者在氨基酸水平上與其它被測(cè)序的DNA聚合酶比較，以鑒定原始來(lái)源材料中存在的皰疹病毒種類。在制作模型的算法規(guī)則中也可使用序列資料預(yù)測(cè)抗原區(qū)或三維結(jié)構(gòu)。在第二個(gè)鑒定方法中，可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定片段的大小，所述方法如在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上電泳，或通過(guò)適當(dāng)?shù)拿芏忍荻入x心。例如，對(duì)于RFHV和KSHV而言，VYGA和GDTD1B之間的片段約為172個(gè)堿基。因此包括引物結(jié)合區(qū)域的整個(gè)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度約為236個(gè)堿基。相應(yīng)的EBV片段含有額外的9個(gè)堿基對(duì)。因此，例如通過(guò)將由每個(gè)片段擴(kuò)增的多核苷酸片段置于分離凝膠的相鄰泳道上電泳，或者通過(guò)將EBV片段置于適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)準(zhǔn)旁邊電泳即可將EBV片段與RFHV或KSHV的片段區(qū)分開(kāi)來(lái)。在大小上與RFHV和KSHV相同的多核苷酸片段可衍生自這些病毒之一的變異株，或密切相關(guān)的種。大小基本上不同的片段更可能衍生自不同的皰疹病毒。在第三個(gè)鑒定方法中，通過(guò)嘗試將片段與寡核苷酸探針雜交來(lái)檢測(cè)片段。在優(yōu)選的實(shí)施例中，檢測(cè)了片段與RFHV或KSHV的DNA聚合酶編碼區(qū)的相關(guān)性。可使用含有DNA聚合酶編碼區(qū)序列或其遺傳互補(bǔ)物的探針進(jìn)行試驗(yàn)。適當(dāng)?shù)奶结樖呛蠷FHV或KSHV的序列的多核苷酸，這種多核苷酸的混合物，或含有衍生自RFHV和KSHV的簡(jiǎn)并序列，如表6所列寡核苷酸的多核苷酸。探針的長(zhǎng)度和特性以及雜交條件的選擇取決于試驗(yàn)的目的。如果目的是僅僅檢測(cè)得自RFHV或KSHV的多核苷酸，包括次要變體，那么在高嚴(yán)緊性的條件下進(jìn)行雜交。使用了來(lái)自各個(gè)RFHV或KSHVDNA聚合酶的序列。較長(zhǎng)的序列改善了試驗(yàn)的特異性，可以在較高嚴(yán)緊性的條件下使用。優(yōu)選探針含有至少約30個(gè)核苷酸的DNA聚合酶序列；更優(yōu)選此序列至少約50個(gè)核苷酸；甚至更優(yōu)選此序列至少約75個(gè)核苷酸長(zhǎng)。如果目的是檢測(cè)與RFHV或KSHV相關(guān)的多核苷酸，如在篩選試驗(yàn)或征集先前未曾描述過(guò)的RFHV/KSHV亞族病毒的試驗(yàn)中，可選擇不同的條件。得自RFHV或KSHV的序列可以被使用，但一般優(yōu)選兩個(gè)的混合物或簡(jiǎn)并探針。選擇序列的長(zhǎng)度和雜交反應(yīng)的條件以提供足夠的特異性，從而排除不需要的序列，但要么提供與潛在靶的最大程度的交叉反應(yīng)性。使用上文給出的公式，通過(guò)計(jì)算Tm，再計(jì)算能忍受的最大程度錯(cuò)配的相應(yīng)溫度即可預(yù)測(cè)適當(dāng)?shù)臈l件。通過(guò)檢測(cè)探針與含有編碼皰疹病毒DNA聚合酶的已知靶多核苷酸樣品的交叉反應(yīng)性，即可憑經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)出條件的適當(dāng)性。在此試驗(yàn)條件下形成穩(wěn)定雙螺旋所需的最小程度的互補(bǔ)性將決定何種DNA聚合酶序列會(huì)與探針雜交。考慮到例如擴(kuò)增得自人或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的靶產(chǎn)生了對(duì)應(yīng)于圖1的堿基330-501的片段，可用RFHV多核苷酸的相應(yīng)片段來(lái)作探針。根據(jù)表2中的資料，如果雜交反應(yīng)在僅需要約50％相同即可形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下進(jìn)行，探針會(huì)與得自任何已被測(cè)序的γ皰疹病毒(包括EBV和sHV1)DNA聚合酶基因的靶雜交。如果反應(yīng)在需要探針和靶之間至少約有62％相同，優(yōu)選至少約65％相同，更優(yōu)選至少約68％相同，甚至更優(yōu)選至少約70％相同才能形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下進(jìn)行，此試驗(yàn)將檢測(cè)來(lái)自RFHV，KSHV，或來(lái)自仍未被測(cè)序的相關(guān)皰疹病毒DNA聚合酶的靶多核苷酸。在這些條件下編碼EBV或sHV1DNA聚合酶的多核苷酸無(wú)望形成穩(wěn)定的雙螺旋。由于據(jù)信eHV2不能感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物，因此在被檢測(cè)的DNA中無(wú)望存在編碼eHV2DNA聚合酶的多核苷酸?？梢詫⑼ㄟ^(guò)大小的鑒定與通過(guò)雜交的鑒定聯(lián)合。例如，可在丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上分離被擴(kuò)增的多核苷酸，將所述多核苷酸印跡到適當(dāng)材料的膜上，如硝酸纖維素膜上，然后與具有適當(dāng)標(biāo)記物，如32P的探針雜交。洗滌后標(biāo)記物的存在反映了樣品中可雜交材料的存在，而與適當(dāng)分子量標(biāo)準(zhǔn)比較的遷移距離反映了材料的大小。在高嚴(yán)緊度條件下與前述探針之一雜交但具有非預(yù)期大小的片段序列表示與探針有高水平的同一性，但與RFHV或KSHV有所不同的DNA聚合酶序列。使用多核苷酸和寡核苷酸檢測(cè)皰疹病毒感染本發(fā)明中包含的編碼皰疹病毒DNA聚合酶的多核苷酸，和根據(jù)此多核苷酸的合成寡核苷酸可用于診斷與皰疹病毒感染相關(guān)的臨床疾病。例如，臨床樣品中可檢測(cè)到皰疹病毒DNA聚合酶的存在可暗示各個(gè)皰疹病毒作為病原因子參與了疾病的發(fā)展。特殊組織而不是周圍組織中聚合酶的存在可用于定位感染的損害。臨床樣品中γ皰疹病毒和其它皰疹病毒之間的鑒別，或RFHV，KSHV和EBV之間的鑒別可用于預(yù)測(cè)感染的臨床進(jìn)程或選擇適于治療的藥物。另外，由于DNA聚合酶可活躍地參與皰疹病毒的復(fù)制，因此對(duì)于某些應(yīng)用而言，DNA聚合酶比其它標(biāo)記物更優(yōu)選。DNA聚合酶在水痘-帶狀皰疹病毒的潛伏期不表達(dá)，但在其復(fù)制期表達(dá)(Meier等人)。因此，DNA聚合酶的測(cè)定有助于測(cè)定被γ皰疹病毒感染的個(gè)體當(dāng)前是否處于疾病的活動(dòng)期。HSV1株從眼睛轉(zhuǎn)移到腦的能力與DNA聚合酶活性相關(guān)(Yeung等人)。因此，DNA聚合酶的測(cè)定有助于預(yù)測(cè)γ皰疹病毒感染的侵襲或侵染。進(jìn)行診斷試驗(yàn)的方法是本領(lǐng)域中廣為人知的，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是常規(guī)技術(shù)。通常為了進(jìn)行本發(fā)明的診斷方法，本發(fā)明的一個(gè)組合物被提供成試劑以檢測(cè)臨床樣品中與之反應(yīng)的靶。例如，本發(fā)明的多核苷酸可被用作試劑以檢測(cè)如可能存在于被皰疹病毒感染的細(xì)胞中的DNA或RNA靶。本發(fā)明的多肽可被用作試劑以檢測(cè)能與之形成特異性復(fù)合物的靶。如抗體分子或(如果多肽是受體)相應(yīng)配體。本發(fā)明的抗體可被用作試劑以檢測(cè)它特異性識(shí)別的靶，如由病毒感染細(xì)胞表達(dá)的多肽。通過(guò)從被測(cè)量診斷參數(shù)的個(gè)體處得到適當(dāng)?shù)慕M織樣品即可提供靶。相關(guān)的試驗(yàn)樣品是那些得自懷疑攜帶皰疹病毒的個(gè)體的樣品。各種類型的樣品適于這一目的，包括那些通過(guò)活組織檢查或外科解剖得自感染或病理學(xué)可疑部位附近的樣品，衍生自它們的體外細(xì)胞培養(yǎng)物，溶解的提取物，血液和血液成分。如果需要，在進(jìn)行檢測(cè)前可從樣品中不完全地純化靶或?qū)袛U(kuò)增。通過(guò)在允許試劑與靶之間形成復(fù)合物的條件下將試劑與樣品接觸來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。可在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，或者例如使用組織學(xué)切片在固體組織樣品上進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)各種本領(lǐng)域中已知的技術(shù)可檢測(cè)復(fù)合物的形成。例如可提供具有標(biāo)記物的試劑，從復(fù)合物中除去未反應(yīng)的試劑；從而剩下的標(biāo)記物的量可表示所形成復(fù)合物的量。在說(shuō)明書下文中將提供復(fù)合物檢測(cè)的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)和替換物。為了測(cè)定所形成的復(fù)合物的量是否代表了感染或未感染皰疹病毒的細(xì)胞，優(yōu)選將試驗(yàn)結(jié)果與對(duì)對(duì)照樣品進(jìn)行的類似試驗(yàn)結(jié)果相比較。一般優(yōu)選使用得自未感染來(lái)源的對(duì)照樣品，要么對(duì)照樣品在組成上類似于被檢測(cè)的臨床樣品。然而，如果已知對(duì)照樣品中靶的相對(duì)量，或者此相對(duì)量能用于比較的目的，則任何對(duì)照樣品都適合。通常優(yōu)選同時(shí)對(duì)試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品進(jìn)行檢測(cè)。然而，如果所形成復(fù)合物的量可以定量并且有足夠的一致性，則在不同日期或不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品是可以接受的。因此，本發(fā)明所包含的編碼RFHV/KSHV亞族DNA聚合酶的多核苷酸和合成的寡核苷酸可被用于檢測(cè)生物樣品中可能存在的γ皰疹病毒的多核苷酸。在具體的診斷試驗(yàn)中使用多核苷酸的一般方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例見(jiàn)日本專利申請(qǐng)5309000(1atron)。例如1)通過(guò)與特異性探針進(jìn)行雜交反應(yīng)；2)通過(guò)與特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，或3)通過(guò)上述兩種方法的聯(lián)合可使使用多核苷酸試劑的檢測(cè)變成特異性的。為了進(jìn)行因與特異性探針雜交而被賦予特異性的試驗(yàn)，選定的多核苷酸應(yīng)具有所需程度的與想要的靶的互補(bǔ)性。優(yōu)選的探針包括長(zhǎng)度至少約為16個(gè)核苷酸的編碼RFHV，KSHV或RFHV/KSHV亞族成員DNA聚合酶的一部分的多核苷酸。更加優(yōu)選的探針含有至少約18，20，25，30，50或100個(gè)核苷酸長(zhǎng)的DNA聚合酶編碼區(qū)。還優(yōu)選能與RFHV/KSHV亞族的多核苷酸而不能與其它皰疹病毒的多核苷酸形成穩(wěn)定雙螺旋的簡(jiǎn)并探針。一般情況下提供的探針具有標(biāo)記物。經(jīng)常用于這種類型檢測(cè)的一些標(biāo)記物包括如32P和32P的放射性同位素，化學(xué)發(fā)光劑或如熒光素的熒光劑，能產(chǎn)生有色溶質(zhì)或沉淀物的酶，如堿性磷酸酶。標(biāo)記物對(duì)于試劑而言可以是內(nèi)源性的，它可通過(guò)直接的化學(xué)鍵被連接，或者通過(guò)一系列中間反應(yīng)分子，如生物素-親和來(lái)復(fù)合物或一系列相互反應(yīng)的多核苷酸被連接?？稍谂c靶多核苷酸雜交之前或之后在試劑中加入標(biāo)記物。為了改善試驗(yàn)的敏感性，經(jīng)常需要增加因雜交引起的信號(hào)，通過(guò)以復(fù)合標(biāo)記物成分摻入每個(gè)復(fù)合物的方式使用系列雜交的多核苷酸或分支的多核苷酸的聯(lián)合可以實(shí)現(xiàn)這一目的，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,124,246(Urdea等人)。如果需要，可從樣品中提取靶多核苷酸，也可以將靶多核苷酸部分純化。為了測(cè)量病毒顆粒，優(yōu)選富集DNA的制備；為了測(cè)量DNA聚合酶的活性轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選富集RNA的制備。一般預(yù)期臨床樣品中皰疹病毒的多核苷酸水平較低，潛伏有病毒的每個(gè)細(xì)胞中僅有幾拷貝編碼聚合酶的DNA，或正在復(fù)制病毒的每個(gè)細(xì)胞中有多至幾百拷貝的DNA。與那些聚合酶基因在其中無(wú)活性的細(xì)胞相比，活躍表達(dá)聚合酶的細(xì)胞中mRNA的水平較高，因此需要通過(guò)擴(kuò)增DNA或RNA來(lái)增強(qiáng)樣品中靶的水平。適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法是PCR，優(yōu)選使用本發(fā)明包含的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA拷貝，然后使用上述引物進(jìn)行PCR可以擴(kuò)增RNA。靶多核苷酸可任選經(jīng)受任何額外處理的聯(lián)合，包括用限制性核酸內(nèi)切酶消化，例如通過(guò)在瓊脂糖或聚丙烯酰胺中電泳以進(jìn)行大小分離，和貼在反應(yīng)基質(zhì)，如印跡材料上。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，通過(guò)將試劑多核苷酸與懷疑含有靶多核苷酸的樣品混合，可允許雜交發(fā)生。接著通過(guò)洗滌或分離以除去未反應(yīng)的試劑。一般情況下，靶多核苷酸和試劑必須都至少部分地被平衡成單鏈形式以便互補(bǔ)序列能有效雜交。因此，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)變性技術(shù)制備樣品是有用的(特別是在DNA檢測(cè)中)。選定的雜交條件的嚴(yán)緊性水平取決于檢測(cè)的目的。如果需要此檢測(cè)對(duì)于RFHV或KSHV是特異性的，則可使用含有各個(gè)DNA聚合酶一個(gè)區(qū)段的探針，在高嚴(yán)緊性的條件下進(jìn)行反應(yīng)。例如對(duì)于優(yōu)選的50個(gè)或更多個(gè)核苷酸的探針?biāo)玫囊惶變?yōu)選條件是37℃，50％甲酰胺，6×SSC，然后在低離子強(qiáng)度下洗滌。一般需要靶與多核苷酸探針至少約90％相同才形成穩(wěn)定的雙螺旋。通過(guò)增加所用探針的長(zhǎng)度也可以增加對(duì)RFHV或KSHV反應(yīng)的特異性。因此對(duì)于本發(fā)明的這一應(yīng)用特別優(yōu)選較長(zhǎng)的探針?；蛘?，如果需要試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)與RFHV或KSHV相關(guān)的γ皰疹病毒，則可使用較低的嚴(yán)緊性。適當(dāng)?shù)奶结槹ǖ米訰FHV或KSHVDNA聚合酶的片段，其混合物，或如表6所列的那些簡(jiǎn)并寡核苷酸。適當(dāng)?shù)碾s交條件被確定成僅允許探針與特定的DNA聚合酶序列雜交，所述序列具有所需程度的與探針的同一性。所需的嚴(yán)緊性取決于多核苷酸探針的長(zhǎng)度和探針與所需靶序列之間同一性的程度?？紤]到例如探針由DFASA和GDTD1B雜交位點(diǎn)之間的KSHV多核苷酸片段組成，需要最少55％同一性的條件會(huì)導(dǎo)致與KSHV，RFHV和EBV的相應(yīng)多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；需要最少68％同一性的條件會(huì)導(dǎo)致與KSHV，RFHV的多核苷酸，或相關(guān)的多核苷酸，而不是EBV的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；需要最少80％同一性的條件會(huì)導(dǎo)致與KSHV的多核苷酸，而不是RFHV或EBV的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋(見(jiàn)表2)。使用上文給出的公式可預(yù)先估計(jì)條件。優(yōu)選通過(guò)用已知含有多核苷酸的分離樣品檢測(cè)探針以進(jìn)一步確證精確的條件，所述樣品包括那些在試驗(yàn)中需被檢測(cè)的和那些不需被檢測(cè)的多核苷酸?；蛘咄ㄟ^(guò)由公開(kāi)序列合成多核苷酸，或者通過(guò)從據(jù)信被各個(gè)皰疹病毒感染的組織中提取和擴(kuò)增DNA可以提供這種樣品。確定雜交條件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是一種常規(guī)的調(diào)整，不需要太多的實(shí)驗(yàn)。由于eHV2，sHV1和EBV相對(duì)于α和β亞族的成員而言，與RFHV或KSHV更加密切相同，排除了那些病毒的多核苷酸的條件一般也排除了表1所列的其它皰疹病毒。另外，如果據(jù)信在最終測(cè)定中，某些病毒不會(huì)存在于受試樣品中(如eHV2在人組織樣品中)，那么當(dāng)確定了試驗(yàn)條件后即可任選忽略相應(yīng)的靶序列。因此條件可被確定為允許如LSGGA，CTDPA，KMLEA或GISPA的寡核苷酸探針能與含有SEQ.IDNO1和SEQ.IDNO3的多核苷酸序列，而不與選自SEQ.IDNO23至SEQ.IDNO29的序列形成穩(wěn)定的雙螺旋。條件也可被確定為允許如PCLNA(SEQ.IDNO21)或含有SEQ.IDNO1或SEQ.IDNO3的至少18個(gè)或更多個(gè)連串堿基的任何適當(dāng)片段的寡核苷酸探針能與含有SEQ.IDNO1的多核苷酸和含有SEQ.IDNO3的多核苷酸，而不與含有SEQ.IDNO23至SEQ.IDNO29中之一的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋。或者為了進(jìn)行因用特異性引物擴(kuò)增而被賦予特異性的試驗(yàn)，可如前所述從生物樣品中制備DNA或RNA。任選在PCR中使用非種特異性的引物，如表4中所列的那些，預(yù)擴(kuò)增靶多核苷酸。然后使用特異性引物，如表6或表7中所列的那些擴(kuò)增靶。例如，如果需要檢測(cè)對(duì)于RFHV是特異性的，則可使用VASGA，ILPCA，PIEAB，PEARB或它們的組合。如果需要檢測(cè)對(duì)于KSHV是特異性的，則可以使用SGILA，CLNIA，IEASB，EARFB或它們的組合。如果需要試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)與RFHV或KSHV相關(guān)的γ皰疹病毒，則可使用簡(jiǎn)并或交叉反應(yīng)性探針，如表6中所列的那些，或它們的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以嵌套形式使用寡核苷酸引物進(jìn)行了兩輪擴(kuò)增第一輪中為病毒特異性或非特異性；第二輪中為病毒特異性。這提供了既敏感又特異的試驗(yàn)。擴(kuò)增過(guò)程中特異性引物的使用足以提供所需的特異性。擴(kuò)增系列的最后充足的反應(yīng)產(chǎn)物的存在表示陽(yáng)性試驗(yàn)。通過(guò)例如將反應(yīng)混合物印跡到如硝酸纖維素的介質(zhì)上并用溴化乙錠染色可以檢測(cè)被擴(kuò)增的多核苷酸?；蛘呖梢栽谧罱K的擴(kuò)增循環(huán)期間在混合物中加入經(jīng)放射性標(biāo)記的底物；將摻入的標(biāo)記物與未摻入的標(biāo)記物分開(kāi)(例如通過(guò)印跡或通過(guò)大小分離)，檢測(cè)標(biāo)記物(例如通過(guò)計(jì)數(shù)或放射性自顯影)。如果在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上電泳，產(chǎn)物的大小將有助于進(jìn)一步證實(shí)被擴(kuò)增片段的本質(zhì)。通過(guò)使用得自前述方法的擴(kuò)增混合物作為前文概述的雜交反應(yīng)的靶源，在特異性擴(kuò)增之后可進(jìn)行特異性雜交。多核苷酸用于基因治療本發(fā)明中包含的藥物含有病毒特異性多核苷酸，多肽或抗體作為活性組分。這種組合物會(huì)降低病毒或感染細(xì)胞本身的病理學(xué)，或者使得病毒或被感染的細(xì)胞對(duì)非特異性藥物化合物的治療更加敏感。可以使用本發(fā)明編碼皰疹病毒DNA聚合酶部分的多核苷酸，例如給被感染的個(gè)體用藥以進(jìn)行基因治療(一般參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,399,346；Anderson等人)。一般的原理是以干擾相應(yīng)基因表達(dá)的方式施用多核苷酸，例如可通過(guò)與基因自身絡(luò)合或與由此基因轉(zhuǎn)錄的RNA絡(luò)合來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目的。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)技術(shù)，如以適當(dāng)?shù)妮d體形式提供多核苷酸，或?qū)⒍嗪塑账岚谥|(zhì)體內(nèi)，便于多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞。多核苷酸可以全身性注射，或者通過(guò)抗原特異性尋靶機(jī)制，或通過(guò)直接注射將多核苷酸提供給感染部位。優(yōu)選的基因治療模式是以能在細(xì)胞內(nèi)部復(fù)制，增強(qiáng)和延長(zhǎng)干擾效果的方式提供多核苷酸。因此，可使多核苷酸與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子有效連接，所述啟動(dòng)子如相應(yīng)基因的天然啟動(dòng)子，在被感染的細(xì)胞中有內(nèi)在活性的異源啟動(dòng)子，或能夠通過(guò)適當(dāng)試劑被誘導(dǎo)的異源啟動(dòng)子。優(yōu)選設(shè)計(jì)構(gòu)建體以使與啟動(dòng)子有效連接的多核苷酸序列與相應(yīng)基因的序列互補(bǔ)。因此，一旦整合到細(xì)胞基因組內(nèi)，所施用的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄本將與基因的轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)，并能與之雜交。此方法已知為反義治療。RFHV/KSHV亞族具有DNA聚合酶活性的多肽及其片段圖1所示的RFHV和KSHV多核苷酸都具有開(kāi)放閱讀框。被編碼的多肽分別被稱為SEQ.IDNO2和SEQ.IDNO4。多肽具有顯著數(shù)目的與其它被測(cè)序的皰疹病毒DNA聚合酶同源的殘基。相對(duì)于其它被測(cè)序的病毒的相應(yīng)片段而言，它們?cè)诖似蝺?nèi)相互之間有更密切的同一性。據(jù)信此片段包含的殘基在完整蛋白質(zhì)的核苷酸底物結(jié)合位點(diǎn)附近。此區(qū)域可能在聚合酶的催化活性中起作用。得自RFHV/KSHV亞族其它成員、具有DNA聚合酶活性的多肽預(yù)期共用此區(qū)域大部分相同的殘基。通常，在RFHV和KSHV之間保守的殘基預(yù)期在亞族內(nèi)相對(duì)保守。從SEQ.IDNO2的約氨基酸89開(kāi)始，有一個(gè)RFHV和KSHVDNA聚合酶之間共同享有的約46個(gè)殘基的線性序列。從SEQ.IDNO2的約氨基酸88開(kāi)始，有一個(gè)RFHV和eHV2DNA聚合酶之間共用的約31個(gè)殘基的線性序列。與eHV2共用的序列分開(kāi)列于SEQ.IDNO112。SEQ.IDNO112中還含有RFHV和sHV1之間共用的約26個(gè)氨基酸的序列，和兩個(gè)RFHV和EBV之間共用的12個(gè)氨基酸的序列。從SEQ.IDNO4的約氨基酸10開(kāi)始，有一個(gè)KSHV和各種其它γ皰疹病毒之間共用的約15個(gè)殘基的線性序列。此共用序列分開(kāi)列于SEQ.IDNO113中。SEQ.IDNO2或4而不是SEQ.IDNOS112或113中所含的、與其它已知的皰疹病毒DNA聚合酶共用的最長(zhǎng)序列為10個(gè)氨基酸長(zhǎng)。因此，RFHV或KSHVDNA聚合酶蛋白質(zhì)序列的11個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)的任何片段(不是SEQ.IDNOS112或113中所含的)據(jù)信對(duì)于RFHV/KSHV亞族，或其中的種和變異體而言是特異性的。本發(fā)明既包含RFHV/KSHV亞族皰疹病毒完整的DNA聚合酶，也包含對(duì)此亞族有特異性的其任何片段。本發(fā)明的優(yōu)選DNA聚合酶片段至少11個(gè)氨基酸長(zhǎng)；更優(yōu)選它們約12個(gè)氨基酸長(zhǎng)；更優(yōu)選它們至少約15個(gè)氨基酸長(zhǎng)；甚至更優(yōu)選它們至少約20個(gè)氨基酸長(zhǎng)，再更優(yōu)選它們至少約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)。RFHV和KSHVDNA聚合酶片段的氨基酸序列可用于鑒定病毒特異性和交叉反應(yīng)性的抗原區(qū)域。原則上，特異性的抗體會(huì)識(shí)別序列間非抗體來(lái)源物種共有的任何氨基酸差異?？贵w結(jié)合位點(diǎn)一般應(yīng)足夠大以包含抗原的5至9個(gè)氨基酸殘基，所述位點(diǎn)應(yīng)足能識(shí)別單個(gè)氨基酸的差異。特異性抗體可能是多克隆應(yīng)答的一部分，所述應(yīng)答在被表達(dá)DNA聚合酶的病毒感染的動(dòng)物中自發(fā)地產(chǎn)生。也可以通過(guò)給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射完整的聚合酶或聚合酶片段來(lái)誘導(dǎo)特異性的抗體。因此，RFHV或KSHV獨(dú)特的5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何肽是潛在的病毒特異性抗原，可以被RFHV-或KSHV-特異性抗體識(shí)別。在RFHV和KSHV，而不是EBV，eHV2和sHV1之間共用的至少5個(gè)氨基酸的肽是潛在的RFHV/KSHV亞族特異性抗原。優(yōu)選肽的一些例子示于表8。本領(lǐng)域技術(shù)人員很快會(huì)認(rèn)識(shí)到通過(guò)細(xì)微改變所列肽的長(zhǎng)度和/或在任一方向上將肽的框架移動(dòng)幾個(gè)殘基即可設(shè)計(jì)出具有類似特異性的其它肽。在γ皰疹病毒亞族的所有已知DNA聚合酶多肽序列之間，表8所示的I類肽是保守的。針對(duì)此區(qū)域中的一個(gè)這種DNA聚合酶的抗體預(yù)期能與其它抗體交叉反應(yīng)。在RFHV和KSHV之間II類肽是保守的，但在sHV1和EBV之間II類肽卻不保守。針對(duì)此區(qū)域的抗體預(yù)期在RFHV，KSHV和RFHV/KSHV亞族的其它病毒之間能交叉反應(yīng)。RFHV和KSHV的III類肽有所不同。與此區(qū)域，特別是與不相同的殘基結(jié)合的抗體預(yù)期可將RFHVDNA聚合酶與KSHVDNA聚合酶區(qū)分開(kāi)來(lái)。特別優(yōu)選的II類和III類肽是QGRKMLE，ARFKVI，RRPIDVS，QRPIEAS，IEASPEA和IDVSPDA。給出RFHV和/或KSHV之DNA聚合酶的完整序列，通過(guò)類似分析可預(yù)測(cè)分子其它區(qū)域的病毒或亞族特異性肽。多肽的制備可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾個(gè)不同方法制備本發(fā)明的多肽，包括完整的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段和抗原區(qū)域。例如，可將全長(zhǎng)cDNA的適當(dāng)鏈與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子有效連接，并轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。再在允許轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，隨后回收多肽。有關(guān)通過(guò)轉(zhuǎn)染釀酒酵母以表達(dá)和回收皰疹病毒DNA聚合酶的描述參見(jiàn)Haffey等人和專利申請(qǐng)EP0337441。有關(guān)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)皰疹病毒另一個(gè)蛋白質(zhì)的描述參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,244,792(Burke等人)。也可以通過(guò)化學(xué)合成從序列資料出發(fā)直接制備多肽。合成的幾個(gè)方法是本領(lǐng)域中已知的方法。優(yōu)選的方法是固相Merrifield技術(shù)?；蛘呖赏ㄟ^(guò)前文描述的任何方法制備編碼所需多肽的多核苷酸，并使用體外翻譯系統(tǒng)，如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)翻譯，例見(jiàn)Dorsky等人。使用多肽評(píng)估皰疹病毒感染在幾個(gè)不同的應(yīng)用中，本發(fā)明所包含的多肽也可被用來(lái)檢測(cè)或評(píng)估個(gè)體中皰疹病毒感染的現(xiàn)狀。在一個(gè)應(yīng)用中，編碼皰疹病毒DNA聚合酶一部分的多肽被提供成檢測(cè)用的試劑以檢測(cè)可特異性地識(shí)別它的抗體的存在。這種抗體可能存在于例如目前或繼往被皰疹病毒感染的個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中。循環(huán)系統(tǒng)中抗DNA聚合酶之抗體的存在能提供病理狀況的早期征兆?？挂倚透窝撞《綝NA聚合酶的抗體是急性乙型肝炎病毒感染的早期征兆(WO8904964Fietelson等人)?？笵NA聚合酶的抗體可用于診斷鼻咽癌(Lin等人，Liu等人)。類似地，在卡波濟(jì)氏肉瘤的損害臨床顯示之前它也能用于監(jiān)測(cè)被HIV感染的病人中抗KSHVDNA聚合酶抗體的存在。被測(cè)量其中的抗體水平的適當(dāng)臨床樣品包括得自懷疑有γ皰疹病毒感染的個(gè)體的血清或血漿。通過(guò)例如免疫測(cè)定法可測(cè)定抗體的存在。本領(lǐng)域中已確立了大量免疫測(cè)定法以使用病毒肽進(jìn)行抗體的定量(例見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,350,671Houghton等人)。例如，可以將潛在含有特異性抗體的試驗(yàn)樣品與預(yù)先確定的不限定量的試劑多肽混合。此試劑可含有直接結(jié)合的標(biāo)記物，如酶或放射性同位素。對(duì)于液相檢測(cè)而言，通過(guò)如過(guò)濾或?qū)游龅姆蛛x技術(shù)除去未反應(yīng)的試劑?；蛘?，通過(guò)固相上的試劑首先捕獲樣品中的抗體。所述試劑可以是例如特異性的多肽，抗-免疫球蛋白，或A蛋白，然后用如結(jié)合有標(biāo)記物的特異性多肽，抗-免疫球蛋白或A蛋白的第二試劑檢測(cè)被捕獲的抗體。至少一種捕獲試劑或檢測(cè)試劑必須是特異性多肽。在第三種變化中，含有多肽的細(xì)胞或組織切片可首先被含有抗體的試驗(yàn)樣品覆蓋，然后被如經(jīng)標(biāo)記的抗-免疫球蛋白的檢測(cè)試劑覆蓋。在所有這些例子中，復(fù)合物中捕獲的標(biāo)記物的量與試驗(yàn)樣品中存在的特異性抗體的量正相關(guān)?？稍O(shè)計(jì)類似的試驗(yàn)，其中試驗(yàn)樣品中的抗體與經(jīng)標(biāo)記的抗體競(jìng)爭(zhēng)同有限量的特異肽結(jié)合，那么復(fù)合物中標(biāo)記物的量與試驗(yàn)樣品中特異性抗體的量負(fù)相關(guān)。比較試驗(yàn)樣品和得自未被感染之個(gè)體的對(duì)照樣品之間使用這些試驗(yàn)中的任一個(gè)得到的結(jié)果。通過(guò)適當(dāng)選擇試劑多肽，可檢測(cè)所需特異性的抗體。例如，如果使用完整的DNA聚合酶，或者使用含有皰疹病毒保守區(qū)域的片段，則在試驗(yàn)樣品中檢測(cè)到的抗體可能是病毒特異性的，交叉反應(yīng)性的，或兩者皆是。優(yōu)選將此特性的試劑用于皰疹病毒感染的一般性篩選試驗(yàn)中。為了使試驗(yàn)特異針對(duì)抗RFHV或抗KSHV的抗體，可選擇含有適當(dāng)病毒DNA聚合酶的非保守區(qū)的抗原肽，如表8的III類所列的那些肽，優(yōu)選使用這種肽的混合物。為了同時(shí)檢測(cè)抗RFHV，KSHV，和密切相關(guān)的γ皰疹病毒家族的病毒，而不抗sHVl和EBV的抗體，可選擇具有表8II類所列肽之特性的抗原肽，優(yōu)選使用這種肽的混合物。一旦感染消退，在皰疹病毒感染期間刺激產(chǎn)生的抗體也會(huì)消退，或者它們也可以作為宿主免疫記憶的一部分被保存。在后一種情況下，通過(guò)測(cè)定抗體的類別可將因目前的感染產(chǎn)生的抗體與因免疫記憶產(chǎn)生的抗體區(qū)分開(kāi)來(lái)。例如，可進(jìn)行這樣一種試驗(yàn)，其中試驗(yàn)樣品中的抗體被特異性的多肽捕獲，再用經(jīng)標(biāo)記的抗-IgM或抗-IgG使之顯現(xiàn)出來(lái)。試驗(yàn)樣品中IgM類特異性抗體的存在表明感染正在發(fā)生，而只存在IgG抗體表明活性是由于先前感染或免疫接種的免疫記憶而產(chǎn)生的。在本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用中，從樣品中分離皰疹病毒編碼的DNA聚合酶，并通過(guò)酶測(cè)定法測(cè)定DNA聚合酶存在的量。通過(guò)例如提取聚合酶和進(jìn)行適當(dāng)?shù)木酆显囼?yàn)可進(jìn)行生物樣品中DNA聚合酶活性的測(cè)定。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如使用如TRITONTMX-100或脫氧膽酸鹽的非離子去污劑可從固體組織樣品或組織勻漿液中使聚合酶增溶。或者，如果聚合酶是由被感染的細(xì)胞分泌的，則可以對(duì)液體樣品，如血漿或淋巴液進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行DNA聚合酶試驗(yàn)的方法是本領(lǐng)域中已知的。例如，制備出的聚合混合物含有推定的DNA聚合酶，含有至少一種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸的核苷酸混合物，如M13噬菌體DNA的DNA模板，和如有必要還含有調(diào)節(jié)性亞單位。在37℃下將混合物保溫足夠長(zhǎng)時(shí)間以允許聚合發(fā)生。通過(guò)測(cè)量標(biāo)記物摻入多核苷酸的量可測(cè)定聚合酶活性有或無(wú)。本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)即可方便地確定進(jìn)行DNA聚合酶試驗(yàn)的最適條件。例如，O′Donnell等人已公開(kāi)了檢測(cè)HSVDNA聚合酶的試驗(yàn)條件。預(yù)期檢測(cè)RFHV和KSHVDNA聚合酶的最適試驗(yàn)條件與之類似。使用多肽作為主動(dòng)疫苗的成分本發(fā)明所包含的多肽如何有效用于治療的例子是通過(guò)免疫接種。在此應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽作為主動(dòng)疫苗的一部分被施用以刺激能抗病原性生物體的抗體；在這種情況下，所述病原體為RFHV/KSHV亞族的皰疹病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知由分離的皰疹病毒成分開(kāi)發(fā)主動(dòng)疫苗例見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,171,568(Berkeetal)。此種類型的疫苗對(duì)預(yù)防特別有用，這是因?yàn)樵诓≡陨矬w有機(jī)會(huì)侵入宿主細(xì)胞并開(kāi)始復(fù)制循環(huán)之前，疫苗所刺激產(chǎn)生的抗體就能夠中和遇到的病原體。制備和施用多肽疫苗的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。肽能夠獨(dú)立地產(chǎn)生免疫應(yīng)答，或者通過(guò)化學(xué)操作，如與KLH類的蛋白質(zhì)載體交聯(lián)或結(jié)合使其變得更具有免疫原性。優(yōu)選此疫苗也含有佐劑，如明礬，胞壁酰二肽，脂質(zhì)體或DETOXTM。疫苗可含有輔助性物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑，乳化劑和有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽或酸。它也含有藥物可接受的賦形劑，所述賦形劑與活性成分相容，并適合于施藥的途徑。合乎需要的肽疫苗劑量通常為10μg至1mg，具有寬的有效范圍。優(yōu)選首次以引發(fā)劑量施用疫苗，通常至少4周后再以加強(qiáng)免疫的劑量施用一次。也可進(jìn)一步加強(qiáng)免疫劑量以增強(qiáng)效果。負(fù)責(zé)治療的人士通?？纱_定劑量和其時(shí)間的選擇。在此應(yīng)用的另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是經(jīng)設(shè)計(jì)可刺激特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞之疫苗的活性成分。此種類型的疫苗對(duì)于治療受試者體內(nèi)已經(jīng)存在的皰疹病毒感染特別有用。皰疹病毒的DNA聚合酶是細(xì)胞毒T細(xì)胞疫苗適當(dāng)?shù)陌?；這不僅是由于其相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)，也是由于它是病毒重要的內(nèi)部成分。通過(guò)循環(huán)完整的病毒和有缺損的病毒顆?？杀磉_(dá)外部病毒成分，該外部成分具有引導(dǎo)免疫系統(tǒng)遠(yuǎn)離被感染細(xì)胞的潛力。然而，被病毒感染的細(xì)胞僅在胞外表達(dá)內(nèi)部的病毒成分，所述細(xì)胞將所述成分顯示于組織相容性1類分子附近。這種細(xì)胞是特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞理想的靶，因?yàn)樗鼈儽硎静《緩?fù)制的部位，所以它們是宿主內(nèi)病毒最易被攻擊的位置。與那些需被用于刺激抗體的疫苗相比，細(xì)胞毒T細(xì)胞疫苗可含有不同的抗原區(qū)域。T細(xì)胞表位與抗體表位有所不同；它們一般較少依賴于構(gòu)象的前后關(guān)系，和/或可由能重疊成兩親性α-螺旋之肽區(qū)域產(chǎn)生。細(xì)胞毒T細(xì)胞疫苗也可含有能增強(qiáng)肽至T細(xì)胞群的呈遞和/或幫助征集細(xì)胞毒T細(xì)胞譜系之細(xì)胞的另外的活性成分或細(xì)胞因子。在前述實(shí)施方案之任一個(gè)的變體中，免疫接種的肽不是以分離的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的形式被提供，而是以表達(dá)載體的形式被提供。編碼肽的多核苷酸與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件有效連接，然后被轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)妮d體中。適當(dāng)?shù)妮d體包括疫苗病毒或皰疹病毒的減毒形式。使用多肽設(shè)計(jì)或篩選抗病毒藥物干擾DNA聚合酶基因或基因產(chǎn)物會(huì)修飾感染的進(jìn)程或疾病的進(jìn)展。本發(fā)明的目的之一是提供一種方法，通過(guò)此方法可開(kāi)發(fā)和試驗(yàn)有用的藥物組合物和利用這種化合物治療γ皰疹病毒感染的方法。特別優(yōu)選可用于治療RFHV和KSHV感染的藥物化合物。適當(dāng)?shù)乃幬锟梢愿蓴_DNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，并能干擾由此基因編碼的多肽的催化功能。不需要知道干擾的機(jī)理；只需要明白對(duì)于與感染過(guò)程相關(guān)的反應(yīng)而言，干擾是優(yōu)先的。優(yōu)選的藥物包括那些競(jìng)爭(zhēng)干擾DNA聚合酶與底物核苷酸三磷酸，DNA模板結(jié)合的藥物，也優(yōu)選核苷酸類似物，它們可摻入由酶合成的聚合鏈，但形成能防止進(jìn)一步聚合的死端(dead-end)復(fù)合物(Reardon等人)?？捎杀疚乃龇椒z測(cè)的優(yōu)選藥物的一些非限制性例子是蚜腸霉素，無(wú)環(huán)鳥苷，9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤，磷卡萘替，卵孢菌素，BHCG，PMEA，其它核苷酸類似物，這些化合物的isotrene以及與所列的這些化合物在結(jié)構(gòu)或功能上相關(guān)的其它化合物。還優(yōu)選能干擾DNA聚合酶與催化活性所必需的調(diào)節(jié)性亞單位的聯(lián)系的藥物。如上文所述，在HSV的復(fù)制過(guò)程中，UL42亞單位對(duì)于HSV的DNA聚合酶活性而言是必需的。由UL42序列設(shè)計(jì)得到的小肽可抑制UL42和DNA聚合酶之間的結(jié)合，此小肽是聚合酶活性有效的抑制劑(美國(guó)專利號(hào)5,223,391；Coen等人)。HSVDNA聚合酶的c-末端區(qū)域負(fù)責(zé)UL42亞單位的結(jié)合。因此預(yù)期在某些條件下(如那些病毒復(fù)制所必需的)，RFHV和KSHVDNA聚合酶會(huì)需要可能是也可能不是UL42的類似物的調(diào)節(jié)性亞單位，以表達(dá)全部的聚合酶活性。因此，與U.S.5,223,391中描述的那些肽功能上相當(dāng)，經(jīng)適當(dāng)改變能用于γ皰疹病毒的肽預(yù)期具有抑制活性及治療用途。本發(fā)明提供了篩選候選藥物以決定哪種適于臨床使用的方法。此方法會(huì)瞄準(zhǔn)目前已知的抗病毒化合物和那些將來(lái)設(shè)計(jì)的抗病毒化合物。此方法包括將有活性的DNA聚合酶與候選藥物聯(lián)合，并測(cè)定候選藥物是否改變了生化功能。DNA聚合酶可以是由RFHV或KSHV的DNA聚合酶基因編碼的具有DNA聚合酶活性的任何片段。通過(guò)表達(dá)編碼分子活性位點(diǎn)的經(jīng)遺傳工程改造的多肽，或通過(guò)用蛋白酶裂解DNA聚合酶并純化活性片段可得到適當(dāng)?shù)钠?。在?yōu)選的實(shí)施方案中，提供了完整的DNA聚合酶。反應(yīng)混合物也可含有適當(dāng)?shù)腄NA模板，底物脫氧核糖核苷酸三磷酸和進(jìn)行反應(yīng)所必需的任何調(diào)節(jié)性亞單位。篩選方法的一個(gè)實(shí)施方案是在體外進(jìn)行DNA聚合酶檢測(cè)。DNA聚合酶以分離的形式被提供，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中與其它反應(yīng)化合物混合。按上文章節(jié)中所述方法進(jìn)行和監(jiān)測(cè)DNA聚合酶試驗(yàn)，通過(guò)例如放射性標(biāo)記的核苷酸摻入合成鏈中的比率測(cè)量反應(yīng)混合物中每摩爾或每克酶的聚合酶活性的量。通過(guò)平行進(jìn)行兩個(gè)反應(yīng)可以測(cè)定候選藥物的效果，所述兩個(gè)反應(yīng)除了一個(gè)含有候選藥物外，具有相同的反應(yīng)物質(zhì)混合物。或者通過(guò)在正在進(jìn)行的聚合酶反應(yīng)中加入候選藥物，并測(cè)定反應(yīng)速率是否改變來(lái)測(cè)定候選藥物的效果。合乎需要的效果可以消除或降低經(jīng)標(biāo)記DNA的合成速率。篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案是在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼DNA聚合酶活性區(qū)域的多核苷酸。用此多核苷酸轉(zhuǎn)染會(huì)增強(qiáng)宿主細(xì)胞的復(fù)制速率，此時(shí)通過(guò)測(cè)量細(xì)胞復(fù)制的速率可監(jiān)測(cè)聚合酶的活性?；蛘呔酆厦傅幕钚砸材鼙槐硎緸榧?xì)胞內(nèi)部如經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸之類的產(chǎn)物產(chǎn)生的速率，因此通過(guò)將其效果與DNA聚合酶活性相聯(lián)系可以測(cè)定藥物的效果。適當(dāng)?shù)膶?duì)照實(shí)驗(yàn)包括在無(wú)藥物存在時(shí)測(cè)量DNA聚合酶活性，并測(cè)定藥物對(duì)未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的影響。篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案是測(cè)量候選藥物與分離的DNA聚合酶或其片段的結(jié)合。與催化位點(diǎn)或調(diào)節(jié)性亞單位的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的化合物預(yù)期會(huì)干擾DNA聚合酶的活性。因此，可將完整的DNA聚合酶，或含有催化位點(diǎn)或調(diào)節(jié)性亞單位的結(jié)合位點(diǎn)的片段與候選藥物混合。通過(guò)例如以放射性標(biāo)記或穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的形式提供候選藥物可直接測(cè)量候選藥物的結(jié)合。通過(guò)例如將聚合酶和適當(dāng)?shù)目贵w一起沉淀，或者通過(guò)提供與固相結(jié)合的聚合酶并在反應(yīng)后洗滌固相可測(cè)定與聚合酶結(jié)合的標(biāo)記物的存在。通過(guò)例如差異光譜學(xué)，核磁共振或圓二色性檢測(cè)也可將候選藥物與聚合酶的結(jié)合以聚合酶構(gòu)象的改變進(jìn)行觀察?；蛘咭部稍诟?jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中測(cè)定結(jié)合例如，將DNA聚合酶與候選藥物混合，再加入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸或調(diào)節(jié)性亞單位的片段。候選藥物與生化相關(guān)位點(diǎn)的結(jié)合應(yīng)能抑制經(jīng)標(biāo)記化合物隨后的結(jié)合。本發(fā)明也通過(guò)合理的藥物設(shè)計(jì)提供了治療皰疹病毒感染之藥物的開(kāi)發(fā)，一般可參見(jiàn)Hodgson和Erickson等人。在此實(shí)施方案中，或者通過(guò)以氨基酸序列為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型，或者優(yōu)選通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定法可測(cè)定DNA聚合酶的三維結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)的方法包括抗體作用，突變分析和抗-獨(dú)特型的形成。特別優(yōu)選X-射線晶體學(xué)。知道蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)，特別是核苷酸和調(diào)節(jié)性亞單位結(jié)合位點(diǎn)附近的重要氨基酸基團(tuán)的方向，就可以從頭設(shè)計(jì)化合物，或者可適當(dāng)修飾現(xiàn)有的化合物。經(jīng)設(shè)計(jì)的化合物要具有適當(dāng)?shù)碾姾善胶猓杷?，?或形狀以使得它能在聚合酶活性位點(diǎn)的附近結(jié)合，并在空間上干擾此位點(diǎn)的正常生化功能。優(yōu)選隨后在上文所述的藥物篩選試驗(yàn)中檢測(cè)通過(guò)此方法設(shè)計(jì)的化合物?？笵NA聚合酶的抗體及其制備本發(fā)明中包含的皰疹病毒DNA聚合酶的氨基酸序列對(duì)于所述病毒感染的宿主而言是外源的。聚合酶較大，并潛在含有大量抗原區(qū)域，它們?cè)诟鱾€(gè)病毒的衣殼內(nèi)被掩蔽，不太可能模擬宿主抗原。因此希望這些聚合酶基本上是免疫原性的。脊椎動(dòng)物宿主在被完整的皰疹病毒感染的過(guò)程中會(huì)自發(fā)產(chǎn)生抗病毒的抗體。預(yù)期通過(guò)給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射分離的DNA聚合酶和適當(dāng)制備的片段也可產(chǎn)生抗體。實(shí)施例5和實(shí)施例10所述的觀察結(jié)果支持這些預(yù)期。一般可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制備抗多肽的抗體。為了在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)刺激抗體的產(chǎn)生，經(jīng)常優(yōu)選通過(guò)如與戊二醛聚合，或與如弗氏佐劑等佐劑聯(lián)合這類技術(shù)增強(qiáng)多肽的免疫原性。將免疫原注射到適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)優(yōu)選注射到嚙齒動(dòng)物體內(nèi)以制備單克隆抗體；優(yōu)選注射到如免或綿羊的較大動(dòng)物中以制備多克隆抗體。優(yōu)選在約4周后提供第二次或加強(qiáng)注射，并在不少于約1周后開(kāi)始收獲抗體源。從經(jīng)免疫的動(dòng)物體內(nèi)收獲的血清提供了多克隆抗體的來(lái)源。從來(lái)源材料中純化特異性抗體活性的詳細(xì)方法是本領(lǐng)域中已知的。如有必要，可通過(guò)如A蛋白層析，硫酸銨沉淀，離子交換層析，高效液相色譜和在偶聯(lián)至固體支持物上的免疫多肽柱上進(jìn)行的免疫親和層析之類的技術(shù)進(jìn)一步純化特異性抗體活性。通過(guò)完整的DNA聚合酶或含有保守序列的片段免疫產(chǎn)生的多克隆抗體在皰疹病毒之間可能有交叉反應(yīng)。通過(guò)用適當(dāng)?shù)奶禺愋钥乖?，如上文?中所列的那些抗原免疫可產(chǎn)生病毒或亞族特異性的抗體。或者，通過(guò)例如使抗體穿過(guò)由其它病毒聚合酶制成的吸附劑并收集未結(jié)合的級(jí)分以除去不需要的抗其它病毒DNA聚合酶的活性，可以使得抗較大片段產(chǎn)生的多克隆抗體為特異性的?；蛘撸梢詮拿庖邉?dòng)物體內(nèi)回收如脾細(xì)胞等免疫細(xì)胞并用于制備能產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞系，例見(jiàn)Harrow&amp;Lane(1988)，美國(guó)專利號(hào)4,472,500(Milstein等人)，和U.S.4,444,887(Hoffman等人)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以特別地通過(guò)細(xì)胞融合，或者通過(guò)用EpsteinBarr病毒轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，或者用致癌DNA轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生能生產(chǎn)抗體的細(xì)胞系?？寺〔⑴囵B(yǎng)經(jīng)處理的細(xì)胞，選擇能產(chǎn)生所需特異性抗體的克隆?？赏ㄟ^(guò)多種技術(shù)對(duì)培養(yǎng)物上清液進(jìn)行特異性檢測(cè)，所述技術(shù)如在標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定法中使用免疫多肽作為檢測(cè)試劑，或者在免疫組化法中使用表達(dá)多肽的細(xì)胞。可從大體積的組織培養(yǎng)物上清液，或者從注射有克隆的適當(dāng)準(zhǔn)備的宿主動(dòng)物腹水液中純化選定克隆的單克隆抗體供應(yīng)。此方法的有效變動(dòng)包括對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行多肽的免疫接種。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)化學(xué)方法，如用蛋白酶使抗體裂解可制備抗體片段和其它衍生物。通過(guò)得到編碼抗體的多核苷酸，并應(yīng)用一般的分子生物學(xué)方法以引入突變并翻譯變異體可以產(chǎn)生抗體的經(jīng)遺傳工程改造的變異體。通過(guò)注射完整的DNA聚合酶或含有保守序列的片段而產(chǎn)生的單克隆抗體在皰疹病毒之間可能有交叉反應(yīng)。通過(guò)用適當(dāng)?shù)奶禺愋钥乖?，如選自表8的那些抗原免疫可產(chǎn)生病毒或亞族特異性的抗體?；蛘?，通過(guò)在篩選方法中使用適當(dāng)?shù)目乖邕x自表8中的一個(gè)抗原可從經(jīng)克隆的雜交瘤中選擇病毒特異性的克隆。使用抗體檢測(cè)生物樣品中的DNA聚合酶抗體可被用于檢測(cè)可能存在于，例如，固形組織樣品和經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞中病毒來(lái)源的DNA聚合酶多肽和片段。進(jìn)行這種測(cè)定的免疫組織學(xué)技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。一般情況下通過(guò)下述技術(shù)的聯(lián)合可保護(hù)組織，所述技術(shù)包括冷凍，在不同的溶劑內(nèi)交換，用如低聚甲醛的試劑固定，用如醇的試劑干燥，或在如石蠟或OCT的商購(gòu)介質(zhì)中包埋。適當(dāng)制備樣品的切片，并用特異針對(duì)蛋白質(zhì)的第一抗體覆蓋?？芍苯犹峁┚哂羞m當(dāng)標(biāo)記物的第一抗體。更多情況下使用多種易生產(chǎn)或可商購(gòu)的顯色劑中的一種來(lái)檢測(cè)第一抗體。典型地，這些顯色劑是抗免疫球蛋白或A蛋白，它們一般具有的標(biāo)記物包括但不限于如熒光素的熒光標(biāo)記物，如過(guò)氧化物酶的能沉淀適當(dāng)化合物的酶，如膠體金的電子密度高的標(biāo)記物或如125I的放射性同位素。再使用適當(dāng)?shù)娘@微技術(shù)觀察切片，比較懷疑受病毒感染的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的標(biāo)記水平，所述對(duì)照細(xì)胞如感染區(qū)域周圍或得自較遠(yuǎn)部位的細(xì)胞。在標(biāo)準(zhǔn)的定量免疫測(cè)定法中，也可檢測(cè)由DNA聚合酶基因編碼的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)由受感染的細(xì)胞以一定的量分泌或排出，則可在血漿或血清樣品中檢測(cè)到蛋白質(zhì)?；蛘?，可從固形組織樣品中溶解或提取靶蛋白質(zhì)。定量前可通過(guò)例如印跡技術(shù)或使用捕獲抗體將蛋白質(zhì)粘附于固相上。本領(lǐng)域中已建立了大量進(jìn)行定量的免疫測(cè)定法，例如，可將蛋白質(zhì)與預(yù)定的非限制性量的特異針對(duì)蛋白質(zhì)的試劑抗體相混合。試劑抗體可含有直接結(jié)合的標(biāo)記物，如酶或放射性同位素，或者也可加入第二個(gè)經(jīng)標(biāo)記的試劑，如抗免疫球蛋白或A蛋白。對(duì)于固相測(cè)定法而言，通過(guò)洗滌除去未反應(yīng)的試劑。對(duì)于液相測(cè)定法而言，通過(guò)一些其它的分離技術(shù)，如過(guò)濾或?qū)游龀ノ捶磻?yīng)的試劑。復(fù)合物中捕獲的標(biāo)記物量與試驗(yàn)樣品中存在的靶蛋白質(zhì)量正相關(guān)。此技術(shù)的變體是競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法，其中靶蛋白質(zhì)與經(jīng)標(biāo)記的類似物競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體的結(jié)合位點(diǎn)，此時(shí)被捕獲的標(biāo)記物量與試驗(yàn)樣品中存在的靶蛋白質(zhì)的量負(fù)相關(guān)。比較試驗(yàn)樣品和得自未受感染之來(lái)源的對(duì)照樣品之間使用任何這類檢定法得到的結(jié)果?？拱捳畈《綝NA聚合酶的特異性抗體在開(kāi)發(fā)，診斷和治療研究中有很多用途。例如，抗體可用于藥物篩選(見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,120,639)或用于制備被動(dòng)疫苗。它們也可按下文所述，被用于檢測(cè)生物樣品中的皰疹病毒和使藥物靶向作用。使用抗體使藥物靶向作用抗體如何能被用于治療皰疹病毒感染的例子是效應(yīng)物成分的特異性靶向作用，被病毒感染的細(xì)胞一般將病毒的肽(包括內(nèi)部病毒成分)呈現(xiàn)于它們的細(xì)胞表面組織相容性1類抗原的前后序列中，因此肽為被感染的細(xì)胞提供了可與特異性抗體結(jié)合的標(biāo)記物。而與抗體結(jié)合的效應(yīng)物成分在被感染的細(xì)胞附近變得密集；改善了對(duì)感染細(xì)胞的效應(yīng)并降低了對(duì)未受感染之細(xì)胞的效應(yīng)。并且，如果抗體能誘導(dǎo)胞吞作用，則可增強(qiáng)效應(yīng)物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的能力。為了靶向作用這一目的，優(yōu)選通過(guò)共價(jià)或高親和性鍵使特異針對(duì)病毒多肽(此時(shí)為DNA聚合酶的區(qū)域)的抗體與適當(dāng)?shù)男?yīng)物成分綴合。這種組合物中適當(dāng)?shù)男?yīng)物成分包括如131I等放射性核素，有毒的化合物和如白喉毒素的有毒肽。另一個(gè)適當(dāng)?shù)男?yīng)物成分是可包裹于脂質(zhì)體中的反義多核苷酸。在抗體分子對(duì)人治療的大多數(shù)應(yīng)用中，優(yōu)選使用人單克隆抗體，或已通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)人源化的抗體。這有助于防止抗體分子自身成為宿主免疫系統(tǒng)的靶。診斷試劑盒診斷實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)室，技術(shù)人員或私人都可進(jìn)行使用本發(fā)明的多核苷酸，寡核苷酸，肽或抗體的診斷步驟。本發(fā)明提供了能用于這些裝置的診斷試劑盒。在得自受感染個(gè)體的臨床樣品中，個(gè)體中存在皰疹病毒表現(xiàn)為樣品中所含DNA，RNA，蛋白質(zhì)或抗體的改變。與得自健康個(gè)體的樣品中的成分相比，因皰疹病毒的存在而導(dǎo)致的這些成分之一的變化采取的形式是成分水平的增加或降低，或成分形式的變化。任選預(yù)處理臨床樣品以富集被檢測(cè)的靶。然后使用者可使用試劑盒中所含的試劑以檢測(cè)診斷成分改變的水平或形式變化。每個(gè)試劑盒必須含有賦予方法特異性的試劑用于檢測(cè)靶DNA或RNA的試劑多核苷酸；用于檢測(cè)靶蛋白質(zhì)的試劑抗體；用于檢測(cè)欲被分析的樣品中可能存在的靶抗體的試劑多肽?？梢赃m于貯存的固體形式或液體緩沖液形式提供試劑，然后當(dāng)進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，用于交換或加入反應(yīng)介質(zhì)中。還提供了適當(dāng)?shù)陌b。此試劑盒可提供對(duì)此方法有用的另外的成分，這些可選擇的成分包括緩沖劑，捕獲試劑，顯色劑，標(biāo)記物，反應(yīng)表面，檢測(cè)的工具，對(duì)照樣品，說(shuō)明書和解釋性的資料。RFHV/KSHV亞族的其它成員RFHV和KSHV是RFHV/KSHV亞族成員的例子。本發(fā)明包含編碼如本文所限定的亞族其它成員DNA聚合酶的多核苷酸序列。我們希望能鑒定和描述此亞族的其它成員，包括能感染包括人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的那些成員。一個(gè)這類成員是感染猴的另一個(gè)病毒，它被稱為RFHV2。如實(shí)施例11所述，從得獼猴的RF組織中克隆了此病毒DNA聚合酶編碼序列的區(qū)段。為了鑒定和描述此家族中的其它成員，對(duì)提取自懷疑被這種病毒感染的組織樣品的DNA使用本發(fā)明的試劑和方法。適當(dāng)?shù)膩?lái)源包括得自在人和其它脊椎動(dòng)物中出現(xiàn)的廣范圍疾病的生物樣品。優(yōu)選疾病中的因子與γ皰疹病毒亞族的其它成員相似，被懷疑是嗜淋巴細(xì)胞的；例如非EBV來(lái)源的感染性單核細(xì)胞增多。更優(yōu)選的疾病在至少一個(gè)臨床或組織學(xué)特征上類似于與RFHV或KSHV相關(guān)之疾病。這些疾病包括a)纖維增殖是疾病病理學(xué)一部分的疾病，尤其是與膠原沉積相關(guān)的疾病，和尤其是纖維組織被打亂的疾??；b)涉及血管發(fā)育異常的疾??；c)涉及惡性轉(zhuǎn)化的疾病，特別是但不限于淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞；d)隱伏的免疫缺損影響疾病的頻率或嚴(yán)重性的疾??；e)在器官的各個(gè)位點(diǎn)或在全身自發(fā)產(chǎn)生的疾??；f)其流行病學(xué)的資料暗示與傳染性或環(huán)境因子相關(guān)的疾病。相對(duì)而言更優(yōu)選滿足不止一個(gè)上述標(biāo)準(zhǔn)的疾病。特別優(yōu)選的一些疾病的例子包括腹膜后纖維變性，小結(jié)狀纖維瘤病，假肉瘤纖維瘤病，纖維肉瘤，硬化腸系膜炎，急性呼吸病綜合征，自發(fā)性肺纖維變性，不同類型的擴(kuò)散增殖性腎小球腎炎，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)增生和所有類型的白血病和淋巴瘤。鑒定RFHV/KSHV亞族之成員的方法優(yōu)選包括或單獨(dú)地或聯(lián)合地使用本發(fā)明提供的方法和試劑。一個(gè)方法涉及擴(kuò)增和/或鑒定樣品中編碼DNA聚合酶的多核苷酸。例如可通過(guò)使用如表6所列的那些RFHV/KSHV亞族特異性的寡核苷酸作為反應(yīng)中的引物在如PCR的反應(yīng)中擴(kuò)增多核苷酸來(lái)實(shí)施此方法。經(jīng)擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物的存在表明樣品中存在有得自RFHV/KSHV亞族之成員的多核苷酸。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)奶结槍?duì)樣品中的多核苷酸進(jìn)行雜交試驗(yàn)也可鑒定亞族的成員。在例如通過(guò)使用表4或表6中所列的寡核苷酸在PCR中進(jìn)行雜交試驗(yàn)以前，任選擴(kuò)增欲被檢測(cè)的多核苷酸。優(yōu)選的雜交試驗(yàn)探針包括表6的寡核苷酸，其它優(yōu)選的探針是編碼RFHV或KSHV之DNA聚合酶的16個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸的多核苷酸片段，優(yōu)選SEQ.IDNO1或SEQ.IDNO3中所含的那些。在最不嚴(yán)緊的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，其中探針不與含有SEQ.IDNO23至29中任一個(gè)的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋，而與含有SEQ.IDNO1的多核苷酸或含有SEQ.IDNO3的多核苷酸，優(yōu)選它們中的任一個(gè)形成穩(wěn)定的雙螺旋。在這些條件下與受試多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋表明在樣品中有得自RFHV/KSHV亞族之成員的多核苷酸存在。也可以使用特異性的試劑抗體鑒定亞族的成員，所述抗體能與由亞族成員產(chǎn)生的抗原交叉反應(yīng)，但不與其它抗原，包括由非亞族成員的皰疹病毒產(chǎn)生的那些抗原交叉反應(yīng)。產(chǎn)生這種抗體的方法在前文已有概述。通過(guò)例如在對(duì)制備自患有上文所列疾病之個(gè)體的組織切片進(jìn)行免疫組化研究中使用抗體可進(jìn)行檢測(cè)。組織切片被抗體正染色表明樣品中存在RFHV/KSHV亞族之成員的DNA聚合酶，這可能是由于組織已被病毒感染。類似地，如果在個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)抗體能與RFHV或KSHV抗原交叉反應(yīng)，但不與其它皰疹病毒抗原交叉反應(yīng)，這表明個(gè)體已經(jīng)被RFHV/KSHV亞族的成員現(xiàn)時(shí)或既往感染。一旦懷疑生物樣品中存在RFHV/KSHV亞族的成員，就需要得到相應(yīng)于圖1核苷酸330-501的DNA聚合酶基因片段。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定片段的序列以確定病毒是否是本文所限定的RFHV/KSHV亞族的bonefide成員。下文實(shí)施例11和12中提供了鑒定RFHV/KSHV亞族之成員的優(yōu)選方法。一旦已鑒定出RFHV/KSHV亞族的新成員，本發(fā)明的其它實(shí)施方案將致力于檢測(cè)、診斷和藥物開(kāi)發(fā)的目的。使它們適于新亞族成員的變化如果是必需的，則希望此變化較小，并且根據(jù)新的序列資料是顯而易見(jiàn)的，或者可以常規(guī)調(diào)節(jié)。RFHV/KSHV亞族之DNA聚合酶的變化形式本發(fā)明也包括RFHV/KSHV亞族之DNA聚合酶的變化形式，如上文所描述，對(duì)其它皰疹病毒的DNA聚合酶所作的研究有助于精確定位涉及底物結(jié)合，聚合酶活性或藥物抗性之分子的活性區(qū)域和殘基。已描述的一些殘基出現(xiàn)在聚合酶分子的保守區(qū)域，并且在RFHV，KSHV和它們最初被描述的病毒之間，這些殘基是相同的。用類似的方法，RFHV/KSHV亞族DNA聚合酶的相同殘基的突變有望具有類似的效果表9中殘基的編號(hào)開(kāi)始于由圖1所示的KSHV整個(gè)DNA聚合酶多核苷酸片段編碼的第一個(gè)氨基酸(即SEQ.IDNO4的第一個(gè)氨基酸)。據(jù)信DNA聚合酶活性對(duì)于皰疹病毒的復(fù)制是必需的。因此表9所列的預(yù)期損害DNA聚合酶活性的突變可用于產(chǎn)生各個(gè)病毒的減毒形式。其它突變可以增加或降低RFHV或KSHV聚合酶對(duì)抗病毒藥物的抗體。皰疹病毒，尤其是它的減毒形式可用于開(kāi)發(fā)以治療為目的的病毒載體(Johnson等人，Ward等人)。一種這類用途是開(kāi)發(fā)多價(jià)疫苗。特別是在發(fā)展中國(guó)家需要提供能刺激免疫系統(tǒng)同時(shí)抗幾種潛在的病原體的預(yù)防性疫苗。經(jīng)遺傳工程改造可表達(dá)幾種不同病原體的免疫原性肽的疫苗可實(shí)現(xiàn)此目的。由于皰疹病毒大的基因組可輕易容納幾千個(gè)堿基的編碼肽的額外DNA，因此皰疹病毒是特別合適的載體。理想的情況是病毒載體足夠完整以表現(xiàn)出一些生物活性并吸引宿主免疫系統(tǒng)的注意，而同時(shí)又被充分減毒以免引起顯著的病理狀況。因此，RFHV/KSHV亞族的減毒病毒可用作抗類似毒性形式的疫苗，并且可以被修飾以表達(dá)另外的肽和拓寬免疫保護(hù)的范圍。皰疹病毒減毒形式的另一用途是作為基因療法的傳遞載體(Latchman等人，Glorioso等人)。為了有效，基因療法中的多核苷酸必須被傳遞到靶組織部位。在治療纖維性疾病，惡性腫瘤和相關(guān)疾病的過(guò)程中，由于RFHV/KSHV亞族的減毒病毒載體具有靶向受感染組織的能力，故優(yōu)于其它靶向作用機(jī)理，包括其它皰疹病毒。在此實(shí)施方案中，病毒先被減毒，然后被修飾以含有基因療法所需的多核苷酸，如前文所概述的那些。前文描述特別地提供了有關(guān)皰疹病毒的DNA聚合酶編碼區(qū)如何被鑒定和它們的序列如何被得到的詳細(xì)解釋。提供了RFHV和KSHVDNA聚合酶基因區(qū)域的多核苷酸序列。據(jù)信所提供的多核苷酸序列是用于此研究之組織樣品中皰疹病毒多核苷酸所含序列的精確復(fù)本。然而據(jù)認(rèn)為由如PCR的擴(kuò)增方法得到的序列可能由于擴(kuò)增而在序列中含有偶然的錯(cuò)誤。對(duì)于單次測(cè)定而言，估計(jì)錯(cuò)誤率在約0.44％至0.75％之間；對(duì)于總共n個(gè)不同的測(cè)定而言，錯(cuò)誤率約為相同的頻率被√(n-1)除。不過(guò)，錯(cuò)誤率可能高至2％或更高。通過(guò)制備皰疹病毒多核苷酸序列文庫(kù)，使用如表7所提供的那些寡核苷酸選擇相關(guān)克隆，并測(cè)定選定克隆中DNA的序列即可得到?jīng)]有擴(kuò)增錯(cuò)誤的序列。相關(guān)的方法學(xué)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，例見(jiàn)實(shí)施例9。據(jù)認(rèn)為出現(xiàn)了皰疹病毒的等位變體和逃逸變體，在不違背本發(fā)明精神的前提下，可分離或得到摻入突變的多核苷酸和多肽，所述突變或者為自然產(chǎn)生，或者為偶然地或故意地誘導(dǎo)產(chǎn)生。提供下文所示實(shí)施例是為了進(jìn)一步指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1皰疹病毒DNA聚合酶的寡核苷酸引物已知的皰疹病毒DNA聚合酶的氨基酸序列得自PIR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，或衍生自得自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的DNA序列，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的排列程序和通過(guò)手工排列序列。幾個(gè)保守的區(qū)域顯而易見(jiàn)。選擇三個(gè)最高度保守的區(qū)域以設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。選定的區(qū)域在圖2中被表示為REGION1，REGION2和REGION3。已鑒定出氨基酸序列的適當(dāng)保守的區(qū)域，使用這些區(qū)域的DNA序列來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸引物。引物被設(shè)計(jì)成在3′末端具有12-14堿基對(duì)的簡(jiǎn)并片段，在5′末端具有18-30堿基對(duì)的共有區(qū)段。這可以提供具有最適敏感性和特異性的引物。簡(jiǎn)并區(qū)段延伸跨越了皰疹病毒DNA聚合酶序列的最高度保守的區(qū)域，該區(qū)域包含最少數(shù)目的可替換密碼子。因此引物可以在簡(jiǎn)并位置用可替換的核苷酸殘基合成并產(chǎn)生最少數(shù)目的組合。所得到的每個(gè)引物有不超過(guò)256個(gè)的可替換形式。共有區(qū)段衍生自DNA聚合酶序列的相應(yīng)側(cè)翼區(qū)域。通常，通過(guò)選擇被分析的所有DNA聚合酶序列的每個(gè)位置處最經(jīng)常出現(xiàn)的核苷酸可得到共有區(qū)段。然而，更傾向于選擇C或G核苷酸以使引物形成穩(wěn)定雙螺旋的能力最大化。結(jié)果示于圖3-5，并概括于表4。圖3表示REGION2附近的已知皰疹病毒DNA聚合酶基因的DNA序列。使用這些序列設(shè)計(jì)如圖所示的寡核苷酸DFASA和DFQSA。在PCR中，通過(guò)與編碼鏈的反義鏈雜交，并在與DNA聚合酶編碼序列的相同方向上起動(dòng)聚合可將這些寡核苷酸用作引物。圖4表示RFGION3附近的DNA序列，由此設(shè)計(jì)了寡核苷酸VYGA，VYGCA和VYGSQA以在5′方向上起動(dòng)聚合。圖5表示REGION3附近的DNA序列，由此設(shè)計(jì)了寡核苷酸GDTD1B和GDTDSQB。這些寡核苷酸會(huì)與編碼鏈雜交并在與DNA聚合酶編碼序列相反的方向上起動(dòng)聚合。根據(jù)設(shè)計(jì)好的序列的合成寡核苷酸訂購(gòu)自O(shè)ligoEtc，Inc。實(shí)施例2DNA提取活組織檢查的樣本得自被診斷為患AIDS的人受試者的卡波濟(jì)氏肉瘤損害，樣本也可得自華盛頓大學(xué)地區(qū)靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中心的豚尾猴，食蟹猴，和日本猴群體的腹膜后纖維瘤病損害。樣本被固定于低聚甲醛中并包埋于石蠟中，如此進(jìn)行以供正常的組織學(xué)檢查。在1.5ml的EPPENDORFTM圓錐形離心管中用500μl的二甲苯提取石蠟樣品的片段。在室溫下將樣品緩慢搖晃5分鐘，將試管置于EPPENDORFTM臺(tái)式離心機(jī)中，以14,000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。用巴氏吸管除去二甲苯后，加入500μl95％的乙醇，重新懸浮樣品，然后再離心。除去乙醇，重復(fù)洗滌步驟。再將樣品自然干燥約1小時(shí)，加入500μl蛋白酶-K緩沖液(0.5％TWEENTM20，一種去污劑；50mMTris緩沖液，pH7.5，50mMNaCl)和5μl蛋白酶K(20mg/ml)，將樣品在55℃下保溫3小時(shí)。通過(guò)在95℃下保溫10分鐘使蛋白酶K失活。實(shí)施例3得到RFHV和KSHVDNA聚合酶的經(jīng)擴(kuò)增區(qū)段根據(jù)下述方法，使用實(shí)施例1中得到的寡核苷酸擴(kuò)增實(shí)施例2中提取的DNA。使用1μlDNA模板，1μl寡核苷酸DFASA(50pmol/μl)，1μl寡核苷酸GDTD1B(50pmol/μl)，10μl10×WB4緩沖液(0.67MTris緩沖液，pH8.8，40mMMgCl2，0.16M(NH4)2SO4，0.1Mβ巰基乙醇，1mg/ml牛血清白蛋白)，1μl含有2.5mM的各種脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)，66μl蒸餾水和50μl礦物油進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)。在Perkin-Elmer(Model480)PCR儀中將混合物加熱至75℃。再加入0.5μlTaq聚合酶(BRL，5U/μl)和19。5μl水。以下列順序進(jìn)行35次擴(kuò)增循環(huán)94℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃1分鐘。按下述進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)在前一步驟的1μl反應(yīng)混合物中加入10μl9-10×WB4緩沖液，1μldNTPs，0.5μlTaq聚合酶，86.5μl水和50μl礦物油。將混合物加熱至75℃，加入1μl寡核苷酸VYGA(50pmol/μl)和寡核苷酸GDTD1B(50pmol/μl)中的每一種。如上進(jìn)行35次擴(kuò)增循環(huán)。實(shí)施例4236個(gè)堿基之片段的序列通過(guò)在2％的瓊脂糖凝膠上電泳純化每份樣品的最終擴(kuò)增混合物的等分試樣。在所用的9只豚尾猴和1只食蟹猴樣品中，4只豚尾猴樣品產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物也可得自人樣品。用溴化乙錠將瓊脂糖凝膠染色，并使用紫外燈觀察DNA。將正確大小的帶洗脫在DEAE紙上。將提取的每個(gè)多核苷酸連接到PGEM-TTM載體上并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(大腸桿菌JM-109)。挑選并培養(yǎng)含有經(jīng)擴(kuò)增之DNA的細(xì)菌克隆。裂解細(xì)菌，并接著使用酚-氯仿通過(guò)乙醇沉淀來(lái)提取DNA。通過(guò)使用M13正向和反向引物的Sanger&amp;Nicholson雙脫氧核苷酸法進(jìn)行測(cè)序。引物雜交區(qū)域之間的片段長(zhǎng)度為172個(gè)堿基對(duì)。對(duì)于所用的4只豚尾猴樣品都產(chǎn)生了相同的序列資料。RFHV和KSHV之間的片段大約有70％的殘基相同。與最密切相關(guān)的皰疹病毒家族已知序列相比，序列之間的差異沿著此片段整個(gè)長(zhǎng)度分布。在此片段的任何兩個(gè)序列之間相同的最長(zhǎng)一段連串核苷酸是11個(gè)。RFHV和KSHV之間由此片段編碼的多肽有81％相同。其中前24個(gè)殘基100％相同，前31個(gè)殘基97％相同。RFHV或KSHV和其它已知的皰疹病毒DNA聚合酶中的任一個(gè)之間，此片段中相同的最長(zhǎng)一段連串氨基酸是10個(gè)。實(shí)施例5RFHV和KSHV特異性擴(kuò)增試驗(yàn)根據(jù)RFHV和KSHVDNA聚合酶之多核苷酸片段的序列制備四種寡核苷酸以用于嵌套病毒-特異性擴(kuò)增反應(yīng)。引物VASGA，ILPCA，PIEAB和PEARB是以RFHV序列為基礎(chǔ)的；引物SGILA，CLNIA，LEASB，和EARFB是以KSHV序列為基礎(chǔ)的(表7)。按下述使用RFHV引物擴(kuò)增得自獼猴PBL的DNA樣品。從出生于華盛頓大學(xué)之猴群體的20只豚尾猴體內(nèi)收集未凝結(jié)的全血樣品。30個(gè)血液樣品得自在野外捕獲的豚尾猴。沒(méi)有一只動(dòng)物具有明顯的纖維瘤病癥狀。通過(guò)離心分離血漿和血細(xì)胞，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的血液分離技術(shù)，通過(guò)密度梯度離心細(xì)胞以制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)。根據(jù)實(shí)施例2中的方法從細(xì)胞中提取DNA。再先使用引物VASGA和PEARB，后使用引物ILPCA和PIEAB以擴(kuò)增DNA。擴(kuò)增的條件與實(shí)施例3中的類似。在瓊脂糖凝膠上電泳反應(yīng)產(chǎn)物，用溴化乙錠染色并在紫外燈下檢查。當(dāng)在重復(fù)試驗(yàn)中和在避免PCR反應(yīng)產(chǎn)物交叉污染的條件下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，此試驗(yàn)中沒(méi)有一個(gè)無(wú)RF癥狀的猴被發(fā)現(xiàn)在其外周血中有可測(cè)水平的編碼DNA聚合酶的RFHV多核苷酸。也可通過(guò)免疫組織學(xué)技術(shù)檢查PBMC以進(jìn)一步證實(shí)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物和RFHV抗原血癥之間的相關(guān)性。將PBMC涂布在顯微鏡的載玻片上，并用50％甲醇，20％丙酮和30％水的混合物固定PBMC。用初級(jí)血清覆蓋之，洗滌，用FITC-(兔抗-猴IgG)(NordicLabs)覆蓋，再次洗滌，然后通過(guò)熒光顯微鏡檢查?？蓮娘@示出陽(yáng)性RFHV擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果的猴體內(nèi)得到含抗體的血清，或者也可從經(jīng)RFHV或RFHV提取物免疫接種的動(dòng)物體內(nèi)得到含抗體的血清?？蓪⒌米跃哂嘘幮越Y(jié)果之猴的血清用作對(duì)照。由于RFHV抗原成分的抗原血癥，在擴(kuò)增試驗(yàn)中顯示出陽(yáng)性結(jié)果之動(dòng)物的PBMC也顯示出陽(yáng)性的免疫組織學(xué)結(jié)果。為了對(duì)KSHV進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，可從懷疑攜有病毒的組織中提取DNA；特別是從具有卡波濟(jì)氏肉瘤損害和體腔B-細(xì)胞淋巴瘤之人受試者的活組織檢查樣品中提取DNA。分兩個(gè)階段擴(kuò)增DNA，第一階段中使用引物SGILA和EARFB，第二階段中使用引物CLNIA和IEASB。如上文所述，經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)，反應(yīng)產(chǎn)物中充足的多核苷酸的存在表示陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例6RFHV和KSHVDNA聚合酶的上游序列將與實(shí)施例3所用相類似的卡波濟(jì)氏肉瘤組織的DNA用于另外的擴(kuò)增反應(yīng)中以得到編碼KSHVDNA聚合酶之基因的較長(zhǎng)片段。如實(shí)施例3所述，使用寡核苷酸DFASA和GDTD1B作為第一階段擴(kuò)增反應(yīng)的引物，在瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物。從已知的sHV1和EBV序列估計(jì)出從DFASA到GDTD1B的片段大小(現(xiàn)在已經(jīng)知道為536個(gè)堿基長(zhǎng))，從凝膠中回收相應(yīng)的帶。使用相同引物對(duì)提取到的多核苷酸進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。如實(shí)施例4所述將產(chǎn)物克隆到大腸桿菌中。從提取自組織的DNA的三個(gè)不同擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定含有適當(dāng)插入物的克隆。使用載體特異性寡核苷酸(M13正向和反向引物)從兩端測(cè)定克隆插入物的序列。對(duì)于所有三個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物而言，測(cè)定從5′端開(kāi)始的約160個(gè)核苷酸(包括DFASA雜交區(qū)域)和從3′端開(kāi)始的約233個(gè)核苷酸(包括GDTD1B雜交區(qū)域)的序列。在三個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的一個(gè)中測(cè)定最靠近片段中間部分的序列。適當(dāng)時(shí)，通過(guò)聯(lián)合三個(gè)測(cè)定的結(jié)果和實(shí)施例4的結(jié)果可得到片段的共有序列。與實(shí)施例4中測(cè)定的RFHVDNA聚合酶片段的序列相比較的數(shù)據(jù)示于圖1。兩個(gè)序列都是從引物DFASA的第一個(gè)位置開(kāi)始編號(hào)的。對(duì)應(yīng)于DFASA和GDTD1B之雜交位點(diǎn)的每個(gè)序列的區(qū)域可能不能準(zhǔn)確地反映靶序列。據(jù)信引物之間的片段代表被用來(lái)擴(kuò)增用于測(cè)序的多核苷酸的DNA。然而，在擴(kuò)增過(guò)程中可能已引入偶發(fā)性的錯(cuò)誤。假定KSHV的共有序列準(zhǔn)確反映了提取自組織的DNA的序列，則不包括與引物雜交的區(qū)域，在往5′末端的方向上，每一擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列中約有0.75％的錯(cuò)誤率，而在往3′末端的方向上序列中約有0.44％的錯(cuò)誤率。為了得到相應(yīng)的RFHV多核苷酸序列，首先使用廣特異性的DNA聚合酶引物DFASA與RFHV特異性引物PEARB的聯(lián)合擴(kuò)增得自獼猴冷凍RF組織之DNA，再通過(guò)使用DFASA與RFHV特異性引物PIEAB的聯(lián)合擴(kuò)增上述DNA。過(guò)程如下將5μlDNA模板與1μl各種引物(50pmol/μl)，10μl10×WB4緩沖液，1μl2.5mMdNTP，59-65μl水和60μl礦物油相混合。升高溫度至60℃，加入Taq聚合酶(0.5μl酶用水稀釋至20μl)，以94℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃1分鐘將DNA擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。在2μl擴(kuò)增產(chǎn)物中加入10μl10×WB4緩沖液，1μl2.5mMdNTP，66.5μl水，0.5μlTaq聚合酶和60μl礦物油。升高溫度至60℃，再加入1μlPIEAB(50pmol/μl)，2μlDFASA(50pmol/μl)和18μl水的混合物，按前述進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)。最后進(jìn)行第三輪擴(kuò)增以引入放射性標(biāo)記，用γ32P-ATP末端標(biāo)記寡核苷酸PIEAB，在1μl經(jīng)標(biāo)記的PIEAB中加入20μl得自上述擴(kuò)增步驟的反應(yīng)混合物以及1μl2.5mMdNTP和1μlTaq聚合酶，按上述方法進(jìn)行94℃，55℃和72℃的5個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。在6％聚丙烯酰胺測(cè)序凝膠上電泳經(jīng)放射性標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物的等分試樣，通過(guò)放射自顯影術(shù)鑒定正確大小的帶(通過(guò)與KSHV序列類似的方法預(yù)測(cè))，并從干燥的凝膠上切下正確大小的帶。通過(guò)在50μl水中保溫洗脫DNA。使用2μl洗脫下的DNA，10μl10×WB4緩沖液，1μl2.5mMdNTP，1μlPIEAB(50pmol/μl)，1μlDFASA(50pmol/μl)，0.5μlTaq聚合酶和84.5μl水進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增反應(yīng)，以95℃30秒，60℃30秒和72℃65秒進(jìn)行35次擴(kuò)增循環(huán)。使用QUIAEXTM凝膠提取試劑盒分離經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物，將DNA克隆到PGTMTM-t載體中。用DNA轉(zhuǎn)化JM-109細(xì)胞，分離含有插入物的菌落，使用含有正確大小之插入物的菌落以得到用于測(cè)序的DNA。將這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)施例4中的數(shù)據(jù)相聯(lián)合可提供對(duì)應(yīng)于RFHV和KSHVDNA聚合酶基因的536個(gè)堿基對(duì)的序列。忽略最外周的引物雜交區(qū)域，已測(cè)定了RFHV和KSHV每個(gè)序列的475個(gè)堿基對(duì)。與其它被測(cè)序的γ皰疹病毒DNA聚合酶基因的相應(yīng)區(qū)域相比較的這些序列列于圖6。RFHV序列和任何其它病毒之間相同的最長(zhǎng)區(qū)域是與eHV2共用的第一個(gè)20個(gè)堿基對(duì)的亞片段(SEQ.IDNO110)和第二個(gè)20個(gè)堿基對(duì)的片段(SEQ.IDNO111)。圖7表示相應(yīng)被編碼的多肽序列。在RFHV和eHV2的DNA聚合酶之間共用的SEQIDNO2中間附近有一個(gè)約31個(gè)殘基的線性序列。此共用序列被單獨(dú)列于SEQ.IDNO112。在RFHV和sHV1之間的相同區(qū)域有一個(gè)共用的26個(gè)氨基酸的序列，在RFHV和EBV之間有兩個(gè)共用的12個(gè)氨基酸的序列。這些同源性區(qū)域圖在其它皰疹病毒DNA聚合酶序列保守的REGION3附近(圖2)。KSHV和其它γ皰疹病毒之間的第二個(gè)共用序列出現(xiàn)在SEQ.IDNO4的起點(diǎn)附近。此序列圖在其它皰疹病毒DNA聚合酶序列保守的REGION2附近，KSHV和其它γ皰疹病毒之間共用的此序列片段單獨(dú)列于SEQ.IDNO113。圖8提供了橫跨不同皰疹病毒范圍的對(duì)應(yīng)于由本文得到的RFHV和KSHV的475個(gè)堿基對(duì)序列編碼之序列的蛋白質(zhì)序列間的比較。如圖9所示，序列之間的同一性水平可被用于構(gòu)建DNA聚合酶之間的關(guān)系圖。種之間的關(guān)系可反映多肽之間和編碼它們的生物體之間相對(duì)的祖先關(guān)系?；诖朔治?，RFHV和KSHV暫時(shí)被排在皰疹病毒的γ亞族之列，此亞族中還包括eHV2，sHV1和EBV，在此基礎(chǔ)上RFHV/KSHV亞族的其它病毒也可以被列于皰疹病毒γ亞族。實(shí)施例7RFHV/KSHV亞族的寡核苷酸引物和探針基于得自RFHV和KSHV的475個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸片段序列，設(shè)計(jì)出5個(gè)寡核苷酸，它們可以被RFHV/KSHV亞族成員用作PCR引物或雜交探針。這些寡核苷酸被稱作LSGGA，CTDPA，PCLNA，KMLEA和GISPA。圖10中顯示出這些寡核苷酸以及它們的來(lái)源序列。與實(shí)施例1中的寡核苷酸相似，它們?cè)谕?′末端的方向上具有共有區(qū)段，在往3′末端的方向上具有簡(jiǎn)并區(qū)段。然而，這些寡核苷酸僅以RFHV和KSHV序列為基礎(chǔ)，因此優(yōu)先與RFHV/KSHV亞族的DNA聚合酶形成穩(wěn)定的雙螺旋。在允許它們與RFHV或KSHV編碼多核苷酸片段形成穩(wěn)定雙螺旋雜交的條件下，與或單獨(dú)或聯(lián)合的RFHV或KSHV序列的等長(zhǎng)多核苷酸相比，它們預(yù)期與更多的RFHV/KSHV亞族成員形成穩(wěn)定的雙螺旋。兩個(gè)寡核苷酸的方向相同。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，這些寡核苷酸中的一個(gè)或另一個(gè)可以與具有相反方向的引物，如GDTD1B聯(lián)合用作引物。實(shí)施例8RFHV和KSHVDNA聚合酶的抗原性和免疫原性區(qū)域基于RFHV和KSHVDNA聚合酶編碼區(qū)域的475個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸序列，可以預(yù)測(cè)對(duì)于每個(gè)病毒而言蛋白質(zhì)上的什么位點(diǎn)是獨(dú)特的，因此構(gòu)成了潛在的結(jié)合病毒特異性抗體的位點(diǎn)。圖7表示6或7個(gè)氨基酸的肽的例子。與相應(yīng)的γ皰疹病毒肽相比，一些肽含有或者對(duì)RFHV或KSHV而言(III類)或者對(duì)RFHV/KSHV亞族而言(II類)為獨(dú)特的一個(gè)或多個(gè)殘基。這些肽已列入前文表8。圖7和表8中氨基酸殘基的編號(hào)都開(kāi)始于在VYGA引物的雜交位點(diǎn)之后編碼的第一個(gè)氨基酸(圖1的核苷酸331處)。為了進(jìn)一步證實(shí)DNA聚合酶的這一57個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)所含區(qū)域可以被抗體識(shí)別，可進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析以產(chǎn)生Hopp和Wooks抗原性作圖。Hopp和Woods測(cè)定法部分地基于連串氨基酸殘基的親水性和疏水性(Hopp等人)。結(jié)果示于圖11和圖12。RFHV的編號(hào)開(kāi)始于在VYGA引物之后編碼的第一個(gè)氨基酸(如圖7)。圖12中KSHV多肽殘基的編號(hào)開(kāi)始于DFASA引物的雜交位點(diǎn)之后編碼的第一個(gè)氨基酸(圖1的核苷酸28處)。RFHV和KSHV都含有經(jīng)預(yù)測(cè)可能是抗體靶位點(diǎn)的幾個(gè)區(qū)域。例如，沿著RFHV的氨基酸序列出現(xiàn)了幾個(gè)疏水的和抗原性的小段序列。KSHV從殘基26，44，52，121和151開(kāi)始出現(xiàn)了疏水性的小段序列；從殘基8，37，45和94開(kāi)始出現(xiàn)了抗原性的小段序列。尤其是對(duì)應(yīng)于一些這些區(qū)域的圖7的肽是抗原性的。實(shí)施例9測(cè)定RFHV和KSHVDNA聚合酶完整編碼區(qū)的序列已經(jīng)得到KSHVDNA聚合酶編碼區(qū)域中實(shí)施例6所述區(qū)段5′和3′方向上的另外的序列資料。根據(jù)實(shí)施例2中的方法，使用被稱作K-12和K-15的兩個(gè)卡波濟(jì)氏肉瘤樣品來(lái)制備DNA。設(shè)計(jì)另外的Type1寡核苷酸引物以同已得到的KSHV序列側(cè)翼的皰疹病毒DNA聚合酶核酸序列雜交，例子列于表10</tables>按下述進(jìn)行PCR擴(kuò)增首先在下述條件下于總體積為50μl的反應(yīng)緩沖液中擴(kuò)增得自每個(gè)樣品的100ngDNA1×PCR緩沖液(67mMTris緩沖液，pH8.8，16mM(NH4)2SO4，10mMβ-巰基乙醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白)，20mMMgCl2，50pmol每種寡核苷酸CVN1A和FDIEClB，100μM(每種)dATP，dCTP，dGTP，dTTP，1.25單位的TaqDNA聚合酶(AMPLITAQTM，Perkin-ElmerCetus)。以95℃30秒；50℃30秒和72℃30秒進(jìn)行45次擴(kuò)增循環(huán)，在2％瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物，并通過(guò)溴化乙錠染色觀察。使用QLAQUICKSPINTMPCR純化試劑盒(Qiagen，ChatsworthCA)純化PCR產(chǎn)物。將產(chǎn)物克隆至PT7BLUE載體(Novagen，MadisonWI)中。使用QUIAGENSPINTM質(zhì)粒微量制備試劑盒純化質(zhì)粒，使用ABI自動(dòng)測(cè)序方法，使用M13正向和反向引物測(cè)定經(jīng)純化之質(zhì)粒的序列。從K-12和K-15的每一種中測(cè)定5個(gè)克隆的序列。被稱為BC-1和BC-2的兩個(gè)體腔淋巴瘤細(xì)胞系被用作下游序列測(cè)定的DNA來(lái)源。用PBS洗滌每一細(xì)胞系中的5×105個(gè)細(xì)胞，并分開(kāi)沉淀之。在每份沉淀物中加入蛋白酶-K緩沖液并在65℃下保溫1小時(shí)。用1∶1(vol∶vol)的酚∶氯仿將DNA抽提兩次，用乙醇沉淀并洗滌，并重新懸浮于10mMTris緩沖液，pH8.0中。在總體積為100μl的1×PCR緩沖液中，同時(shí)使用大約0.5μg來(lái)自BC-1和BC-2細(xì)胞系的總基因組DNA以及25pmol寡核苷酸引物CVNVA和EARFB，2.5單位的TaqDNA聚合酶(BoehringerMannheim)，250μMdNTP和4mMMgCl2。在加入Taq聚合酶之前，在70℃下“熱啟動(dòng)”1分鐘以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行94℃45秒，60℃45秒和72℃90秒的35次擴(kuò)增循環(huán)。在2％瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物并通過(guò)溴化乙錠染色觀察。按上述方法純化PCR產(chǎn)物并克隆到PT7BLUE載體中。使用ABI自動(dòng)測(cè)序方法測(cè)定經(jīng)純化質(zhì)粒的序列，該方法使用了KSHV序列的特異性引物RDSWA，F(xiàn)DCSA，YSTLB和DYETB。對(duì)單個(gè)排列開(kāi)放閱讀框使用GenePro算法分析DNA序列。對(duì)于多重排列使用Clustalw算法確定共有序列。所得核苷酸序列(SEQ.IDNO116)與其編碼的氨基酸序列(SEQ.IDNO117)一起示于圖13。總共顯示出2511個(gè)核苷酸，其中開(kāi)始的35個(gè)對(duì)應(yīng)于CVNVA引物，最后的12個(gè)對(duì)應(yīng)于YFDKB引物。對(duì)應(yīng)于SEQ.IDNO117之氨基酸13至833的SEQ.IDNO116的堿基36至2499表示KSHVDNA聚合酶的序列。KSHVDNA聚合酶的部分氨基酸序列與其它皰疹病毒之序列的對(duì)比示于圖14。用星號(hào)(*)標(biāo)記的殘基在所有示出的序列中是相同的。以圓點(diǎn)(·)標(biāo)記的殘基表示保守的氨基酸取代。用箭頭(↑)標(biāo)記的殘基是令人感興趣的，因?yàn)樵谄渌捳畈《局g它們是保守的，但在KSHV中卻是不同的。這些殘基中的一個(gè)是在KSHV中為組氨酸，而在其它病毒中相同位置卻是天冬氨酸，這是非保守性的差異。用箭頭標(biāo)記的殘基可能是特異針對(duì)KSHV或RFHV/KSHV亞族之抗體或藥物的適當(dāng)?shù)陌?。在所得的四個(gè)KSHVDNA聚合酶核苷酸序列中，在四個(gè)位置處標(biāo)出了變異。據(jù)信這些表示自然發(fā)生的等位變異。約在核苷酸319處，序列TTCTCG也可為TTTTGG，這是沉默突變(不會(huì)影響所編碼的蛋白質(zhì)序列)。約在核苷酸348處，序列AACCCG也可為AATCCG，這也是沉默突變。約在核苷酸1795處，序列CCAGTA也可為CCAATA，這表示被編碼的肽從-Pro-Val-變成了-Pro-Ile。約在核苷酸1822處，序列TTCAAG也可為TTCAGG，這表示被編碼的肽從-Phe-Lys-變成-Phe-Arg-。KSHV氨基酸序列的變體與其它皰疹病毒DNA聚合酶序列的對(duì)比示于圖15。據(jù)信KSHVDNA聚合酶核苷酸序列與其它皰疹病毒相應(yīng)序列的比較可設(shè)計(jì)表11所列的另外的Type3(病毒特異性)寡核苷酸</tables></tables>根據(jù)其它γ皰疹病毒，預(yù)測(cè)KSHVDNA聚合酶序列含有總共約3000個(gè)堿基對(duì)，在所示序列的5′和3′方向上都具有另外的核苷酸，通過(guò)進(jìn)行針對(duì)受感染組織樣品描述的方法，使用Type1寡核苷酸測(cè)定DNA聚合酶上游和下游的側(cè)翼基因序列即可測(cè)定剩余的序列?；蛘?，通過(guò)產(chǎn)生受感染組織的DNA文庫(kù)也可得到完整的DNA聚合酶序列。對(duì)于RFHV序列而言，文庫(kù)制備自由實(shí)施例5的擴(kuò)增試驗(yàn)已知含有RFHVDNA的獼猴PBMC，對(duì)于KSHV序列而言，文庫(kù)制備自卡波濟(jì)氏肉瘤損害或B細(xì)胞體腔淋巴瘤。用蛋白酶K消化DNA裂解物，使用酚-氯仿提取DNA。充分透析后，用Sau3AI限制性核酸內(nèi)切酶部分消化制品。在蔗糖梯度中離心消化物，回收約10-23千堿基的片段。通過(guò)用BamHI切割制備λDASH2TM載體噬菌體(Stratagene)。然后將選定大小的片段與載體混合，并使用DNA連接酶連接。根據(jù)廠商的指導(dǎo)，用Stratagene的包裝提取物制備經(jīng)連接的載體，將所述載體用于感染XLI-BLUETMMRA細(xì)菌。在瓊脂上以每個(gè)平板約20,000個(gè)細(xì)菌的密度涂布約200,000個(gè)被噬菌體感染的細(xì)菌。培養(yǎng)后，用硝酸纖維素覆蓋平板上的菌落，將硝酸纖維素切成片段，從片段上洗脫噬菌體，使用適當(dāng)?shù)牟《咎禺愋砸飳?duì)它們的DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在瓊脂糖凝膠上電泳反應(yīng)產(chǎn)物，并用溴化乙錠染色。從顯示出所期望之大小的經(jīng)擴(kuò)增的DNA的平板區(qū)域回收噬菌體。將回收的噬菌體用于感染新的XLI細(xì)菌并重新涂布于新鮮培養(yǎng)基上，重復(fù)此過(guò)程直至得到有限稀釋的單個(gè)克隆。然后使用限制性核酸酶作出由此方法選擇的每個(gè)克隆的圖譜以確證所摻入的片段大小。使用載體特異性引物由兩個(gè)末端測(cè)定大于完整DNA聚合酶序列的插入物的序列。將此序列與完整的EBV基因組的已知多核苷酸序列相比較以確定此片段是否跨越了完整的DNA聚合酶序列。從適當(dāng)?shù)目寺≈械玫紻NA，剪切，并通過(guò)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的鳥槍克隆測(cè)定DNA的序列。實(shí)施例10鑒定免疫原性位點(diǎn)為了鑒定在RFHV感染的自然過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生何種抗體，從如實(shí)施例5所述在用PBMC進(jìn)行的RFHVDNA聚合酶擴(kuò)增試驗(yàn)中呈現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果的10-20只獼猴體內(nèi)得到系列血清樣品。為了檢測(cè)抗KSHV的抗體，從10-20個(gè)具有卡波濟(jì)氏肉瘤損害的AIDS受試者，10-20個(gè)HIV-陽(yáng)性、癥狀-陰性的受試者和10-20個(gè)HIV-陰性對(duì)照中得到血清樣品。在最初的研究中，合并每一群體中的血清以分析抗體。適當(dāng)時(shí)可根據(jù)RFHV或KSHV序列合成12個(gè)殘基長(zhǎng)的肽。制備覆蓋了整個(gè)序列并有8個(gè)殘基重疊的順序(Sequential)肽。根據(jù)廠商指導(dǎo)使用Genosys的SPOTSTM試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)F-Moc化學(xué)法，在尼龍膜支持物上制備肽。用血清覆蓋制備出的膜，洗滌，并在適當(dāng)時(shí)用與β-半乳糖偶聯(lián)的抗-猴IgG或抗-人IgG覆蓋。加入底物X-gal以顯色，陽(yáng)性染色表明血清中存在抗相應(yīng)肽的IgG抗體反應(yīng)性。實(shí)施例11得到RFHV/KSHV亞族的其它DNA聚合酶序列按下述得到RFHV/KSHV皰疹病毒亞族第三成員的DNA聚合酶編碼序列。從患有腹膜后纖維瘤病的獼猴的兩個(gè)冷凍組織樣品中提取DNA。根據(jù)實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行提取。在40μg糖原載體存在的情況下用乙醇沉淀經(jīng)提取的DNA，用70％乙醇洗滌，并重新懸浮于10mMTris緩沖液，pH8.0中。使用三重-嵌套的PCR擴(kuò)增DNA聚合酶編碼序列的151個(gè)堿基對(duì)片段在100μl總反應(yīng)緩沖液中以下述條件首次擴(kuò)增100ng各個(gè)樣品的DNA1×PCR緩沖液(67mMTris緩沖液，pH8.8，16mM(NH4)2SO4，10mMβ-巰基乙醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白)，4mMMgCl2，25pmol每種寡核苷酸VYGA和VYGCA，和50pmol寡核苷酸GDTD1B，25μM(每種)dATP，dCTP，dGTP，dTTP，2.5單位的TaqDNA聚合酶(Boehringer-Mannheim)。在加入Taq聚合酶之前，在70℃下“熱啟動(dòng)”1分鐘以進(jìn)行擴(kuò)增，以94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒進(jìn)行42次擴(kuò)增循環(huán)。使用2μl初次PCR產(chǎn)物作為模板如前所述在50μl反應(yīng)體積中進(jìn)行第二次擴(kuò)增，但使用25pmol每種寡核苷酸PCLNA和GDTDSQB和1.25單位Taq聚合酶。如前所述使用“熱啟動(dòng)”和相同條件下的35次循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。使用2μl第二次PCR的產(chǎn)物作為模板如前所述在50μl反應(yīng)體積中進(jìn)行第三次擴(kuò)增，但使用25pmol每種寡核苷酸KMLEA和GDTDSQB和1.25單位Taq聚合酶。使用“熱啟動(dòng)”和94℃30秒，65℃30秒和72℃30秒的35次循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。在3％瓊脂糖凝膠上電泳最終的PCR產(chǎn)物，通過(guò)溴化乙錠染色觀察。使用QIAQUICKSPINTMPCR純化試劑盒(Qiagen，ChatsworthCA)純化PCR產(chǎn)物。將產(chǎn)物克隆到PC7BLUE載體中(Novagen，MadisonWI)，使用QUIAGENSPINTM質(zhì)粒微量制備試劑盒純化質(zhì)粒。用USB測(cè)序酶7-脫氮-dGTP試劑盒，使用M13正向和反向引物測(cè)定純化質(zhì)粒的序列。基于151個(gè)堿基對(duì)片段的序列，設(shè)計(jì)了兩個(gè)被稱為KVIYB和ASPDB的序列特異性(Type3)寡核苷酸。將這些寡核苷酸與Type1寡核苷酸QAHNA一起用于嵌套PCR擴(kuò)增可得到468個(gè)堿基對(duì)的片段。如前所述，通過(guò)在100μlPCR混合物中使用～1μg每種DNA樣品來(lái)進(jìn)行第一次擴(kuò)增，但50pmol的每種QAHNA和KVIYB被用作引物。使用“熱啟動(dòng)”和94℃30秒，55℃60秒和72℃60秒的35次循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。在100μl反應(yīng)體積中使用3μl初次PCR產(chǎn)物作為模板，50pmolQAHNA和ASPDB作為引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，使用“熱啟動(dòng)”和94℃30秒，60℃60秒和72℃60秒的40次循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。然后在2.5％瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物并通過(guò)溴化乙錠染色觀察。如前所述將PCR產(chǎn)物克隆到PC7BLUE載體中并測(cè)序。圖16中表示了所得的核苷酸序列命名為“RFMm”(SEQ.IDNO118)。這相當(dāng)于在本申請(qǐng)的其它地方被稱作“RFHVMm”或“RFHV2”的DNA聚合酶編碼序列。被編碼的蛋白質(zhì)序列示于圖17(SEQ.IDNO119)。RFHVMm與其它皰疹病毒的DNA聚合酶序列同一性分析示于表12</tables>使用PHYLIP分析包裝中提供的距離矩陣，鄰近值并接和自舉分析的方法進(jìn)行系統(tǒng)分析。圖18表示自舉分析的結(jié)果，所示數(shù)目為支持所示支化點(diǎn)的總分為100的分?jǐn)?shù)。此分析有力支持將RFHV/KSHV亞族與其它γ皰疹病毒分開(kāi)的支化點(diǎn)。與它們中的任一個(gè)與KSHV相比之結(jié)果相比，RFHVMm和RFHVMn相互之間更加密切相關(guān)。還分析了序列的G+C含量，結(jié)果示于表13。顯示出了使用GerePro軟件(RiversideScientific)計(jì)算出的跨越RFHVMn454bp的相應(yīng)區(qū)域的G+C百分含量。括號(hào)中的值是為已知的完整DNA聚合酶序列計(jì)算出的G+C含量。還顯示出了CpG的比率，考慮到單核苷酸組分，此比率為CpG頻率觀測(cè)值期望值的比值。</tables>KS和RF序列的G+C頻率互相之間十分類似，該值處于EBV和eHV2之高G+C含量與sHV1之低G+C含量的中間。KS和RF的CpG二核苷酸頻率十分類似，根據(jù)它們的單核苷酸組成，此值接近期望值(1.00)。相對(duì)于非RFHV/KSHV亞族的γ皰疹病毒而言，這些值更接近于α和β皰疹病毒。CpG數(shù)據(jù)表明RFHVMn，RFHVMm和KSHV基因組在未分裂的細(xì)胞中保持潛伏狀態(tài)，與之形成對(duì)照的是sHV1和EBV在增殖的成淋巴細(xì)胞中保持潛伏狀態(tài)。系統(tǒng)分析，CpG分析和由三種病毒引起的癥狀之間的相似性都支持使用猴病毒作為KSHV和可能感染人的RFHV/KSHV亞族其它成員的模型。RFHVMm-特異性Type3寡核苷酸的例子示于表14圖19是顯示本發(fā)明的某些寡核苷酸沿著DNA聚合酶的編碼序列大致相對(duì)的雜交位置圖。核苷酸殘基的編號(hào)是大致的，并基于GlycoproteinB編碼區(qū)域的起始位置，所述編碼區(qū)在DNA聚合酶編碼區(qū)的上游側(cè)翼。每個(gè)寡核苷酸名稱的后面是表示寡核苷酸類型的以小寫表示的縮寫h＝所有皰疹病毒(Type1)；sq＝可使用的另外的測(cè)序尾；g＝γ皰疹病毒(Type1)；f＝RFHV/KSHV亞族皰疹病毒(Type2)；m＝RFHVMm特異性(Type3)；n＝RFHVMn特異性(Type3)；ks＝KSHV特異性(Type3)。系統(tǒng)分析，CpG分析和由三種病毒引起的癥狀之間的相似性都支持使用猴病毒作為KSHV和可能感染人的RFHV/KSHV亞族其它成員的模型。在篩選試驗(yàn)中使用寡核苷酸引物以檢測(cè)多種生物樣品中DNA聚合酶編碼序列的存在，結(jié)果示于圖20。豚尾猴#2，#3，#4，#7，#1和#5的RF樣品結(jié)果分別示于泳道A-D，I和J。獼猴的RF樣品結(jié)果示于泳道G&amp;H。未受感染的SRV2-陰性豚尾猴的外周血淋巴細(xì)胞的結(jié)果示于泳道E&amp;F。按下述使用嵌套PCR檢測(cè)樣品對(duì)于豚尾猴樣品，外部引物是VASGA和PEARB；內(nèi)部引物是PEARB和PIEAB。對(duì)于獼猴樣品，外部引物是FVEGA和KVIYB；內(nèi)部引物是SPKDA和ASPDB。在這個(gè)和其它實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與樣品的來(lái)源有兩種方式的相關(guān)性首先，擴(kuò)增是病毒特異性的，RFHVMn特異性寡核苷酸不能擴(kuò)增來(lái)自獼猴RF損害的序列，但RFHVMm特異性寡核苷酸可以。第二，沒(méi)有RF-相關(guān)癥狀的豚尾猴樣品不產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物，甚至當(dāng)其它病毒存在時(shí)也不產(chǎn)生。被SRV-2自然感染的多種組織中都不存在RFHVMn序列，所述組織包括胸腺，骨髓，脾，唾液腺，肝臟，腸系膜淋巴結(jié)，回盲腸的接合處，十二指腸，腎臟和性腺。實(shí)施例12其它感染人的RFHV/KSHV亞族γ皰疹病毒的DNA聚合酶序列冷凍保存懷疑含有上文未曾描述過(guò)的γ皰疹病毒，尤其是纖維增殖性疾病，淋巴細(xì)胞惡性腫瘤和與免疫缺損和免疫抑制相關(guān)之疾病，如急性呼吸道疾病綜合癥(ARDS)的人組織樣品，按實(shí)施例2所述提取DNA。根據(jù)實(shí)施例3所述使用三個(gè)皰疹病毒寡核苷酸引物DFASA，VYGA和GDTD1B進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。或者也可在此實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)RFHV2時(shí)如前文所述使用亞族特異性(Type2)引物。在瓊脂糖上電泳經(jīng)擴(kuò)增的多核苷酸并印跡到尼龍膜上。將印跡與經(jīng)32P標(biāo)記的，含有得自編碼DNA聚合酶之RFHV多核苷酸的多核苷酸片段探針(圖1的殘基330-501)雜交。在允許探針和皰疹病毒DNA聚合酶之間形成穩(wěn)定的雙螺旋，但不允許探針與內(nèi)源性的真核DNA聚合酶之間形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。此條件需要探針和靶的雜交區(qū)段之間有大約60％的同一性以形成穩(wěn)定的復(fù)合物。根據(jù)探針序列和靶的相應(yīng)序列的長(zhǎng)度，使用上文給出的公式計(jì)算這些條件。估計(jì)條件如下a)允許探針在室溫下，缺乏甲酰胺時(shí)，于6×SSC(0.15MNaCl，15mM檸檬酸鈉緩沖液)中與靶雜交；和b)在室溫下用2×SSC將新形成的雙螺旋洗滌較短時(shí)間(5-10分鐘)。選擇在這些條件下與經(jīng)標(biāo)記的探針雜交的經(jīng)擴(kuò)增的多核苷酸以進(jìn)一步鑒定。對(duì)于與RFHV或KSHV相比沒(méi)有插入或缺失、已用VYGA和GDTD1B作為內(nèi)部引物進(jìn)行擴(kuò)增的病毒而言，包括引物結(jié)合區(qū)域的擴(kuò)增的內(nèi)部片段的預(yù)期大小是236堿基對(duì)。如實(shí)施例4所述測(cè)定片段的序列。通過(guò)與實(shí)施例9中相類似的方法選擇含有與RFHV或KSHV不同之片段的樣品以測(cè)定完整的DNA聚合酶基因序列。參考文獻(xiàn)Altschul等，(1986)。數(shù)學(xué)生物學(xué)通報(bào)，48603-616。Ambroziuk等，(1995)。科學(xué)，268582-583。Basco等，(1992)。生物與化學(xué)雜志，26719427-19434。Basco等，(1993)。染色體，10232-38。BerelV.等，(1990)。柳葉刀，335123-128。Bemard等，(1989)。細(xì)胞，59219-228。Bemard等，(1990)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，874610-4614。Beaucage等，(1981)。四面體通訊，221859-1862。CesamanE.等，(1995)。新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3321186-1191。ChangY.等，(1994)。科學(xué)，2661865-1869。Derbyshire等，(1991)。EMBOJ，1017-24。DigardP.等，(1995)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，921456-1460。DorskyD.I.等，(1990)。病毒學(xué)雜志，641394-1397。DorskyDI.等，(1988)。病毒學(xué)雜志，623224-3232。EmeryV.C.等，(1992)。pp.257-277見(jiàn)，AIDS機(jī)會(huì)感染的分子和細(xì)胞生物學(xué)；S.Myint&amp;A.Cann，eds，Chapman&amp;Hall.Erickson等，(1990)?？茖W(xué)249527-533。FieldsB.N.&amp;KnipeD.M.，eds.(1991)。基礎(chǔ)病毒學(xué)，第2版，RavenPress。FiresmithT.H等，(1994)。Int.J.Dematol.33755-762。GibsJ.S.等，(1988a)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，856672-6676。GibbsJ.S.等，(1988b)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，857969-7973。GiddensW.E.Jr等，(1983)。pp.249-253見(jiàn)，非人靈長(zhǎng)類的病毒和免疫性疾??；AlanR.LissInc。GloriosoJ.C.等，(1994)。Dev.Biol.Stand8279-87。HaffeyM.L.等，(1988)。病毒學(xué)雜志，624493-4498。HallJ.D.等，(1989)。核酸研究，179231-9244。Henikoff等，(1992)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，8910915-10919。Hirose等，(1978)。四面體通訊，(1978)192449-2452。Hodgson(1991)。生物/技術(shù)學(xué)，919-21。HoppT.P.等，(1981)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，783824-3828。JohnsonP.A.等，(1994)。細(xì)胞生物學(xué)方法，43A191-210。KarlinS.等，(1994)。病毒學(xué)雜志，681886-1902。KnopfC.W.等，(1988)。生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，951298-314。Kumar等，(1984)。有機(jī)化學(xué)雜志，494905-4912。LarderB.A.等，(1987)。EMBOJ.6169-175。LatchmanD.S.等，(1994)。分子生物技術(shù)，2179-195。LinL.S.等，(1995)。醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志，4599-105。LisitsynN.等，(1993)?？茖W(xué)，259946-。LiuM.Y等，(1989)。醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志，28101-105。MarcyA.I.等，(1990)。病毒學(xué)雜志，645883-5890。MartinR.W等，(1993)。醫(yī)學(xué)，72245-26。MeierJ.L.等，(1993)，病毒學(xué)雜志，677573-7581。MeinkothJ.等，(1984)。分析生物化學(xué)，138267-。MilesS.A(1994)。當(dāng)代腫瘤學(xué)論點(diǎn)，6497-502。MitsuyasuR.T.(1993)。當(dāng)代腫瘤學(xué)論點(diǎn)，5835-844。MooreP.S.等，(1995)。新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3321181-1185。Northfelt.D.W(1994)。藥學(xué)(新西蘭)，48569-582。O′DonnellM.E.等，(1987)。生物與化學(xué)雜志，2624252-4259。ReardonJ.E.等，(1989)。生物與化學(xué)雜志，2647405-7411。Simon等，(1991)。EMBOJ.102165-2171。Soengas等，(1992)。EMBOJ.114227-4237。StowN.D.(1993)。核酸研究，2187-92。TsaiC.-C.等，(1986)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，36119-124。VanDevanter等，(1996)。臨床微生物學(xué)雜志，341666-1671。WangT.S.-F.等，(1989)。FASEBJ.314-21。WardP.L.等，(1994)。遺傳學(xué)趨勢(shì)，10267-274。YeungK.C.等，(1991)。當(dāng)代眼科研究，10(Suppl.)31-37。專利和專利申請(qǐng)US4415732CaruthersM.H等(多核苷酸合成)US4444887HoffmanM.K.(方法)US4472500MilsteinC等(細(xì)胞)US4683195MullisK.B.(PCR)US4683202MullisK.B.等(PCR)US4642333PersonS.(HSVGb表達(dá))US5120639HaffeyM.L.等(藥物篩選中的AbvsPOL)US5124246UrdeaM.S等(分支的DNA)US5171568BurkeR.L.等(HSVGb/Gd疫苗)US5176995SninskyJ.J.等(病毒的PCR方法)US5223391CoenD.M.等(UTL42肽作為POL抑制劑)US5244792BurkeR.L.等(HSVGb表達(dá))US5350671HoughtonM等(HCV診斷)US5354653MatsumotoT.等(HSV菌株探針檢測(cè))US5399346AndersonW.F等(基因療法)EP0337441HaffeyM.L.(在酵母中表達(dá)HSV1POL)WO8904964FeitelsonM.等(診斷中的抗-HBVDNAPOL)JP5309000IatronLabInc(EBVPOL的PCR檢測(cè))序列表</tables></tables></tables>序列描述SEQIDNO1GTGTTCGACTTTGCTAGTCTTTACCCCAGCATCATGCAGGCACACAACCTCTGTTATTCT60ACCCTGATTACAGGAAGCGCCCTACACGGGCACCCCGAACTGACCCCCGACGACTACGAA120ACCTTCCACCTGAGCGGGGGAACGGTACACTTTGTAAAAAAGCACGTCCGCGAGTCACTA180CTGTCCAAACTGCTCACAACATGGCTGGCCAAGAGGAAAGAGATCCGCAAAAATTTAGCC240TCGTGCACAGACCCCACCATGCGCACCATACTGGATAAACAACAGCTGGCCATCAAGGTC300ACATGTAACGCGGTGTACGGGTTCACCGGCGTCGCTTCCGGCATCCTACCGTGCCTGAAC360ATCGCAGAGACGGTGACCCTCCAGGGCAGGAAAATGCTGGAAACGTCTCAGGCGTTCGTA420GAGGGAATCTCGCCAACGGCACTGGCAGACCTACTGCAGCGACCGATCGAGGCGTCTCCG480GAAGCCAGGTTTAAAGTGATATACGGCGACACCGACTCCGTGTTTGTCGCATGCCG536序列描述SEQIDNO2ValPheAspPheAlaSerLeuTyrProSerIleMetGlnAlaHisAsnLeuCysTyrSerThrLeuIleThrGlySerAlaLeuHisGlyHisProGluLeuThrProAspAspTyrGluThrPheHisLeuSerGlyGlyThrValHisPheValLysLysHisValArgGluSerLeuLeuSerLysLeuLeuThrThrTrpLeuAlaLysArgLysGluIleArgLysAsnLeuAlaSerCysThrAspProThrMetArgThrIleLeuAspLysGlnGlnLeuAlaIleLysValThrCysAsnAlaValTyrGlyPheThrGlyValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluThrSerGlnAlaPheValGluGlyIleSerProThrAlaLeuAlaAspLeuLeuGlnArgProIleGluAlaSerProGluAlaArgPheLysValIleTyrGlyAspThrAspSerValPheValAlaCys序列描述SEQIDNO3GTGTTCGACTTTGCTAGCCTCTACCCCAGTATCATCCAAGCGCACAACTTGTGCTACTCC60ACACTGATACCCGGCGATTCGCTCCACCTGCACCCACACCTCTCCCCGGACGACTACGAA120ACCTTTGTCCTCAGCGGAGGTCCGGTCCACTTTGTAAAAAAACACAAAAGGGAGTCCCTT180CTTACCAAGCTTCTGACGGTATGGCTCGCGAAGAGAAAAGAAATAAGAAAGACCCTGGCA240TCATGCACGGACCCCGCACTGAAAACTATTCTAGACAAACAACAACTGGCCATCAAGGTT300ACCTGCAACGCGGTTTACGGCTTCACGGGCGTTGCCTCTGGCATACTGCCTTGCCTAAAC360ATAGCGGAGACCGTGACACTACAAGGGCGAAAGATGCTGGAGAGATCTCAGGCCTTTGTA420GAGGCCATCTCGCCGGAACGCCTAGCGGGTCTCCTGCGGAGGCCAATAGACGTCTCACCC480GACGCCCGATTCAAGGTCATATACGGCGACACCGACTCCGTGTTTGTCGCATGCCG536序列描述SEQIDNO4ValPheAspPheAlaSerLeuTyrProSerIleIleGlnAlaHisAsnLeuCysTyrSerThrLeuIleProGlyAspSerLeuHisLeuHisProHisLeuSerProAsoAspTyrGluThrPheValLeuSerGlyGlyProValHisPheValLysLysHisLysArgGluSerLeuLeuThrLysLeuLeuThrValTrpLeuAlaLysArgLysGluIleArgLysThrLeuAlaSerCysThrAspProAlaLeuLysThrIleLeuAspLysGlnGlnLeuAlaIleLysValThrCysAshAlaValTyrGlyPheThrGlyValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluArgSerGlnAlaPheValGluAlaIleSerProGluArgLeuAlaGlyLeuLeuArgArgProIleAspValSerProAspAlaArgPheLysValIleTyrGlyAspThrAspSerValPheValAlaCys序列描述SEQIDNO5GTGTTCGACTTYGCNAGYYTNTAYCC26序列描述SEQIDNO6GTGTTCGACTTYCARAGYYTNTAYCC26序列描述SEQIDNO7ACGTGCAACGCGGTGTAYGGNKTNACNGG29序列描述SEQIDNO8ACGTGCAACGCGGTGTACGGSGTSACSGG29序列描述SEQIDNO9ACGTGCAACGCGGTGTA17序列描述SEQIDNO10TAYGGNGAYACNGACTCCGTGTTTGTCGCATGCCG35序列描述SEQIDNO11CGGCATGCGACAAACACGGAGTCNGTRTCNCCRTA35序列描述SEQIDNO12CGGCATGCGACAAACACGGA20序列描述SEQIDNO13CGTCGCTTCCGGCATCCTACC21序列描述SEQIDNO14GGCATCCTACCGTGCCTGAAC21序列描述SEQIDNO1521CCGGAGACGCCTCGATCGGTC序列描述SEQIDNO16AACCTGGCTTCCGGAGACGCC21序列描述SEQIDNO17GCGTTGCCTCTGGCATACTG20序列描述SEQIDNO18CTGCCTTGCCTAAACATAGCG21序列描述SEQIDNO19GGTGAGACGTCTATTGGCCT20序列描述SEQIDNO20AATCGGGCGTCGGGTGAGACG21序列描述SEQIDNO21GTCGCCTCTGGCATCCTNCCNTGYCTNAA29序列描述SEQIDNO22CAGGGCCGGAAGATGCTGGARACRTCNCARGC32序列描述SEQIDNO23ATGAGTTTCTACAACCCCTACTTGGTCAAGAGGACCTTTCTTAAAAAGGCCGCCCCCTCG60CGGCCGACCAAGGAATATACCAGGATAATTCCAAAATGCTTCAAGACCCCAGGCGCCGCG120GGGGTGGTGCCCCACACCAGCACCCTGGACCCGGTGTGCTTCGTGGGGGACAAGGAGACC180CCCATCCTGTACGGGGACGGGAGCAGGAGCCTGTGGAGCGCGGGTGGGCGGGGCGGGCCG240GGGACGGGCGCGGGCCAGGGCCACACGCCTGTGGCCCTGACCTTCCACGTCTATGACATA300ATAGAGACGGTGTACGGCCAGGACAGGTGCGACCACGTGCCCTTTCAGTTTCAGACGGAC360ATCATCCCCAGCGGGACGGTCCTCAAGCTGCTGGGTCGCACCTCGGACGACCGCAGCGTG420TGCGTGAACGTGTTCAGGCAGGAGCTGTACTTTTACGTGCGCGTGCCCGAGGGGCTCAAG480CTGGACTTTCTCATCCAGCAGTGCTCGCGGGAGAACTTTAACTTTAGCCAGGGCCGGTAC540CGATATGAGAAAACAAGCAAGCGCGTGTTGCGCGAGTACTGCGTCGAGGCGCGGGAGGTG600TACCGGGTGTTCGCGTCGAGCCAGGGGTTCGTGGACCTCCTGGCCGGGGGGCTCACGGCC660GCGGGGTGCGAGGTCTTCGAGACAAACGTGGACGCGGCCAGGCGGTTCATCATAGACAAC720GGGTTCTCCACCTTCGGGTGGTACTCGTGCGCGGCGGCCGTCCCGCGCCAGGGGGGGGCG780GCCAGGGACTCCTGGACGGAGTTGGAGTACGACTGCGCCGCGGGGGACCTGGAGTTTCAC840GCGGGGCGGGCGGACTGGCCGGGCTACAACGTCCTCTCCTTCGATATAGAGTGCCTGGGG900GAGAACGGGTTCCCCAACGCGAGCAGGGACGAGGACATGATCCTGCAGATCTCCTGCGTG960ATCTGGAAGGCGGGGTCGGGGGAGGCGCCCAGGAGCGTGCTCCTGAACCTGGGCACGTGC1020GAGGAGATAGAGGGGGTGGAGGTGTACCAGTGCCCCTCGGAGCTGGACCTGCTCTACCTC1080TTTTTCACCATGATCAGGGACGC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TrpValTyrArgGluGlyLeuProGluGlyPheValAAGATAATTCAAGTGCTCAACGCGAGCCACCGGGAACTGTGCGAACGC2256LysIleIleGlnValLeuAsnAlaSerHisArgGluLeuCysGluArgAGCGTACCAGTAGACAAACTGACGTTTACCACCGAGCTAAGCCGCCCG2304SerValProValAspLysLeuThrPheThrThrGluLeuSerArgProCTGGCGGACTACAAGACGCAAAACCTCCCGCACCTGACCGTGTACCAA2352LeuAlaAspTyrLysThrGlnAsnLeuProHisLeuThrValTyrGlnAAGCTACAAGCTAGACAGGAGGAGCTTGCACAGATACACGACAGAATC2400LysLeuGlnAlaArgGlnGluGluLeuProGlnIleHisAspArgIleCCCTACGTGTTCGTCGACGCCCCAGGTAGCCTGCGCTCCGAGCTGGCA2448ProTyrValPheValAspAlaProGlySerLeuArgSerGluLeuAlaGAGCACCCCGAGTACGTTAAGCAGCACGGACTGCGCGTGGCGGTGGAC2496GluHisProGluTyrValLysGlnHisGlyLeuArgValAlaValAspCTGTATTTCGACAAG2511LeuTyrPheAspLys序列描述SEQIDNO117AspAspArgSerValCysValAsnValPheGlyGlnArgCysTyrPheTyrThrLeuAlaProGlnGlyValAsnLeuThrHisValLeuGlnGlnAlaLeuGlnAlaGlyPheGlyArgAlaSerCysGlyPheSerThrGluProValArgLysLysIleLeuArgAlaTyrAspThrGlnGlnTyrAlaValGlnLysIleThrLeuSerSerSerProMetMetArgThrLeuSerAspArgLeuThrThrCysGlyCysGluValPheGluSerAsnValAspAlaIleArgArgPheValLeuAspHisGlyPheSerThrPheGlyTrpTyrGluCysSerAsnProAlaProArgThrGlnAlaArgAspSerTrpThrGluLeuGluPheAspCysSerTrpGluAspLeuLysPheIleProGluArgThrGluTrpProProTyrThrIleLeuSerPheAspIleGluCysMetGlyGluLysGlyPheProAsnAlaThrGlnAspGluAspMetIleIleGlnIleSerCysValLeuHisThrValGlyAsnAspLysProTyrThrArgMetLeuLeuGlyLeuGlyThrCysAspProLeuProGlyValGluValPheGluPheProSerGluTyrAspMetLeuAlaAlaPheLeuSerMetLeuArgAspTyrAsnValGluPheIleThrGlyTyrAsnIleAlaAsnPheAspLeuProTyrIleIleAlaArgAlaThrGlnValTyrAspPheLysLeuGlnAspPheThrLysIleLysThrGlySerValPheGluValHisGlnProArgGlyGlySerAspGlyGlyAsnPheMetArgSerGlnSerLysValLysIleSerGlyIleValProIleAspMetTyrGlnValCysArgGluLysLeuSerLeuSerAspTyrLysLeuAspThrValAlaLysGlnCysLeuGlyArgGlnLysAspAspIleSerTyrLysAspIleProProLeuPheLysSerGlyProAspGlyArgAlaLysValGlyAsnTyrCysValIleAspSerValLeuValMetAspLeuLeuLeuArgPheGlnThrHisValGluIleSerGluIleAlaLysLeuAlaLysIleProThrArgArgValLeuThrAspGlyGlnGlnlleArgValPheSerCysLeuLeuGluAlaAlaAlaThrGluGlyTyrIleLeuProValProLysGlyAspAlaValSerGlyTyrGlnGlyAlaThrValIleSerProSerProGlyPheTyrAspAspProValLeuValValAspPheAlaSerLeuTyrProSerIleIleGlnAlaHisAsnLeuCysTyrSerThrLeuIleProGlyAspSerLeuHisLeuHisProHisLeuSerProAspAspTyrGluThrPheValLeuSerGlyGlyProValHisPheValLysLysHisLysArgGluSerLeuLeuAlaLysLeuLeuThrValTrpLeuAlaLysArgLysGluIleArgLysThrLeuAlaSerCysThrAspProAlaLeuLysThrIleLeuAspLysGlnGlnLeuAlaIleLysValThrCysAsnAlaValTyrGlyPheThrGlyValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluArgSerGlnAlaPheValGluAlaIleSerProGluArgLeuAlaGlyLeuLeuArgArgProValAspValSerProAspAlaArgPheLysValIleTyrGlyAspThrAspSerLeuPheIleCysCysMetGlyPheAsnMetAspSerValSerAspPheAlaGluGluLeuAlaSerIleThrThrAsnThrLeuPheArgSerProIleLysLeuGluAlaGluLysIlePheLysCysLeuLeuLeuLeuThrLysLysArgTyrValGlyValLeuSerAspAspLysValLeuMetLysGlyValAspLeuIleArgLysThrAlaCysArgPheValGlnGluLysSerSerGlnValLeuAspLeuIleLeuArgGluProSerValLysAlaAlaAlaLysLeuIleSerGlyGlnAlaThrAspTrpValTyrArgGluGlyLeuProGluGlyPheValLysIleIleGlnValLeuAsnAlaSerHisArgGluLeuCysGluArgSerValProValAspLysLeuThrPheThrThrGluLeuSerArgProLeuAlaAspTyrLysThrGlnAsnLeuProHisLeuThrValTyrGlnLysLeuGlnAlaArgGlnGluGluLeuProGlnIleHisAspArgIleProTyrValPheValAspAlaProGlySerLeuArgSerGluLeuAlaGluHisProGluTyrValLysGlnHisGlyLeuArgValAlaValAspLeuTyrPheAspLys序列描述SEQIDNO118CCTATGTTACTCTACCCTGATTCAGGGGAACGCCATTCTCTCGCAC46LeuCysTyrSerThrLeuIleGlnGlyAsnAlaIleLeuSerHisCCCGAGTTGACCCCGAACGACTACGAAACATTCCACCTAAGCGGAGGA94ProGluLeuThrProAsnAspTyrGluThrPheHisLeuSerGlyGlyCCGGTGCACTTCGTAAAAAAACACGTACGAGAGTCATTACTGTCAAAA142ProValHisPheValLysLysHisValArgGluSerLeuLeuSerLysCTTCTGACGACTTGGCTAACAAAAAGAAAAGAGATCCGCAAAAATCTC190LeuLeuThrThrTrpLeuThrLysArgLysGluIleArgLysAsnLeuGCCTCGTGCGGAGACCCAACCATGCGAACCATCCTTGATAAGCAGCAG238AlaSerCysGlyAspProThrMetArgThrIleLeuAspLysGlnGlnCTGGCCATCAAGGTCACATGTAATGCGGTGTACGGGTTTACCGGCGTC286LeuAlaIleLysValThrCysAsnAlaValTyrGlyPheThrGlyValGCCTCCGGTATTCTACCGTGCCTGAATATTGCAGAAACAGTCACCCTC334AlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuCAGGGCAGAAAAATGCTAGAAACGTCCCAGGCGTTTGTAGAGGGCATA382GlnGlyArgLysMetLeuGluThrSerGlnAlaPheValGluGlyIleTCGCCAAAAGACCTGTCAGACCTGATACAACGTCCGATCGACGCTTCC430SerProLysAspLeuSerAspLeuIleGlnArgProIleAspAlaSerCCGGACGCCAGGTTTAAAGTGATA454ProAspAlaArgPheLysValIle序列描述SEQIDNO119LeuCysTyrSerThrLeuIleGlnGlyAsnAlaIleLeuSerHisProGluLeuThrProAsnAspTyrGluThrPheHisLeuSerGlyGlyProValHisPheValLysLysHisValArgGluSerLeuLeuSerLysLeuLeuThrThrTrpLeuThrLysArgLysGluIleArgLysAsnLeuAlaSerCysGlyAspProThrMetArgThrIleLeuAspLysGlnGlnLeuAlaIleLysValThrCysAsnAlaValTyrGlyPheThrGlyValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluThrSerGlnAlaPheValGluGlyIleSerProLysAspLeuSerAspLeuIleGlnArgProIleAspAlaSerProAspAlaArgPheLysValIle序列描述SEQIDNO120ValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluArgSerGlnAlaPheValGluAlaIleSerProGluArgLeuAlaGlyLeuLeuArgArgProValAspValSerProAspAlaArgPheArgValIle序列描述SEQIDNO121ValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluArgSerGlnAlaPheValGluAlaIleSerProGluArgLeuAlaGlyLeuLeuArgArgProIleAspValSerProAspAlaArgPheLysValIle序列描述SEQIDNO122ValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluArgSerGlnAlaPheValGluAlaIleSerProGluArgLeuAlaGlyLeuLeuArgArgProValAspValSerProAspAlaArgPheLysValIle序列描述SEQIDNO123ValAlaSerGlyIleLeuProCysLeuAsnIleAlaGluThrValThrLeuGlnGlyArgLysMetLeuGluArgSerGlnAlaPheValGluAlaIleSerProGluArgLeuAlaGlyLeuLeuArgArgProValAspValSerProAspAlaArgPheArgValIle序列描述SEQIDNO124AACACAGAGTCNGTRTCNCCRTA23序列描述SEQIDNO125AGCATCATCATGGCCCAYAAYCTNTGYT28序列描述SEQIDNO126GAYTTYGCNAGYYTTNTAYCC20序列描述SEQIDNO127CACCCATRCAYTCDATRTCRAA22序列描述SEQIDNO128TACAACGTCCTCTCCTTYGAYATHGARTG29序列描述SEQIDNO129GTCTGCGTGAAYGTNTTYGGNCA23序列描述SEQIDNO130GACGACCGCAGCGTGTGCGTGAAYGTNTTYGGNCA35序列描述SEQIDNO131ACGACCGCAGCGTGTGCGTG20序列描述SEQIDNO132TAAAAGTACAGCTCCTGCCCGAANACRTTNACRCA35序列描述SEQIDNO133TAAAAGTACAGCTCCTGCCCGAA23序列描述SEQIDNO134TTTGACTTTGCCAGCCTGTAYCCNAGYATNAT32序列描述SEQIDNO135TTTGACTTTGCCAGCCTGTAYCCNTCNATNAT32序列描述SEQIDNO136TTTGACTTTGCCAGCCTGTA20序列描述SEQIDNO137CGGCATGCGACAAACACGGAGTCCGTRTCNCCRTADAT38序列描述SEQIDNO138TTAGCTACTCCGTGGAGCAGYTTRTCRAARTA32序列描述SEQIDNO139TTGTGCGCTTGGATGATACTG21序列描述SEQIDNO140GAGGGCCTGCTGGAGGACGTG21序列描述SEQIDNO141CGGTGGAGAAGCCGCAGGATG21序列描述SEQIDNO142ACCTCCCGCACCTGACCGTGT21序列描述SEQIDNO143AAGCTAGACAGGAGGAGCTTC21序列描述SEQIDNO144ACTTGAATTATCTTGACGAAC21序列描述SEQIDNO145ACGACAAGGTTCTGATGAAGG21序列描述SEQIDNO146AGAGACTCTTGGACGGAACTG21序列描述SEQIDNO147AGTTTGACTGCAGCTGGGAGG21序列描述SEQIDNO148CGGGTATCAGTGTGTGAGTAGC21序列描述SEQIDNO149GAGGACAAAGGTTTCGTAGTC21序列描述SEQIDNO150CTATGTTACTCTACCCTGATT21序列描述SEQIDNO151GTATATCTCTTTAAACCTGGC21序列描述SEQIDNO152AACCTGGCGTCCGGGGAAGCG2權(quán)利要求1.含有編碼皰疹病毒DNA聚合酶之區(qū)域的分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有與選自SEQ.IDNO1和SEQ.IDNO3的核苷酸27-501至少有69％相同的核苷酸序列。2.含有權(quán)利要求1之多核苷酸的DNA聚合酶編碼區(qū)域中至少18個(gè)連串的核苷酸片段的分離的多核苷酸，其中SEQ.IDNOS110或111中不含所述片段的序列。3.含有權(quán)利要求1之多核苷酸的DNA聚合酶編碼區(qū)域中至少50個(gè)連串的核苷酸片段的分離的多核苷酸。4.權(quán)利要求2的分離的多核苷酸，它編碼具有核酸結(jié)合活性，核苷酸結(jié)合活性，或DNA聚合酶活性的多肽。5.含有編碼皰疹病毒DNA聚合酶之區(qū)域的分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有與寡核苷酸LSGGA(SEQ.IDNO107)至少有80％相同的26個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列，或含有與寡核苷酸CTDPA(SEQ.IDNO108)至少有69％相同的29個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列，或含有與寡核苷酸KMLEA(SEQ.IDNO22)至少有80％相同的32個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列，或含有與寡核苷酸GISPA(SEQ.IDNO109)至少有69％相同的29個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列。6.含有權(quán)利要求5之多核苷酸的DNA聚合酶編碼區(qū)域中至少18個(gè)連串的核苷酸的片段，其中SEQ.IDNOS110或111中不含所述片段的序列。7.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述皰疹病毒能夠感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物。8.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述皰疹病毒是RFHVRFHV2，或KSHV。9.含有與SEQ.IDNO1所含的核苷酸27-501之間，或SEQ.IDNO3所含的核苷酸27-501之間，或SEQ.IDNO116所含的核苷酸36-2499之間，或SEQ.IDNO118所含的核苷酸1-454之間的線性序列至少有18個(gè)核苷酸相同，而不與SEQ.IDNO110或SEQ.IDNO111中所含的線性序列相同的線性序列的分離的多核苷酸。10.權(quán)利要求9的分離的多核苷酸，含有基本上與SEQ.IDNO1的核苷酸27-501，或SEQ.IDNO3的核苷酸27-501，或SEQ.IDNO116的核苷酸36-2499，或SEQ.IDNO118的核苷酸1-454相同的線性序列。11.由權(quán)利要求3的多核苷酸編碼的分離的多肽。12.分離的多肽，含有基本上與SEQ.IDNO2所含氨基酸10-167之間，或SEQIDNO4所含氨基酸10-167之間，或SEQ.IDNO117所含氨基酸13-833之間的序列，或與SEQ.IDNOS119-123中的任-個(gè)所含的氨基酸序列至少有12個(gè)氨基酸相同的線性序列，但SEQ.IDNOS112或SEQ.IDNO113中不含該序列。13.權(quán)利要求12的分離的多肽，具有核酸結(jié)合活性，核苷酸結(jié)合活性，或DNA聚合酶的活性。14.含有與第二個(gè)氨基酸序列相連的權(quán)利要求12的分離肽氨基酸序列的融合多肽。15.分離的多肽，含有與選自SEQ.IDNO80，82，84，86，88，和90-103的氨基酸序列相同的線性序列。16.編碼權(quán)利要求12的多肽的分離的或非天然產(chǎn)生的多核苷酸。17.編碼融合多肽的多核苷酸，含有與編碼多肽的第二多核苷酸直接相連的權(quán)利要求2的多核苷酸。18.含有編碼與根據(jù)權(quán)利要求12之多肽有至少12個(gè)連串的氨基酸相同之多肽的多核苷酸序列的重組克隆載體。19.含有編碼與根據(jù)權(quán)利要求12之多肽有至少12個(gè)連串的氨基酸相同之多肽的多核苷酸序列的重組表達(dá)載體。20.含有編碼皰疹病毒DNA聚合酶的線性序列的重組克隆載體，所述序列至少有18個(gè)核苷酸長(zhǎng)并與SEQ.IDNOS1，3，116，或118中所含的，而不是SEQIDNOS110或111中所含的線性序列相同。21.在遺傳上被權(quán)利要求16的多核苷酸，或權(quán)利要求18，19，或20的載體所改變的宿主細(xì)胞。22.特異針對(duì)權(quán)利要求1多核苷酸的所述編碼區(qū)所編碼的DNA聚合酶的單克隆或分離的多克隆抗體。23.特異針對(duì)權(quán)利要求12之多肽的單克隆或分離的多克隆抗體。24權(quán)利要求22的抗體，它是單克隆抗體。25.權(quán)利要求22的抗體，它是分離的多克隆抗體。26.與選自SEQIDNOS5-16，21，22，104-109，和124-152的寡核苷酸基本上相同的寡核苷酸。27.得到編碼DNA聚合酶的多核苷酸的擴(kuò)增拷貝的方法，包括步驟a)用權(quán)利要求26的寡核苷酸接觸多核苷酸；并b)延伸已與多核苷酸形成雙螺旋的寡核苷酸。28.權(quán)利要求27的方法，包含進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述PCR包括退火和延伸的重復(fù)循環(huán)，其中退火在至少60℃的溫度下進(jìn)行。30.權(quán)利要求28的方法，其中所述PCR在含有10-30mM(NH4)2SO4和1-10mMMgCl2的緩沖液中進(jìn)行。31.權(quán)利要求27的方法，其中被擴(kuò)增的多核苷酸首先得自生物樣品，所述生物樣品取自患有以成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積為特征的疾病的個(gè)體。32.檢測(cè)來(lái)源于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括步驟a)將樣品中的DNA或RNA與含有權(quán)利要求2的多核苷酸的探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在。33.權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括在與探針接觸之前對(duì)樣品中的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。34.權(quán)利要求33的方法，其中使用含有根據(jù)權(quán)利要求26之序列的寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。35.檢測(cè)來(lái)源于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括步驟a)將樣品中的DNA或RNA與含有SEQ.IDNOS21，22，107，108，或109中所示序列的寡核苷酸探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在。36.檢測(cè)樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括步驟a)將樣品中的DNA或RNA與含有SEQ.IDNOS22，107，108，或109中所示序列的寡核苷酸探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核苷酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS23-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在。37.檢測(cè)樣品中病毒DNA或RNA的方法，包括步驟a)在反應(yīng)中使用權(quán)利要求26的寡核苷酸作為引物對(duì)樣品中的多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；和b)如果有的話，檢測(cè)多核苷酸擴(kuò)增拷貝的存在。38.能與含有選自SEQ.IDNO107，SEQ.IDNO108和它們各自的互補(bǔ)序列的序列的寡核苷酸形成穩(wěn)定雙螺旋的分離的多核苷酸，所處的條件中寡核苷酸能與具有SEQ.IDNO1所示序列的多核酸，和具有SEQ.IDNO3所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS23-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋。39.含有由權(quán)利要求38之多核苷酸編碼的12個(gè)氨基酸的線性序列的分離的多肽。40.檢測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括檢測(cè)得自個(gè)體的生物樣品中的病毒DNA或RNA，其中通過(guò)權(quán)利要求32的方法檢測(cè)病毒DNA或RNA。41.檢測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括檢測(cè)得自個(gè)體的生物樣品中的病毒DNA或RNA，其中通過(guò)下列方法檢測(cè)病毒DNA或RNAa)將樣品中的DNA或RNA與含有權(quán)利要求2的多核苷酸的探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有選自SEQ.IDNOS1，3，116，或118的至少一個(gè)序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在。42.檢測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括檢測(cè)得自個(gè)體的生物樣品中的病毒DNA或RNA，其中通過(guò)下列方法檢測(cè)病毒DNA或RNAa)將樣品中的DNA或RNA與含有權(quán)利要求2的多核苷酸的探針接觸，所處的條件應(yīng)能允許探針與具有SEQ.IDNO116中所示序列的多核苷酸，而不與具有SEQ.IDNOS24-29中任一個(gè)的序列的多核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定雙螺旋的存在。43.檢測(cè)生物樣品中皰疹病毒多核苷酸的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括權(quán)利要求2的多核苷酸。44.檢測(cè)生物樣品中皰疹病毒多核苷酸的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括權(quán)利要求26的寡核苷酸。45.檢測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括下列步驟a)將得自個(gè)體的樣品中的抗體與權(quán)利要求11或12的多肽接觸，所處的條件能允許穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物的形成；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中所形成的所述穩(wěn)定復(fù)合物。46.檢測(cè)生物樣品中存在的抗-皰疹病毒抗體的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括權(quán)利要求11或12的多肽。47.檢測(cè)皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的方法，包括下列步驟a)將得自個(gè)體的樣品中的多肽與權(quán)利要求22或23的抗體接觸，所處的條件能允許穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物的形成；和b)如果有的話，檢測(cè)步驟a)中形成的所述穩(wěn)定復(fù)合物。48.檢測(cè)生物樣品中存在的皰疹病毒多肽的診斷試劑盒，它含有適當(dāng)包裝的試劑，其中試劑包括權(quán)利要求22或23的抗體。49.用于治療皰疹病毒感染的組合物，包括權(quán)利要求2的多核苷酸和相容的藥物賦形劑。50.確定候選藥物是否能用于治療γ皰疹病毒感染的方法，包括下列步驟a)將權(quán)利要求11的多肽與候選藥物接觸；和b)確定候選藥物是否能改變多肽的生化功能。51.權(quán)利要求50的方法，其中步驟b)中確定的多肽生化功能是多肽與核酸的結(jié)合。52.權(quán)利要求50的方法，其中步驟b)中確定的多肽生化功能是DNA聚合酶的活性。53.確定候選藥物是否能用于治療γ皰疹病毒感染的方法，包括下列步驟a)使用權(quán)利要求2的多核苷酸在遺傳上改變細(xì)胞；和b)與未被多核苷酸在遺傳上改變的細(xì)胞相比確定候選藥物對(duì)細(xì)胞的影響。54.得到用于治療被皰疹病毒感染之個(gè)體的化合物的方法，包括下列步驟a)產(chǎn)生能與涉及與核酸的相互作用的權(quán)利要求11或12的多肽區(qū)結(jié)合的化合物；和b)確定化合物是否干擾多肽的生化功能。全文摘要本發(fā)明提供了分離的編碼皰疹病毒γ亞族三個(gè)成員的DNA聚合酶的多核苷酸。兩個(gè)來(lái)自感染腹膜后纖維瘤病的獼猴,另一個(gè)來(lái)自感染卡波濟(jì)氏肉瘤的人AIDS患者。一個(gè)編碼靠近DNA聚合酶活性部位的區(qū)域的454堿基對(duì)片段在這三個(gè)病毒間同一性為69—83%,但與其它已知γ皰疹病毒序列間的同一性只有54—68%,與α和β皰疹病毒序列間的同一性小于55%。本發(fā)明也提供了編碼RFHV/KSHV亞族內(nèi)相關(guān)病毒DNA聚合酶的多核苷酸。根據(jù)序列數(shù)據(jù)制備的多核苷酸可用作檢測(cè)和鑒定相關(guān)序列的試劑。這類試劑可用來(lái)檢測(cè)RFHV/KSHV亞族的成員,包括但不限于RFHV、RFHV2和KSHV。相應(yīng)的多肽和肽片段可通過(guò)表達(dá)多核苷酸或通過(guò)化學(xué)合成獲得。它們可用來(lái)檢測(cè)感染受試者血清中可能存在的特異性抗體。它們也可用來(lái)設(shè)計(jì)或篩選通過(guò)抑制DNA聚合酶活性而限制病毒復(fù)制的藥物化合物。文檔編號(hào)A61K48/00GK1196089SQ96196991公開(kāi)日1998年10月14日申請(qǐng)日期1996年7月12日優(yōu)先權(quán)日1995年7月14日發(fā)明者T·M·羅瑟,M·L·波斯,K·斯特蘭德,G·J·托達(dá)羅申請(qǐng)人:華盛頓州大學(xué)