專利名稱：利用酶化軟骨治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域發(fā)明的背景中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)＂以臟治臟＂的原理已被廣泛地應(yīng)用于多種疾病的治療。近幾年對于“口服耐受性”(Oraltolerence)的免疫學(xué)研究從另一側(cè)面揭示了這一有效的治療的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)原理(1·2)。但是動物軟骨一直沒有被有效地應(yīng)用于對各種骨關(guān)節(jié)及其它軟骨疾病的治療，其原因是傳統(tǒng)的煎制方法不能有效地提取軟骨中的主要有效成分。
軟骨蛋白的主要成分是膠原，膠原蛋白現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)有十八種，其共同的特征是含有由三條蛋白鏈構(gòu)成三股螺旋結(jié)構(gòu)(3)。軟骨中的膠原蛋白是II型·IX型和XI型·II型膠原由三條相同的蛋白鏈組成，而IX型和XI型膠原由三條不同的蛋白鏈組成，這三種膠原一起構(gòu)成軟骨膠原纖維(4)。膠原纖維除了維持軟骨的機(jī)械強(qiáng)度外，還通過其RGD氨基酸序列和細(xì)胞表面的細(xì)胞外基質(zhì)受體(INTEGRIN)結(jié)合，所傳遞的信號保證了軟骨細(xì)胞的生存、生長和分化(5，6)。
軟骨細(xì)胞合成的前膠原(PROCLLAGEN)在細(xì)胞外被轉(zhuǎn)化為成熟的膠原分子，膠原分子近一步組裝成膠原纖維。在膠原纖維中，膠原分子非螺旋的羰基和氨基末端的賴氨酸和羥賴氨酸被氧化后會和另一分子的賴氨酸、羥賴氨酸發(fā)生縮合反應(yīng)形成分子間的共價結(jié)合。經(jīng)過一系列的縮水和重排，這一分子間的交聯(lián)轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的鍵合(7)。從而使膠原纖維中分子間的結(jié)合變得非常穩(wěn)定。在軟骨中，膠原纖維還被透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素所包埋(8)。因此軟骨膠原的可溶性極低。
風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制還不清楚。患者關(guān)節(jié)紅腫、疼痛并發(fā)生變形，其主要病理特征是膠原纖維降解和關(guān)節(jié)軟骨壞死。再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎可以發(fā)生于身體的任何軟骨，包括耳軟骨和鼻軟骨，其特征是所患組織紅腫變形并發(fā)生壞死。它們的共同特征是免疫細(xì)胞大量侵入和患者有抗自身軟骨膠原蛋白的自身免疫抗體(9)。
METHOTREXATE，CYCLOSPORIN A和AZATHIOPPINE已被用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎。它們都是非特異性的免疫抑制藥物，具有細(xì)胞毒性，長期服用會降低患者的免疫功能。激素類藥物也被用于這兩種疾病的治療，但是長期服用會導(dǎo)致毒性副作用。中醫(yī)對于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療主要是祛風(fēng)除濕散寒止痛，所用藥以蟲類藥為主。它們的主要功能是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。其特征也是缺乏特異性，治療效果并不理想。
根據(jù)中醫(yī)的“以臟治臟”及現(xiàn)代免疫學(xué)的“口服耐受性”的原理，軟骨尤其是所含的膠原蛋白可能具有治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟發(fā)炎的功能。本發(fā)明利用蛋白酶消化使軟骨膠原纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘哪z原分子，并將酶化軟骨應(yīng)用于對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎的治療。
發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容膠原分子因其含有三股螺旋結(jié)構(gòu)而非常穩(wěn)定，在低溫下不會被胃蛋白酶或胰白酶所消化。具有非螺旋結(jié)構(gòu)的羰基和氨基末端卻可以被這兩種酶所消化，因而胃蛋白酶和胰蛋白酶消化可以切斷膠原纖維中分子間的交聯(lián)。在本發(fā)明中，我首先將勻漿后的軟骨在低濃度醋酸中溶脹，然后利用胃蛋白酶在酸性緩沖液或胰蛋白酶在中性緩沖液中進(jìn)行消化。利用這一方法，百分之五十到百分之九十的軟骨被溶解。軟骨膠原蛋白的回收率可達(dá)百分之六十到百分之八十，軟骨的溶解率和膠原蛋白的回收率隨組織的年紀(jì)增加而降低。所提取得膠原蛋白含有II型、IX型和XI型膠原。利用我們報道的逐級鹽沉淀的方法(10)，這三種膠原可以被分離純化。它們都表現(xiàn)出典型的電泳蛋白圖譜(圖一)。II型膠原是軟骨膠原的主要成分，胚胎軟骨百分之八十的膠原為II型膠原，其所占比例隨軟骨的年齡增加而增加。酶化軟骨中的II型膠原的理化性質(zhì)鑒定如表一所列。這些數(shù)據(jù)顯示了膠原在酶化軟骨中保持了它們的三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。
表一酶化軟骨中的II型膠原的解旋溫度(Tm)賴氨酸和脯氨酸的羥基化以及羥基賴氨酸的糖化(GGHGlc-Gal-Hyl，GHGal-Hyl
根據(jù)中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“以臟治臟”及現(xiàn)代免疫學(xué)的“口服耐受性”的原理，酶化軟骨可以被用于防治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)軟骨炎。酶化軟骨可以特異性地抑制與這兩種疾病有關(guān)的自身免疫反應(yīng)。酶化軟骨可制成水劑、片劑、膠囊、沖劑供患者服用。
參考文獻(xiàn)(1).Chen Y.，Inobe J.，Marks R.，Gonnella P.，Kuchroo V.K.and Weiner H.(1995)，Nature Vol376，177-180(2).Whitacre C.G.，Gienapp I.E.，and Bitar D.(1991)，J.immun.Vol 147，2155-2163b(3).Piez K.A.and Sherman M.R.(1975)，Nature，Vol 258，87-90(4).Yang C.L.，Notbohm H.，Acil Y.，Rui H.F.andMuller P.K.(1995) ，Biochem.J.Vol 306，871-875(5).Zachary I.and Rozengurt E.(1992)，Cell，Vol 71，891-894(6).Juliano R.L.and Haskill S.(1993)，J.Cell Biol.，Vol 120，577-585(7).Eyre D.R.and Oguchi H.(1980)，Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol 92，403-410(8).Harnegard D.(1977)，J.Biol.Chem.Vol 252，1980-1989.(9).Yang C.l.et al(1993)，Arch Dermotol.Res.Vol285，245-249(10).Yang C.L.et al(1991)，Eur.J.Biochem.Vol 202，1141-114權(quán)利要求
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明的主要成果是利用限制性蛋白酶技術(shù)有效地提取軟骨中的有效成分。并根據(jù)中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“以臟治臟”的原理，將酶化軟骨應(yīng)用于對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎的治療。本發(fā)明的技術(shù)特征是利用生物酶解技術(shù)從動物軟骨中制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎的有效組分。本發(fā)明的權(quán)利要求和請求保護(hù)的范圍是1、酶化軟骨的制備技術(shù)利用限制性蛋白酶消化溶解軟骨并保持其膠原成分的結(jié)構(gòu)完整性，蛋白酶包括胃蛋白酶和胰蛋白酶。2、利用酶化軟骨治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎酶化軟骨或從酶化軟骨分離出的單一組分或多組分制成可供口服的劑型，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明的主要成果是利用限制性蛋白酶消化技術(shù)有效地提取軟骨中的有效成分。并根據(jù)中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“以臟治臟”的原理，將酶化軟骨應(yīng)用于對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和再發(fā)性多發(fā)性軟骨炎的治療。
文檔編號A61K35/32GK1134818SQ9511606
公開日1996年11月6日 申請日期1995年10月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月11日
發(fā)明者楊春林 申請人:張小寧