專利名稱：相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的msrv-1病毒和致病性和/或感染性msrv-2因子的制作方法
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是最常見的人類炎性風(fēng)濕病，其流行程度也特別高3％(1)。起初的診斷很困難其臨床異質(zhì)性，及與某些時(shí)候重要的免疫學(xué)異常相關(guān)的關(guān)節(jié)外癥狀，使之更為復(fù)雜化。這是一種目前仍不知病因的疾病，它被歸在自身免疫病一類，因?yàn)樗袑?duì)自身抗原的加劇的免疫學(xué)反應(yīng)。
有關(guān)RA的病毒性的和/或細(xì)菌性的病因?qū)W常常被提出來，但迄今為止仍不能成功地找到RA的致病因素(2)。
將RA定義為一種自身免疫病的概念以及那些支持病毒性或甚至細(xì)菌性病因?qū)W假說的概念很可能現(xiàn)已結(jié)合進(jìn)對(duì)多種機(jī)制的理解中，就如由Fujinami R.S.和Oldstone M.B.A(3)所描述的，一種微生物可以在被感染的宿主體內(nèi)誘發(fā)一種自身免疫反應(yīng)。已知細(xì)菌性或病毒性來源的分子，或者甚至是內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的分子均具有所謂超抗原特性(4， 5)。它們通過結(jié)合某些“T”受體的V區(qū)而直接刺激那些對(duì)不同的抗原具有專一性的T淋巴細(xì)胞，這一特點(diǎn)導(dǎo)致一種假說，即這些分子與自身免疫病理學(xué)的疾病發(fā)生過程是密切相關(guān)的(6)。然而，尚無任何特殊的細(xì)菌性或病毒性致病因素及可能的超抗原產(chǎn)生物，能明確地與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。
本申請(qǐng)人的尋找RA病因的工作現(xiàn)已導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了存在兩種病理學(xué)和/或感染性因子，各自獨(dú)立或是聯(lián)合地，相關(guān)于RA的病理學(xué)狀態(tài)。
由本申請(qǐng)人在研究多發(fā)性硬化癥(MS)的某個(gè)相關(guān)因素的工作中所用到的、并在法國專利申請(qǐng)92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，9401530，94 01531和94 01532中描述過，以及H.Perron et al.(7)的發(fā)表文章中描述過的培養(yǎng)和檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒性物質(zhì)的技術(shù)，使得有可能完全意外地證實(shí)MS的相關(guān)因素與那些構(gòu)成本發(fā)明主題的RA相關(guān)因素之間的相似性。
假定，在RA中，該過程發(fā)生在關(guān)節(jié)處，而且更特別牽涉到滑膜，則培養(yǎng)物應(yīng)該用從RA病人受感染的關(guān)節(jié)中穿刺得到的滑液中的細(xì)胞來制備。使用這樣一種培養(yǎng)物，就有可能獲得在體外增殖的成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞，從而允許進(jìn)行一些實(shí)驗(yàn)。該培養(yǎng)基質(zhì)被用于對(duì)經(jīng)超離心再經(jīng)等密度梯度離心純化而濃縮的感染性顆粒的有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶活性進(jìn)行研究。所用到的檢測(cè)條件是從源自MA(7)的LM7株發(fā)展來的，它能檢測(cè)該梯度的許多不同級(jí)份的有效逆轉(zhuǎn)錄酶活性。而后，用與有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶分子的共有序列相似的簡并引物經(jīng)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)分析在這些級(jí)份中擴(kuò)增的核酸序列，揭示了有效序列的存在，它與致病性和/或傳染性因子MSRV1和MSRV2的序列相同，該序列事先已在得自多發(fā)性硬化癥的病例的培養(yǎng)物中得到鑒定。
因此，本發(fā)明的各種主題如下I)使用一種病毒物質(zhì)，該物質(zhì)為純化或分離狀態(tài)，有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，相關(guān)于某內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒因子家族，得自某有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的病毒株，而該株是從分別被稱為POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)且登錄號(hào)為V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)且登錄號(hào)為V9310816)的兩種病毒株及其變異株中選出來的，這些變異株由帶至少一種抗原的病毒組成，該抗原能被至少一種抗體所識(shí)別，而該抗體又直接針對(duì)相關(guān)于上文提到的病毒株P(guān)OL-2和MS7PG的病毒中任何一個(gè)的至少一種抗原，目的是獲得診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述病毒物質(zhì)或其一種再激活物(均是與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的)引起的感染。
ii)使用一種病毒物質(zhì)，該物質(zhì)為純化或分離狀態(tài)，有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，相關(guān)于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒因子家族，由某個(gè)細(xì)胞系產(chǎn)生，該細(xì)胞系選自分別被稱為PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)93010817)的細(xì)胞系，或由任一種能產(chǎn)生帶至少一種抗原的病毒的受感染細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生，該抗原能被至少一種抗體識(shí)別，該抗體又直接針對(duì)相關(guān)于由前述PLI-2和LM7PC細(xì)胞系產(chǎn)生的任何一種病毒的至少一種抗原，目的是獲得診斷預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療由上述病毒物質(zhì)或者該病毒物質(zhì)的再激活物(其均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān))引起的感染。
iii)使用一種病毒物質(zhì)，其基因組包括選自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的一段核苷酸序列，特別是該核苷酸序列，在任一段由100個(gè)相鄰單體組成的序列上，與選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列有至少50％、優(yōu)選至少70％的同源性，為的是要獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或處理某感染，這種感染由上述病毒物質(zhì)或其再激活物(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)引起。
iv)使用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，該逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)基因組的pol基因包括一段等價(jià)核苷酸序列，它與屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒ERV-9或HSERV-9的基因組的pol基因的一段核苷酸序列有至少50％、優(yōu)選至少65％的同源性，目的是獲得診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療一種感染，此感染由上述病毒物質(zhì)或其再激活物(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)引起。
v)使用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，其基因組的pol基因編碼一段肽序列，此肽序列與由逆轉(zhuǎn)錄病毒ERV-9或HSERV-9基因組的pol基因所編碼的肽序列有至少50％、優(yōu)選至少70％同源性，目的是獲得診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療感染，該感染是由上述病毒物質(zhì)及其再激活物(均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān))引起。
vi)使用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，其基因組的pol基因編碼一段肽序列，對(duì)于該肽序列上任一段連續(xù)的至少帶30個(gè)氨基酸的序列而言，該肽序列與由選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列所編碼的一段肽序列有至少50％、優(yōu)選至少70％同源性，為的是獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療某感染，此感染由上述病毒物質(zhì)及其再激活物(均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān))引起。
vii)使用一段核苷酸片段，其核苷酸序列包括選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，尤其是這樣的核苷酸序列即其任一段含有100個(gè)緊鄰單體的連續(xù)序列與選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段序列有至少50％、優(yōu)選至少70％同源性，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療一種感染，它由上述病毒物質(zhì)，及其再激活物(均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān))引起。
viii)使用一種特殊的引物，該引物包括一段核苷酸序列，該序列與vii)中所定義的片段的核苷酸序列至少部分相同或等價(jià)，尤其是這樣的核苷酸序列，在其任一段帶10個(gè)連續(xù)單體的序列上，與上述片段的至少一部分有至少70％同源性，目的是通過聚合作用對(duì)相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種病毒物質(zhì)的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增，依照某一優(yōu)選的應(yīng)用，該引物包括一段選自SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO47，SEQ IDNO48和SEQ ID NO49及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
ix)使用一探針，它包括一段核苷酸序列，其相同于或等價(jià)于vii)中定義的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列，特別是一個(gè)核苷酸序列即在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的序列上與上述片段的至少某一部分具有至少70％的同源性，是為了獲得一種組合物以檢測(cè)、區(qū)分或鑒定一種生物學(xué)樣品中與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的一種病毒物質(zhì)或其激活物；按照一種優(yōu)選的應(yīng)用，該探針包含一個(gè)選自SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO16，SEQ IDNO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ IDNO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ IDNO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ IDNO33，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48和SEQ ID NO49及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
x)使用一種致病性和/或感染性因子，其為純化或分離狀態(tài)，區(qū)別于從i)到vi)任一項(xiàng)中定義的病毒物質(zhì)，它來自一種病毒株，而該病毒株選自分別被稱為POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)且錄入號(hào)為V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)為V93010816)的病毒株及其變異株，組成病毒株的致病性和/或感染性因子包括至少一種抗原，該抗原能被至少一種抗體識(shí)別，而這種抗體是能直接針對(duì)相應(yīng)于上文提到的POL-2和MS7PG病毒株的致病性和/或感染性因子中的任一種的至少一種抗原，這些因子均不同于上述病毒株的任一種逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療一種感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)引起。
xi)使用一種致病性和/或感染性因子，其為純化或分離狀態(tài)，不同于從i)到vi)中任一項(xiàng)定義的病毒物質(zhì)，由一個(gè)選自被分別稱為PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)為92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)為93010817)的兩個(gè)細(xì)胞系中的一個(gè)細(xì)胞系產(chǎn)生以及由能產(chǎn)生至少任一種致病性和/或感染性因子的受感染細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生，和/或由它們的變異物產(chǎn)生，或者由一種能產(chǎn)生帶至少一種抗原的致病性和/或感染性因子的受染細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生，這種抗原能被至少一種抗體所識(shí)別，該抗體則直接針對(duì)至少一種相應(yīng)于由上文提到的PLI-2系和LM7PC細(xì)胞系產(chǎn)生的任一種致病性和/或感染性因子的抗原，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防治或治療一種感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)引起。
xii)使用一種帶一種核酸的致病性和/或感染性因子，此核酸包括一段選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ IDNO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是與含有選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ IDNO40，SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一段序列的核苷酸序列有至少70％、優(yōu)選至少90％同源性的核苷酸序列，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療一種感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān))引起。
xiii)使用一核苷酸片段，它帶有一段選自SEQ ID NO 10，SEQ IDNO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這樣的核苷酸序列即在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上與選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ IDNO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一段序列至少有70％、優(yōu)選至少90％同源性，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療某感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其再激活物(均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān))引起。
xiv)使用一種引物，它帶有相同于或等價(jià)于xiii)中定義的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列的一段核苷酸序列，尤其是在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的序列上與上述片段的至少某一部分有至少90％同源性的核苷酸序列，以通過聚合來對(duì)相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病性和/或感染性因子的一段RNA或DNA進(jìn)行擴(kuò)增；依照某較有利的用法，該引物包含一段選自SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ IDNO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ IDNO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ IDNO44，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列，xv)使用一種探針，它含有一段相同于或等價(jià)于xiii)中定義的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列的核苷酸序列，尤其是這樣的核苷酸序列即在其任一段帶10個(gè)連續(xù)單體的序列上與上述片段的至少一部分有至少90％同源性，以獲得診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療某感染，它由上述致病性和/或感染性因子或其激活物(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)引起；依照一種較有利的用法，該探針帶有一段選自SEQ ID NO1 0， SEQ ID NO11， SE Q IDNO13，SE Q ID NO14，SEQ ID NO 15，SE Q ID NO27，SEQID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SE Q ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ IDNO44，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列，xiv)使用一種帶有兩種致病性和/或感染性因子的組合物，其為分離或純化狀態(tài)，即，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性、并與內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒因子家族有關(guān)的人病毒或其變異株組成的第一因子，以及第二因子或該第二因子的變異體，這兩種致病性和/或感染性因子是來自相同的病毒株，該病毒株選自分別被稱為POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V93010816)的兩株病毒株及其變異株，為的是獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療某感染，它由第一種致病性和/或感染性因子，以及第二種致病性和/或感染性因子(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或是上述第一因子或上述第二因子的再激活物引起，xvii)使用一種由兩種致病性和/或感染性因子組成的組合物，是處于分離或純化狀態(tài)的，即，由一種帶逆轉(zhuǎn)錄酶活性、并相關(guān)于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒因子家族的一種人類病毒或其變異體組成的第一因子，以及第二因子或其變異體，這兩種致病性和/或感染性因子是由相同的細(xì)胞系產(chǎn)生，該細(xì)胞系選自被分別稱為PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)93010817)的兩個(gè)細(xì)胞系，這兩種因子也可用一種能產(chǎn)生至少任一個(gè)致病性和/或感染性因子的一種受感染細(xì)胞培養(yǎng)物和/或其變異物產(chǎn)生，為的是獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療某感染，它由第一致病性和/或感染性因子，和第二致病性和/或感染性因子(它們均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或是上述第一因子或第二因子的再激活物引起。
xviii)使用一種含有兩種致病性和/或感染性因子的組合物，其為分離或純化態(tài)，就是說，由一種病毒或其變異物組成的第一因子，其基因組包括一個(gè)選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，尤其是這樣的核苷酸序列即在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上，與選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一個(gè)核苷酸序列有至少50％、優(yōu)選至少70％的同源性，以及第二致病性和/或感染性因子，其基因組合有一個(gè)選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，尤其是這樣的核苷酸序列即在其任一段帶100個(gè)連續(xù)單體的序列上，與選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一個(gè)核苷酸序列有至少70％、優(yōu)選至少90％的同源性，為的是獲取一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療某感染，它由第一致病性和/或感染性因子，和第二致病性和/或感染性因子(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或者上述第一因子或上述第二因子的一種再激活物引起，xix)使用一種核苷酸片段組合物，該組合物包括第一片段和第二片段，第一片段含有一個(gè)選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這樣的核苷酸序列即在任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上，與選自SEQ ID NO1，SEQID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列有至少50％、優(yōu)選至少70％的同源性，第二片段含有一個(gè)選自SEQ IDNO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ IDNO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這樣的核苷酸序列即在其任一段有100個(gè)連續(xù)單體的序列上，與選自SEQ ID NO10，SEQID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一個(gè)核苷酸序列有至少70％、優(yōu)選至少90％的同源性，上述每個(gè)片段特別是一個(gè)探針，以獲得一種診斷，預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)第一致病性和/或感染性因子，和第二致病性和/或感染性因子(均相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，或一種上述第一因子或上述第二因子的再激活物。
xx)使用一種含有ix)中定義的第一核苷酸片段部分地或全部地編碼出的一種第一多肽，及由ix)中定義的第二核苷酸片段部分或全部地編碼的一種第二多肽的組合物，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)第一致病性和/或感染性因子和第二致病性和/或感染性因子(均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān))；按一種優(yōu)選的用法，這種組合物包括一個(gè)第一配體和一個(gè)第二配體，第一配體特別是能特異性針對(duì)第一多肽的一種抗體，第二配體特別是能特異性針對(duì)第二多肽的一種抗體，所述第一和第二多肽在上文中已有定義，xxi)一種產(chǎn)生i)到vi)中任一項(xiàng)所定義的第一致病性和/或感染性因子和/或x)到xii)中任一項(xiàng)所定義的第二致病性和/或感染性因子的方法，這些因子均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)，其特征是來自滑液穿刺的細(xì)胞在體外培養(yǎng)，這些細(xì)胞特別是選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人關(guān)節(jié)液的脫皮成纖維細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞，xxii)一種產(chǎn)生i)到vi)中任一項(xiàng)定義的第一致病性和/或感染性因子和/或x)到xii)中任一項(xiàng)定義的第二致病性和/或感染性因子的方法，各因子均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)，其特征是經(jīng)Epstein-Barr病毒無限增殖化的B淋巴細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，這些細(xì)胞來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，xxiii)一種核苷酸片斷，其核苷酸序列含有一段選自SEQ IDNO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這樣的核苷酸序列即在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的順序中，與選自SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段序列顯示出至少50％、優(yōu)選至少70％的同源性，xxiv)一種用于擴(kuò)增的特定引物，該擴(kuò)增是通過聚合作用對(duì)按上述i)ii)iii)iv)v)或vi)描述的一種病毒物質(zhì)的某段RNA或DNA進(jìn)行的，這種引物包括一個(gè)相同于或等價(jià)于xxiii)中所述的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列，特別是一個(gè)顯示了與至少部分的上述片段在任一個(gè)含10個(gè)連續(xù)單體的順序上有至少70％同源性的核苷酸序列；本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選引物包括選自SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，以及他們的互補(bǔ)序列的一個(gè)核苷酸序列，xxv)一種能與上面i)ii)iii)iv)v)或vi)中所述的一種病毒物質(zhì)的RNA或DNA特異性雜交的探針，它包括一段等同于或等價(jià)于xxiii)中描述的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列的核苷酸序列，特別是一段在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的順序上與上述片段的至少一部分顯示出70％同源性的核苷酸序列；本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選探針包括選自SEQ ID NO47，SEQID NO48，SEQ ID NO49以及它們的互補(bǔ)序列的一個(gè)核苷酸序列，xxvi)一個(gè)核苷酸片段，其核苷酸序列包括選自SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及它們的互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的一個(gè)核苷酸序列，特別是在其任一個(gè)含100個(gè)連續(xù)單體的順序上，與選自SEQ ID NO40，SEQ IDNO41及它們的互補(bǔ)序列的一個(gè)序列顯示出至少70％、優(yōu)選至少90％同源性的核苷酸序列，xxvii)一個(gè)用于擴(kuò)增的特定引物，擴(kuò)增是通過聚合作用對(duì)上面x)xi)或xii)中所述的一種病毒物質(zhì)的RNA或DNA進(jìn)行的，該引物包括一個(gè)相同于或等價(jià)于xxvi)中描述的一個(gè)片段的至少部分核苷酸序列的核苷酸序列，特別是一個(gè)在其任一個(gè)含10個(gè)連續(xù)單體的順序上與上述片段的至少一部分顯示出至少90％同源性的核苷酸序列；本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選引物包括選自SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46及它們的互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列。
xxiii)一個(gè)能與上面x)xi)或xii)中描述的一種病毒物質(zhì)的RNA或DNA進(jìn)行特異性雜交的探針，它包括一段相同于或等價(jià)于xxvi)中描述的片段的至少部分核苷酸序列的核苷酸序列，特別是一個(gè)在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的順序上與上述片段的至少一部分顯示出至少90％同源性的核苷酸序列；本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選探針包括一段選自SEQ ID NO44，SEQID NO45，SEQ ID NO 46及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
在詳細(xì)介紹本發(fā)明之前，現(xiàn)在先規(guī)定出在說明書和權(quán)利要求書中用到的各種術(shù)語-菌株或分離株被認(rèn)為是指任何感染性和/或致病性生物學(xué)成分，例如，包括病毒和/或細(xì)菌和/或寄生蟲，并產(chǎn)生一種致病性和/或抗原性能力，能包含于培養(yǎng)物或活性宿主體內(nèi)；通過舉例的方式，按上文所規(guī)定的一種病毒株可能會(huì)包括一個(gè)共感染因子，如一種致病性原生生物，-本說明書中所用術(shù)語“MSRV”表示任一種致病性和/或感染性因子，相關(guān)于MS或RA，特別是一種病毒種，該病毒種的減毒株或從該種衍生出的缺損干擾顆粒。眾所周知，病毒特別是含RNA的病毒具有一種變異性，尤其是出現(xiàn)相對(duì)高水平的自發(fā)突變之后(9)，下文中將考慮到這點(diǎn)以定義等價(jià)的概念。
-人類病毒這一術(shù)語指一種能感染人類的病毒，-考慮到在實(shí)施本發(fā)明時(shí)可能遇到的所有天然的或誘導(dǎo)的變異，本發(fā)明的主題(包括上文規(guī)定的和權(quán)利要求書中有的)在文中均被表達(dá)為包括以下規(guī)定的各種生物學(xué)物質(zhì)特別是核苷酸或多肽同源序列的等價(jià)物或衍生物，-本發(fā)明的一種病毒或一種致病性和/或感染性因子的變異體包括至少一種抗原，它能被至少一種直接針對(duì)與上述病毒和/或上述致病性和/或感染性因子相應(yīng)的至少一種抗原的抗體所識(shí)別，和/或包括一個(gè)基因組，其中任一部分都能用至少一種雜交探針來檢測(cè)，和/或包括至少一種核苷酸擴(kuò)增引物，比如象那些有選自SEQ ID NO13到SEQ ID NO38和SEQ ID NO44到SEQ ID NO49及其互補(bǔ)序列的一個(gè)核苷酸序列，在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的特異性雜交條件下專一地針對(duì)上述病毒和/或致病性和/或感染性因子，-按本發(fā)明，一個(gè)核苷酸片段或一個(gè)核苷酸或一個(gè)多聚核苷酸是單體的一種排列，或一種生物多聚體，有天然核酸的信息序列的特征，能在預(yù)定條件下與任何其他核苷酸片段雜交，這種排列有可能包容了不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的單體，而且可能來自一種天然核酸分子和/或通過遺傳重組獲得和/或通過化學(xué)合成而獲得，-因此，一種單體可能是核酸的一種天然核苷酸，其組成為一種糖、一種磷酸基團(tuán)和一種含氮堿基；RNA中此糖為核糖，DNA中此糖為2-脫氧核糖；依據(jù)該核酸是DNA還是RNA，此含氮堿基則選自腺嘌呤、鳥嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶；或者此核苷酸可能在三種組成成分中至少有一種被修飾；舉例來說，修飾可能發(fā)生在堿基內(nèi)，產(chǎn)生已修飾過的堿基如次黃嘌呤核苷，5-甲基脫氧胞嘧啶核苷，脫氧尿嘧啶核苷，5-(二甲基氨基)脫氧尿嘧啶核苷，2，6-二氨基嘌呤，5-溴脫氧尿嘧啶核苷和任何其它促進(jìn)雜交的修飾堿基；就糖而言，修飾作用可包括用一種多聚酰胺取代至少一個(gè)脫氧核糖(10)，而考慮到磷酸基因，修飾作用可包括用酯類取代，特別是從二磷酸酯、烷基和芳基碳酸酯和硫代磷酸酯，-“信息序列”是指任意有序的單體序列，其化學(xué)性質(zhì)和在某參照方向中的順序構(gòu)成或不構(gòu)成如同天然核酸一樣性質(zhì)的一條有用信息，-雜交指一過程，在這過程中，在適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件下，有足夠的互補(bǔ)序列的兩種核苷酸片段配對(duì)到一起，形成一條復(fù)合鏈，尤其是一雙鏈或三鏈，優(yōu)選呈一螺旋形式。
-探針包括一段化學(xué)合成或是經(jīng)消化或酶裂解某一較長的核苷酸片段而得的核苷酸片段，有至少6個(gè)單體，較有利的是從10到100個(gè)單體，優(yōu)選10至30個(gè)單體，且在特殊條件下有雜交特異性；更可取的是，一種少于10個(gè)單體的探針并不單獨(dú)使用，而是在有其他相同大小或不同大小的探針存在的情況下使用；在一種特殊條件下，使用較長的探針也可能有用，如超過100個(gè)單體的探針；一種探針有可能被特別用于診斷目的，而這樣的探針就將是，舉個(gè)例子來說，捕獲和/或檢測(cè)探針。
-這種捕獲探針可用任何適當(dāng)?shù)姆绞?，也就是說直接地或間接地，固定在一種固相支持物上，如可通過共價(jià)結(jié)合或被動(dòng)吸附，-這種檢測(cè)探針可進(jìn)行標(biāo)記，用特別選自放射性同位素的標(biāo)記物標(biāo)記，用特別選自過氧化物酶和堿性磷酸酶，以及那些能水解一種產(chǎn)色、產(chǎn)熒光、或發(fā)光底物的酶來標(biāo)記，還可用生色的化合物，產(chǎn)色、產(chǎn)熒光的或發(fā)光的化合物，核苷酸堿基的類似物以及生物素標(biāo)記。
-本發(fā)明中用于診斷的探針可被用于所有已知的雜交技術(shù)，特別是“斑點(diǎn)印跡”(11)、“Southern印跡”(12)、“Northern印跡”(是一種相同于“Southern印跡”但使用RNA作為靶子的技術(shù))，及夾心技術(shù)(13)；本發(fā)明中較有利的是夾心技術(shù)的應(yīng)用，它包括一種特異性的捕獲探針和/或一種特異性的檢測(cè)探針，應(yīng)理解，這里的捕獲探針和檢測(cè)探針應(yīng)具有至少是部分不同的一個(gè)核苷酸序列。
-本發(fā)明還包括一種能在體內(nèi)或體外與RNA和/或DNA雜交的探針，以鎖定復(fù)制現(xiàn)象，尤其是翻譯和/或轉(zhuǎn)錄，和/或降解上述DNA和/或RNA，-引物是帶有至少6個(gè)單體、優(yōu)選有10至30個(gè)單體、在特殊條件下有雜交專一性的探針，它是為了啟動(dòng)酶促聚合反應(yīng)，如在諸如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))這樣的擴(kuò)增技術(shù)中，在象排序這樣的延伸過程中，在逆轉(zhuǎn)錄方式或類似過程中，-兩種核苷酸或肽序列被說成是就它們相互間而言，就一參照序列而言是等價(jià)的或派生的，前提是如果就功能性來說，相應(yīng)的生物聚合物即使不相同，考慮到應(yīng)用或在它們所涉及的技術(shù)中，可能實(shí)質(zhì)上扮演了相同的角色；特別等價(jià)的序列是在天然變異基礎(chǔ)上得到的兩個(gè)序列，尤其是從它們被鑒定出的生物種的自發(fā)突變或誘導(dǎo)而得序列以及具有下面定義的同源性的同源序列。
-變異性指對(duì)序列的任何自發(fā)或誘導(dǎo)的修飾，尤其是由取代和/或插入和/或缺失核苷酸和/或核苷酸片段而造成的，和/或在至少一個(gè)末端延長和/或縮短序列而造成的；非天然變異可能是由于使用遺傳工程技術(shù)的結(jié)果，例如挑選簡并或非簡并合成引物來選擇性地?cái)U(kuò)增某一核酸而造成的；這種變異可能會(huì)表現(xiàn)為對(duì)任一起始序列的修飾，作為參照來考慮，它也可能以相對(duì)于上述參照序列的同源性程度來表達(dá)，-同源性表現(xiàn)了兩種相比較的核苷酸或肽片段相似性的程度；它用相似性的百分率來計(jì)算，這特別是將核苷酸或肽序列與參照核苷酸或肽序列直接比較而得到的，-這種相似性百分率已被專一地用于測(cè)定組成本發(fā)明的一個(gè)部分的核苷酸片段，它們與鑒定自SEQ ID NO1至SEQ ID NO9，SEQ IDNO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43的片段同源(MSRV-1)，這是一個(gè)方面，另一方面還有那些與鑒定自SEQ ID NO10至SEQ IDNO12，及SEQ ID NO40至SEQ ID NO43的片段同源的片段(MSRV-2)，就象測(cè)定與鑒定自SEQ ID NO16至SEQ ID NO26，SEQ IDNO31至SEQ ID NO33和SEQ ID NO47至SEQ ID NO49的探針和引物同源的探針和引物的相似性程度一樣，這是其一，還有那些鑒定自SEQID NO13至SEQ ID NO15，SEQ ID NO27至SEQ ID NO30，SEQ IDNO34至SEQ ID NO37及SEQ ID NO44至SEQ ID NO46的探針和引物，這是其二；經(jīng)實(shí)例論證，在得自MSRV-1的病毒RNA片段的核酸上各種通用共用序列之間所觀察到的最低相似百分率在圖2所描繪的區(qū)段中是67％，而MSRV-1則是根據(jù)稍后所要概括的步驟從LM7PG和PLI-2細(xì)胞系中衍生來的。
-任一個(gè)核苷酸片段若具有等價(jià)于參照序列的核苷酸序列，它就被說成是等價(jià)于或衍生于參照片段；根據(jù)上面的定義，以下片斷特別等價(jià)于參照核苷酸片段a)任何能至少部分地與參照片斷的互補(bǔ)片斷雜交的片段b)與參照片斷對(duì)比時(shí)顯示出數(shù)量上多于其它任何源于其它分類群的相同連續(xù)堿基的任何片斷，c)由其來源于的生物種的天然變異所產(chǎn)生或易于產(chǎn)生的任何片段d)任何易于由對(duì)參照片段應(yīng)用遺傳工程技術(shù)而得到的片段e)任何片段，包括至少8個(gè)緊鄰的核苷酸，編碼一種與參照片段所編碼的肽同源或相同的肽f)任何由于插入、缺失、取代至少一個(gè)單體，延長或縮短至少一個(gè)末端而區(qū)別于參照片段的片段；如，任一個(gè)相應(yīng)于參照片段在至少其中一個(gè)末端上用不編碼多肽的核苷酸序列填充的片段-多肽一詞特指一種至少有2個(gè)氨基酸的肽，特別是寡肽或蛋白質(zhì)，通過人的干預(yù)而提取、區(qū)分或大體上分離出或合成的，特別是那些用化學(xué)合成或在重組有機(jī)物中表達(dá)而得到的，-至少部分是由核苷酸片段編碼出的表達(dá)多肽被理解為，有至少3個(gè)由包含于上述核苷酸片段的至少9個(gè)緊鄰的單體編碼的氨基酸的多肽-一個(gè)氨基酸在如下情況中被說成另一個(gè)氨基酸的類似物即當(dāng)它們各自的理化性質(zhì)，如極性、疏水性和/或堿性和/或酸性和/或中性，都基本上相同時(shí)；因此，亮氨酸是異亮氨酸的類似物-一個(gè)多肽被說成是等價(jià)于或源自一個(gè)參照多肽，條件是進(jìn)行比較的多肽具有大體相同的性質(zhì)，而且特別是相同的抗原性、免疫學(xué)酶學(xué)和/或分子識(shí)別性質(zhì)；特別是以下多肽均等價(jià)于一個(gè)參照多肽a)具有一個(gè)序列的任一個(gè)多肽，該序列中至少有一個(gè)氨基酸被一個(gè)類似氨基酸取代，b)任一個(gè)有等價(jià)肽序列的多肽，它由上述參照多肽和/或編碼上述多肽的核苷酸片段的自發(fā)變異或誘導(dǎo)變異而得到，c)上述參照多肽的一個(gè)minotope，d)任一個(gè)多肽，在其序列中一個(gè)或更多的來自L系列的氨基酸被一個(gè)來自D系列的氨基酸取代，反之亦然。
e)任一個(gè)多肽，其中，相應(yīng)的親代肽(其肽鏈上不含任何NH-CO鍵)的肽鏈上的至少一個(gè)CO-NH鏈、最好是所有CO-NH鍵被一個(gè)(或更多)NH-CO鍵所取代，f)任一個(gè)多肽，其中相應(yīng)的親代肽(其肽鏈上不含任何NH-CO鍵)的肽鏈上的至少一個(gè)CO-NH鏈、最好是所有CO-NH鏈被一個(gè)(或更多)NH-CO鍵取代，每個(gè)氨酰殘基的手性，不管它是否被牽涉進(jìn)一個(gè)或更多上文提到的CO-NH鍵，相對(duì)于組成上述親代肽的相應(yīng)氨酰殘基而被保留或被轉(zhuǎn)化，這些肽類化合物還被表示為immunoretroids，g)任一個(gè)多肽，其序列中對(duì)氨基酸側(cè)鏈的修飾已經(jīng)被導(dǎo)入，象胺功能的乙?；瑤€基功能的羧化或羧基功能的酯化，h)任一個(gè)多肽，其序列中一個(gè)或多個(gè)肽鍵已被修飾，如卡巴、逆、反向，逆反，被還原和亞甲氧基鍵，i)任一個(gè)多肽，它的至少一個(gè)抗原能被參照多肽的一抗原識(shí)別。
-兩個(gè)相對(duì)照的肽段表現(xiàn)同源性特征的相似性百分率，按本發(fā)明，是至少50％，且優(yōu)選至少是70％。
假定一種有逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性的病毒可能被按遺傳學(xué)的方式表示為RNA和DNA形式的特征，就應(yīng)該同時(shí)提及病毒性DNA和病毒性RNA，以鑒定與有這樣的逆轉(zhuǎn)錄酶活性的病毒(MSRV-1)有關(guān)的序列的特征。
假定在受染細(xì)胞中，這種致病性和/或感染性因子(MSRV-2)一起作為DNA和作為RNA被檢測(cè)出來，它的特征也應(yīng)表示成DNA或RNA形式。
本說明書及權(quán)利要求書中用到的“序列”一詞，如“第一核苷酸序列”均不用于表達(dá)一個(gè)特殊的順序，而是為了更清楚地解釋本發(fā)明。
在閱讀了下列詳細(xì)說明后，將對(duì)本發(fā)明有較好的理解，同時(shí)也需參考附圖，它們是-

圖1描述了根據(jù)shih的過程(8)得自LM7培養(yǎng)物的MSRV-2A型的序列；該序列在參考SEQ ID NO10之下被鑒定出來-圖2描述了經(jīng)PCR技術(shù)在“pol”區(qū)擴(kuò)增到的MSRV-1B序列的通用核酸共有序列，用的病毒性DNA來自LM7PC和PLI-2細(xì)胞系，被識(shí)別在SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5和SEQ IDNO6，帶SEQ ID NO7的擴(kuò)增引物的常見共有序列之下。
-圖3描述了在shih(8)定義的“pol”區(qū)的PCR得到的MSRV-1B型的序列的系統(tǒng)樹。
-圖4給出了每個(gè)MSRV-1B/“PCR POL”型家族的功能性閱讀框架的定義，上述家族A到D分別被圖2中定義的核苷酸序列SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所定義，-圖5給出了MSRV-2B序列的共有序列的一個(gè)實(shí)例，鑒定為SEQ ID NO11，-圖6描述了PSJ17克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO9)，-圖7描述稱為M003-P004的克隆的核苷酸序列SEQ ID NO8，-圖8描述了F11-1克隆的SEQ ID NO2核苷酸序列；在引物區(qū)兩個(gè)箭頭所指部分相應(yīng)于在對(duì)用于克隆F11-1的引物進(jìn)行選擇時(shí)產(chǎn)生的變異；在這同一個(gè)圖上還描述了翻譯成氨基酸的結(jié)果。
-圖9描述了SEQ ID NO1核苷酸序列，及可能將SEQ ID NO1讀成氨基酸的一個(gè)功能性框架；在這個(gè)序列中，逆轉(zhuǎn)錄病毒性逆轉(zhuǎn)錄酶的序列下被劃了線。
-圖10描述了被稱作MSRV2EL1的克隆的核苷酸序列SEQ IDNO12，-圖11，由三個(gè)連續(xù)頁組成，它描述了按照6個(gè)可能的閱讀框架將SEQ ID NO12(包括引物SEQ ID NO13)翻譯為氨基酸，-圖12顯示了在MSRV2-EL1序列(SEQ ID NO12)上MSRV2-A序列(SEQ ID NO10)的一種排列；引物雜交區(qū)識(shí)別在SEQ IDNO13參照下(除了克隆尾部以外)，在同一圖中框出；識(shí)別在SEQ IDNO14參照下的引物雜交區(qū)則表示在方括號(hào)之間，-圖13描述了在實(shí)施例7所規(guī)定的條件下對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活性的測(cè)定，測(cè)定是在蔗糖梯度的級(jí)分中進(jìn)行的，該梯度已完成沉隆作用達(dá)到了存在于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的感染性和/或致病性因子的平衡點(diǎn)，該細(xì)胞取自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)液，就如實(shí)施例7所描述的那樣；該曲線描繪了在梯度的不同部分逆轉(zhuǎn)錄酶活性的變化；該活性以DPM(每分鐘分解量)為單位表示在Y軸上；X軸代表在梯度上按密度遞增順序收集到的部分(從第1級(jí)分到第10級(jí)分)，-圖14，分為圖14A，14B和14C，在圖14A中顯示被SEQ IDNO39識(shí)別的“MSRV-1 pol PR”克隆的序列，它是在實(shí)施例9規(guī)定的條件下得自一類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎樣品；圖14B和14C顯示了分別帶SEQID NO1和SEQ ID NO6的這個(gè)克隆的序列排列，它與得自多發(fā)性硬化癥來源的樣品的逆轉(zhuǎn)錄病毒MSRV-1的序列是一致的。
-圖15，分成圖15A，15B和15C，在圖15A中，顯示，被SEQID NO40識(shí)別的“MSRV2sPR”克隆的序列，它是按實(shí)施例9所規(guī)定的條件從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎樣品中得到的；圖15B和15C顯示這個(gè)分別帶SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的克隆的序列排列，它與得自多發(fā)性硬化癥來源的感染因子MSRV-2的序列一致，-圖16顯示被SEQ ID NO41識(shí)別的“MSRV2cPR”克隆的序列，它按實(shí)施例10所規(guī)定的條件從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)液的細(xì)胞中得到，
-圖17顯示被SEQ ID NO41識(shí)別的“MSRV2cPR”克隆的序列，它是得自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液的細(xì)胞，以及帶SEQ ID NO10的該克降的序列末端部分(654-705)的排列，與得自多發(fā)性硬化癥樣品的MSRV-2感染因子的序列一致，-圖18顯示被SEQ ID NO41識(shí)別的“MSRV2cPR”克隆的序列，得自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液的細(xì)胞，以及這個(gè)帶SEQ ID NO12的克隆的序列排列，與多發(fā)性硬化癥來源樣品的MSRV-2感染因子的一個(gè)序列一致，-圖19顯示被SEQ ID NO42識(shí)別的“MSRV1nPR”克隆的序列，它是用類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液得出的，是按實(shí)施例10規(guī)定的條件進(jìn)行的。
-圖20顯示被SEQ ID NO43識(shí)別的“MSRV1nPR”克隆的序列，得自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液的細(xì)胞，而且這個(gè)帶SEQ ID NO1的克隆的序列排列與來自多發(fā)性硬化癥樣品的MSRV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)序列一致。
實(shí)施例1通過在來自LM7系細(xì)胞培養(yǎng)物的純化感染因子制備物中擴(kuò)增依賴RNA的DNA聚合酶基因保守區(qū)，來產(chǎn)生被稱為MSRV-2A的MSRV-2克隆。
分子學(xué)方法在于使用PCR技術(shù)(8)，它使得有可能擴(kuò)增外源及內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因的相對(duì)保守區(qū)域，也可以是能編碼有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性的酶的病毒，如特別是乙肝病毒，更可以說是任何依賴RNA的DNA聚合酶或酶基因的，只要在這一區(qū)段內(nèi)有由擴(kuò)增引物所規(guī)定的足夠的序列同源性。這一PCT技術(shù)被用在抽提自感染因子的純化制品的核酸上，該制品按程序(14)從最初的LM7培養(yǎng)物上清(7)得到后就保存在-80℃的深冷冰箱中。包含了LM7型RT活性峰的級(jí)分被置于一個(gè)體積的有硫氰酸胍(15)的緩沖液中，-80℃保存，直到按P.Chomzynski(15)描述的技術(shù)抽提核酸。
PCR反應(yīng)之前，樣品中的RNA用所謂“隨機(jī)”引物(六核苷酸的混合物)在“DNA合成系統(tǒng)plus”試劑盒(Amersham)中轉(zhuǎn)錄或互補(bǔ)DNA，要按照廠家的建議并基于樣品中存在的RNA量的近似值，最接近于對(duì)數(shù)因子(log factor)。
對(duì)cDNA作PCR擴(kuò)增后得到的DNA用TA克隆盒(Britishbiotechnology)插入一質(zhì)粒中。2μl DNA溶液與5μl無菌蒸餾水、1μl10倍濃度的連接緩沖液“10X LIGATION BUFFER”、2μl“pCRTMVECTOR” (25ng/ml)和1μl“TA DNA LIGASE”一起混合。這一混合物12℃溫育過夜。隨后步驟的完成按TA Cloning Kit的說明書進(jìn)行。在程序的最后，挑選出重組細(xì)菌的白色菌落以便進(jìn)行培養(yǎng)和按所謂的“小量制備”程序(16)提取有關(guān)質(zhì)粒。得自每個(gè)重組菌落的質(zhì)粒制備物用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈畈⒃诃傊悄z上分析。用溴化乙錠對(duì)疑膠染色后，質(zhì)粒上帶有插入序列可在紫外光下檢測(cè)出來，這種質(zhì)粒經(jīng)與互補(bǔ)于“TA Cloning Kit”的克隆質(zhì)粒上的Sp6啟動(dòng)子的引物雜交被選擇來，對(duì)插入序列測(cè)序。測(cè)序前要按使用測(cè)序盒“Prism readyreaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit”(AppliedBiosystems提供，Ref.401384)所建議的方法進(jìn)行反應(yīng)，且自動(dòng)測(cè)序是用“Automatic Seq uencer”373A型(Applied Biosystems提供)按其廠家說明進(jìn)行的。
所得序列再用Mac Vector和關(guān)于核酸序列的計(jì)算化數(shù)據(jù)庫基因庫的Gene works軟件，及Swiss Prot(為由核酸序列中已證實(shí)的閱讀框架推斷出的氨基酸序列而設(shè))進(jìn)行分析。對(duì)從源于解凍的LM7上清液的病毒樣品得到、并在蔗糖梯度上的逆轉(zhuǎn)錄酶活性峰區(qū)純化到的序列的分析，顯示了克隆的一個(gè)主要群體(約42％克隆)，相對(duì)于其他序列的單個(gè)代表的范圍(總是少于5％或在少數(shù)情況中甚至小于10％)，且與已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒在預(yù)期的“pol”區(qū)有部分同源性。這個(gè)克隆被稱為MSRV2-A，并被SEQ ID NO10鑒別(參看圖1)。在PCR引物之間被擴(kuò)增的區(qū)段與由SEQ ID NO11識(shí)別的MSRV2-B(參看圖5)相應(yīng)序列同源，在實(shí)施例2中有描述。在位于PCR引物上的序列中發(fā)現(xiàn)的不同之處被解釋為是因?yàn)橛昧撕啿⒁镒骰旌衔?，并在不同技術(shù)條件下使用。對(duì)基因庫數(shù)據(jù)庫的詢問迄今尚無可能揭示一完全相同的序列，或是有顯著同源的序列。
這個(gè)序列示于圖1中。圖1所示序列有一開放性閱讀框架，它位于兩末端都發(fā)現(xiàn)有PCR引物的框架中，但它要短于已知的介于這些引物之間的預(yù)期區(qū)段內(nèi)的一套逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。在這個(gè)序列中發(fā)現(xiàn)相對(duì)于相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(8)有45個(gè)堿基對(duì)(15個(gè)氨基酸)的缺失，它跟在上游引物序列之后，而下游引物之前還有一些序列。然而，該閱讀框架是開放的并且貫穿包括幾個(gè)引物在內(nèi)的整個(gè)序列而未被打斷，由它推斷出的氨基酸序列與已知的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒的相應(yīng)區(qū)域有顯著同源性。位于PCR引物內(nèi)部的序列中，谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和天冬氨酸(正常情況下它們?cè)谀孓D(zhuǎn)錄病毒和已知的其他有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的病毒的這個(gè)pol區(qū)是相當(dāng)保守的)(8)現(xiàn)都被保存在新序列的閱讀框架里的正確位置上。
最后，如果這個(gè)序列明顯不同于數(shù)據(jù)庫中已描述過的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，就能提請(qǐng)大家注意這是個(gè)屬于新的感染和/或致病因子的序列，稱為MSRV-2a。根據(jù)對(duì)所得序列的分析，這種因子大體上與一種逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)，但考慮到為得到這個(gè)序列所使用的技術(shù)，它也有可能是一個(gè)帶有DNA的病毒，其基因組能編碼一種偶然帶有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶，例如，乙肝病毒(HBV)就屬于這種情況(8)。更進(jìn)一步考慮，在這一PCR擴(kuò)增技術(shù)中用到的簡并引物的隨機(jī)特點(diǎn)，會(huì)由于無法預(yù)見的序列同源性或有關(guān)的酶的基因中的保守位點(diǎn)，而使得有可能擴(kuò)增來源于原核或真核的致病和/或其感染因子(原生物)的一段核酸。
實(shí)施例2通過在得自LM7PC和PLI-2系的毒粒制品中對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的保守性pol區(qū)進(jìn)行“嵌套”PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生被稱為MSRV-1B和MSRV-2B的克隆，其分別定義一種逆轉(zhuǎn)錄病毒MSRV-1和共感染因子MSRV2這里使用了一種來自Shih所發(fā)表的技術(shù)(8)的PCR技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)通過用DNase處理反應(yīng)基質(zhì)中的所有成分，使得有可能去除所有痕量污染DNA。它同時(shí)還通過在PCR擴(kuò)增循環(huán)的兩個(gè)連續(xù)系列內(nèi)應(yīng)用不同但重疊的引物，使得有可能增加由一定量RNA合成的原本就較少，后來更因DNase對(duì)RNA的干擾作用而在樣品中更為減少的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增的機(jī)會(huì)。實(shí)際上，DNase在用時(shí)是處于過強(qiáng)活性的條件下，這樣就能在這種酶經(jīng)85℃加熱10分鐘被滅活之前去除所有污染的DNA的痕跡。由Shih(8)所描述的PCR技術(shù)的這一變化用在一段cDNA上，該cDNA是按H.Perron描述的技術(shù)(14)從蔗糖梯度純化的感染顆粒的片段的核酸合成的，這些顆粒一方面來自PLI- 2細(xì)胞系(ECACCNO.92072201)產(chǎn)生的“POL-2”分離株(ECACC NO.V92072202)，另一方面來自LM7PC細(xì)胞系(ECACC NO.93010817)產(chǎn)生的MS7PG分離株(ECACC NO.V93010816)。這些培養(yǎng)物均按構(gòu)成公布在Nos.WO 93/20188和WO 92/20189的專利申請(qǐng)的主題的方法來獲得。
用TA Cloning Kit克隆經(jīng)這一技術(shù)擴(kuò)增的產(chǎn)物并用自動(dòng)測(cè)序儀按實(shí)施例1的描述分析序列后，這些序列用基因庫數(shù)據(jù)庫的最新適用版本的Geneworks軟件進(jìn)行分析。
從這些樣品中克隆并測(cè)序的序列特別與兩個(gè)類型的序列相關(guān)第一型序列，發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)克隆中(55％的來自PLI-2培養(yǎng)物的POL-2分離株的克隆和67％的來自LM7PC培養(yǎng)物的MS7PG分離株的克隆)，這個(gè)序列相關(guān)于一個(gè)“pol”序列家族，后者相似于但又不同于被稱為ERV-9或HSERV-9的內(nèi)源性人類逆轉(zhuǎn)錄病毒；第二型序列，它相關(guān)于那些與屬于上文所指MSRV-2的感染和/或致病因子的序列有很高同源性的序列。
出現(xiàn)在大多數(shù)克隆中的第一型序列由這樣一些序列組成，它們的多變性使得有可能定義序列的四個(gè)亞家族。這些亞家族相互間很相似，因而可以把它們看作是來自同一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的類似種，就象眾所周知的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒的情形一樣(17)或者可以把它們看作是與共調(diào)節(jié)于生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)內(nèi)源性原病毒相互作用的結(jié)果。這些或多或少有缺陷的內(nèi)源因子對(duì)可能是由一個(gè)復(fù)制原病毒產(chǎn)生的相同調(diào)節(jié)信號(hào)敏感，因?yàn)樗鼈儗儆谕粋€(gè)內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒家族(18)。這個(gè)內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒新家族，或者換個(gè)說法，這個(gè)新的逆轉(zhuǎn)錄病毒種(其類似種后代在培養(yǎng)物中獲得，且它包括下文所述的共有序列)被稱為MSRV-1B。
圖2表示出本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的各種MSRV-1B克隆的序列的通用共有序列，這些序列各自被鑒別為SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5和SEQ ID NO6。這些序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中的參考X57147和M37638的HSERV9序列有從70％至88％的核酸同源性。圖3描述了這些序列的系統(tǒng)樹。此圖中，A，B，C和D亞家族代表了主要在隨后重復(fù)的類似實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的序列，它們存在于純化自MS7PG和POL-2分離株的毒粒的純RNA樣品中。從序列的這些家庭中定義了代表不同的可能為外源性MSRV-1B逆轉(zhuǎn)錄病毒的類似種、或者代表MSRV-1B內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的不同亞家族的四種“共有”核酸序列。圖4表示這些代表性共有序列，并翻譯成了氨基酸。這些MSRV-lB序列的每個(gè)亞家族都存在一個(gè)功能性閱讀框架，而且顯然每例中的功能性開放閱讀框架均與核酸序列下第二行上的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)。被SEQ ID NO7識(shí)別的MSRV-1B序列的通用共有序列表示在圖2中，它是通過在“pol”區(qū)的這種PCR技術(shù)獲得的。
出現(xiàn)在大多數(shù)測(cè)序的克隆的第二型序列由圖5中的MSRV-2B，并由SEQ ID NOll所識(shí)別。在PCR引物之間擴(kuò)增的區(qū)段與實(shí)施例1所述的位于PCR引物內(nèi)的MSRV2-A序列(圖1上SEQ ID NO10)，在最鄰近的堿基水平上有同源性。在相應(yīng)于PCR引物的序列中發(fā)現(xiàn)的差別被解釋成在各種技術(shù)條件下使用簡并引物作為混合物的結(jié)果。
MSRV-2A(SEQ ID NO10)和MSRV-2B(SEQ ID NO11)這兩種序列，從跡象看(它們是同源的，或甚至相同的)是衍生自同一種生物體，而且它們明顯不同于數(shù)據(jù)庫中已描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，這就使得有可能認(rèn)為這是個(gè)屬于一種新感染因子的序列區(qū)，稱為MSRV-2。根據(jù)已獲得的對(duì)第一序列的分析，這種感染因子看起來大體上相關(guān)于某逆轉(zhuǎn)錄病毒，但考慮到為獲得這一序列而采用的技術(shù)，它也可能是一種DNA病毒，其基因組編碼偶然地具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶，例如，乙酐病毒(HBV)就是這種情況(8)。而且，在這一PCR擴(kuò)增技術(shù)中用到的簡并引物的隨機(jī)特性，會(huì)由于無法預(yù)見的序列同源性或由于有關(guān)酶的基因中保守的位點(diǎn)而使得有可能擴(kuò)增一段來源于原核或真核致病和/或感染因子(原生生物)的核酸。
實(shí)施例3通過內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄酶與來自PLI-2系的毒粒制品作用來產(chǎn)生PSJl7克隆，它定義一種逆轉(zhuǎn)錄病毒MSRV-1。
這條途徑直接涉及從分離株中假定的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，用同樣是這個(gè)分離株所具有的逆轉(zhuǎn)錄酶活性獲得被逆轉(zhuǎn)錄成的DNA序列。理論上，這種逆轉(zhuǎn)錄酶活性僅能在有逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA時(shí)才有功能，該RNA可連在一引物tRNA上或與已在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中被逆轉(zhuǎn)錄的DNA短鏈雜交(19)。這樣，在被細(xì)胞核酸所污染的材料中特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列的產(chǎn)生就被這些作者通過病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性對(duì)病毒的RNA部分進(jìn)行專一性酶促擴(kuò)增的方式來優(yōu)化。為此，作者們確定了專門的理化條件，在這些條件下毒粒中所帶的RNA上的這種逆轉(zhuǎn)錄酶促活性可在體外試驗(yàn)中生效。這些條件與下文所述程序的技術(shù)性描述(內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，純化，克隆和測(cè)序)相關(guān)。
這條分子途徑在于使用一種濃縮但未純化的制品，毒粒從已備的PLI-2細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液根據(jù)以下方法獲得每周收集兩次培養(yǎng)物上清液，10,000rpm預(yù)離心30分鐘以除去細(xì)胞碎片，然后凍于-80℃或者直接用于下續(xù)步驟。4℃下，新鮮或解凍的上清液在30％PBS-甘油墊層上100,000g離心(或在一個(gè)LKB-HITACHI 45T型轉(zhuǎn)子中30,000rpm)2小時(shí)。棄上清液，沉淀團(tuán)用小體積PBS溶解并形成濃縮但未純化的毒粒。這種濃縮但未純化的病毒樣品被用來進(jìn)行一項(xiàng)稱之為內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄作用的反應(yīng)，照如下進(jìn)行按上文描述的過程純化的毒粒200μl(其中有逆轉(zhuǎn)錄酶活性約1-5百萬dpm)在37℃解凍直到出現(xiàn)液相，再置于冰上。一種5倍濃度的緩沖液已預(yù)備好，其中有如下成分Tris-HCl pH8.2，500mM；NaCl 75mM；MgCl225mM，DTT75mM和NP40 0.10％。100μl5倍濃度(5X)緩沖液+25μl dATP濃度為100mM的溶液+25μl dTTP濃度為100mM的溶液+25μl dGTP 100mM溶液+25μl dCTP 100ml溶液+100μl無菌蒸餾水+在PBS中的200μl毒粒懸浮液(逆轉(zhuǎn)錄酶活性為5百萬dpm)混合到一起，42℃溫育3小時(shí)。進(jìn)行這種溫育之后，反應(yīng)混合物直接加入酚/氯仿/異戊醇緩沖混合物(Sigma ref.P3803)中；收集水相并加1倍體積的無菌蒸餾水到有機(jī)相以重新抽提剩余的核酸材料。水相收集物集中起來，其中所含核酸通過加3M乙酸鈉(pH5.2)1/10體積，加2倍體積乙醇和1μl糖原(Boehringer-Mannheim ref.901 393)而沉淀下來，樣品置于-20℃4小時(shí)或4℃過夜。離心后得到的沉淀物再用70％乙醇洗滌并重新懸浮于60ml蒸餾水中。這個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物隨后被純化、克隆并測(cè)序，是按照如下程序進(jìn)行在其末尾處帶有未成對(duì)的腺嘌呤的鈍末端DNAs被進(jìn)行增殖先進(jìn)應(yīng)行一個(gè)“補(bǔ)平”反應(yīng)，25μl預(yù)先純化過的DNA溶液與2μl的一種2.5mM溶液(含有等摩爾量的dATP+dGTP+dTTP+dCTP/1μl DNA聚合酶T4(Boehringer-Mannheim ref.004 786)/5μl10X“限制性酶溫育緩沖液”(Boehringer-Mannheim ref.417 975)/1μl 1％牛血清白蛋白溶液/16μl無菌蒸餾水)混合。該混合物在11℃溫育20分鐘。向其中加入5μl TE緩沖液和1μl糖原(Boehringer-Mannheim ref.901 393)，然后用酚/氯仿/異戊醇(Sigma ref，P3803)抽提核酸，再用乙酸鈉按上文所述進(jìn)行沉淀。將離心后沉淀下來的DNA重新懸浮于1μl 10mM Tris緩沖液(pH7.5)中。5μl這樣的懸浮液再與20μl 5X Taq緩沖液、20μl 5mMdATP、1μl(5U)Taq DNA聚合酶(AmplitaqTM)及54μl無菌蒸餾水混合?；旌衔?5℃培育2小時(shí)，在溶液表面有一層油膜。培育后從油膜下提取的懸浮液水相溶液中的DNA照前述進(jìn)行沉淀并重新懸浮于2μl無菌蒸餾水中。所得DNA用TA CloningTMKit插入一質(zhì)粒中。2μlDNA溶液與5μl無菌蒸餾水、1μl 10倍濃度連接緩沖液“10XLIGATION BUFFER”、2μl “pCRTMVECTOR”(25ng/ml)及1μl“TA DNA LIGASE”混合。這個(gè)混合物于12℃溫育過夜。后續(xù)步驟按TA Cloning Kit(British Biotechnology)的說明來進(jìn)行。程序的最后，挑出重組細(xì)菌的白色菌落以便培養(yǎng)并能依據(jù)被稱為“小量制備”的程序抽提經(jīng)摻入的質(zhì)粒(16)。每個(gè)重組菌落的質(zhì)粒制備物用一適宜的限制性酶切割并在瓊脂糖凝膠上分析。在與一種引物(該引物與TA CloningKit的克隆質(zhì)粒上存在的Sp6啟動(dòng)子互補(bǔ))之后，用溴化乙錠示蹤凝膠后就能選擇出帶有在紫外光下能檢測(cè)到的插入序列的質(zhì)粒，從而用于對(duì)插入序列測(cè)序。測(cè)序前再按為應(yīng)用“ Prism ready reaction Kit dyedeoxyterminator cycle sequencing kit”(Applied Biosystems，ref.40/384)而建議的方法進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)，然后進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，用AppliedBiosystems的“自動(dòng)測(cè)序儀，373A型”，按廠家建議進(jìn)行測(cè)序。
在計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)庫上對(duì)克隆自反應(yīng)混合物中存在的DNA片段的序列的鑒別分析使之能顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒型的一個(gè)序列。相關(guān)的PSJ17克隆得到完全測(cè)序，所得的描繪在圖8中并由SEQ ID NO9識(shí)別的序列用最新“Genebank”數(shù)據(jù)庫上的“Geneworks”軟件進(jìn)行分析。對(duì)數(shù)據(jù)庫的分析未能發(fā)現(xiàn)任一段與已描述的序列完全相同的序列。只發(fā)現(xiàn)與某些已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒因子有部分同源。根據(jù)參考文獻(xiàn)(20)，最引人關(guān)注的同源性是關(guān)于一種被稱作ERV-9，或HSERV-9的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。
實(shí)施例4對(duì)含于“POL MSRV-1B”限定的5′區(qū)和PSJ17克隆限定的3′區(qū)之間的核酸序列的PCR擴(kuò)增。
定義5種寡核苷酸M001，M002-A，M003-BCD，P004和P005，以擴(kuò)增來自純化的POL-2毒粒的RNA。進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)以便檢查是否有污染(與水反應(yīng))。擴(kuò)增由一個(gè)RT-PCR步驟及隨后的“嵌套”PCR組成，RT-PCR按實(shí)施例2的步驟進(jìn)行，“嵌套”PCR按EP-A-0,569,272號(hào)文件中所述的PCR過程進(jìn)行。在第一個(gè)RT-PCR循環(huán)中，用M001和P004或P005引物。在第二個(gè)PCR循環(huán)中，用M002-A引物或M003-BCD引物及P004引物，這些引物的位置如下M002-AM003-BCDM001 — P004 P005
——— —————————————————————RNAPOL-2<----------> <--------------------->pol MSRV-1PSJ17它們的組成為引物M001GGTCITICCICAIGG(SEQ ID NO20)
引物 M002-ATTAGGGATAGCCCTCATCTCT(SEQ ID NO21)引物 M003-BCDTCAGGGATAGCCCCCATCTAT(SEQID NO22)引物 P004AACCCTTTGCCACTACATCAATTT(SEQID NO23)引物 P005GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT(SEQID NO24)所得到的被稱為M003-P004的“嵌套”擴(kuò)增產(chǎn)物，描繪在圖7中，它相當(dāng)于SEQ ID NO8這個(gè)序列。
實(shí)施例5在逆轉(zhuǎn)錄酶活性峰處純化到的病毒樣品中，用一段已識(shí)別出的序列對(duì)MSRV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分進(jìn)行擴(kuò)增和克隆化。
這里用到一種來自Frohman(21)公布的PCR技術(shù)。它使得能用一個(gè)位于將被擴(kuò)增的基因組3′端的物異性引物向待分析的基因組的5′區(qū)延長序列。這一技術(shù)上的變化被描述在來自the firm clontech LaboratoriesInc.，(Palo-Alto California USA)的文件中，同時(shí)提供的還有它的產(chǎn)品“5′-AmpliFINDERTMRACE Kit”，這一產(chǎn)品如前所述被用于純化的毒粒的某一部分。
在試劑盒操作中用到的用于合成cDNA和進(jìn)行PCR擴(kuò)增的特異性3′引物分別與下列MSRV-1序列互補(bǔ)cDNATCATCCATGTACCGAAGG(SEQ ID NO25)擴(kuò)增 ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT(SEQ IDPCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化后，再按常規(guī)方法純化(16)，然后重新懸浮于10ml蒸餾水中。由于Taq聚合酶的特點(diǎn)之一在于將一個(gè)腺嘌呤加在兩條DNA鏈的每一條的3′端，故所得的DNA用TA CloningTMKit(British Biotechnology)直接插入一質(zhì)粒中。2μl DNA溶液混于5μl無菌蒸餾水、1μl 10倍濃度的連接緩沖液“10X LIGATIONBUFFER”、2μl“PCRTMVECTOR”(25ng/ml)及1μl“TA DNALIGASE”中。該混合物12℃溫育過夜。后繼步驟按TA CloningKit(British Biotechnology)的說明進(jìn)行。程序最后，挑出重組細(xì)菌的白色菌落以便培養(yǎng)并能按所謂的“小量制備”程序抽提有關(guān)的質(zhì)粒(16)。每個(gè)重組菌落的質(zhì)粒制備物被用一合適的限制性酶切割并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。選擇出帶有用溴化乙錠標(biāo)記凝膠后能在紫外光下檢測(cè)到的插入序列的質(zhì)粒以進(jìn)行插入序列的測(cè)序，測(cè)序是通過與“ TA CloningKit”的克隆化質(zhì)粒上的Sp6啟動(dòng)子的一種互補(bǔ)引物雜交后而完成的。測(cè)序前再按為應(yīng)用“Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cyclesequencing kit”(Applied Biosystems，ref.401384)而建議的方法進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)，然后用Applied Biosystems的“自動(dòng)測(cè)序儀373A型”按廠家建議完成自動(dòng)測(cè)序。
這一技術(shù)首先應(yīng)用于如下述純化的毒粒的兩個(gè)部分，在來自PLI-2細(xì)胞系產(chǎn)生的“POL-2”分離株和LM7PC細(xì)胞系產(chǎn)生的MS7GP分離株的蔗糖上每周兩次收集培養(yǎng)物上清液，10,000rpm預(yù)離心30分鐘以除去細(xì)胞碎片，再凍存于-80℃或直接用于后續(xù)步驟。4℃下將新鮮的或解凍的上清液在30％PBS-甘油的墊層上于100,000g(或在LKB-HITACHI 45T型轉(zhuǎn)子上30,000rpm)離心2小時(shí)。去上清液后，沉淀團(tuán)用小體積PBS溶解并組成濃縮好但未經(jīng)純化的毒粒部分。這種濃縮的病毒隨后在一個(gè)蔗糖梯度上在無菌的PBS緩沖液(15至50％重量比)中沉降并在4℃以35,000rpm(100,000g)在一帶蓋的轉(zhuǎn)子中超速離心12小時(shí)。10個(gè)部分均被收集，勻化后從每部分取出20μl，以便按H.Perron(7)的技術(shù)分析逆轉(zhuǎn)錄酶活性。包括了“屬于LM7型”的RT活性峰的部分隨后被稀釋在無菌PBS緩沖液中并于35,000rpm(100,000g)超速離心1小時(shí)以沉降病毒顆粒。由此得到的純化了的病毒團(tuán)塊再溶解于小體積的一種適宜緩沖液以提取RNA。在這種抽提自純化的胞外毒粒的RNA上進(jìn)行上文提到的cDNA合成反應(yīng)。按前述技術(shù)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增使得能獲得F1-11克隆，它的序列可被SEQ ID NO2識(shí)別，在圖8中有描繪。
這個(gè)克隆使得用事先已測(cè)序的各種克隆來定義代表MSRV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒的“pol”基因(如圖9描述的那樣)的區(qū)段成為可能。這個(gè)稱為SEQ ID NO1的序列，可從在其末端重疊的各種不同克隆中重新構(gòu)成，方法是糾正由引物和擴(kuò)增作用或克隆技術(shù)帶來的人為現(xiàn)象，因?yàn)檫@種假象將作為一個(gè)整體人為地干擾系統(tǒng)中的閱讀框架。
圖9中，在核酸序列下描述了潛在的閱讀框架及由它翻譯成的氨基酸。
實(shí)施例6在一種被MSRV-2感染的培養(yǎng)物中，用一個(gè)已鑒定的序列捕捉、擴(kuò)增并克隆MSRV-2基因組的一個(gè)部分。
連續(xù)幾星期定期收集類似于H.Perron(7)所描述的能表達(dá)“LM7型的”逆轉(zhuǎn)錄酶活性的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，在加10％甘油之后存于-80℃的低溫冰箱中。再解凍全部上清以便經(jīng)超速離心濃縮感染顆粒并經(jīng)在蔗糖梯度上離心以達(dá)到其平衡點(diǎn)而純化感染顆粒，按H.Perron(14)描述的方法在收集于梯度上的各種不同部分中測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)錄酶活性峰的不同部分被收集在一起以便按一種用于純化RNA的程序(15)從中抽提核酸，但抽提到的核酸不用DNase處理。一種源于Shin(8)所述技術(shù)的PCR擴(kuò)增過程被直接施于這種未經(jīng)DNase處理的核酸樣品上，按EP-A-0,569,272號(hào)文件中描述的一種RNA擴(kuò)增過程，在100μl的總體積中，含有200ng DNA，1μl RNA Guard，33μmol Shih(8)描述的與那些用于直接(DNA)PCR的完全相同的引物(MOP)的每種混合物；0.25mM每種dNTP、10μl 10X緩沖液、2.5μTag酶和0.4μl RT酶(RT-AMV；10μ)也加入樣品中。擴(kuò)增循環(huán)如下進(jìn)行RNA變性65℃/10分鐘，合成cDNA 50℃/8分鐘，然后就與Shih(8)描述的PCR循環(huán)一樣了。進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)以便檢查是否沒有污染(在水中反應(yīng))。產(chǎn)物在10％丙烯酰胺凝膠上分析。
RT-PCR擴(kuò)增的樣品隨后按實(shí)施例1所述的技術(shù)被克隆和測(cè)序。
從RT-PCR產(chǎn)物中測(cè)序到的大部分克隆與MSRV-2A序列及與其等價(jià)序列MSRV-2B(預(yù)先描述在實(shí)施例1和2中)相一致。
且去除人工序列后，證實(shí)其它被測(cè)序的克隆與實(shí)施例1和2所述的MSRV-1型的序列一致。
檢驗(yàn)了這種核酸材料(來自那些純化的帶感染顆粒的部分)中存在的序列之后，其中至少有一些與逆轉(zhuǎn)錄酶活性有關(guān)，所剩核酸材料被用于在帶MSRV2序列(預(yù)先已識(shí)別并描述在實(shí)施例1和2)的核酸上進(jìn)行一種特殊的捕捉。
在早先的一個(gè)步驟中，帶MSRV2序列的遺傳材料通過一個(gè)50循環(huán)的單向PCR技術(shù)采用一個(gè)單獨(dú)引物進(jìn)行了擴(kuò)增。這個(gè)引物與生物素的一個(gè)分子在其3′端配對(duì)，從而允許從3′到5′進(jìn)行單向擴(kuò)增，而且它與以下被鑒定為SEQ ID NO38的序列一致
5′TAAAGATCTAGAATTCGGCTATAGGCGGCATCCGGCAACT 3′隨后在連接了親和素的磁珠(Dynabeads)的溶液中按廠家(Dynal)建議進(jìn)行捕捉，經(jīng)室溫下一系列洗滌后(它能去除未與生物素連接的核酸)后，直接在磁珠上進(jìn)行PCR，在3′端有個(gè)特殊引物，5′端也有個(gè)引物，它們由10個(gè)堿基(10體)的隨機(jī)序列的寡核苷酸溶液提供。
這種從3′到5′的特異性擴(kuò)增引物與SEQ ID NO13所識(shí)別的序列一致5′ GCATCCGGCAACTGCACG 3′用這些引物在35℃進(jìn)行超過40循環(huán)的PCR使經(jīng)第一步PCR特異性地?cái)U(kuò)增生物素化的基因材料并捕捉到Dynabeads磁珠上成為可能。在用“TA Cloning”kit對(duì)經(jīng)第二步PCR擴(kuò)增的DNA進(jìn)行克隆化并測(cè)定重組克隆的序列后，按實(shí)施例1所描述的技術(shù)，得到一個(gè)748堿基對(duì)的序列。這一核酸序列SEQ ID NO12表示在圖10中。這個(gè)被延長的序列將在下文中稱作MSRV-2EL1。
與SEQ ID NO13這個(gè)引物互補(bǔ)的反向序列出現(xiàn)在3′末端，在圖10中用框表示。在該引物的上游區(qū)段發(fā)現(xiàn)了已在MSRV-2A和MSRV-2B克隆中識(shí)別出的序列。
圖11表現(xiàn)了按6個(gè)可能的閱讀框架將此序列翻譯成氨基酸的過程。
MSRV2-A序列(SEQ ID NO10)在MSRV-2EL1(SEQ IDNO12)序列上的排列呈現(xiàn)于圖12。值得注意的是，除了在相應(yīng)于簡并引物(用來獲得MSRV-2A)的區(qū)段內(nèi)有少數(shù)差別之外， MSRV-2A序列嚴(yán)格等同于延長的序列。圖上這一區(qū)段下面劃了線；且SEQ ID NO13這一引物(除了克隆尾巴以外)的雜交區(qū)段也在圖上用框表示出來，而SEQ ID NO14引物的雜交區(qū)段則表示在方括號(hào)內(nèi)。這個(gè)區(qū)段中真正的MSRV-2基因組的序列很可能就是MSRV-2EL1的，其中并沒有象MSRV-2A的情形那樣(或類似MSRV-2B)受嚴(yán)格性低的雜交引物的影響。
因此MSRV-2EL1序列相應(yīng)于MSRV-2基因組的一個(gè)新序列區(qū)。當(dāng)使用定義在MSRV-2EL1和MSRV-2A中的新PCR引物時(shí)，這種結(jié)果也得到檢驗(yàn)，而這個(gè)新引物允許在本實(shí)施例描述的克隆過程中所用的核酸上進(jìn)行一個(gè)特殊的擴(kuò)增。
Genebank數(shù)據(jù)庫查詢的結(jié)果(1994年8月進(jìn)行)，就是MSRV-2EL1序列顯示出與至今所知的基因序列沒有明顯的同源性。然而，查詢根據(jù)這個(gè)MSRV-2EL1序列的6個(gè)潛在閱讀框架可能進(jìn)行的翻譯成氨基酸的過程，其結(jié)果顯示MSRV-2EL1與細(xì)菌、病毒或細(xì)胞的序列有部分同源性。
不能用特異性引物在正常人DNA上做PCR擴(kuò)增顯示這不是一段細(xì)胞來源的序列。因此MSRV-2對(duì)人而言是一種外源性感染因子。然而，引物混合物的簡并特點(diǎn)，在對(duì)Shih(8)所述的技術(shù)作了變動(dòng)的應(yīng)用中，能促使識(shí)別稱為MSRV-2A和MSRV-2B的第一序列因子，這樣的引物特點(diǎn)有可能促使對(duì)一個(gè)基因組的無法預(yù)見的擴(kuò)增作用，而該基因組既不屬于一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，甚至也不屬于一個(gè)編碼一種RNA依賴性DNA聚合酶的基因。
實(shí)施例7對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的關(guān)節(jié)液中取出的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并檢測(cè)與LM7培養(yǎng)物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄酶活性相似的酶活性。
關(guān)節(jié)液(AF)在無菌條件下取自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的一個(gè)有炎癥的膝關(guān)節(jié)。該液體在4℃1800rpm離心10分鐘。移去上清液并將上清等分成若干份存于-80℃后，將細(xì)胞碎片溶解于RPMI培養(yǎng)基中，RPMI培養(yǎng)基的組成如下RPMI 1640培養(yǎng)基補(bǔ)加青霉素(200,000U/L)，鏈霉素(200mg/L)、L-谷氨酰胺(6mM/L)，丙酮酸鹽(1％)，非必需氨基酸(1％)，可選擇加入一種抗人β干擾素多克隆抗體(10U/ml)，還有20％胎牛血清(56℃溫育30分鐘滅活補(bǔ)體)。這些懸浮的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至一個(gè)小培養(yǎng)瓶(25cm3)中并用上述培養(yǎng)基把體積補(bǔ)足5ml，其中的細(xì)胞將在一個(gè)溫箱中在5％CO2和37℃條件下維持體外培養(yǎng)過程。
4天后，用新鮮的組分相同的培養(yǎng)基換掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，后者吸出后在1800rpm離心10分鐘。上清等分后存于-80℃；含有未粘附在培養(yǎng)瓶上的細(xì)胞的碎片溶解于培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中。這些細(xì)胞將作為一種細(xì)胞懸液在培養(yǎng)中維持下去。
培養(yǎng)基至少每星期換兩次。
培養(yǎng)3周后，在裝有來自病理學(xué)關(guān)節(jié)液的第一代細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中含有巨噬細(xì)胞型的和其它的成纖維細(xì)胞型的粘附細(xì)胞，它們都存在一種“行式”(ranges)有絲分裂增殖現(xiàn)象。這些增殖行逐漸覆蓋了培養(yǎng)瓶的較低的表面，而且在融合期，這些成纖維細(xì)胞被刮拭分離并用5ml培養(yǎng)基分到2個(gè)25cm3的瓶中。這些貼壁細(xì)胞隨后按其增殖能力所允許的潛力多次地傳代并分瓶。實(shí)際上，在傳6代后，即培養(yǎng)了約2個(gè)月后，成纖維細(xì)胞停止增殖，瓶則存放起來直至細(xì)胞退化。
在用于傳代懸浮細(xì)胞、主要是淋巴樣型細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，巨噬細(xì)胞型或成纖維細(xì)胞型的貼壁細(xì)胞有時(shí)在某一后期貼壁。懸浮的淋巴樣細(xì)胞未有增殖就退化，且不能在培養(yǎng)中維持到三周后。
所有這些培養(yǎng)瓶的上清均被集中起來，等分后保存于-80℃。
對(duì)由某RA病人的病理性關(guān)節(jié)液細(xì)胞產(chǎn)生的一種可能為逆轉(zhuǎn)錄病毒因子的搜尋工作在于，按各種不同的理化條件尋找逆轉(zhuǎn)錄酶活性，這些條件允許非選擇性檢測(cè)這種由事先未知的逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼的酶，就象H.Perron等人所做的工作一樣(他們研究了從多發(fā)性硬化癥的神經(jīng)系統(tǒng)中得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性)(7)。對(duì)檢測(cè)來自本例RA病人AF的細(xì)胞培養(yǎng)上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的特異性信號(hào)的條件隨后證實(shí)非常類似于那些構(gòu)成檢測(cè)某多發(fā)性硬化癥病例來源的培養(yǎng)物L(fēng)M7產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的最佳方案。因此需要驗(yàn)證這種酶活性是否可以在相同于MS中分離出的逆轉(zhuǎn)錄病毒MSRV1/LM7的檢測(cè)條件下被測(cè)出，這是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人關(guān)節(jié)液的培養(yǎng)物上清中得到的病毒顆粒濃縮后在一蔗糖梯度上沉降平衡的)。
得自本例RA的AF貼壁細(xì)胞的一系列培養(yǎng)上清被解凍以便使總體積能達(dá)至少100ml。將這些上清混合，預(yù)離心以便去除細(xì)胞碎片，再超速離心以便沉淀可能有的病毒顆粒，這樣沉淀到的碎片置于一蔗糖梯度上，在100，000g離心以便達(dá)到在超速離心碎片中存在的因子的分離并在收集等體積的部分并收集遞增的蔗糖密度的部分后，對(duì)這些部分中的每一部分的逆轉(zhuǎn)錄酶活性進(jìn)行分析。所有這些操作是在H.Perron(14)描述的條件下進(jìn)行的。
用在LM7株上最佳化的條件分析“RA”梯度的收集部分中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的結(jié)果示于圖13?？梢钥闯?，顯著的逆轉(zhuǎn)錄酶活性(大于界值2000dpm)出現(xiàn)在部分2到部分5，及部分9中。在最不密集部分發(fā)現(xiàn)的活性很不集中，這可能是由于梯度上裝載的材料過多造成的(5ml管)。在較密部分第二峰(No.9)很可能由那些已失去包膜(衣殼)的較大密度毒粒組成，就象已在用LM7系產(chǎn)生的毒粒制備的梯度上發(fā)現(xiàn)病毒失去衣殼的現(xiàn)象(14)。
在RA來源的AF細(xì)胞培養(yǎng)上進(jìn)行的工作的這一階段，看起來這些細(xì)胞產(chǎn)生了病毒顆粒，該病毒顆粒帶有與從MS的柔腦脊膜LM7細(xì)胞產(chǎn)生的毒粒中檢測(cè)到的是同一類型的逆轉(zhuǎn)錄酶。
實(shí)施例8來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的原始淋巴樣B細(xì)胞的培養(yǎng)。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序，從RA病人外周血B淋巴細(xì)胞中建立了原始淋巴樣細(xì)胞系，(該細(xì)胞系經(jīng)體外加EB病毒(EBV)的B95株或經(jīng)病人B淋巴細(xì)胞具有的自體株而無限增殖化)。
簡而言之，在Ficoll-Hypaque梯度(Flow/ICN)中離心而分離出單核血細(xì)胞，經(jīng)RPMI 1640中離心洗滌，再溶于一種培養(yǎng)基質(zhì)中，該基質(zhì)中含有RPMI 1640并加了青霉素(200,000U/L)、鏈霉素(200mg/L)、L-谷氨酰胺(2mM/L)、丙酮酸鹽(1％)、非必需氨基酸(1％)、HEPES緩沖液(1％)及20％胎牛血清(56℃培育30分鐘滅活了補(bǔ)體的)。這些懸浮細(xì)胞被轉(zhuǎn)入一個(gè)小培養(yǎng)瓶(25cm3)，體積用上述培養(yǎng)基質(zhì)補(bǔ)足5ml，其中的細(xì)胞將在溫箱中在5％CO2和37℃條件下維持體外培養(yǎng)。
更新一半培養(yǎng)基，每周進(jìn)行兩次將瓶子垂直放置至少2小時(shí)后，移走一半的培養(yǎng)上清(只要建立一個(gè)細(xì)胞系，就立刻將上清存于一個(gè)-80℃低溫冰箱中)，并代之以新鮮培養(yǎng)基，其中沉淀的淋巴細(xì)胞均被乳化。當(dāng)建立了一個(gè)細(xì)胞系而且瓶中的細(xì)胞密度足夠時(shí)，經(jīng)移液管乳化的細(xì)胞就被分在兩個(gè)瓶中而培養(yǎng)基也就被平分。
在Ficoll中分離后，淋巴樣細(xì)胞在有環(huán)孢菌素A存在時(shí)被放置10至20天，以便能從培養(yǎng)物中抑制并除去T淋巴細(xì)胞。其原因就是這些T淋巴細(xì)胞有阻止培養(yǎng)物中的B淋巴細(xì)胞被EBV病毒無限增殖的能力。
根據(jù)單個(gè)病例的具體情況，培養(yǎng)物可在經(jīng)環(huán)孢菌素A處理后就這樣保存，以等待可能出現(xiàn)的B淋巴細(xì)胞被病人自身所帶的EBV病毒株無限增殖化的現(xiàn)象(如果他是此病毒的血清陽性)，或者另一種情況下把1ml產(chǎn)EBV毒粒的B95系的上清(先用佛波醇的丁酸酯誘導(dǎo))加到培養(yǎng)瓶中以便在有EBV B95株的情況下產(chǎn)生大規(guī)模的B淋巴細(xì)胞感染，并也就更可能產(chǎn)生少數(shù)B克隆的無限增殖化。
有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)瓶維持至少3個(gè)月，這期間出現(xiàn)無限增殖化的B淋巴細(xì)胞克隆(以飄浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞“群”的形式增殖，)用光學(xué)顯微鏡監(jiān)控。
當(dāng)原始淋巴樣細(xì)胞系被建立后(它們來自RA)，它們定期被平分并被維持在連續(xù)培養(yǎng)中。每周兩次換培養(yǎng)基時(shí)收集的上清被凍在-80℃以便后續(xù)分析逆轉(zhuǎn)錄酶活性，由培養(yǎng)中B細(xì)胞表達(dá)的致病和/或感染性因子的基因組的PCR檢測(cè)，等等。應(yīng)用這些培養(yǎng)物來發(fā)現(xiàn)并鑒定與RA相關(guān)的致病和/或感染性因子將在后面的實(shí)施例中描述。
實(shí)施例9通過對(duì)純化自RA的一滑液細(xì)胞培養(yǎng)或原始淋巴樣細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)的致病和/或感染性因子制品上依賴于RNA的DNA聚合酶基因的保守的pol區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增來生產(chǎn)MSRV-2和MSRV-1克隆。
就象在實(shí)施例1中一樣，分子途徑在于應(yīng)用Shin的PCR技術(shù)(8)，它有可能擴(kuò)增外源和內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因的保守區(qū)，也可以擴(kuò)增能編碼有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性的一種酶的病毒的pol基因的保守區(qū)。如特別是乙肝病毒，或更廣地說有任何依賴于RNA的DNA聚合酶或在所用的擴(kuò)增引物定義的區(qū)域內(nèi)有足夠的序列同源性的酶基因的病毒。這一PCR技術(shù)用在抽提出的核酸上，核酸是從按Perron H.(14)描述的過程在一梯度上純化得到的感染因子制品中抽提的，感染因子來自一例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的病理性關(guān)節(jié)液(AF)的細(xì)胞培養(yǎng)上清，是按實(shí)施例7所描述的過程得到的。帶有按照為LM7株優(yōu)化的條件(7)測(cè)得的RT活性峰的部分用一倍體積的含硫氰酸胍的緩沖液溶解并存于-80℃直到核酸按Chomzynskip.(15)的技術(shù)提取出為止。
在PCR反應(yīng)之前，用“cDNA合成系統(tǒng)plus”盒(Amersham)把樣品中的RNA轉(zhuǎn)錄成帶“隨機(jī)”引物(一種6核苷酸的混合物)的互補(bǔ)DNA(cDNA)，按廠家建議進(jìn)行，并根據(jù)樣品中有的RNA總重的一個(gè)近似值，達(dá)到最接近的log factor。另外，，cDNA的合成可以直接在有引物的情況下進(jìn)行，該引物用于按EP-A-0,569,272號(hào)文件中描述的一步“RT-PCR”法進(jìn)行PCR。
把用PCR擴(kuò)增cDNA后得到的DNA用TA Cloning Kit(Britishbiotechnology)插入一質(zhì)粒，選擇出來，提取出并測(cè)序，均按實(shí)施例1和2所述過程進(jìn)行。
所得序列然后用Mac Vector和Genebank計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)庫上的Geneworks軟件(用于分析核酸序列)，及Swiss Prot計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)庫(用于分析由核酸序列中出現(xiàn)的閱讀框架推斷出的氨基酸序列)進(jìn)行分析。RA之AF的解凍的細(xì)胞培養(yǎng)上清在逆轉(zhuǎn)錄酶活性峰沉淀得到的病毒顆粒樣品中獲得的序列，經(jīng)分析顯示出兩種序列第一型序列，發(fā)現(xiàn)于少數(shù)克隆，相關(guān)于與事先從MS病人分離到并定性的MSRV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒的等價(jià)“pol”區(qū)(法國專利申請(qǐng)92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，94 01530，94 01531 and 9401532)有顯著同源性的一段序列，第二型序列，發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)克隆，相關(guān)于與一段被稱為MSRV-2的致病和/或感染性因子的序列有高度同源性的序列，MSRV-2是事先從MS病人中分離并定性到的(法國專利申請(qǐng)92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，9401530，94 01531 and 94 01532)。
將從RA的AF細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的病毒材料中擴(kuò)增并克隆的MSRV-1型的序列(克隆“ MSRV1 polPR”，SEQ ID NO39)與從MS病人的細(xì)胞產(chǎn)生的毒粒中克隆到的MSRV-1參照序列的比較示于圖14。
從RA的AF細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的感染物質(zhì)中擴(kuò)增并克隆的MSRV-2型的序列(克隆“MSRV2sPR”，SEQ ID NO40)與從MS病人細(xì)胞產(chǎn)生的感染物質(zhì)中得到的MSRV-2參照序列的比較示于圖15。
兩種類型的被發(fā)現(xiàn)有Shih等人(8)的“逆轉(zhuǎn)錄酶活性”簡并引物的序列因此準(zhǔn)確相當(dāng)于在相似條件下發(fā)現(xiàn)的序列，它們?cè)谌崮X脊膜細(xì)胞培養(yǎng)物中，屬于源自各種MS病人的脈絡(luò)叢或B原始淋巴樣細(xì)胞系(法國專利申請(qǐng)92 04322，92 13447，92 13443，92 01529，94 01530，94 01531 and 94 01532)。
實(shí)施例10用特異性PCR引物及依ELOSA技術(shù)的特異性雜交檢驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)物上清中以及直接在RA病人的生物學(xué)液體中MSRV-1和MSRV-2序列的存在。
有好幾種PCR技術(shù)被用于檢測(cè)RA病人和其他風(fēng)濕病人(非RA)的細(xì)胞、血漿和關(guān)節(jié)液培養(yǎng)物上清中的MSRV-1和MSRV-2基因組。
根據(jù)P.Chomzynski(15)描述的技術(shù)，提取質(zhì)粒的及培養(yǎng)物上清的RNA，在這之前要在1ml培養(yǎng)上清或質(zhì)粒(收集后存于-80℃低溫冰箱)中加入一定體積的含硫氰酸胍的緩沖液。
從關(guān)節(jié)液(AF)中及從單核血細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)中抽提RNA的過程按以下程序進(jìn)行所有溶液均在用DEPC處理過的蒸餾水中配制以去除所有痕量RNA酶；解凍500μl到1ml的AF，往里面加入1/100體積的20％SDS溶液，同時(shí)按每mlAF加7μl的比例加入蛋白酶K溶液；將液體輕微搖勻，加RNAsin(B0ehringer)或RNA guard(Pharmacia)后于37℃溫育；1小時(shí)后，1倍體積的GUT緩沖液(按Chomzynski(15))被加入，迅速搖勻混合物?；旌衔镏械腞NA隨后按上文提到的由Chomzynski描述的程序(15)提取出來。
為檢測(cè)MSRV2，MSRV-2EL1(SEQ ID NO12)序列使得定義幾對(duì)寡核苷酸引物成為可能，這些引物可用于通過PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性的DNA或RNA。
下文定義的第一對(duì)MSRV2引物使得對(duì)不同人類細(xì)胞中MSRV-2基因組完成特異性測(cè)定成為可能，方法是按EP-A-0,569,272號(hào)文件中描述的一種RNA擴(kuò)增過程進(jìn)行PCR或RT-PCR步驟。
所用的引物如下5′引物，由SEQ ID NO14識(shí)別5′GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3′3′引物，由SEQ ID NO15識(shí)別5′GCATCCGGCAACTGCACG 3′cDNA合成的步驟之后，PCR進(jìn)行連續(xù)35個(gè)成鏈循環(huán)，每個(gè)循環(huán)均1分鐘在94℃，1分鐘在54℃，1分鐘在72℃。
對(duì)本實(shí)施例而言，從不同類型的細(xì)胞中抽提出的未經(jīng)DNase處理的全部RNA被用于這個(gè)RT-PCR反應(yīng)，因而就能檢測(cè)對(duì)RNA富集的核酸提取物中的致病原具特異性的RNA和DNA。實(shí)際上，我們的試驗(yàn)顯示對(duì)MSRV2具特異性的DNA很容易在抽提到的核酸中檢測(cè)出來，所述核酸是按上述通常用于RNA提取的方法提取到的。
按這一技術(shù)用SEQ ID NO14和SEQ ID NO15作PCR引物擴(kuò)增到的一個(gè)“MSRV2cPR”克隆的序列描繪在圖16，其中引物序列來自RA病人關(guān)節(jié)液的細(xì)胞培養(yǎng)。圖17和18描述了分別帶有得自MS病人的克隆的MSRV2核苷酸序列SEQ ID NO10和SEQ IDNO12的“MSRV2cPR”克隆的序列的排列?？梢钥吹?，源于RA樣品或MS樣品的序列有顯著同源性。
以下定義的新的MSRV2引物對(duì)使得有可能完成對(duì)病人來源的不同生物學(xué)液體中的MSRV-2基因組的檢測(cè)，用的是兩步連續(xù)的PCR(“嵌套”PCR)，或兩步連續(xù)的RT-PCR，按EP-A-0,569,272號(hào)文件所述的一個(gè)RNA擴(kuò)增程序進(jìn)行，根據(jù)它就有可能檢測(cè)到在生物學(xué)樣品中以RNA或DNA形式存在的MSRV-2序列。
這一“嵌套”PCR按已描述的方式在未徑DNase處理的抽提核酸樣品上進(jìn)行。
用于第一步40個(gè)循環(huán)并在48℃的雜交溫度下的引物如下5′引物，由SEQ ID NO44識(shí)別5′GCCGATATCACCCGCCATGG 3′3′引物，由SEQ ID NO15識(shí)別5′GCATCCGGCAACTGCACG 3′這步之后，取出10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用于進(jìn)行第二步的所謂“嵌套”PCR擴(kuò)增，用的引物位于已擴(kuò)增的區(qū)段內(nèi)。該第二步驟進(jìn)行了35至40循環(huán)，于50℃的引物雜交溫度(“退火”)下進(jìn)行。反應(yīng)體積為100μl。
第二步所用引物如下5′引物，由SEQ ID NO45識(shí)別5′CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3′3′引物，由SEQ ID NO46識(shí)別5′TCTCCACTCCGAATATTCCG 3′按上述“嵌套PCR”進(jìn)行的一系列MSRV-2 PCR所得結(jié)果呈現(xiàn)在附于本說明書的表II中。
對(duì)MSRV-1，擴(kuò)增進(jìn)行兩步(“嵌套”PCR)，但先進(jìn)行一步cDNA合成。而且，核酸樣品要先用DNase預(yù)處理，并在兩個(gè)擴(kuò)增步驟中進(jìn)行一個(gè)沒有RT(AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)的PCR對(duì)照，以便檢驗(yàn)RT-PCR擴(kuò)增僅來源于MSRV-1 RNA。至于無陽性RT的對(duì)照，分成等分的RNA起始樣品再用DNase處理并重新擴(kuò)增。
用缺乏DNase活性的DNase進(jìn)行處理的過程如下抽提的RNA在有“RNase抑制劑”(Boehringer-Mannheim)存在下在經(jīng)DEPC處理的水中等分至終濃度為10μl中1μg；向這些10μl的等份中加入1μl“無RNase的DNase”(Boehringer-mannheim)和1.2μl緩沖液(pH5，含0.1M/l乙酸鈉和5mM/l MgSO4)；混合物20℃溫育15分鐘，在一個(gè)“熱循環(huán)儀”中95℃保持1.5分鐘。
第一步MSRV-1RT-PCR可以按EP-A-0,569,272號(hào)文件所描述的RNA擴(kuò)增程序的一種變動(dòng)方法進(jìn)行。特別是，cDNA合成這一步在42℃進(jìn)行1小時(shí)，但cDNA合成的進(jìn)行更好地是按以下程序把用DNaase處理過并保存在冰中的RNA在65℃加熱10分鐘，然后迅速插入冰中；再加入到一個(gè)維持在42℃的在準(zhǔn)備進(jìn)行PCR的熱循環(huán)儀中的混合物內(nèi)，混合物含1倍PCR緩沖液，1.5mM MgCl2，250mM每種dNTP，300-400nM的每種引物(PCR第一步的5′和3′端引物)，10個(gè)單位的RT-AMV和2.5個(gè)單位的Tag，終體積為100μl；該混合物42℃保持1到2小時(shí)，再于95℃保持5分鐘，以便使RT-AMV變性。然后開始PCR擴(kuò)增循環(huán)，并持續(xù)超過40個(gè)循環(huán)，其中引物的雜交期(退火)在53℃進(jìn)行1分鐘，延伸期在72℃進(jìn)行2至3分鐘，DNA變性期在95℃進(jìn)行1分鐘。
這第一步所用引物如下5′引物5′AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3′SEQ ID NO163′引物5′TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3′SEQ ID NO17
這一步后，10μl擴(kuò)增產(chǎn)物被取出并用于進(jìn)行第二步所謂“嵌套”PCR擴(kuò)增，用位于已擴(kuò)增的區(qū)段內(nèi)的引物。PCR擴(kuò)增循環(huán)超過35至40循環(huán)，引物的雜交期在53℃進(jìn)行1分鐘，延長期在72℃進(jìn)行1至2分鐘，DNA變性期在95℃進(jìn)行1分鐘。反應(yīng)混合物的組分與前一步一樣，只是這次不加RT-AMV。
這第二步所用引物如下5′引物，由SEQ ID NO18識(shí)別5′TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3′3′引物，由SEQ ID NO19識(shí)別5′AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3′按上述技術(shù)用PCR引物SEQ ID NO16和SEQ ID NO17，并隨后用SEQ ID NO18和SEQ ID NO19從RA病人關(guān)節(jié)液的RNA擴(kuò)增得的“MSRV1nPR”克隆的序列呈現(xiàn)在圖19。圖20描述了有參照克隆的MSRV1核苷酸序列SEQ ID NO01的“MSRV1nPR”克隆序列的排列，參照克隆得自MS病人。同樣可以看出，源自RA或MS的序列有顯著同源性。
到目前為止，按這些PCR技術(shù)從RA樣品中擴(kuò)增到的其他MSRV1和MSRV2序列也顯露出與得自MS病人的序列一致或同源。
在一系列按上述嵌套“RT-PCR”技術(shù)進(jìn)行的MSRV-1 PCR中，所得結(jié)果示于本說明書所附的表I中。
這樣，確實(shí)發(fā)現(xiàn)MSRV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組和MSRV-2基因組存在于RA病人的生物學(xué)液體樣品中。在更為廣泛的系列研究中得到的其他結(jié)果更肯定了這些結(jié)果。
而且，經(jīng)這些PCR技術(shù)擴(kuò)增的序列的特異性可以檢驗(yàn)并估價(jià)，采用F.Mallet(22)描述的和FR-2,663,040號(hào)文件中所述的“ELOSA”技術(shù)。
對(duì)MSRV-1，上述嵌套PCR產(chǎn)物可以在兩個(gè)ELOSA系統(tǒng)中測(cè)試，這樣就可能分別檢測(cè)MSRV-1的共有序列A及共有序列B+C+D，它們分別相應(yīng)于實(shí)施例2和圖2，3，4中描述的亞家族。實(shí)際上，類似于共有序列B+C+D的序列主要發(fā)現(xiàn)于MSRV-1毒粒來源的RNA樣品，該毒粒純化自培養(yǎng)物或擴(kuò)增自RA或MS病人的胞外生物學(xué)液體，而類似于共有序列A的序列主要發(fā)現(xiàn)于正常人細(xì)胞DNA中。
這個(gè)用于亞家族A的PCR產(chǎn)物的捕捉和特異性雜交的ELOSA/MSRV-1系統(tǒng)使用了帶有一個(gè)5′胺鍵的一段捕捉寡核苷酸cpV1A(按FR-A-2,663,040號(hào)文件中所述技術(shù))，還使用了偶聯(lián)過氧化物酶的一個(gè)檢測(cè)用寡核苷酸dpV1A(按FR-A-2,663,040號(hào)文件所述技術(shù))(或者偶聯(lián)生物素)，該cpV1A和dpV1A分別有下列序列cpV1A 5′GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3′SEQ ID NO47dpV1A 5′CATCTITTTGGICAGGCAITAGC 3′SEQ ID NO48用于捕捉和特異性雜交亞家族B+C+D的PCR產(chǎn)物的ELOSA/MSRV-1系統(tǒng)使用了同樣的偶聯(lián)過氧化物酶的檢測(cè)用寡核苷酸dpV1A(按上述技術(shù))(或偶聯(lián)生物素)，還使用了帶一個(gè)5′胺鍵的捕捉用寡核苷酸cp1VB(按上述技術(shù))，它有這樣的序列cpV1B 5′CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3′S EQ ID NO49就如表I可看到的，這樣一種技術(shù)被用于不同風(fēng)溫病患者生物學(xué)液體中得來的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物所有RA病人(在用BET標(biāo)記的瓊脂糖凝膠上可檢測(cè)到預(yù)期大小的一個(gè)擴(kuò)增過的DNA帶)均對(duì)B+C+D型MSRV1呈陽性反應(yīng)而對(duì)MSRV1-A呈陰性反應(yīng)；只有一個(gè)單一的非RA對(duì)照在用BET標(biāo)記的凝膠上有一個(gè)明顯正確的大小的可見擴(kuò)增帶；相應(yīng)的PCR產(chǎn)物被證明在ELOSA MSRV1-A和MSRV1-BCD上呈陰性反應(yīng)，與其他非RA對(duì)照的所有PCR產(chǎn)物一樣；對(duì)這種擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)它與一段無關(guān)于MSRV1的人工序列一致。
因此，與上面定義的嵌套R(shí)T-PCR聯(lián)合應(yīng)用的ELOSA MSRV1技術(shù)使得有可能對(duì)病人生物液體中的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行一種非常靈敏也非常特異的檢測(cè)。
也可以設(shè)想，依靠由發(fā)明者在與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有關(guān)的領(lǐng)域內(nèi)的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)的方法，可以對(duì)MSRV-1和/或MSRV-2的感染作用和/或重新活化作用進(jìn)行診斷，并基于該治療使對(duì)病人生物學(xué)液體中這些因子的檢測(cè)變得“陰性”的程度，估價(jià)它在RA病人身上的治療效果。而且，對(duì)尚未表現(xiàn)出風(fēng)濕病癥狀的個(gè)體進(jìn)行早期檢測(cè)可以設(shè)置一種治療方案，它越先于與關(guān)節(jié)病現(xiàn)象有關(guān)的損傷期，就越在以后的臨床進(jìn)展中從一種程度上更有效果?，F(xiàn)在，至今尚不能在有炎癥以前或甚至在損傷癥狀以前建立一種RA診斷方法，因此也無法在已出現(xiàn)值得注意的關(guān)節(jié)病的臨床指征之前建立起治療方案。
因此，診斷人體內(nèi)MSRV-1和/或MSRV-2感染作用和/或再活化作用就成為一種決定因素，而本發(fā)明對(duì)包括神經(jīng)性指征(MS)或風(fēng)濕性指征(RA)，或換種說法，包括了作為前癥狀或尚未相關(guān)于一個(gè)性質(zhì)明確的臨床癥狀的感染作用和/或再活化作用，提供了一種診斷方法。
除了進(jìn)行MSRV-1和/或MSRV-2感染和/或再活化的診斷外，由此還可能估計(jì)MS、RA或任何其他相關(guān)臨床癥狀的治療效果，這是基于它對(duì)使病人生物學(xué)液體中這些因子的檢測(cè)變“陰性”的有效性。
表I對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他風(fēng)濕病病人的生物學(xué)液體中MSRV-1基因組用PCR，再經(jīng)所謂“ELOSA”技術(shù)雜交而檢測(cè)出的結(jié)果。診斷 測(cè)試?yán)龜?shù)樣品 MSRV-1 MSRV-1 MSRV-1嵌套 ELOSAELOSART-PCR 亞型A亞型B(BET帶)(B+C+D)10 10- 10- 10-風(fēng)濕性而 關(guān)節(jié)液細(xì)非類風(fēng)濕關(guān)胞培養(yǎng)基質(zhì) 0+ 0+ 0+節(jié)炎的對(duì)照類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 10 5- 10- 5-關(guān)節(jié)液細(xì)5+ 0+ 5+胞培養(yǎng)基質(zhì)風(fēng)濕性而 8 關(guān)節(jié)液 8- 8- 8-非類風(fēng)濕關(guān)0+ 0+ 0+節(jié)炎的對(duì)照類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 5 關(guān)節(jié)液 3- 5- 3-2+ 0+ 2+7 血漿6- 7- 7-風(fēng)濕性而非類風(fēng)濕關(guān)1+ 0+ 0+節(jié)炎的對(duì)照類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 6 血漿 4- 6- 4-2+ 0+ 2+4 單核血細(xì)胞 4- 4- 4-風(fēng)濕性而非 (干性團(tuán)塊)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)0+ 0+ 0+炎的對(duì)照類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 2 單核血細(xì)胞0-2- 0-(干性團(tuán)塊)
表II對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他風(fēng)濕病病人生物學(xué)液體中MSRV-2基因組用PCR及隨后的所謂“ELOSA”技術(shù)雜交而檢測(cè)出的結(jié)果。診斷測(cè)試?yán)龜?shù)樣品MSRV-2注釋嵌套R(shí)T-PCR(BET帶)風(fēng)濕性而非類風(fēng) 4關(guān)節(jié)液 4-濕關(guān)節(jié)炎的對(duì)照 0+類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 5關(guān)節(jié)液 1-4+風(fēng)濕性而非類風(fēng)5 血漿 4- 陽性病人濕關(guān)節(jié)炎的對(duì)照 1+ 被多次輸；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 8 血漿 6-血的病人2+
序列表1一般資料 (i) 申請(qǐng)人 (A)姓名BIOMERIEUX(B)街道NONE(C)城市MARCY L′ETOILE(E)國家 FRANCE(F)郵編69280(ii) 發(fā)明名稱SEP延伸(iii)序列數(shù)49(iv) 計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D) 軟件PatentIn Release#1.0，版本 #1.30(EPO)2 SEQ ID NO1的資料(i) 序列特征(A) 長度1158堿基對(duì)(C) 鏈型單性(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)DNA(xi) 序列描述SEQ ID NO1CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG60CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG 180GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT 240CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAGGGATAGC 300CCCCATCTAT TTGGCCAGGC ATTAGCCCAA GACTTGAGTC AATTCTCATA CCTGGACACT 360CTTGTCCTTC AGTACATGGA TGATTTACTT TTAGTCGCCC GTTCAGAAAC CTTGTGCCAT 420CAAGCCACCC AAGAACTCTT AACTTTCCTC ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCCAAACCA 480AAGGCTCGGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTNAGGGC TAAAATTATC CAAAGGCACC 540AGGGCCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGCTT ATCCTCATCC CAAAACCCTA 600AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TGGCATAACA GGTTTCTGCC GAAAACAGAT TCCCAGGTAC 660ASCCCAATAG CCAGACCATT ATATACACTA ATTANGGAAA CTCAGAAAGC CAATACCTAT 720TTAGTAAGAT GGACACCTAC AGAAGTGGCT TTCCAGGCCC TAAAGAAGGC CCTAACCCAA 780GCCCCAGTGT TCAGCTTGCC AACAGGGCAA GATTTTTCTT TATATGCCAC AGAAAAAACA 840GGAATAGCTC TAGGAGTCCT TACGCAGGTC TCAGGGATGA GCTTGCAACC CGTGGTATAC 900CTGAGTAAGG AAATTGATGT AGTGGCAAAG GGTTGGCCTC ATNGTTTATG GGTAATGGNG 960GCAGTAGCAG TCTNAGTATC TGAAGCAGTT AAAATAATAC AGGGAAGAGA TCTTNCTGTG 1020TGGACATCTC ATGATGTGAA CGGCATACTC ACTGCTAAAG GAGACTTGTG GTTGTCAGAC 1080AACCATTTAC TTAANTATCA GGCTCTATTA CTTGAAGAGC CAGTGCTGNG ACTGCGCACT 1140TGTGCAACTC TTAAACCC11582SEQ ID NO2的資料(i) 序列特征(A) 長度297堿基對(duì)(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)DNA(xi) 序列描述SEQ ID NO2CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG 60CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT120TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT GGACCTTAAG180GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT240CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAAGGGA 2972 SEQ ID NO3的資料(i) 序列特征(A) 長度85堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO3GTTTAGGGAT ANCCCTCATC TCTTTGGTCA GGTACTGGCC CAAGATCTAG GCCACTTCTC 60AGGTCCAGSN ACTCTGTYCC TTCAG852SEQ ID NO4的資料(i) 序列特征(A) 長度86堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO4GTTCAGGGAT AGCCCCCATC TATTTGGCCA GGCACTAGCT CAATACTTGA GCCAGTTCTC 60ATACCTGGAC AYTCTYGTCC TTCGGT 862SEQ ID NO5的資料(i) 序列特征(A) 長度85堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO5GTTCARRGA TAGCCCCCATC TATTTGGCCW RGYATTAGCC CAAGACTTGA GYCAATTCTC 60ATACCTGGA CACTCTTGTCC TTYRG 852SEQ ID NO6的資料(i) 序列特征(A) 長度85堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO6GTTCAGGGAT AGCTCCCATC TATTTGGCCT GGCATTAACC CGAGACTTAA GCCAGTTCTY 60ATACGTGGAC ACTCTTGTCC TTTGG 852SEQ ID NO7的資料(i) 序列特征(A) 長度111堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO7GTGTTGCCAC AGGGGTTTAR RGATANCYCY CATCTMTTTG GYCWRGYAYT RRCYCRAKAY 60YTRRGYCAVT TCTYAKRYSY RGSNAYTCTB KYCCTTYRGT ACATGGATGA C 1112SEQ ID NO8的資料(i) 序列特征(A) 長度645堿基對(duì)(R) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO8TCAGGGATAG CCCCCATCTA TTTGGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGT CAATTCTCAT60ACCTGGACAC TCTTGTCCTT CAGTACATGG ATGATTTACT TTTAGTCGCC CGTTCAGAAA 120CCTTGTGCCA TCAAGCCACC CAAGAACTCT TAACTTTCCT CACTACCTGT GGCTACAAGG 180TTTCCAAACC AAAGGCTCGG CTCTGCTCAC AGGAGATTAG ATACTNAGGG CTAAAATTAT 240CCAAAGGCAC CAGGGCCCTC AGTGAGGAAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCCTCATC 300CCAAAACCCT AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC AGGTTTCTGC CGAAAACAGA 360TTCCCAGGTA CASCCCAATA GCCAGACCAT TATATACACT AATTANGGAA ACTCAGAAAG 420CCAATACCTA TTTAGTAAGA TGGACACCTA CAGAAGTGGC TTTCCAGGCC CTAAAGAAGG 480CCCTAACCCA AGCCCCAGTG TTCAGCTTGC CAACAGGGCA AGATTTTTCT TTATATGCCA 540CAGAAAAAAC AGGAATAGCT CTAGGAGTCC TTACGCAGGT CTCAGGGATG AGCTTGCAAC 600CCGTGGTATA CCTGAGTAAG GAAATTGATG TAGTGGCAAA GGGTT 6452SEQ ID NO9的資料(i) 序列特征(A) 長度741堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA (基因組)(xi) 序列描述SEQ ID NO9CAAGCCACCC AAGAACTCTT AAATTTCCTC ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCCAAACCA60AAGGCTCAGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTTAGGGT TAAAATTATC CAAAGGCACC 120AGGGGCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGGTT ATCCTCATCC CAAAACCCTA 180AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TAGCATGATC AGGTTTCTGC CGAAAACAAG ATTCCCAGGT 240ACAACCAAAA TAGCCAGACC ATTATATACA CTAATTAAGG AAACTCAGAA AGCCAATACC 300TATTTAGTAA GATGGACACC TAAACAGAAG GCTTTCCAGG CCCTAAAGAA GGCCCTAACC 360CAAGCCCCAG TGTTCAGCTT GCCAACAGGG CAAGATTTTT CTTTATATGG CACAGAAAAA 420ACAGGAATCG CTCTAGGAGT CCTTACACAG GTCCGAGGGA TGAGCTTGCA ACCCGTGGCA 480TACCTGAATA AGGAAATTGA TGTAGTGGCA AAGGGTTGGC CTCATNGTTT ATGGGTAATG 540GNGGCAGTAG CAGTCTNAGT ATCTGAAGCA GTTAAAATAA TACAGGGAAG AGATCTTNCT 600GTGTGGACAT CTCATGATGT GAACGGCATA CTCACTGCTA AAGGAGACTT GTGGTTGTCA 660GACAACCATT TACTTAANTA TCAGGCTCTA TTACTTGAAG AGCCAGTGCT GNGACTGCGC 720ACTTGTGCAA CTCTTAAACC C 7412SEQ ID NO 10的資料(i) 序列特征(A) 長度93堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(基因組)(xi) 序列描述SEQ ID NO10TGGAAAGTGT TGCCACAGGG CGCTGAAGCC TATCGCGTGC AGTTGCCGGA TGCCGCCTAT60AGCCTCTACA TGGATGACAT CCTGCTGGCC TCC 932SEQ ID NO11的資料(i) 序列特征(A) 長度96堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO11TTGGATCCAG TGYTGCCACA GGGCGCTGAA GCCTATCGCG TGCAGTTGCC GGATGCCGCC 60TATAGCCTCT ACGTGGATGA CCTSCTGAAG CTTGAG 962SEQ ID NO12的資料(i) 序列特征(A) 長度748堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO12TGCAAGCTTC ACCGCTTGCT GGATGTAGGC CTCAGTACCG GNGTGCCCCG CGCGCTGTAG 60TTCGATGTAG AAAGCGCCCG GAAACACGCG GGACCAATGC GTCGCCAGCT TGCGCGCCAG 120CGCCTCGTTG CCATTGGCCA GCGCCACGCC GATATCACCC GCCATGGCGC CGGAGAGCGC 180CAGCAGACCG GCGGCCAGCG GCGCATTCTC AACGCCGGGC TCGTCGAACC ATTCGGGGGC 240GATTTCCGCA CGACCGCGAT GCTGGTTGGA GAGCCAGGCC CTGGCCAGCA ACTGGCACAG 300GTTCAGGTAA CCCTGCTTGT CCCGCACCAA CAGCAGCAGG CGGGTCGGCT TGTCGCGCTC 360GTCGTGATTG GTGATCCACA CGTCAGCCCC GACGATGGGC TTCACGCCCT TGCCACGCGC 420TTCCTTGTAG ANGCGCACCA GCCCGAAGGC ATTGGCGAGA TCGGTCAGCG CCAAGGCGCC 480CATGCCATCT TTGGCGGCAG CCTTGACGGC ATCGTCGAGA CGGACATTGC CATCGACGAC 540GGAATATTCG GAGTGGAGAC GGAGGTGGAC GAAGCGCGGC GAATTCATCC GCGTATTGTA 600ACGGGTGACA CCTTCCGCAA AGCATTCCGG ACGTGCCCGA TTGACCCGGA GCAACCCCGC 660ACGGCTGCGC GGGCAGTTAT AATTTCGGCT TACGAATCAA CGGGTTACCC CAGGGCGCTG 720AAGCCTATCG CGTGCAGTTG CCGGATGC 7482SEQ ID NO13的資料(i) 序列特征(A) 長度18堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO13GCATCCGGCA ACTGCACG 182 SEQ ID NO14的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單性(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)DNA(xi) 序列描述SEQ ID NO14GTAGTTCGAT GTAGAAAGCG 202SEQ ID NO15的資料(i) 序列特征(A) 長度18堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)DNA(xi) 序列描述SEQ ID NO15GCATCCGGCA ACTGCACG182 SEQ ID NO16的資料(i) 序列特征(A) 長度23堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO16AGGAGTAAGG AAACCCAACG GAC 232 SEQ ID NO17的資料(i) 序列特征(A) 長度19堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO17TAAGAGTTGC ACAAGTGCG 192 SEQ ID NO18的資料(i) 序列特征(A) 長度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO18TCAGGGATAG CCCCCATCTA T 212 SEQ ID NO19的資料(i) 序列特征(A) 長度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO19AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT 242 SEQ ID NO20的資料(i) 序列特征(A) 長度15堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(ix) 特點(diǎn)(B) 位置5，7，10，13(D) 其它資料G代表肌苷(i)(xi) 序列描述SEQ ID NO20GGTCGTGCCG CAGGG 152 SEQ ID NO21的資料(i) 序列特征(A) 長度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO21TTAGGGATAG CCCTCATCTC T 212 SEQ ID NO22的資料(i) 序列特征(A) 長度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA (基因組)(xi) 序列描述SEQ ID NO22TCAGGGATAG CCCCCATCTA T 212 SEQ ID NO23的資料(i) 序列特征(A) 長度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA (基因組)(xi) 序列描述SEQ ID NO23AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT 242 SEQ ID NO24的資料(i) 序列特征(A) 長度23堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO24GCGTAAGGAC TCCTAGAGCT ATT 232 SEQ ID NO25的資料(i) 序列特征(A) 長度18堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO25TCATCCATGTACCGAAGG 182 SEQ ID NO26的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO26ATGGGGTTCC CAAGTTCCCT202 SEQ ID NO27的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)DNA(xi) 序列描述SEQ ID NO 27GCCGATATCA CCCGCCATGG202 SEQ ID NO28的資料(i) 序列特征(A) 長度18堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型互補(bǔ)DNA(xi) 序列描述SEQ ID NO28GCATCCGGCA ACTGCACG 182 SEQ ID NO29的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO29CGCGATGCTG GTTGGAGAGC202 SEQ ID NO30的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO30TCTCCACTCC GAATATTCCG 202 SEQ ID NO31的資料(i) 序列特征(A) 長度26堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO31GATCTAGGCC ACTTCTCAGG TCCAGS 262 SEQ ID NO32的資料(i) 序列特征(A) 長度23堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(ix) 特點(diǎn)(B) 位置6，12，19(D) 其它資料G代表肌苷 (i)(xi) 序列描述SEQ ID NO32CATCTGTTTG GGCAGGCAGT AGC 232 SEQ ID NO33的資料(i) 序列特征(A) 長度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO33CTTGAGCCAG TTCTCATACC TGGA242 SEQ ID NO34的資料(i) 序列特征(A) 長度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO34AGTGYTRCCM CARGGCGCTG AA 222 SEQ ID NO35的資料(i) 序列特征(A) 長度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA (基因組)(xi) 序列描述SEQ ID NO35GMGGCCAGCA GSAKGTCATC CA222 SEQ ID NO36的資料(i) 序列特征(A) 長度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(基因組)(xi) 序列描述SEQ ID NO36GGATGCCGCC TATAGCCTCT AC 222 SEQ ID NO37的資料(i) 序列特征(A) 長度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO37AAGCCTATCG CGTGCAGTTG CC 222 SEQ ID NO38的資料(i) 序列特征(A) 長度40堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO38TAAAGATCTA GAATTCGGCT ATAGGCGGCA TCCGGCAAGT402 SEQ ID NO39的資料(i) 序列特征(A) 長度126堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO39GTGCTACCAC AGGGGTTCAG GGATAGCTCC CATCTATTTG GCCTGACATT AACCCGAGAC 60TTAAGCCAGT TCTCATACGT GGACACTCTT GTCCTTTGGT ACGTGGATGA CATCCTGCTG 120GCCTCC 1262 SEQ ID NO40的資料(i) 序列特征(A) 長度87堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO40GTGCTGCCCC AGGGCGCTGA AGCCTATCGC GTGCAGTTGCCGGATGCCGC CTATAGCCTC 60TACGTGGATG ACCTGCTGCT GGCCTCC 872 SEQ ID NO41的資料(i) 序列特征(A) 長度705堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO41GTAGTTCGAT GTAGAAAGCG CCCGGAAACA CGCGGGACCA ATGCGTCGCC AGCTTGCGCG60CCAGCGCCTC GTTGCCATTG GCCAGCGCCA CGCCGATATC ACCCGCCATG GCCGCCGGAG 120AGCGCCAGCA GACCGGCGGC CAGCGGCGCA TTCTCCAACG CCGGGCTCGT CGAATCATTC 180GGGGGCGATT TCCCCACGAC CGCGATGCTG GTTGGAGAGC CAGGCCCTGG CCAGCAACTG 240GCACAGGTTC AGGTAACCCC TGCTTGTCCC CGCACCCAAC AGCAGCAGGC GGGTCGGCTT 300GTCGCGCTCG TCCGTGATTG GTGGATCCAC AACGTCAGCC CCGACGATGG GCTTCACGCC 360CTTGCCACGC GCTTCCTTGT AGAAGCGCAC CAGCCCGGAA GGCATTGGCG AGATCGGTCA 420AGCGCCAAGG NSCCCCATGC CATCTTTGGC GGCAGGCCTT GACGGCATCG TCGAGACGGA 480CATTGCCATC GACCGACGGA ATATTCGGAG TGGAGACGGA GGTGGACGAA GCGCGGCGAA 540TTCATCCGCG TATTGTAACG GGTGACACCT TCCCCAAAGC ATTCCGGGCG TGCCCGATTG 600ACCCGGAGCA ACCCCGCACG GCTGCGCGGG CAGTTATAAT TTCGGCTTAC GAATCAACGG 660GTTACCCCAG GGCGCTGAAG CCTATCGCGT GCAGTTGCCG GATGC 7052 SEQ ID NO42的資料(i) 序列特征(A) 長度648堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO42CAGGGTATAG CCCCCATCTA TTTGGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGC CAGTTCTCAT60ACCTGGACAC TCTTGTCCTT CAGTATATGG ATGATTTACT TTTAGTGACC CATTCAGAAA 120CCTTGTGATG TCAAGCCACA CAAGTGCTCT TAACTTTCCT CTTTACCTCT GGCTACAAGG 180TTTTCAAACC AAAGGCTCAG CTCTGCTCAC AGCAGGTTAA ATATTTAGGG CTAAAATTAT 240CCAAAGGCAC CAGGGCCCTC AGTGAGGAAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCTTCATC 300CCAAAACCCT AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC AGGCTTCTGC TGAATATGGA 360TTCCCAGGTT YGGTGAAATA GCCAGGCCAT TAAATACACT AATTAAGGAA ACTCAGAAAG 420CCAATACCCA TTTAGTAAGA TGGACATCTG AAGCACAATC AGCTTTCCAG GCACTAAAGA 480AAGCCCTAAC CCAAGCCCCA GTGTTAAGCT TGCCAACAGG GCAAGACTTT TCTTTATATG 540TCACAGAAAA AATAGGAATA GCTCTAGGAG TCCTTACACA GGTCTGAGGG ACAAGCTTGC 600AACCCGTGGC ATATCTGAGT AAGGARRCTG ATGTAGTGGC AAAGGGTT 6482 SEQ ID NO43的資料(i) 序列特征(A) 長度648堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO43CAGGGTATAG CCCCCATCTA TTTGGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGC CAGTTCTCAT60ACCTGGACAC TCTTGTCCTT CAGTATATGG ATGATTTACT TTTAGTGACC CATTCAGAAA 120CCTTGTGATG TCAAGCCACA CAAGTGCTCT TAACTTTCCT CTTTACCTCT GGCTACAAGG 180TTTTCAAACC AAAGGCTCAG CTCTGCTCAC AGCAGGTTAA ATATTTAGGG CTAAAATTAT 240CCAAAGGCAC CAGGGCCCTC AGTGAGGAAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCTTCATC 300CCAAAACCCT AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC AGGCTTCTGC TGAATATGGA 360TTCCCAGGTT YGGTGAAATA GCCAGGCCAT TAAATACACT AATTAAGGAA ACTCAGAAAG 420CCAATACCCA TTTAGTAAGA TGGACATCTG AAGCACAATC AGCTTTCCAG GCACTAAAGA 480AAGCCCTAAC CCAAGCCCCA GTGTTAAGCT TGCCAACAGG GCAAGACTTT TCTTTATATG 540TCACAGAAAA AATAGGAATA GCTCTAGGAG TCCTTACACA GGTCTGAGGG ACAAGCTTGC 600AACCCGTGGC ATATCTGAGT AAGGARRCTG ATGTAGTGGC AAAGGGTT6482 SEQ ID NO44的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO44GCCGATATCA CCCGCCATGG 202 SEQ ID NO45的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO45CGCGATGCTG GTTGGAGAGC 202 SEQ ID NO46的資料(i) 序列特征(A) 長度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO40TCTCCACTCC GAATATTCCG 202 SEQ ID NO47的資料(i) 序列特征(A) 長度26堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO47GATCTAGGCC ACTTCTCAGG TCCAGS 262 SEQ ID NO48的資料(i) 序列特征(A) 長度23堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO48CATCTITTTG GICAGGCAIT AGC 232 SEQ ID NO49的資料(i) 序列特征(A) 長度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓樸構(gòu)型線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO49CTTGAGCCAG TTCTCATACC TGGA24
參考文獻(xiàn)(1)Sauvezio B.等，“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，現(xiàn)狀與前景”，Sany J.，1-13，Collection Médecine-Sciences Flammarion，巴黎，1987。(2)Kahen A.，病毒和類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎，見“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，現(xiàn)狀與前景”，Sany J.，1-13，Collection Me decine-Sciences Flammarion，巴黎，1987。(3)Fujinami R.S.和Oldstone M.B.A.編，微生物學(xué)和免疫學(xué)中的前沿課題，145，柏林，Springer Verlag，1989。(4)Acha-Orbea H.和Palmer E.，Mls-一種利用免疫系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒-今日免疫學(xué)1991；12，271-276。(5)Cole B.C.和Atkin C.L，支原體關(guān)節(jié)炎T-細(xì)胞分裂素，MAM一種模型超級(jí)抗原，今日免疫學(xué)1991；12，271-276(6)Posnet D.N.，超級(jí)抗原在自身免疫中起作用嗎？免疫學(xué)探討，1993；5，65-72。(7)Perron H.等，病毒學(xué)研究，1989；140，551-561。(8)Shih A.，Misra R.和Rush M.G.，病毒學(xué)研究，1989；63，64-75。(9)Fields和Knipe，基礎(chǔ)病毒學(xué)，1986，Rev Press N.Y.(10)Nielsen P.E.等，科學(xué)1991；254，1497-1500(11)Maniatis等，分子克隆，Cold Spring Harbor，1982。(12)Southern.E.M.，分子生物學(xué)雜志，1975；98，503(13)Dunn A.R.和Hassel J.A.，細(xì)胞1977；12，23(14)Perron H.等，病毒學(xué)研究，1992；143，337-350(15)Chomzynski P.和Sacchi N.，分析生物化學(xué)，1987；162，156-159。(16)Sambrook.J.，F(xiàn)ritsch E.F.，和Maniatis T.，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，1989.(17)Meyerhans等，細(xì)胞1989；58，901-910。(18)Linial M.L.和Miller A.D.，“微生物學(xué)和免疫生物學(xué)中的前沿課題。逆轉(zhuǎn)錄病毒，復(fù)制方法”157卷，125-152；Swanstrom R.和VogtP.K.編，Springer-Verlag，Heidelberg 1990(19)Lori F.等，病毒學(xué)雜志，1992；66，5067-5074(20)La Mantia等，核酸研究，1991；19，1513-1520(21)Frohman等，美國國家科學(xué)院院報(bào)1988；85，8998-9002(22)Mallet F.等，臨床微生物學(xué)雜志，1993；31，1444-1449。
權(quán)利要求
1.使用一種病毒物質(zhì)，其為純化狀態(tài)或分離狀態(tài)，有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，相關(guān)于一內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒因子的一個(gè)家族，來自有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的一病毒株，該病毒株選自分別被稱為POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V93010816)的病毒株及其變異株，組成這些病毒株的病毒帶有至少一種抗原，它能被至少一種抗體識(shí)別，該抗體直接針對(duì)至少一種相關(guān)于上述病毒株P(guān)OL-2和MS7PG的任一個(gè)病毒的抗原，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病毒物質(zhì)，或上述物質(zhì)的再激活物導(dǎo)致的感染。
2.使用一種病毒物質(zhì)，其為純化或分離狀態(tài)，有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，相關(guān)于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒因子的一個(gè)家族，由選自被分別稱為PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)93010817)的細(xì)胞系的一個(gè)細(xì)胞系產(chǎn)生，或由能產(chǎn)生如下病毒的任何受感染細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生，該病毒帶有至少一種抗原，它能被至少一種抗體識(shí)別，該抗體直接針對(duì)相關(guān)于由上述PLI-2和LM7PC系產(chǎn)生的任一種病毒的至少一種抗原，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物以檢測(cè)、防止或治療由上述與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病毒物質(zhì)或上述物質(zhì)的一種再激活物導(dǎo)致的感染。
3.使用一種病毒物質(zhì)，其基因組含有選自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的一段核苷酸序列，特別是那種核苷酸序列，即在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上與選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列有至少50％、優(yōu)選至少70％同源性，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病毒物質(zhì)，或上述物質(zhì)的一種再激活物所導(dǎo)致的感染。
4.使用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，其基因組的pol基因含有一等價(jià)核苷酸序列，并特別與屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒ERV-9或HSERV-9的基因組的pol基因的一段核苷酸序列有至少50％、優(yōu)選至少65％同源性，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病毒物質(zhì)，或上述物質(zhì)的一種再激活物導(dǎo)致的感染。
5.使用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，其基因組的pol基因編碼一個(gè)肽序列，該序列與逆轉(zhuǎn)錄病毒ERV-9或HSERV-9的基因組的pol基因所編碼的一個(gè)肽序列有至少50％、優(yōu)選至少70％同源性，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病毒物質(zhì)，或上述物質(zhì)的一種再激活物引起的感染。
6.使用一種病毒物質(zhì)，其基因組的pol基因編碼的一段肽序列，該肽序列在其任一段有至少30個(gè)氨基酸的連續(xù)序列上與由選自SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ IDNO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列所編碼的一段肽序列有至少50％、優(yōu)選至少70％的同源性，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病毒物質(zhì)，或上述物質(zhì)的一種再激活物引起的感染。
7.使用一段核苷酸片段，其核苷酸序列包括選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的一段核苷酸序列，特別是選自這樣的核苷酸序列，其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列至少有50％、優(yōu)選至少70％同源于選自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段序列，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病毒物質(zhì)，或上述病毒物質(zhì)的一種再激活物所引起的感染。
8.使用一種特異性引物，它包括一段核苷酸序列，該序列完全相同于或等價(jià)于權(quán)利要求7中定義的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列，特別是這樣一段核苷酸序列，在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少70％同源于上述片段的至少一個(gè)部分，以用聚合作用擴(kuò)增相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種病毒物質(zhì)的一段RNA或DNA。
9.按照權(quán)利要求8的用途，其特征在于引物帶有一個(gè)核苷酸序列，此序列選自SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，EQ要ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO47，SEQ IDNO48和SEQ ID NO49及其互補(bǔ)序列。
10.使用一種探針，它帶有一段核苷酸序列，該序列相同于或等價(jià)于權(quán)利要求6中定義的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列，特別是這樣一段核苷酸序列，在其任一段有10個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少70％同源于上述片段的至少一部分，以獲得一種組合物以檢測(cè)、分離或鑒定某生物學(xué)樣品中與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的一種病毒物質(zhì)。
11.按照權(quán)利要求10的用途，其特征在于該引物帶有選自SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ IDNO7，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，EQ要ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO47，SEQ IDNO48和SEQ ID NO49及其互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列。
12.使用一種致病和/或感染因子，其為純化或分離狀態(tài)，不同于權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)中定義的病毒物質(zhì)，其來自一病毒株，該病毒株選自分別被稱為POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V93010816)的病毒株及其變異株，所包括的致病和/或感染因子帶有至少一種抗原，它能被至少一種抗體識(shí)別，該抗體直接針對(duì)相關(guān)于上述病毒株P(guān)OL-2和MS7PG的任一種致病和/或感染因子的至少一種抗原，這些因子各自不同于上述毒株的任一種逆轉(zhuǎn)錄病毒物質(zhì)，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病和/或感染因子，或上述因子的一種再激活物引起的感染。
13.使用一種致病和/或感染因子，其為純化或分離態(tài)的，不同于權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)定義的病毒物質(zhì)，產(chǎn)自一細(xì)胞系，該系選自分別被稱為PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)93010817)的兩種細(xì)胞系，以及產(chǎn)自任何能產(chǎn)生至少任一種致病和/或感染因子的感染細(xì)胞培養(yǎng)物和/或其變異體，或產(chǎn)自任一種感染細(xì)胞培養(yǎng)，該細(xì)胞培養(yǎng)能產(chǎn)生一種致病和/或感染因子。該因子帶有至少一種抗原，該抗原能被至少一種抗體識(shí)別，該抗體能直接針對(duì)相應(yīng)于上述PLI-2和LM7PC產(chǎn)生的任一種致病和/或感染因子的至少一種抗原，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病和/或感染因子，或上述因子的一種再激活物引起的感染。
14.使用一種帶一種核酸的致病和/或感染因子，該核酸帶有一段選自SEQ ID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40，SEQID NO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，它與含有一段選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ IDNO12，SEQ 1D NO40，SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的序列的一段核苷酸序列有至少70％、優(yōu)選至少90％的同源性，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病和/或感染因子，或上述因子的一種再激活物引起的感染。
15.使用一核苷酸片段，其含有選自SEQ ID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸片斷，特別是這樣一種核苷酸序列，它在其任一段有100個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少70％、優(yōu)選至少90％同源于選自SEQ ID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一段序列，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病和/或感染因子，或上述因子的再激活物引起的感染。
16.使用一種引物，其含有一段核苷酸序列，該序列相同于或等價(jià)于權(quán)利要求15中定義的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列，特別是一核苷酸序列，在其任一段有10個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少90％同源于上述片段的至少一部分，以通過聚合來擴(kuò)增與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的致病和/或感染因子的一段RNA或DNA。
17.按權(quán)利要求16的用途，其特點(diǎn)在于該引物帶有一段選自SEQ IDNO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO27，SEQ IDNO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO34，SEQ IDNO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO44，SEQ IDNO45和SEQ ID NO46及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
18.使用一種引物，其含有一核苷酸序列，該序列相同于或等價(jià)于權(quán)利要求15的一片段的至少一部分核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少90％同源于上述片段的至少一部分，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由上述與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的致病和/或感染因子，或上述因子的再激活物引起的感染。
19.按照權(quán)利要求18的用途，其特點(diǎn)在于，該探針包括一段選自SEQID 10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ IDNO30，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ IDNO37，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
20.使用由兩種致病和/或感染因子組成的一種組合物，其為分離態(tài)或純化態(tài)的，即，第一因子，包括人病毒，有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，相關(guān)于內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒因子的一個(gè)家族，或是上述病毒的一個(gè)變異株；以及第二因子，或上述第二因子的一種變異，這兩種致病和/或感染因子象那些衍生于相同病毒株的因子一樣，這里的病毒株選自被分別稱為POL-2(1992年7月22 ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)為V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V93010816)的兩種毒株及其變異株，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的第一致病和/或感染因子和第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或上述第二因子的一種再激活物所致的感染。
21.使用由兩種致病和/或感染因子組成的組合物，其為分離態(tài)或純化態(tài)的，即，第一因子，由帶逆轉(zhuǎn)錄酶活性的一種人病毒構(gòu)成，它相關(guān)于內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒因子的一個(gè)家族，或由上述病毒的一種變異體組成；以及第二因子，或上述第二因子的一種變異體，這兩種致病和/或感染因子就象那些產(chǎn)自同樣的細(xì)胞系的因子，該細(xì)胞系選自被分別稱為PLI-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)92072201)和LM7PC(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)93010817)的兩種細(xì)胞系，這兩種因子也產(chǎn)自受感染細(xì)胞培養(yǎng)和/或其變異，該培養(yǎng)能產(chǎn)生其中至少一種致病和/或感染因子，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的第一致病和/或感染因子，第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或第二因子的再激活物引起的感染。
22.使用由兩種致病和/或感染因子組成的組合物，其為分離或純化態(tài)的，即，第一因子，包括一種病毒或其變異體，其基因組包括一段選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6，EQ要ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這樣一種核苷酸序列，其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少50％，優(yōu)選至少70％同源于一段選自SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列；第二致病和/或感染因子，其基因組有一段選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少70％、優(yōu)選至少90％同源于選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一段核苷酸序列，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的第一致病和/或感染因子和由第二致病和/或感染因子，或由上述第一因子或第二因子任一種的再激活物引起的感染。
23.使用一種核苷酸片段組合物，其中有第一片段，其核苷酸序列有一段選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上有至少50％、優(yōu)選至少70％同源于一段選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO39，SEQ ID NO42和SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列；以及第二片段，其核苷酸序列包括一段選自SEQ IDNO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ IDNO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含100個(gè)單體的序列上有至少70％、優(yōu)選至少90％同源于選自SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO40和SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一核苷酸序列，上述每個(gè)片段都尤其是一個(gè)探針，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的第一致病和/或感染因子，第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或第二因子任一種的再激活物引起的感染。
24.使用一種組合物，它包括第一多肽，其部分或全部地由權(quán)利要求23中定義的第一核苷酸片段編碼；以及第二多肽，其部分或全部地由權(quán)利要求23中定義的第二核苷酸片段編碼，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的第一致病和/或感染因子，第二致病和/或感染因子，或上述第一因子或第二因子任一種的再激活物引起的感染。
25.按權(quán)利要求24的用途，其特點(diǎn)在于該用途包括第一配基，特別是一抗體，它特異性針對(duì)第一多肽，以及第二配基，特別是一抗體，它特異性針對(duì)第二多肽，所述第一多肽和第二多肽是權(quán)利要求24中定義的。
26.按權(quán)利要求1至6之一產(chǎn)生第一致病和/或感染因子，和/或，按權(quán)利要求13和15之一產(chǎn)生第二致病和/或感染因子的方法，這些因子相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其特點(diǎn)在于來自滑液穿刺的細(xì)胞均經(jīng)體外培養(yǎng)，這些細(xì)胞特別選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人關(guān)節(jié)液的去皮成纖維細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞。
27.按權(quán)利要求1至6之一產(chǎn)生第一致病和/或感染因子，和/或，按權(quán)利要求13和14之一產(chǎn)生第二致病和/或感染因子的方法，這些因子相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其特點(diǎn)是由EB病毒無限增殖化的B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)，這些細(xì)胞來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人。
28.核苷酸片段，其核苷酸序列包括一段選自SEQ ID NO39，SEQID NO42，SEQ ID NO43，及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上顯示出至少50％、優(yōu)選至少70％同源于選自SEQ ID NO39，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43及其互補(bǔ)序列的一段序列。
29.通過聚合作用對(duì)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的病毒物質(zhì)的一段RNA或DNA進(jìn)行擴(kuò)增所用的特異性引物，其特點(diǎn)是該引物帶有一段核苷酸序列，該序列相同于或等價(jià)于權(quán)利要求28的一個(gè)片段的至少一部分核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的順序上顯示至少70％同源于上述序列的至少一部分。
30.按權(quán)利要求29的引物，其特征在于，它包括一段選自SEQ IDNO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49及它們的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
31.能與權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的病毒物質(zhì)的RNA或DNA特異性雜交的探針，其特征在于它包括一段核苷酸序列，該序列相同于或等價(jià)于權(quán)利要求28的一片段的至少一部分核苷酸序列，特別是這樣一種核苷酸序列，在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的順序上顯示至少70％同源于上述片段的至少一部分。
32.按權(quán)利要求31的探針，其特征在于它含有一段選自SEQ IDNO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49及它們的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
33.核苷酸片段，其核苷酸序列包括一段選自SEQ ID NO40，SEQID NO41及其互補(bǔ)序列和等價(jià)序列的核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含100個(gè)連續(xù)單體的序列上顯示至少70％、優(yōu)選至少90％同源于選自SEQ ID NO40，SEQ ID NO41及其互補(bǔ)序列的一段序列。
34.用于通過聚合作用對(duì)權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)的致病和/或感染因子的RNA或DNA進(jìn)行擴(kuò)增的特異性引物，其特征在于它包括一段核苷酸序列，該序列相同于或等價(jià)于權(quán)利要求33的片段的至少一部分核苷酸序列，特別是這種核苷酸序列，在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的順序上顯示至少90％同源于上述片段的至少一部分。
35.按權(quán)利要求34的引物，其特征在于它包括一段選自SEQ IDNO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
36.能與權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)的致病和/或感染因子的RNA或DNA特異性雜交的探針，其特點(diǎn)在于它包括一段核苷酸序列，該序列相同于或等價(jià)于權(quán)利要求33的片段的至少一部分核苷酸序列，特別是這樣一段核苷酸序列，在其任一段含10個(gè)連續(xù)單體的順序上顯示至少90％同源于上述片段的至少一部分。
37.按權(quán)利要求36的探針，其特征在于它包括一段選自SEQ IDNO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種病毒物質(zhì)的應(yīng)用，其為純化態(tài)或分離態(tài)，有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，涉及內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒因子的一個(gè)家族，本發(fā)明還/或涉及一種致病和/或感染因子的應(yīng)用，該因子處于純化態(tài)或分離態(tài)，它不同于上述病毒物質(zhì)，它們每一個(gè)都衍生于一種有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的病毒株，該株選自被分別稱為POL-2(1992年7月22日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V92072202)和MS7PG(1993年1月8日在ECACC提出申請(qǐng)，登錄號(hào)V93010816)的兩種病毒株及其變異株，這些毒株包括的病毒有至少一種抗原，它能被至少一種抗體所識(shí)別，該抗體能直接針對(duì)相關(guān)于上文提到的病毒株P(guān)OL-2和MS7PG之一的至少一種抗原，以獲得一種診斷、預(yù)防或治療組合物來檢測(cè)、防止或治療由相關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的上述病毒物質(zhì)和/或上述致病和/或感染因子引起的感染。
文檔編號(hào)A61K39/21GK1153530SQ9619017
公開日1997年7月2日 申請(qǐng)日期1996年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月7日
發(fā)明者H·普朗, B·曼德朗德, F·馬萊特, F·比丁, F·比塞姆 申請(qǐng)人:比奧美希奧公司