專利名稱：白細胞介素－12對血管生成的抑制作用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由有害的血管生成所引起的疾病預防。更具體地說，本發(fā)明涉及白細胞介素-12(IL-12)在預防有害的血管生成的藥物制備中的用途，特別是用于治療血管生成依賴的或與血管生成有關的疾病。
白細胞介素-12(IL-12)以前曾被稱為天然殺傷細胞刺激因子(Kobayashi M，et a1.，J.Exp.Med.170827-845，1989)和細胞毒淋巴細胞成熟因子(Stern A.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876808-6812，1990)，它在多種鼠腫瘤模型中具有有效的抗腫瘤和抗腫瘤轉移的活性(Brunda M.j.etal.，J.Exp.med.1781223-1230，1993；Nastala C.L，et al.，J.Immunol.153；1697-1706，1994)。盡管IL-12發(fā)揮其抗腫瘤作用的機理尚不完全清楚，人們已知道IL-12在體外能對自然殺傷細胞及T細胞產生多種生物作用(Manetti R.，et al.，J.Exp.Med.1791273-1283，1994；Wu C.Y. et al.，J.Immunol.1511938-1949，1993；Tripp C.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA903725-3729，1993；Seder R.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010188-10192，1993；Bloom E.T.，et al.，J.Immunol.1524242-4254，1994；Cesano A.，et al.，J.Immunol.1512943-2957，1993；ChanS.H.，et al.，J.Immunol.14892-98，1992)。IL-12對細胞毒T淋巴細胞的活化作用在抗腫瘤活性中起著決定性的作用(Brunda M.J.，etal.J.Exp.Med.1781223-1230，1993)。IL-12的部分抗腫瘤活性保持在嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)及光禿小鼠中，這兩者均為T細胞缺陷，在CD8衰竭的胸腺機能正常的小鼠中也是如此(Brunda M.J.，et al.J.Exp.Med.1781223-1230，1993；O′Toole M.，et al.J.Lmmunol.150294A 1993)。這些結果證明，IL-12對鼠腫瘤具有有效的體內抗腫瘤和抗腫瘤轉移的作用，也證明了CD8+T細胞對引發(fā)抗皮下腫瘤具有關鍵作用。
本發(fā)明提供了白細胞介素-12在藥物制備中的用途，該藥物可有效抑制有害的血管生成。據(jù)觀察IL-12在體內可抑制多種腫瘤，但在體外對腫瘤細胞沒有直接作用。此外，在T細胞缺陷的小鼠中，IL-12的抗腫瘤活性沒有完全消失，這提示IL-12具有抗血管生成的性質。IL-12誘發(fā)強烈抑制新血管形成的作用。該作用不是通過免疫系統(tǒng)的特異細胞類型產生的。在IL-12的抗血管生成作用中，γ干擾素(IFN-γ)起到關鍵的傳遞介質作用。IL-12的抗血管生成的驚奇作用是精確設計一些治療方案的核心，該治療方案包括其與新血管形成的其它抑制劑共同給藥的方案。
其次，本發(fā)明提供了白細胞介素-12在藥物制備中的用途，該藥物用于治療由有害的或失控的血管生成所引起的疾病，特別是用于抑制由這種有害的或失控的血管生成所引起的新血管形成，尤其是視網膜/脈絡膜新血管形成。本發(fā)明另一目的是用于治療與糖尿病的視網膜病有關的視網膜/脈絡膜新血管形成，或者與黃斑變性有關的視網膜/脈絡膜新血管形成。
本發(fā)明的又一目的是提供了白細胞介素-12在藥物制備中的用途，該藥物用于治療由失控的血管生成引起的疾病，該疾病是角膜新血管形成。
本發(fā)明還有一個目的是提供了白細胞介素-12在制備治療糖尿病的視網膜病和黃斑變性藥物中的用途。
本發(fā)明進一步包括白細胞介素-12在治療由有害的或失控的血管生成所引起的疾病的藥物制備中的用途。其中的疾病來源于固體腫瘤或血源性腫瘤及它們的轉移瘤。
本發(fā)明還有一個目的是提供了白細胞介素-12在藥物制備中的用途，該藥物用于治療各種類型的增生性玻璃體視網膜病，無論是否與糖尿病有關。
上述這些藥物可含有一種或多種附加的血管生成抑制劑。
白細胞介素-12及其在治療上述疾病中的用途是本發(fā)明的一部分內容。而且，本發(fā)明還包括白細胞介素-12，或其與一種或多種附加的血管生成抑制劑結合起來在治療上述疾病中的用途。附圖的簡要說明

圖1基因重組的鼠白細胞介素-12對bFGF誘發(fā)的鼠角膜新血管形成的作用。這些照片代表作為載體(對照)用的或經IL-12治療的C57BL/6和SCID小鼠的角膜在植入基礎纖維細胞生長因子小丸(P)后5天時的情況。在對照組的角膜中有明顯新血管生成，而經IL-12治療的角膜幾乎看不到血管應答。(注意到SCID小鼠預先存在有虹膜血管，由于其虹膜著色不足，通過角膜能看見該虹膜血管。因此，IL-12治療組中所見到的血管是在該虹膜同一平面上，并不是由基礎纖維細胞生長因子誘發(fā)產生的角膜血管。)圖2基礎纖維細胞生長因子小丸植入C57BL/6小鼠后5天時的血管生成應答。由載體(21只角膜)、IL-12(30只角膜)或IL-12的單體混合物(10只角膜)構成的治療程序如下所述。血管長度以mm計，記錄的時間(clock hours)以小時計，以平均值±SEM表示。
圖3IFN-γ抗體對小鼠角膜新血管形成的IL-12誘發(fā)抑制作用。如下所述，給雄性C57BL/6小鼠單次腹膜內注射大鼠XMGl.2 IFN-γ抗體或大鼠IgG。在第5天測量血管長度和時間。分別對這兩種情況重復本實驗，得到類似結果。數(shù)據(jù)以至少13只角膜的平均值±SEM表示。
圖4IFN-γ對基礎纖維細胞生長因子誘發(fā)的小鼠角膜新血管形成的治療作用。雄性C57BL/6小鼠在植入小丸當天腹膜內注射IFN-γ藥團，或在植入小丸前3天開始連續(xù)輸注IFN。在基礎纖維細胞生長因子小丸植入后5天測量血管長度和時間，結果以每組10只角膜的平均值±SEM表示。
圖5IL-12與AGM-1470對Lewis肺癌生長的作用。雄性C57BL/6小鼠在第0天接種Lewis肺癌，在能測量到腫瘤后再用鹽水、IL-12或AGM-1470處理。治療的原始記錄和測量過程如下所述。結果由每組4只動物的單次實驗得出。
圖6IL-12與AGM-1470對Lewis肺癌在肺表面的自發(fā)性轉移的作用。治療的原始記錄和計算過程如下所述。結果由每組4只動物的單次實驗得出。
血管生成是腫瘤及轉移瘤生長擴大數(shù)毫米直徑的主要原因(Folkman J.，N.Engl.J.Med.2851182-1186，1971)。已有的預防腫瘤及轉移瘤中新血管發(fā)育的方法可有效抑制這些腫瘤生長(Millauer B.，et al.，Nature 367576-579，1994；KimK.J.，et al.，Nature 362841-844，1993)。為確定IL-12是否具有抗血管生成的性質，用一種基礎纖維細胞生長因子誘發(fā)的小鼠角膜新血管形成模型進行測定。結果表明，IL-12為體內血管生成的有效抑制劑，而且該作用是由IFN-γ介導的。
血管生成是在組織或器管內產生新的血管。在正常生理條件下，人或動物只在非常特殊及有限的情況下才會有血管生成。例如，血管生成通常見于傷口愈合、胎兒及胚胎發(fā)育、以及黃體、子宮內膜及胎盤的形成中。對血管生成的控制，就是對血管生成刺激劑與抑制劑的嚴格限制。已發(fā)現(xiàn)控制血管生成可改變某些疾病狀態(tài)，而且在多數(shù)情況下，與疾病有關的病理損傷都涉及失控的血管生成。
控制下的血管生成與失控的血管生成被認為是相似的作用方式。在內皮細胞和周皮細胞外包圍著一層基膜，這兩種細胞組成了毛細血管。血管生成開始于內皮細胞與白細胞釋放的酶侵蝕基膜。然后，排列形成血管腔的內皮細胞伸出基膜。血管生成刺激劑誘導內皮細胞移行穿過受侵蝕的基膜。移行細胞離開母體血管，形成“新芽”，內皮細胞在此進行有絲分裂而增生。內皮新芽彼此結合形成毛細血管袢，從而產生新的血管。在疾病狀態(tài)下，預防血管生成能避免由于新的微血管系統(tǒng)的侵入而造成的損害。
持續(xù)的血管生成見于許多疾病癥狀中，如腫瘤生長(包括原發(fā)瘤與轉移瘤)和內皮細胞的異常生長在這些情況下造成可見的病理損傷。因失控的血管生成而發(fā)生的多種病理狀態(tài)已被歸入血管生成依賴性的或與血管生成有關的疾病類型中。針對血管生成過程的控制而進行的療法能使這些疾病痊愈或好轉。
由血管生成引起的疾病的實例是眼部新生血管病。該疾病以新血管侵入眼部結構為特征，如視網膜或角膜。這是最常見的致盲原因，而且還涉及20歲左右人的眼部疾病。在與年齡有關的黃斑變性中，伴隨而來的視力障礙產生原因在于視網膜色素上皮下方的纖維血管組織增生，引起脈絡膜毛細血管生成而致布魯赫膜缺損。血管生成所造成的損傷也涉及糖尿病的視網膜疾病、視網膜早熟、角膜移植排斥、新血管引起的青光眼、和晶狀體后纖維組織形成。其它與角膜新血管形成有關的疾病包括但不限于下列疾病流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏癥、接觸性晶狀體勞損、特異性角膜炎、上緣角膜炎、翼狀胬肉干性角膜炎、斯耶格倫綜合癥、紅斑痤瘡、phylectenulosis、梅毒、分支桿菌感染、磷脂變性、化學灼傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹感染、帶狀皰疹感染、原蟲感染、卡波濟肉瘤、莫倫潰瘍、Terrien′s邊緣變性、邊緣角質層分離、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡、多動脈炎、創(chuàng)傷、Wegener肉樣瘤、鞏膜炎、史蒂文斯-約翰遜病、periphigoid放射狀角膜切開術和角膜移植排斥。
與視網膜/脈絡膜新血管形成有關的疾病包括但不限于下列疾病糖尿病的視網膜病、黃斑變性、鐮狀細胞性貧血、肉樣瘤、梅毒、彈性纖維假黃瘤、佩吉特病、靜脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈阻塞、慢性葡萄膜炎/vitritis、分支桿菌感染、Lyme′s病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、視網膜早熟、伊爾斯病、Bachets病、感染引起的視網膜炎或脈絡膜炎、推定性眼部組織胞漿菌病、Bests病、近視、眼窩、Stargarts病、局部planitis、慢性視網膜脫離、高粘滯性綜合癥、弓形體病、創(chuàng)傷、和激光照射后引起的并發(fā)癥。其它疾病包括但不限于下列疾病與潮紅有關的疾病(角部新血管形成)和由纖維血管或纖維組織異常增生引起的疾病，包括各種類型的增生性玻璃體視網膜病。另一種疾病是類風濕性關節(jié)炎，據(jù)認為其中也涉及血管生成。即在關節(jié)滑液襯中的血管發(fā)生了血管生成。除了形成新血管網以外，內皮細胞還釋放因子與反應性氧，引起血管翳生長和軟骨損傷。涉及血管生成的因子能主動引起并有助于保養(yǎng)類風濕性關節(jié)炎的慢性發(fā)炎狀態(tài)。
與血管生成有關的因子也可引起骨關節(jié)炎。有關血管生成的因子對軟骨細胞的活化作用導致了關節(jié)損傷。其后，血管生成因子會促進新骨的生成。引入預防骨損傷的療法能終止疾病的發(fā)展，并能緩解關節(jié)炎病人的痛苦。慢性炎癥也涉及病理學上的血管生成。諸如潰瘍性結腸炎和節(jié)段性回腸炎的疾病狀態(tài)由于新血管向內生長進入發(fā)炎組織，引起組織學上的改變。巴爾通體病是一種在南美發(fā)現(xiàn)的細菌感染，它能引起一種以血管內皮細胞增生為特征的慢性癥狀。另一種有關血管生成的病理學作用見于動脈粥樣硬化癥。其血管腔內形成的斑塊具有刺激血管生成的活性。
最常見的兒童血管生成疾病之一是血管瘤。多數(shù)情況下，該腫瘤是良性的并自然消退而無危險性。在較嚴重的情況中，腫瘤發(fā)展成為大的空洞狀和浸潤性的形式，引起各種臨床并發(fā)癥。多發(fā)性血管瘤，即全身性血管瘤，死亡率較高。血管瘤的抵抗療法尚不能用在目前的治療中。血管生成造成的損傷也見于遺傳性疾病中，如Osler-Weber-Rendu病，或稱之為遺傳出血性毛細血管擴張。這是一種可遺傳的疾病，以多發(fā)性小血管瘤為特征，即血管或淋巴管腫瘤。血管瘤見于皮膚和粘膜，并經常伴有鼻出血(鼻衄)或胃腸道出血，有時伴有肺或肝的動靜脈瘺。
血管生成在固體瘤的形成與轉移中呈隆凸狀。已發(fā)現(xiàn)血管生成因子與若干種固體瘤有關，如橫紋肌肉瘤、成視網膜細胞瘤、尤因肉瘤、成神經細胞瘤、和骨肉瘤。若沒有血液供應以提供養(yǎng)分及排除細胞排泄物，腫瘤就不會擴大。血管形成起重要作用的腫瘤包括固體瘤和良性瘤，后者如聽覺神經瘤、神經纖維瘤、沙眼和化膿性肉芽腫。預防血管生成能終止這些腫瘤的生長，并終止由于這些腫瘤的存在而對動物造成的損傷。
血管生成與血源性腫瘤、如與白血病有關，以及與各種急性或慢性骨髓腫瘤有關，后者白細胞無限制地增生，這些疾病通常伴有貧血、凝血障礙、和淋巴結、肝、脾腫大。據(jù)認為，血管生成在骨髓異常中的作用是引發(fā)白血病樣的腫瘤。
血管生成在腫瘤轉移的兩個階段中都起到重要作用。第一階段中，血管生成的活化作用是主要的，此階段腫瘤血管形成，使腫瘤細胞進入血流并循環(huán)至全身。腫瘤細胞在離開原發(fā)部位并在繼發(fā)的轉移部位穩(wěn)定下來后，必須進行血管生成才能使新腫瘤生長和擴大。因此，預防血管生成能防止腫瘤轉移，并能抑制腫瘤在原發(fā)部位的生長?；趯ρ苌稍谀[瘤的維持與轉移中作用的認識，能用于預測乳腺癌。原發(fā)腫瘤的新血管形成數(shù)量的測量是通過計數(shù)侵襲性乳腺癌的新血管形成最強區(qū)域中微血管密度來進行的。高水平的微血管密度與腫瘤的復發(fā)相互關聯(lián)。通過治療控制血管生成，有可能使腫瘤不再復發(fā)。
正常的生理過程也涉及血管生成，如生殖和傷口愈合。血管生成是排卵的重要一步，也是受精后植入囊胚泡的重要一步。阻止血管生成能用于誘發(fā)閉經、阻塞排卵或防止囊胚泡植入。在傷口愈合中，過度修復或過度纖維組織的形成會帶來外科手術中有害的副作用，這種情況可能由血管生成引起或由此而加劇。粘連是外科常見的并發(fā)癥，并引起諸如小腸梗之類的問題。
有幾種化合物已用于預防血管生成。Taylor等人用谷醇溶蛋白抑制血管生成，見Taylor et al.，Nature 297307(1982)。谷醇蛋白的毒性限制了其在實際療法中的應用。Folkman等人發(fā)現(xiàn)了肝素與甾類化合物在控制血管生成中的用途。見Folkman et al.，Science22l719(1983)和美國專利Nos.5,001,116及4,994,443。已發(fā)現(xiàn)甾類化合物，如缺乏糖皮質激素與鹽皮質激素活性的四氫皮質醇能抑制血管生成。
其它在動物體內發(fā)現(xiàn)的內源性因子，如來自牛玻璃體液的4kDa糖蛋白和取自軟骨的因子已經用來抑制血管生成。諸如干擾素的細胞因子可抑制血管生成。例如，α干擾素或人β干擾素可抑制小鼠真皮中由人腫瘤細胞誘發(fā)產生的血管生成。β干擾素也是一種由異源脾細胞誘發(fā)血管生成的有效抑制劑。見Sidky et al.，Canser Research 475155-5161(1987)。據(jù)報道，人α干擾素的基因重組體(α/A)成功地用于治療由血管生成誘發(fā)的肺多發(fā)性血管瘤。見White et al.，N.Engl.J.Med.3201197-1200，1971。
按照本發(fā)明所提供的組合物與方法有效地抑制動物、包括人與其它動物體內有害的血管生成。這些組合物易于通過包括腸道外途徑在內的不同途徑和安全劑量給藥，并在體內部位抑制血管生成。本發(fā)明提供了一種由有害并失控的血管生成引引導的哺乳動物疾病的治療方法，該方法是以含有白細胞介素-12的組合物給藥，給藥劑量足以抑制血管生成。
本發(fā)明尤其用于治療某些眼部新生血管疾病，如黃斑變性。作為本發(fā)明一部分內容的組合物優(yōu)選以腸道外途徑給藥，從而終止疾病發(fā)展。其它可用本發(fā)明治療的疾病有糖尿病的視網膜病、新生血管青光眼和晶狀體后纖維組織形成。
白細胞介素-12可按現(xiàn)有技術中已知的方法制備，載于歐洲專利申請433827號、國際專利申請WO9005147及WO9205256、Kobayashi M.et al.，J.Exp.Med.170827-845，1989，以及Stern A.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876808-6812，1990。白細胞介素-12可按已知常用的化學合成法、基因重組法制備，或者從天然原料中提純。術語“白細胞介素-12”也包括那些類似于精制和/或重組蛋白質的多肽，不過其變體是自然形成的或有意設計的。
本發(fā)明證明了對血管生成的抑制作用是IL-12的一種新的生物活性。這種對新血管形成的抑制作用具有深遠意義，而且該作用也是在IL-12有最佳抗腫瘤作用的濃度時產生的(Brunda M.J.et al.，J.Exp.Med.1781223-1230，1993)。若將IL-12用在小雞絨毛膜尿囊膜測定法中，觀察不到其對血管生成的抑制作用，這說明IL-12是種特異性的。因此選擇小鼠角膜新血管形成模型來評價IL-12的抗血管生成性質。使用這種具有不同免疫背景的小鼠種系模型，該免疫系統(tǒng)的個體細胞類型(自然殺傷細胞或T細胞)不能成為IL-12抗血管生成作用的傳遞介質。
用于此項研究的小鼠角膜新血管形成鑒定法是一種基礎纖維細胞生長因子促成的血管生成模型。因此可以表明，IL-12能特異性抑制基礎纖維細胞生長因子誘發(fā)的血管生成。不過，若用含有血管內皮生長因子的小丸(160ng/丸)代替基礎纖維細胞生長因子小丸，IL-12仍表現(xiàn)出同樣的抑制作用。
使用IL-12的療法使小鼠血流中IFN-γ持續(xù)上升(Gately M.K.et al.，Int.Immund.6157-167，1994)。IFN-γ抗體給藥阻止了IL-12誘發(fā)新血管形成的抑制作用。此外，注射IFN-γ藥團或連續(xù)輸注IFN-γ又會抑制新血管的形成。這些發(fā)現(xiàn)表明，IFN-γ是IL-12抗血管生成活性的一種必要和充分的傳遞介質。用IFN-γ抗體處理胸腺機能正常的小鼠會導致IL-12抗腫瘤功效的喪失，這樣的觀察資料也支持了IFN-γ在IL-12抗腫瘤活性中的重要作用(Nastala CL，et al.，J.Immunol 1531697-1706，1994)。IFN-γ曾用于鼠腫瘤模型(Brunda M.J.，et al.，Int.J.Cancer 40807-810，1987)。但是IFN-γ作為一種抗癌劑在臨床應用中尚不是非常成功。IFN-γ的藥物動力學已可解釋這種藥在臨床試驗中沒有得到預期結果的原因。IFN-γ藥團靜脈內給藥后，半衰期(小時)相對較短(Rutenfranz I.，etal.J.InterferonRes.8573-580，1988)，皮下注射后在血清中檢測不到藥物(Cross S.E，et al.，J.Interferon Res.45606-609，1993)。與藥團注射相比，腹膜內連續(xù)輸注IFN-γ提高了對血管生成的抑制作用，這樣的觀察結果表明了兩種給藥方法之間的藥物動力學差異。不過這不能排除在植入基礎纖維細胞生長因子小丸之前另外有3天連續(xù)用IFN-γ治療已得到的有益效果。
盡管IFN-γ或取自經IL-12治療的動物血清在體外對內皮細胞增生曾發(fā)現(xiàn)有顯著的作用，目前仍不清楚IFN-γ如何發(fā)揮其對血管的作用。有關IFN-γ作為一種抗血管生成劑的文獻報道尚存在爭議，而且它們主要是基于體外觀察結果得出的(Sato N.，et al.，J.Invest.Dermatool.9585s-89s，1990；Saegusa Y.，et al.，J.ell.Physiol.142488-495，1990；Friesel R.，etal.J.Cell.Biol.104689-696，1987；Saiki I.，et al.、Int.J.Cancer 51641-645，1992 Kobayashi S.，et al.，Immunopharmacol.2723-30，1994)。由于IFN-γ涉及大量基因的調節(jié)(Sen G.C.et al.，J.Biol.Chem.2675017-5020；1992)，因此似乎有理由可以假設IFN-γ在下游的作用涉及抗血管生成效果。
用患有Lewis肺癌小鼠進行實驗的結果確認了IL-12與AGM-1470作為單一試劑使用時的有效的抗腫瘤活性(Brunda M.J.，et al.J.Exp.Med.1781223-1230，1993；Ingber D.et al.，Nature 348555-557，1990)。在Lewis肺癌模型中觀察到同時用IL-12與AGM-1470治療具有加性效應，這說明這些試劑通過不同途徑作用于內皮細胞。用復合的抗血管生成劑是可提高治療惡性腫瘤效果的方案。本發(fā)明清楚地證明，IL-12是一種有效的體內血管生成抑制劑，其作用是通過誘導IFN-γ持續(xù)釋放來實現(xiàn)的。
關于本發(fā)明的IL-12藥學上可接受的制劑可用本領域普通技術人員已知的制劑方法進行制備。這些制劑均能按標準途徑給藥。一般來說，該制劑是腸道外給藥(如靜脈內、皮下、或肌內)，也預料可用局部、透皮、口服或直腸途徑給藥。此外，該制劑中可加入可生物降解的聚合物，它能使IL-12持續(xù)釋放，將該聚合物植入需要藥物釋放的部位、如腫瘤附近?？缮锝到獾木酆衔锛捌鋺迷斠夿rem et al.，J.Neurosurg，74441-446(1991)。IL-12的劑量取決于治療的病情、具體化合物和其它臨床因素，如人或動物的體重與身體狀況、及IL-12的給藥途徑。本發(fā)明應理解為可以人用也可獸用。在對人以腸道外途徑給藥時，約0.1至20mg/kg、每周1至5次，優(yōu)選為0.5至10mg/kg、每周1至3次，最優(yōu)選為l至l0mg/kg、每周1至3次的劑量一般來說足夠了。
該制劑包括那些適宜腸道外途徑(包括皮下、肌內、靜脈內、真皮內、氣管內和硬膜外)給藥的劑型?？砂闯Ｓ弥扑幖夹g將該制劑制成方便的單位劑量方式。該制備方法包括使IL-12與藥物載體或賦型劑結合的步驟。一般來說，在制備時要使IL-12與液體載體均勻、緊密地結合。適宜腸道外給藥的制劑包括含水及非水的無菌注射溶液，溶液中可含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑和使制劑與預期的受治療者血液等滲的溶質；還包括含水及非水的無菌懸浮液，該懸浮液可含有懸浮劑和增稠劑。制劑可置于單位劑量或多劑量容器中，如密封的安瓿和小瓶，可在凍干(冷凍干燥)條件下貯存，要求僅在使用前加入無菌液體載體，如注射用水。
優(yōu)選的單位劑量制劑，如上所述，含有有效成分的日劑量或日單位劑量、每日分次劑量、或其分次的相應劑量。
能按本發(fā)明治療的與角膜新血管形成有關的疾病包括但不限于下列疾病糖尿病的視網膜疾病、視網膜早熟、角膜移植排斥、新血管引起的青光眼、和晶狀體后纖維組織形成。流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏癥、接觸性晶狀體勞損、特異性角膜炎、上緣角膜炎、翼狀胬肉干性角膜炎、斯耶格倫綜合征、紅斑痤瘡、phylectenulosis、梅毒、分枝桿菌感染、磷脂變性、化學灼傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹感染、帶狀皰疹感染、原蟲感染、卡波濟肉瘤、莫倫潰瘍、Temen′s邊緣變性、邊緣角質層分離、創(chuàng)傷、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡、多動脈炎、Wegener肉樣瘤、鞏膜炎、史蒂文斯-約翰遜病、periphigoid放射狀角膜切開術、角膜移植排斥。
能按本發(fā)明治療的與視網膜/脈絡膜新血管形成有關的疾病包括但不限于下列疾病糖尿病的視網膜病、黃斑變性、鐮狀細胞性貧血、肉樣瘤、梅毒、彈性纖維假黃瘤、佩吉特病、靜脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈阻塞、慢性葡萄膜炎/Vitritis、分支桿菌感染、Lyme′s病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、視網膜早熟、伊爾斯病、Bachets病、感染引起的視網膜炎或脈絡膜炎、推定性眼部組織胞漿菌病、Bests病、近視、眼窩、Stargarts病、局部planitis、慢性視網膜脫離、高粘滯性綜合征、弓形體病、創(chuàng)傷、激光照射后引起的并發(fā)癥。
其它疾病包括但不限于下列疾病與潮紅有關的疾病(角部新血管形成)和由纖維血管或纖維組織異常增生引起的疾病，包括各種類型的增生性玻璃體視網膜病，無論是否與糖尿病有關。
另一種能按本發(fā)明治療的疾病是類風濕性關節(jié)炎。該病據(jù)認為是由于在關節(jié)滑液襯血管中生成新血管。除了形成新血管網以外，內皮細胞還釋放因子與反應性氧，引起血管翳生長和軟骨損傷。涉及血管生成的因子能主動引起并有助于保持類風濕性關節(jié)炎的慢性發(fā)炎狀態(tài)。
另一些能按本發(fā)明治療的疾病有血管瘤、Osler-Weber-Rendu病，或稱之為遺傳出血性毛細血管擴張，還有固體瘤或血源性瘤，及獲得性免疫缺陷綜合癥。
用基本纖維細胞生長因子誘發(fā)的小鼠角膜新血管形成模型來評價IL-12對體內血管生成的作用。不同種系的不鼠用IL-12治療，每天lmg腹膜內給藥連續(xù)治療5天。用新血管形成的血管長度和角膜的時間來測量含有基本纖維細胞生長因子的小丸而產生的新血管形成的程度。用患有Lewis肺癌小鼠評價LI-12與AGM-1470血管生成抑制劑的抗腫瘤活性。用牛毛細血管內皮細胞、小鼠胰內皮細胞和小鼠血管內皮瘤細胞系進行體外增生研究。免疫活性的C57BL/6小鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠和自然殺傷細胞缺陷的Beige小鼠經IL-12治療的結果是角膜新血管形成幾乎被完全抑制了。IFN-γ中和抗體給藥阻止了血管生成潛在的抑制作用。此外，腹膜內注射IFN-γ藥團或借助于腹膜內植入的滲透藥泵連續(xù)輸注IFN-γ，都能再現(xiàn)在用IL-12治療中觀察到的抗血管生成作用。用IL-12與AGM-1470共同治療患有Lewis肺癌小鼠，產生加和的抗腫瘤作用，這提示了不同的抗血管生成的作用機理。
用下列實施例進一步說明本發(fā)明，但無論如何也不能將其解釋為對本發(fā)明范圍的附加限制。相反，本領域技術人員在閱讀本說明書之后顯然可采取其它各種具體的、變換的及等效的實施方案而不背離本發(fā)明的構思和/或附在后面的權利要求的范圍。
實施例1.材料基因重組的鼠IL-12(IL-12)、基因重組的鼠γ干擾素(IFN-γ)和大鼠IgGlXMGl.2IFN-γ封閉性抗體，均來自Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ.AGM-1470(TNP 470)和基本纖維細胞生長因子得自Takeda Industries，Osaka，Japan。所有其它材料購自Sigma，StLouis，Mo。
用二硫蘇糖醇(10mM)與碘乙酰胺(50mM)還原IL-12制得IL-12的單體混合物。然后將此混合物滲析3小時(分子量截斷點6-8000D，Spectra/Por滲析膜，Houston，Tx)去除去該還原化合物。用SDS-PAGE確認混合物中有單體存在而沒有二聚物存在。2.細胞和培養(yǎng)條件本項研究使用牛毛細血管內皮細胞、小鼠胰島內皮細胞初級培養(yǎng)物和小鼠血管內皮瘤細胞系。在10％CO2大氣中，在Dulbeco改進的Eagle′s最少量必需培養(yǎng)基(DMEM)中進行單細胞層培養(yǎng)，培養(yǎng)基中補充了100V/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、2mM左旋谷酰胺(“全培養(yǎng)基”)及10％牛血清(GIBCOBRL，Grand Island，NY)。牛毛細血管內皮細胞在4ng/ml基本纖維細胞生長因子(bFGF)的存在下培養(yǎng)時保持不變，而小鼠胰島內皮細胞在6ng/ml基本纖維細胞生長因子與10％NUSERUM IV培養(yǎng)營養(yǎng)物(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)的存在下則進行生長。涉及牛與小鼠內皮細胞的實驗在10與15代之間進行。3.小鼠雄性C57BL/6小鼠、SCID(C57BL/6/SCID/szj)小鼠和Beige(C57BL/6/bgj)小鼠購自Jackon Laboratories，Bar Harbor，ME。光禿小鼠(NCR Nu/Sed，SwissWhite background)來自Massachusetts General Hospital，Boston，MA。全部動物研究對雄性、6-8周齡小鼠進行。4.體外測定為評價對內皮細胞增生的作用，將牛毛細血管內皮細胞、小鼠胰島內皮細胞及血管內皮瘤細胞置于24池板中，使其密度為10000-12500個細胞/池。二十四小時后，在1ng/ml基本纖維細胞生長因子與5％牛血清的全培養(yǎng)基中孵育細胞，并用待測化合物激發(fā)免疫應答。72小時后，通過使其受胰蛋白酶作用來收集細胞，并用Coulter計數(shù)器計數(shù)細胞數(shù)目。5.體內測定為研究IL-12與IFN-γ在體內對血管生成的作用，使用前述小鼠角膜血管生成測定法，并作了改變(Polakowski I.J.，et al.，Am.J.Pathol.143507-517，1993；Muthukkaruppan V.，et al.，Science2051416-1418，1979)。簡要地說，在兩只眼角膜緣的1mm內做出角膜微囊，再將含有基本纖維細胞生長因子(-80ng)、硫糖鋁及hydron的小丸植入兩只眼中。每日測量新血管形成的最大血管長度與時間，作為血管應答。本項研究數(shù)據(jù)在植入基本纖維細胞生長因子后第5天得出，那天的血管生成應答達到最大。
實驗中腹膜內植入滲透泵(Alzet2002，Alza Corporation，Palo Alto，CA)，以確保鹽水或IFN-γ能實現(xiàn)連續(xù)輸注。在植入基本纖維細胞生長因子之前讓小鼠從上述剖腹術中恢復3天。實驗結束后，檢查一下剩余泵容量，以確保正常的功能和傳輸。
在每日注射IL-12的第5天注射后24小時，通過心臟穿刺得到經IL-12治療的小鼠血清。6.腫瘤實驗雄性C57BL/6小鼠接種106個Lewis肺癌細胞。在腫瘤體積達到75mm3后，用鹽水、IL-12、AGM-1470或IL-12加AGM-1470開始進行治療。IL-12腹膜內給藥劑量為1mg/天，連續(xù)給藥5天。休止2天后再重復上述循環(huán)。AGM-1470每隔一天皮下給藥，劑量為30mg/kg。用連續(xù)測經器測量正交直徑，按下式計算腫瘤體積，以mm3計最大直徑×最小直徑2×0.52。接種后三周，切除腫瘤和肺，稱重。在解剖顯微鏡下計數(shù)肺表面轉移瘤數(shù)目。7.統(tǒng)計學分析用Student′s雙尾t檢驗計算各組間的統(tǒng)計學上顯著差異。結果以平均值±均值的標準誤差(SEM)表示。8.IL-12對小鼠角膜新血管形成的作用雄性C57BL/6小鼠用IL-12(每天以溶于0.1ml載體中的1mg IL-12腹膜內給藥，連續(xù)給藥5天，從植入小丸當天開始)或用載體(1％同種基團的小鼠血清的磷酸鹽緩沖鹽水)作對比處理。在治療過程中沒有產生明顯毒性。經IL-12治療的C57BL/6小鼠幾乎沒有因基本纖維細胞生長因子小丸而形成角膜新血管，而用載體處理的小鼠在植入該小丸后5天內有血管生長進到小丸(P＜0.0001；圖1和圖2)。結果來自三個獨立的實驗。若將IL-12還原為單體混合物并以每天1mg這種混合物腹膜內給藥5天，則體內對新血管形成的抑制作用喪失(圖2)。
為搞清楚IL-12對新血管形成的抑制作用是通過免疫系統(tǒng)的哪種細胞起作用的，于是對免疫系統(tǒng)異常的小鼠種系進行小鼠角膜新血管形成測定。我們首先研究了T細胞缺陷的SCID小鼠。IL-12在SCID小鼠中保持了其對血管生成的抑制作用(以載體與IL-12分別處理小鼠，結果為血管長度0.98±0.06mm與0.22±0.02mm)(P＝0.0002)，時間4.6±0.4h與3±0.3h(P＝0.011)。其抑制作用程度與在胸腺機能正常的C57BL/6小鼠中觀察到的類似。自然殺傷細胞缺陷的beige小鼠經IL-12治療后觀察到了類似的抑制圖形(以載體或IL-12分別處理小鼠，結果為血管長度0.7±0.05mm與沒有新血管(P＜0.0001)，時間3.6±0.3h與沒有新血管(P＜0.0001))。發(fā)現(xiàn)光禿小鼠有自發(fā)的角膜新血管形成，該作用掩蓋了由基本纖維細胞生長因子誘發(fā)新血管的作用。不過上述發(fā)現(xiàn)的一致點在于經IL-12治療的動物沒有毛細血管生長進到小丸，而經載體處理的小鼠明顯生成了長入小丸的血管，這在一定程度上說明了IL-12對血管生成的抑制作用。9.IL-12與IFN-γ對內皮細胞體外增生的作用IL-12(在0.001-100ng/ml范圍內)對牛或小鼠的內皮細胞或血管內皮瘤細胞的增生沒有作用。經IL-12治療5天后，C57BL/6、SCID或光禿小鼠血清對各類型的內皮細胞增生沒有抑制作用。
IFN-γ(在0.0001-200ng/ml范圍內)對小鼠胰島內皮細胞增生僅有最小作用(與對照細胞相比有16％抑制)，對牛毛細管內皮細胞增生沒有作用。10.IFN-g作為IL-12體內活性傳遞介質的作用對C57BL/6小鼠單次注射IFN-γ抗體(在植入小丸當天，在第一次注射IL-12前2小時，每只小鼠腹膜內給藥1mg)完全消除了IL-12抗血管生成性質(P＜0.0001)。用大鼠IgG進行對照物注射(在植入小丸當天每只小鼠腹膜內注射1mg)。并不影響IL-12對新血管形成的抑制作用(圖3)。
為搞清楚IFN-γ治療是否會導致與IL-12類似的抑制血管生成作用，于是給C57BL/6小鼠每日腹膜內注射IFN-γ(250,000U/天，連續(xù)5天)。在這些小鼠中觀察到了對血管長度顯著(P＝0.0007)的抑制作用(圖4)，且沒有產生明顯的毒性。為保持IFN-γ水平恒定不變，腹膜內植入微滲透泵，在實驗過程中該泵釋放IFN-γ并達到130,000U/天的最終劑量。在泵植入72小時后植入基本纖維細胞生長因子小丸。植入載有鹽水的泵并不影響對照動物體內新血管的發(fā)育。這些動物體內新血管形成程度與不植入泵的對照動物相當。不過，植入含有IFN-γ的泵的動物，角膜中新血管生長被完全抑制了(圖4；與對照組相比，對血管長度，P＝0.0002，對時間，P＝0.0004)。對照動物與經IFN-γ治療的小鼠在剖腹術后的恢復階段中體重都下降了。植入小丸后，對照動物體重上升，而經IFN-γ治療的小鼠體重不變，并有嗜睡表現(xiàn)。11.IL-12與AGM-1470對Lewis肺癌的治療作用與用鹽水處理的對照動物相比，IL-12或AGM-1470有效地抑制接種了Lewis肺癌小鼠原發(fā)腫瘤的生長和自發(fā)的肺轉移瘤。同時用IL-12或AGM-1470治療患有Lewis肺癌小鼠，結果發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤體積比單用IL-12或AGM-1470治療的動物更小(圖5)，自發(fā)肺轉移瘤比單用IL-12或AGM-1470治療的動物更小(圖6)。在各組治療過程中均沒有明顯毒性產生。
權利要求
1.白細胞介素-12在藥物制備中的用途，該藥物用于治療由有害的或失控的血管生成所引起的疾病。
2.權利要求1的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病為新血管形成。
3.權利要求2的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病為視網膜/脈絡膜新血管形成。
4.權利要求3的用途，其中視網膜/脈絡膜新血管形成與糖尿病的視網膜病有關。
5.權利要求3的用途，其中視網膜/脈絡膜新血管形成與黃斑變性有關。
6.權利要求1的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病為角膜新血管形成。
7.白細胞介素-12在制備治療糖尿病的視網膜病的藥物中的用途。
8.白細胞介素-12在制備治療黃斑變性的藥物中的用途。
9.權利要求1的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病起源于固體瘤或血源性瘤及它們的轉移瘤。
10.權利要求l的用途，其中由有害的或的控的血管生成所引起的疾病為增生性玻璃體視網膜病。
11.按照權利要求1至10的白細胞介素-12加一種或多種其它的血管生成抑制劑的用途。
12.白細胞介素-12在治療如權利要求l至ll中任一項權利要求限定的疾病中的用途。
13.用于治療如權利要求1至11中任一項權利要求所述疾病的白細胞介素-12。
14.與一種或多種另外的血管生成抑制劑結合的白細胞介素-12，用于治療如權利要求1至11中任一項權利要求所述的疾病。
15.如前面所述的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及白細胞介素－12在藥物制備中的用途,該藥物用于治療有害的或失控的血管生成,這對治療糖尿病引起的視網膜病及黃斑變性具有重要意義。
文檔編號A61K38/20GK1189102SQ96191943
公開日1998年7月29日 申請日期1996年2月7日 優(yōu)先權日1996年2月7日
發(fā)明者摩西·J·?？寺? 加里·A·特魯依特, 埃米爾·E·沃斯特 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司, 兒童醫(yī)療中心公司