專利名稱：用克力克斯(n)芳烴類化合物抑制和治療包膜病毒的感染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制由包膜病毒所引起的細胞感染的方法，尤其涉及應(yīng)用本發(fā)明定義的克力克斯(n)芳烴類化合物(Calix(n)areneCompounds)抑制其感染的方法;在有關(guān)的方面，本發(fā)明涉及抑制經(jīng)性交傳播的包膜病毒感染的方法。
參考文獻Allen,R.M.,clinNeuropharmacol,6∶S64(1983).
Almi,M.,Arduini,A.Casnati,A.,Pochini,A.,andArduiniA.,Pochini,A.,Rizzi,A.,Sicuri,A.R.,andBarre-Simoussi,F.,etal.,Science220∶868-871(1983).
Blackburn,G.M.,etal.,ChemicaScripta,26∶21(1986).
Bundgaard,H.,(Ed.)"DesignofProdrugs",Elsivier,Amsterdam(1985).
Chanock,R.M.,etal.,Am.J.Hyg.66∶29-300(1957).
Collins,P.,JAntimicrobchemoth,5∶431(1979).
deMendoza,J.,Nieto,P.M.,Prados,P.,andSanchez,C.(1990)Tetrahedron46,671-682.
Dick,E.C.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.127∶1079-1081(1968).
Erlich,K.S.,etal.,N.Eng.J.Med.320∶293-296(1989).
Elion,G.B.,etal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA74∶5617-5620(1977).
Galbraith,A.W.,Lancet,1026(1969).
Gibrack,C.D.,etal.,J.Inf.Dis.146∶673-682(1982).
Gottlieb,M.S.,etal.,N.Eng.J.Med.305∶425-3(1981).
Gormer,B.,etal.(1990)Makromol.Chem.191,81-87.
Gutsche,C.D.(1991)"SinglestepSynthesisandPropertiesofCalixarenes",inCalixaranes-aVersatileClassofMacrocyclicCompounds,Vicens,J.,andBohmer,V.Editors,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,The.Netherlands,pp.1-37.
Gutsche,C.D.,andNam,K.C.(1988)J.Am.Chem.Soc.110,6153-6162.
Gutsche,C.D.,Dhawan,B.,Levine,J.A.,No,K.H.,andBauer,L.J.(1983)Tetrahedron39,409-426.
Gutsche,C.D.,andLin,L-G.(1986)Tetrahedron42,1633-1640.
Gutsche,C.D.,Levine,J.A.,andSujeeth,P.K.(1985)J.Org.Chem.50,5802-5806.
Hansch,C.,Leo,A.,Structure-ActivityCorrelation,Wiley,(1979).
Hansch,C.inDrugDesign(E.J.Ariens,ed.),Vol.II,p.271,AcademicPress,(1971).
Hillenan,M.R.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.85∶183-188(1954).
Hirao,T.,Masunaga,T.,Yamada,N.,Ohshiro,Y.,andAgawa,T.(1982)Bull.Chem.Soc.Jpn.55,909-913.
Huttunen,P.,etal,PharmacolBiochem&Behav24∶1733-38(1986).
Jaffe,Chem.Rev.,53,191(1953).
Kern,E.R.,Amer.J.Med.73∶100-108(1982).
Klatzmann,D.,etal.,Science225∶59-63(1984).
Lifson,J.D.,etal.,Science241∶712-716(1988).
March,J.,Advanced Organic Chemistry 3rded.,Chapter 9,Wiley(1985).
Martin,J.C.,ed.NucleosideAnaloquesasAntiviralAqents,ACS,WashingtonD.C.(1989).
Mertz,G.J.,etal.,JAMA260∶201-206(1988).
Mitsuya,M.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci∶82∶7096-7100,USA(1985).
Moritaetal.(1989)Chem.Lett.,p.1349-.
Noetal.(1986)Bull.Kor.Chem.Soc.7,442.
Po,B-L,etal.,TetrahedronLetters,30(8)∶1005(1989).
Po,B-L,etal.,Tetrahedron,46(10)∶3651(1990).
Po,B-L,etal.,Tetrahedron,46(12)∶4379(1990).
Popovic,M.,etal.Science224∶497-500(1984).
Roizman,B.,etal,Inter.Virol.16∶201-217(1981).
Roizman,B.,etal.,J.Virol.15∶75-79(1961).
Rowe,W.P.,etal.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.84∶570-573(953).
Schaefer,J.P.,Higgins,J.G.,andShenoyP.K.(1973)Org.Synth.,Coll.Vol.V,249.
Shinkai,S,etal.(1987)J.Chem.Coc.PerkinTrans.I,2297-2299.
Shinkai,S.,etal.(1987)J.Chem.Soc.PerkinTrans.I,2039-2045.
Sidwell,R.W.,AppMicrobiol,22∶797(1971).
Smith,K.O.,etal.,AntimicrobAgtsChemother22∶55(1982).
Smith,R.A.,etal.,"RibavirinAbroadspectrumantiviralagent∶In∶Stapleton,T.,Editor,StudiesWithaBroadSpectrumAntiviralAgent.InternationalCongressandSymposiumService(London),RoyalSocietyofMedicine,3-23(1986).
Spear,P.G.[Roizman,B.,Editor],TheHerpesSimplexViruses,Vol.3,PlenumPress,NewYork,pp.315-356(1989).
Stannard,L.M.,etal.,J.Gen.Virol.,68∶715-725(1987).
Stella,V.J.,etal.,"TrendsinProdrugResearch",Vol5(11)∶276(1984).
Svensson,L.A.,etal.,DrugMetabRev,19∶165(1988).
Svensson,L.A.,etal.,DrugNewsandPerspecti,4(9)∶544(1991).
Ungaro,R.(1989)Tetrahedron45,2177-2182.
Ungaro,R.(1990)Tet.Lett.31,4653-4656.
Weinelt,F.,andSchneider,H-J.(1991)J.Org.Chem.56,5527-5535.
Yilmaz,M.,andVural,U.S.(1991)Synth.React.Inorg.Met.Org.Chem.21,1231-1241.
人們面臨的挑戰(zhàn)是，需研制出病毒疾病有效的治療和預(yù)防藥物，以便抑制病毒過程而不產(chǎn)生嚴重的副作用，并且最好不產(chǎn)生病毒的抗性。由于病毒的復(fù)制需要應(yīng)用宿主細胞的成分，因此通過抑制病毒的復(fù)制而治療病毒感染也可以使受感染的宿主細胞致死。理想的是在病毒侵襲宿主細胞之前應(yīng)該使病毒在宿主中被破壞或失去活性。這可以由宿主的免疫系統(tǒng)以不同程度的成績來完成，但是該機制要求更早期的免疫反應(yīng)，早期免疫反應(yīng)可通過先前感染或接種疫苗而建立。此外，許多病毒[例如皰疹單純病毒(HSV)]可以有效地避免宿主的免疫系統(tǒng)，并且至少一種病毒-人免疫缺陷病毒(HIV)已知能損壞宿主的免疫系統(tǒng)(Gottlieb)。
核苷類似物是目前最廣泛應(yīng)用的抗病毒藥物，這一類型藥物的作用是破壞病毒的復(fù)制，這可經(jīng)由兩種途徑來完成1)抑制核酸過程中所需要的酶，2)或是產(chǎn)生有缺陷的病毒基因組，例如通過導(dǎo)致復(fù)制的未成熟終止。例如無環(huán)鳥苷為嘌呤類似物，可用于治療多種病毒疾病，包括皰疹單純病毒-1(HSV-1)及皰疹單純病毒-2(HSV-2)，無環(huán)鳥苷可以在幾個重要的方面抑制病毒的復(fù)制，包括抑制病毒的胸苷激酶和DNA聚合酶，以及DNA單鏈延伸(Elion)。三唑核苷為另一個嘌呤類似物，是一種專門用于治療呼吸道合胞病毒(RSV)感染的藥物。該化合物能夠降低細胞的GTP水平，能阻止數(shù)種依賴GTP的病毒過程(Smith)。疊氮胸苷(Azidothymidine;AZT)為目前最廣泛用于治療HIV感染的藥物，疊氮胸苷為一種胸苷類似物，它用于抗人逆轉(zhuǎn)錄病毒特別有效。用AZT阻斷病毒的依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)具有極高的親合力，但是它同時也會阻斷人DNA聚合酶，從而引起DNA鏈的終止(Mitsuya)。
其他的核酸類似物包括ganciclovir，阿糖腺苷，碘苷，三氟胸苷和膦甲酸鹽(foscarnet)(一種無機磷酸鹽類似物)。如前文所述，所有這些藥物均可阻斷病毒復(fù)制，而同時也具有破壞政黨宿主復(fù)制和/或DNA復(fù)制過程的能力(參見，例如Martin)。
基于對病毒感染和復(fù)制機理的了解，推導(dǎo)出另一類可選擇的藥物治療法，這包括試圖阻斷病毒進入宿主細胞，或改變宿主核糖體中蛋白質(zhì)合成、病毒DNA/RNA的復(fù)合以及免疫調(diào)節(jié)。干擾素是一種糖蛋白，它們具有多種作用(包括增強某種特定的免疫反應(yīng)以及直接抗病毒的作用)。這一類型藥物用于預(yù)防感染時要比用于治療已經(jīng)確定的感染更有效，同時這些藥物通常會引起一些不良的反應(yīng)，包括急性的嚴重不適、骨髓抑制、病毒抗性、以及造成宿主免疫系統(tǒng)對干擾素產(chǎn)生反應(yīng)。
用核酸的“反義(anti-sense)”聚合體進行治療是一種方法，在該方法中特定的病毒基因組是選擇的目標。此種治療法提供了具有高度辨別力的手段，因此預(yù)計有較低的副作用;但是將它用于治療將會面臨以下困難，例如，如何篩選靶標，如何將它引入細胞中，以及如何準確判斷抑制各單鏈產(chǎn)生所需的藥量。能附著于并且能干擾宿主核糖核蛋白質(zhì)合成的藥物將可以阻斷病毒的復(fù)制。這些藥物包括毒素蓖麻蛋白、不同的植物蛋白質(zhì)(例如美洲商陸抗病毒蛋白質(zhì)、α-帚曲菌素，以及其它低分子量的化合物)。應(yīng)用這些藥物的缺點是，它們?nèi)狈x擇性。在治療HIV感染中，已經(jīng)研制出又一種療法，專門用來針對獨特的逆轉(zhuǎn)錄病毒酶-逆轉(zhuǎn)錄酶。非逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)并不會產(chǎn)生或應(yīng)用該種酶，但若無此種酶的存在，HIV病毒便無法復(fù)制。在某些實例中，如果能夠?qū)Σ《緩?fù)制機理的結(jié)構(gòu)方面進一步深入了解將能提供更多的藥物治療法。某些病毒(包括正粘液病毒，副粘液病毒，皰疹病毒，囊膜病毒，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒)，在結(jié)構(gòu)上含有一個包圍病毒外殼及核酸的病毒包膜。當宿主細胞遭受包膜病毒感染時，宿主細胞的質(zhì)膜會變化，以便包含含部分帶有病毒密碼的蛋白質(zhì)，當在宿主細胞內(nèi)裝配的病毒的核蛋白核心離開宿主細胞時，它由已修飾過的質(zhì)膜包膜，因而形成病毒包膜。當宿主受病毒感染時，因為上述結(jié)構(gòu)對宿主細胞而言是非常獨特的，因此可與正常細胞區(qū)分開來，它可用來作為治療上的另一靶標。
本發(fā)明包括治療由包膜病毒感染的方法。該方法包括將治療有效劑量的衍生的克力克斯(n)芳烴[calix(n)arene]類化合物用于感染的部位，在該化合物環(huán)位置上連接至環(huán)的橋鍵的間位是具有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團的極性取代基。
在一通用實施方案中，克力克斯(n)芳烴具有以下通式 其中n=4～10，R1為OH、O=、烷基或芳基醚、酯、酸、或其混合體，R2為帶有末端羧酸衍生物(carboxylate)、膦酸衍生物(phosphonate)、亞磺酸衍生物(sulfinate)或磺酸衍生物(sulfonate)基團的極性取代基，包括其可解離的酯類和酰胺類，R4為＞CHR″、≥CR″或其混合體，這里R″為氫或羧酸衍生物基團。
R1最好為OH，或者在該化合物的部分氧化形式中R1為OH和=O的結(jié)合體。
在一具體的實施方案中，本發(fā)明化合物具有上式結(jié)構(gòu)，其中n=4、6或8，R1為OH或=O，或為其混合體，R2定義同上，
R4為＞CH2或≥CH，或為其混合體。
在更具體的實施方案中，R2為(CH2)mR2′，這里m=1～3，R2′為磺酸衍生物基團SO3R或SO2NRR′，這里R和R′各自為氫或低級烷基。
在另一實施方案中，R2為(CH2)mR2′，這里m=1～3，R2′亞磺酸衍生物基團SO2R或S(=O)NRR′，這里R和R′各自為氫或低級烷基。
在又一實施方案中，R2為(CH2)m-R2′，這里m=0～3，R2′為羧酸衍生物基團CO2R或C(O)NRR′，這里R和R′各自為氫或低級烷基。
在另一實施方案中，R2為(CH2)m-R2′，這里m=0～3，R2′為膦酸衍生物基團PO(OR)2、PO(OH)(OR)、PO(OR)(NRR′)或PO(NRR′)2，這里R和R′各自為氫或低級烷基。
另一方面，本發(fā)明涉及以上所述類型的新的克力克斯(n)芳烴類化合物，并且它們具有亞磺酸衍生物、磺酸衍生物、膦酸衍生物和羧酸衍生物的末端基團。
在一實施方案中，所述新的化合物包括具有以上通過結(jié)構(gòu)的氧化或部分氧化的克力克斯(n)芳烴類，其中R1為OH、=O、烷基或芳基醚、酯、酸或其混合體，在克力克斯(n)芳烴化合物中至少1個R1基團為=O;R2為具有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團的極性取代基;并且R4為＞CH2或≥CH或其混合體。在優(yōu)選的實施方案中，R1為OH或=O，并且在克力克斯(n)芳烴化合物中至少1個R1基團為=O。
在另一實施方案中，新的化合物包括具有以上通式結(jié)構(gòu)的克力克斯(n)芳烴類，其中n=4～10，R1為OH、=O、烷基或芳基醚、酯、酸或其混合體，R2為具有末端羧酸衍生物或亞磺酸衍生物基團的極性取代基，并且R4為＞CH2或≥CH或其混合體。
本發(fā)明化合物可以口服給藥治療人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸合胞病毒(RSV)或皰疹單純病毒(HSV-1或HSV-2)。
本發(fā)明化合物可以經(jīng)吸入給藥治療呼吸合胞病毒，以及局部給藥治療HSV-1或HSV-2。其它的給藥方式有如靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用克力克斯(n)芳烴類化合物和抗病毒核苷類似物配方治療病毒感染。可以將所述克力克斯(n)芳烴與核苷類似物配制成軟膏劑供局部給藥治療，例如治療由于HSV-1或HSV-2所引起的損傷。另外，本發(fā)明化合物可以配制成液體劑或片劑供口服給藥治療全身病毒感染，或配制成溶液制劑供全身給藥。
另一方面，本發(fā)明還包括抑制由性交傳播的包膜病毒感染的方法。在該方法中，將預(yù)防上有效劑量的大環(huán)化合物局部地用于可能的性接觸部位。所述大環(huán)化合物由以連接環(huán)的橋鍵相連的芳環(huán)亞單元組成，結(jié)果形成相連原子的連續(xù)鏈構(gòu)成的大環(huán)骨架，并且在芳基亞單元的非骨架原子上含有負電荷取代基。該負電荷取代基優(yōu)選包括磺酸衍生物基團、亞磺酸衍生物基團、羧酸衍生物基團或膦酸衍生物基團。在一實施方案中，所述化合物包括酰胺或酯形式的負電荷取代基，它們可以在體內(nèi)解離成負電荷形式。
大環(huán)化合物的環(huán)亞單元優(yōu)選包括在3和6位有亞磺酸衍生物基團或磺酸衍生物基團的萘亞單元，和/或在4位有負電荷取代基的苯基亞單元，其中在萘或苯基2位環(huán)碳原子位置和相鄰萘基的7位環(huán)碳位置或相鄰苯基的5位環(huán)碳位置之間有橋鍵。
在一通用的實施方案中，所述大環(huán)化合物含有至少四個萘亞單元，各個萘亞單元在1位和8位有極性基團，在3位和6位有亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團，并且在一個亞單元的2環(huán)碳位置和相鄰亞單元的7環(huán)碳位置之間有橋鍵。該類型的一個優(yōu)選的化合物其通用結(jié)構(gòu)式如下 其中n=4、6或8，R1為OH、=O、烷基或芳基醚、酯、酸、或其混合體，R2為磺酸衍生物基團或亞磺酸衍生物基團，R4為＞CHR″、≥CR″或其混合體，這里R″為氫或羧酸衍生物基團。
在一較具體的實施方案中，R1為OH、=O或其混合體，R2為磺酸衍生物基團，R4為＞CH2或≥CH或其混合體。
在另一通用的實施方案中，所述大環(huán)化合物含有至少四個苯基亞單元，苯基亞單元在4位有負電荷取代基，并且在一個苯基亞單元的2位環(huán)碳位置和相鄰的苯基亞單元的5位環(huán)碳位置之間有橋鍵。該類型一個優(yōu)選化合物的通用結(jié)構(gòu)式如下
其中n、R1、R2和R4同上。
在一更具體的實施方案中，R2為(CH2)mR2′，這里m=0～3，R2′為磺酸衍生物基團。
在又一更具體的實施方案中，R2為(CH2)mR2′，這里m=0～3，R2′為亞磺酸衍生物基團。
在另一更具體的實施方案中，R2為(CH2)mR2′，這里m=0～3，R2′為羧酸衍生物基團。
在又一更具體的實施方案中，R2為(CH2)mR2′，這里m=0～3，R2′為膦酸衍生物基團。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用組合物的方法，該組合物含有如上所述的大環(huán)化合物與抗病毒的核苷類似物。
本發(fā)明組合物可經(jīng)局部給藥抑制性伙伴之間病毒感染的傳播。所述組合物可以為例如凝膠潤滑劑、栓劑，并且該組合物含有運載大環(huán)化合物的載體，此外，還可以將該化合物用于物理障礙類型器具的表面作抗感染的預(yù)防手段。
另一方面，本發(fā)明還包括用于抑制經(jīng)性傳播的包膜病毒感染的凝膠潤滑劑組合物。該凝膠組合物包括凝膠潤滑劑載體和溶于該載體中的如上所述的大環(huán)化合物。
又一方面，本發(fā)明包括與上述大環(huán)化合物組合使用的物理障礙類型器具，用于抑制由性傳播所引起的包膜病毒感染。在一實施方案中，上述器具有含有以上所述大環(huán)化合物的凝膠潤滑劑。
本發(fā)明化合物能夠有效地預(yù)防由性傳播的包膜病毒，包括肝炎δ病毒(HDV)、肝炎B病毒(HBV)、肝炎C病毒(HCV)，乳頭瘤病毒，皰疹單純病毒(HSV-1及HSV-2)，HIV-1及HIV-2，HTLV-Ⅰ及HTLV-Ⅱ。
研究以下有關(guān)本發(fā)明的詳細敘述及附圖，本發(fā)明上述和其他的目的以及特征將會變得更明顯。


圖1表示本發(fā)明的以萘為亞單元的大環(huán)化合物的一般結(jié)構(gòu)式。
圖2A及2B表示了圖1所列化合物的非氧化(2A)及部分氧化(2B)的形式，其中n=4，亞單元為鉻變酸。
圖3A及3B表示合成圖2A所示的一個大環(huán)化合物的兩個通法。
圖4A及4B表示帶有混合的苯基和磺化的萘亞單元的非氧化(4A)及部分氧化(4B)的大環(huán)化合物。
圖5表示將大環(huán)鉻變酸上的磺酸取代基轉(zhuǎn)化成甘氨?；酋０泛突酋０坊鶊F的反應(yīng)。
圖6表示將含有鉻變酸亞單元的大環(huán)化合物中的磺酸基團轉(zhuǎn)化成亞硫酸鹽或亞磺酸甲酯或芳基酯的反應(yīng)式。
圖7表示用于本發(fā)明的由苯基所組成的大環(huán)化合物的一般結(jié)構(gòu)式。
圖8表示圖7結(jié)構(gòu)式的非氧化形式，其中n=4，亞單元為對磺酸苯酚。
圖9A及9B表示合成圖8化合物的非氧化及部分氧化形式的通法。
圖10表示用乙?；〈鷪D8化合物上的環(huán)羥基的反應(yīng)式。
圖11表示在苯基為亞單元的大環(huán)化合物上將磺酸取代基轉(zhuǎn)化成甘氨?；酋０坊姆磻?yīng)。
圖12表示制備如圖8所列類似的大環(huán)化合物的反應(yīng)式，但該化合物帶有含羧酸的橋鍵。
圖13表示用羧酸基團取代圖8化合物中羥基的反應(yīng)式。
圖14表示由對-叔丁基前體制備克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖15表示制備具有對-羧基取代基的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖16表示制備經(jīng)亞甲基鍵連接羧基取代基到對位的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖17表示制備如圖16所示的類似的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式，但其中羧基取代基是經(jīng)亞乙基鍵連接到對位上。
圖18表示制備具有對-膦酸(酯)取代基的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖19表示制備經(jīng)亞甲基連接膦酸(酯)取代基到對位(C-4)的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖20表示制備對-2-溴乙基-O-甲苯磺?；?克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式，對-2-溴乙基-O-甲苯磺?；?克力克斯(n)芳烴可作為制備其他克力克斯(n)芳烴衍生物的前體。
圖21表示應(yīng)用圖20所示制備溴乙基-克力克斯(n)芳烴制備具有經(jīng)亞乙基連接膦酸(酯)基到C-4位置的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖22表示制備經(jīng)亞甲基連接磺酸基到C-4位置的克力克斯(n)芳烴衍生物的反應(yīng)式。
圖23表示制備經(jīng)亞乙基連接磺酸(鹽)基到C-4位置的克力克斯(n)芳烴衍生物的反應(yīng)式。
圖24表示為了在亞甲基橋鍵上引入其他取代基而制備在亞甲基橋鍵(圖7中R4)上帶有氯原子的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖25表示制備圖12所示的類似的克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式，起始物質(zhì)為圖24的環(huán)化的前體。
圖26表示制備有羧甲基連接到橋鍵亞甲基上的克力克斯(n)芳烴(結(jié)構(gòu)式LⅧ)的反應(yīng)式，以及應(yīng)用有機銅酸鹽試劑制備在亞甲基橋鍵上具有經(jīng)選擇的R基團的各種克力克斯(n)芳烴(結(jié)構(gòu)式VX)的通法。
圖27表示制備在克力克斯(n)芳烴類的不同環(huán)位置上連接有3-磺?；趸母鞣N克力克斯(n)芳烴的反應(yīng)式。
圖28表示制備由苯基及萘基環(huán)相互交替的大環(huán)化合物的反應(yīng)式。
圖29A及29B為以環(huán)化合物KY-1(29A)和KY-42(29B)藥物劑量為函數(shù)的HSV病毒得量曲線圖。
圖30表示化合物KY-1對3H標記的HSV-1與細胞結(jié)合的抑制作用。
圖31表示HSV-1病毒蝕斑形成的抑制曲線圖，(1)當病毒與化合物KY-1接觸之前(空心方塊)，(2)病毒與化合物接觸之后(實心方塊)，(3)病毒與化合物接觸期間(實心園圈)，用Vero細胞進行培育。
圖32A表示HSV-1蛋白質(zhì)的SDS-PAGE自動射線照相情形A帶為有巰基乙醇存在的情況;B帶為無巰基乙醇存在的情況;以及HSV-2蛋白質(zhì)的SDS-PAGE自動射線照相情形C帶為有巰基乙醇存在的情況;D帶為無巰基乙醇存在的情況;均帶有放射性同位素標記的KY-1，E帶為染色標記的蛋白質(zhì)的情形。
圖32B表示放射性同位素標記的KY-1化合物的SDS-PAGE自動射線照相情形;A帶和B帶為該化合物與糖蛋白gD結(jié)合的情況;C帶和D帶為該化合物與糖蛋白gB結(jié)合的情況;E帶和F帶為該化合物與糖蛋白gC結(jié)合的情況。
圖33(A-D)表示在兔上用目鏡施加HSV-1之后，局部應(yīng)用化合物Y-1的效果曲線圖圖33A表示對表皮損傷的效果;圖33B表示對結(jié)膜炎的效果;圖33C表示對虹膜炎的效果;圖33D表示對基質(zhì)疾病的效果。
圖34A和34B分別表示HSV-1(34A)和HSV-2(34B)病毒得量的下降情況實心園圈表示感染的細胞與增加濃度的化合物Y-1單獨接觸時的情況;空心園圈表示感染的細胞與增加濃度的無環(huán)鳥苷單獨接觸時的情況;實心方塊表示感染的細胞與增加的濃度(無環(huán)鳥苷+25μg/ml化合物Y-1)接觸時的情況;實心隋園表示感染的細胞與增加的濃度(無環(huán)鳥苷+50μg/ml化合物Y-1)接觸時的情況。
1.定義除非另有說明，本發(fā)明中所定義的術(shù)語具有以下意義。
“包膜病毒”意指包圍病毒外殼的含有蛋白質(zhì)病毒包膜的病毒。所述包膜病毒包括正粘液病毒和副粘液病毒、皰疹病毒、囊膜病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒。當細胞遭受包膜病毒感染時，宿主細胞的質(zhì)膜會改變而含有部份帶有病毒密碼的蛋白質(zhì)，當在宿主細胞內(nèi)裝配的病毒的核蛋白核心離開宿主細胞時，病毒蛋白質(zhì)會被修飾后的質(zhì)膜包膜，因而形成病毒包膜。
“性傳播的包膜病毒”是已知或是疑為性接觸傳播的包膜病毒。具體地例子包括δ、B、C型肝炎病毒(HDV、HBV、HCV)，乳頭瘤病毒、皰疹單純病毒1及2(HSV-1和HSV-2)，HIV-1(也稱為HTLV-Ⅲ)，HIV-2，HTLV-Ⅰ及HTLV-Ⅱ。
“芳基環(huán)”亞單元是含有至少一個芳香環(huán)(即必須有6π(Pi)電子以便是芳香性的五元或六元環(huán))的單環(huán)或稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)。例子包括苯、萘、以及稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)，例如四氫萘，以及雜環(huán)結(jié)構(gòu)，包括稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)，例如喹啉、異喹啉和吲哚。
“由芳環(huán)亞單元組成的大環(huán)化合物”是通過連接芳環(huán)亞單元上的環(huán)原子成環(huán)鏈而形成的環(huán)狀化合物。
“克力克斯(n)芳烴”或“克力克斯芳烴化合物”是指有以下骨架結(jié)構(gòu)的大環(huán)化合物 其中n最好為4-10，在優(yōu)選的實施方案中，n為4、6或8。
部分氧化的克力克斯(n)芳烴是指具有上式結(jié)構(gòu)的化合物，其中R1基團中至少一個為=O。在完全氧化的克力克斯(n)芳烴中，所有的R1基團均為=O。部分氧化的克力克斯(n)芳烴的結(jié)構(gòu)實例見圖9B。此外，由于各個R1均為=O，應(yīng)認為連在同一芳環(huán)上的R4基團為≥CR形式，即該R4基團是雙鍵連接在該芳環(huán)上，見圖9B。
在克力克斯芳烴化合物中“橋鍵連接在環(huán)上的位置”是指在所述化合物的各個環(huán)上的環(huán)位置的2及6位。
在克力克斯芳烴化合物中“非橋鍵位置”是指在所述化合物的各個環(huán)上的環(huán)位置的1、3、4及5位。
在克力克斯芳烴化合物中“橋鍵的間位環(huán)位置”是指在所述化合物的各個環(huán)上的環(huán)位置的4位。
“極性取代基”是指辛醇/水分配系數(shù)小于1的基團R。
“有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、磺酸衍生物或亞磺酸衍生物的極性取代基”是指有下式的R-CO2-或R′-CO2-(羧酸衍生物)、-PO3-或R′-PO3-(膦酸衍生物)、-SO3-或R′-SO3-(磺酸衍生物)、-SO2-或R′-SO2-(亞磺酸衍生物)，這里R′是可以有效地連接相關(guān)的羧酸衍生物、膦酸衍生物或磺酸衍生物基團到克力克斯芳烴的苯環(huán)上的有1～4個原子的直鏈，一個較好的R′直鏈是(CH2)m′，這里m=1～3。
“羧酸衍生物”基團包括羧酸基團-CO2-、羧酸鹽和羧酸的酯和羧酰胺，其可在體內(nèi)解離。羧酸的酯具有通式-CO2-R，這里R為未被取代的低級烷基或取代的烷基，而羧酰胺具有通式CONRR′，這里NRR′為仲胺或叔胺，即R和R′各自為氫或低級烷基或未被取代的低級烷基。在體內(nèi)如果羧酸酯或羧酰胺分別經(jīng)血清酯酶或酰胺酶水解，那么羧酸酯或羧酰胺可以解離為相應(yīng)的羧酸基團。
“膦酸衍生物”基團包括膦酸基團-PO3-2，包括膦酸鹽，以及可以在體內(nèi)解離的膦酸酯和膦酰胺。膦酸酯具有通式-PO3RR′，這里R和R′為低級烷基或取代的低級烷基，膦酰胺具有通式PO(OR)、(NRR′)、PO(NRR′)2，這里R和R′各自為氫或低級烷基。在體內(nèi)如果膦酸酯或膦酰胺分別經(jīng)血清磷酸酶或磷酰胺酶水解，那么膦酸酯或膦酰胺可以解離為相應(yīng)的膦酸基團。
“磺酸衍生物”基團包括磺酸基團-SO3-，包括磺酸鹽，以及可以在體內(nèi)解離的磺酸酯和磺酰胺，磺酸酯具有通式-SO3R，這里R為未被取代的低級烷基或取代的低級烷基，磺酰胺具有通式SO2NRR′，這里R和R′各自為氫或低級烷基。在體內(nèi)如果磺酸酯或磺酰胺分別經(jīng)血清酯酶或磺酰胺酶水解，那么，磺酸酯或磺酰胺可以解離為相應(yīng)的磺酸基團。
“亞磺酸衍生物”基團包括亞磺酸基團-SO3-，包括亞磺酸鹽，以及可在體內(nèi)解離的亞磺酸酯或亞磺酰胺。亞磺酸酯具有通式-SO2R，這里R為未被取代的低級烷基或取代的低級烷基，亞磺酰胺具有通式SONRR′，這里R和R′各自為氫或低級烷基。在體內(nèi)如果亞磺酸酯或亞磺酰胺分別經(jīng)血清酯酶或磺酰胺酶水解，那么亞磺酸酯或亞磺酰胺可以解離為相應(yīng)的亞磺酸基團。
術(shù)語“磺酸衍生物”、“亞磺酸衍生物”、“膦酸衍生物”和“羧酸衍生物”包括相應(yīng)的酸形式及其任何藥學(xué)上適用的鹽。
“負電荷取代基”是指在生理狀況下帶負電荷的取代基?？商峁┴撾姾傻幕鶊F實例包括磺酸衍生物基團(SO3-)，亞磺酸衍生物基團(SO2-)，膦酸衍生物基團(-PO32)，羧酸衍生物基團(-CO2-)。較好的負電荷取代基具有下式-X-SO3-，-X-SO2-、-X-PO3-或-X-CO2-，這里X為可有效地連接相關(guān)羧酸衍生物基團、膦酸衍生物基團、亞磺酸衍生物基團及磺酸衍生物基團到克力克斯芳烴的苯環(huán)上的有1～4個原子的直鏈。一個較好的鏈為(CH2)m，這里m＝0-3。
“低級烷基”是指含有1-5個碳原子的直鏈或支鏈的烷基。
“取代的低級烷基”是指在其碳原子上有一個或一個以上取代基的低級烷基。
Ⅱ.制備芳基亞單元大環(huán)化合物該部分敘述用于本發(fā)明方法中的兩種基本類型的芳基大環(huán)化合物的合成。第一種類型化合物(萘基為亞單元)的合成方法見下面的A部分，第二種類型化合物(苯基為亞單元)的合成方法見B及C部分。從這三部分合成途徑，人們將明白由混合亞單元(例如萘基和苯基亞單元)如何制備大環(huán)化合物。所述合成方法也可廣泛的應(yīng)用于由雜環(huán)亞單元(特別是帶有磺酸衍生物基團或亞磺酸衍生物基團取代基的雜環(huán)亞單元)合成大環(huán)化合物。
A.取代的萘亞單元的大環(huán)化合物圖1表明了由取代的萘亞單元組成的用于本發(fā)明大環(huán)化合物的一般結(jié)構(gòu)式。圖2A及2B分別表示了該類型化合物的實例，(Ⅰ)為非氧化的形式，(Ⅱ)為部分氧化的形式。此化合物為鉻變酸(1，8-二羥基-3，6-二磺酸萘)亞單元的四聚體，它是由亞甲基或次甲基(＞CH2或≥CH)橋鍵(R4)連接的。如圖所示，亞甲基/次甲基橋鍵和內(nèi)部的環(huán)原子(在環(huán)位置1、2、7及8)構(gòu)成了一個連續(xù)的鏈，在1和8的位置連有R1=OH或=O極性基團。在環(huán)的3-6位上的非鏈原子(位于環(huán)上3-6位每個取代基)連有R2=磺酸衍生物基團或亞磺酸衍生物基團取代基。由H1及C13NMR的研究及質(zhì)譜分析，推論出了部分氧化結(jié)構(gòu)的特征。
在以下A-C部分的討論和合成路線的敘述中，通常只提供化合物的非氧化亞單元形式。應(yīng)該認識到，在加熱與酸性情況下，暴露于空氣中之后，所述化合物可能會部分或完全地氧化，即如圖2B所示，所述化合物含有一個或多個R1酮基(=O)，并且在環(huán)與相關(guān)的橋鍵(R4)之間有雙鍵。還應(yīng)該認識到，同樣的反應(yīng)機制通常也適用于化合物的部分氧化形式，例如圖2B所示的結(jié)構(gòu)，或是含有另外的R1=O基團的類似結(jié)構(gòu)，例外的是R1修飾反應(yīng)通常為選擇性的修飾R1-OH基團，保留相應(yīng)的R1=O基團不變。
下面將看出，化合物最好含有其中R1為極性取代基的鉻變酸衍生物，極性取代基有例如OH，=O，CO2H，或是醚，硫醚，酯，硫酯連接的烷基或芳基，或是由以上基團的組合，例如其中在部分氧化結(jié)構(gòu)中的OH基團由一個上述基團取代。
如以上所述，R2為磺酸衍生物基團或亞磺酸衍生物基團。
R3為氫原子，不具有電荷或帶負電荷的取代基，將受下文所述的活性限制。R3最好為氫。
下面還將看出，連接鉻變酸衍生物亞單元的R4橋鍵最好為＞CHR或≥CR形式(表示在部分氧化的形式中不飽和的橋鍵)，這里R為氫或含碳的小基團，例如低級烷基、鏈烯基、酮、羧酸基團、或芳基，所述橋鍵也可為-CH2NR′CH2-形式，這里R′同樣地為H或含碳的小基團，例如低級烷基。
另外，在大環(huán)化合物中橋鍵也可為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括芳基環(huán)結(jié)構(gòu)，如圖4所示二聚的大環(huán)，或是通過雜環(huán)(如吡喃或呋喃環(huán))成橋而形成的類似結(jié)構(gòu)。
亞單元的數(shù)目可為4(如圖2A結(jié)構(gòu))至8，較好的大環(huán)含有4、6或8個亞單元，在以下所述的反應(yīng)式中，所形成的大環(huán)化合物可以包括由不同數(shù)目(n)的亞單元所組成的混合體，例如一個常見的結(jié)構(gòu)，n=4(4個亞單元)的結(jié)構(gòu)以及還有含有6或8個亞單元的結(jié)構(gòu)。
下面表1列出了由R1、R2、R3及R4取代基取代的具有代表性的大環(huán)化合物，它們已被合成并測試了其抗病毒活性。表中左欄的KY及Y數(shù)目是指相應(yīng)化合物的類似物名稱。例如，其中R1為OH、R2為SO2NH2、R3為H、R4為-CH2-的化合物稱為KY-3。雖然在表中并未列出，但這些化合物均可以部分氧化的狀態(tài)存在，其中一個或多個R1基團為=O，并且相鄰的橋鍵含有雙鍵碳連接到環(huán)上。
表1KY R1R2R3R4KY-1 OH SO3Na H >CH2KY-3 OH SO2NH2H >CH2KY-42 OH SO3Na H >CHCO2HKY-48 OH SO3Na H >CHCHOHCH2OHKY-85 OH SO3Na OH >CHC6H6KY-97 OH SO3Na H >CH2CH=CH2KY-110 OH SO3Na H >CHO(O)CH3KY-121 OH SO2C6H3(OH)2H >CH2KY-123 OH SO2Na H >CH2KY-143 OH SO3Na OH >CH2KY-147 OH SO2NHCH3H >CH2KY-148 OH SO2NHEt H >CH2KY-151 OCH3SO3Na H >CH2KY-158 OH SO2CH3H >CH2KY-171 OH SH H >CH2KY-175 OH SO3CH3H >CH2KY-176 OH SO2NHC6H6H >CH2KY-193 OH SO3Na Br >CHBrCH2BrKY-194 OH SO3Na Br >CH2KY-270 OCOCH3SO3Na H >CH2KY-272 OCOCH3SO3Na H >CHCO2HKY-276 OCOEt SO3Na H >CH2KY-277 COEtCl SO3Na H >CH2KY-280 OCH3SO3Na H >CH2KY-281 OCOC3H7SO3Na H >CH2KY-284 OCH3SO3Na H >CHCO2HKY-285 OCOCH3SO3Na H >CH2KY-288 OCOPr SO3Na H >CH2KY-289 OCOC4H9SO3NH4H >CH2KY-290 OCOBu SO3Na H >H2KY-291 OCOC5H11SO3NH4H >CH2KY-293 OCOCH=CHCH3SO3NH4H >CH2KY-294 OCO(CH2)6CO2H SO3NH4H >CH2KY-307 O(CH2)5CO2H SO3NH4H >CH2KY-346 OH SO3Na H -CH2N(CH3)CH2KY-352 OH SO3NHC6H11O5H >CH2KY-357 OH SO2NHCH2CO2Na H >CH2KY-359 OH SO2NHOH H >CH2KY-395 OCH3SO3Na H -CH2N(CH3)CH2-KY-397 OCH3SO2NH2H >CH2KY-398 OCH3SO2NHCH2CO2H H >CH2KY-399 OCH3SO2NHCH2CO2H H -CH2N(CH3)CH2-Y-20 OH SO3Na H -CH2C4H2OCH2-Y-34 OH SO3Na H -CH2C6H4CH2Y-66 OH SO3Na H >CHCO2HKYY-19 OH SO2NHCH(CH2)2(CO2H)2H >CH2
圖3A及3B說明了制備大環(huán)鉻變酸化合物的兩個較好的合成方法。圖3A所述方法涉及鉻變酸衍生物(包括鉻變酸本身)與醛(RCHO)的環(huán)化形成大環(huán)化合物，如圖2所示的四聚體，其中鉻變酸亞單元是通過R取代的亞甲基基團連接，即R4為＞CHR(包括≥CR)。所示合成路線提供了制備具有各種不同亞甲基橋鍵R基團的大環(huán)化合物的簡便的方法，該方法是在式RCHO醛存在下進行環(huán)化反應(yīng)。
例如，為了制備帶有-CH2-橋鍵的大環(huán)化合物，如KY-1化合物(Ⅳ)，使鉻變酸(Ⅲ)和甲醛反應(yīng)。一般的反應(yīng)條件在實施例1A中KY-1的合成中給出。同樣，KY-42是通過二羥乙酸環(huán)化而得(實施例1C);KY-48是在甘油醛存在下制得;KY-85是在苯甲醛存在下制得;KY-97是在丙烯醛存在下制得;KY-110是在丙酮醛存在下制得。人們會明白，各種帶有小烷基、鏈烯基、酸及其它烴R基團的其它的RCHO醛也均適用。此外，R橋鍵可在環(huán)化反應(yīng)后再加以修飾。例如，KY-193可通過KY-97化合物的溴化制得。
圖3B所示的方法中，鉻變酸衍生物(Ⅲ)的環(huán)化是通過與六亞甲基四胺反應(yīng)進行的，結(jié)果生成-CH2N(CH3)CH2-(Ⅴ)的3-原子鏈橋。合成KY-346的環(huán)化反應(yīng)見實施例1J。-CH2N(CH3)CH2-橋鍵在環(huán)化反應(yīng)后可以按已知方法進行修飾，生成-CH2N(R′)CH2-的各種不同的N-取代的橋鍵，這里R′為各種含碳的小基團。在部分氧化的結(jié)構(gòu)中，一些橋鍵可以為=CHN(R′)CH2-形式。
如以上所述，圖4A所示化合物為典型的帶環(huán)狀橋鍵(在此為苯基橋鍵)的大環(huán)萘。如實施例3所述，在鹽酸存在下，使鉻變酸與1，2-苯二甲醇的乙酸液進行反應(yīng)，得到上述化合物。類似的方法可用于其它環(huán)橋鍵例如呋喃、吡喃、吡咯等連接鉻變酸亞單元。圖4A及4B表示化合物的非氧化形式(Ⅵ)及部分氧化形式(Ⅷ)。
已知可用兩個通法合成帶有經(jīng)選擇的R1、R2及R4取代基的大環(huán)化合物。其中一個方法是，將鉻變酸的衍生物在環(huán)化后再加以修飾，結(jié)果經(jīng)環(huán)化的產(chǎn)物或者含有經(jīng)選擇的R1、R2和R4取代基，或者含有可容易地改變?yōu)榻?jīng)選擇的取代基的取代基。該方法通過其中含有SO2NH2R2取代基的KY-3的合成而詳細敘述，詳見實施例1B。此時經(jīng)環(huán)化的鉻變酸(Ⅷ)首先與氯磺酸反應(yīng)，生成相應(yīng)的R2=SO2C1衍生物(Ⅸ，圖5)。然后使該大環(huán)化合物與氨水反應(yīng)，生成所需的R2=SO2NH2衍生物(Ⅹ，圖5)。
可以用類似的方法合成KY-357(R2=SO2NHCH2CO2H)，其方法是使最后的亞單元與甘氨酸于堿性pH條件下反應(yīng)(Ⅺ，圖5)。
圖6(與圖5配合)，說明將環(huán)化的鉻變酸的磺酸基團轉(zhuǎn)變?yōu)閬喕撬猁}(Ⅻ)及亞磺酸甲基酯(XIV)的方法。如以上所示，整個反應(yīng)過程的第一步涉及生成相應(yīng)的磺酸氯衍生物(Ⅸ)。然后用亞硫酸鈉處理，生成相應(yīng)的亞磺酸鹽Ⅻ。然后在碳酸氫鈉存在下與硫酸二甲酯反應(yīng)，得到相應(yīng)的亞磺酸甲基酯(XIV)。
同樣，帶有各種不同R1取代基的大環(huán)化合物可以在環(huán)化之后通過修飾鉻變酸制得。在合成KY-151時，例如可以使(R=OCH3)環(huán)化的鉻變酸按實施例1F所述在堿性條件下與硫酸二甲酯反應(yīng)生成環(huán)化的鉻變酸二甲醚。同樣，在制備KY-307(R1=O(CH2)5CO2H)時，可以在堿性反應(yīng)條件下使環(huán)化的鉻變酸與6-溴已酸反應(yīng)，首先使環(huán)化的鉻變酸轉(zhuǎn)變成己酸的二醚。
作為另一實施例，在制備化合物例如KY-272和KY-294(其中R1為OCOR形式)中，可以按實施例1J合成KY-285所述，使通過環(huán)化鉻變酸形成的大環(huán)化合物于堿性條件下與式RCOCl酰氯反應(yīng)。
在第二個通法中，通過萘亞單元的衍生反應(yīng)，使經(jīng)選擇的取代基在亞單元萘上形成，然后使亞單元環(huán)合，生成所需的大環(huán)。對于K-175(R2=SO3CH3)的合成，按以上所述使鉻變酸與磺酰氯反應(yīng)，生成相應(yīng)的R2=SO2Cl取代基。進一步與NaOCH3反應(yīng)，生成所需的R2取代基，反應(yīng)的詳細敘述參見實施例1H。
人們明白，生成經(jīng)選擇的取代基的大環(huán)化合物的合成方法包括首先的鉻變酸衍生反應(yīng)和環(huán)合后隨后的亞單元的衍生反應(yīng)。例如在制備KY-397(R1=OCH3，R2=SO2NH2)中，首先在R1位置使鉻變酸亞單元反應(yīng)，生成如以上所述的二甲醚衍生物。與甲醛進行環(huán)合之后，如以上所述使所述化合物在R2位置進一步地衍生，將SO3基團轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧腟O2NH2取代基。
以上所述KY化合物可以容易地轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N亞磺酸衍生物、磺酸衍生物，其酸和鹽。按照熟知的方法，使鹽和酸形式在一般的陽離子交換樹脂上進行交換，用一種陽離子代替另一種陽離子。因此，例如在銨鹽(如氯化銨)存在下，通過質(zhì)子陽離子交換，可以得到表1所示幾個KY化合物的銨鹽。此外，使大環(huán)化合物與各種金屬陽離子(如Ca、Ba、Pt、Cu、Bi、Ge、Zn、La、Nd、Ni、Hf或Pd的陽離子)反應(yīng)，可以得到所述大環(huán)化合物的金屬鹽和金屬螯合物，其中金屬在所述化合物的內(nèi)側(cè)極性凹處進行螯合。
如實施例1A、1B、1C和1J所述，用吸收光譜和質(zhì)譜及核磁共振譜(NMR)研究了本發(fā)明制得的幾個太環(huán)化合物的物理特征。所述化合物包括四聚大環(huán)化合物(如圖2所示)，或四聚形式占主要的混合物。
B.克力克斯(n)芳烴化合物圖7表示可用于本發(fā)明方法的此類克力克斯(n)芳烴類化合物通式。該類型的一個實例化合物參見圖8，它是由亞甲基橋鍵連接的苯酚對磺酸亞單元的四聚體(XV)。如圖所示，亞甲基橋鍵與“內(nèi)側(cè)”環(huán)原子(環(huán)位置2、1和6)形成連續(xù)的鏈，同時在環(huán)的1位有R1=OH基團。在環(huán)的4位原子上的非鏈原子(環(huán)位置3～5位上每一個取代基)有R2=磺酸取代基。
圖9A列示出生成克力克斯(n)芳烴類化合物的通法。左邊所示的前體(XVI)為叔丁基克力克斯(n)芳烴，其中n為該大環(huán)化合物中苯酚亞單元(帶有對位叔丁基取代基)的數(shù)目，橋鍵為亞甲基。有4、6和8個亞單元的叔丁基克力克斯芳烴市場上是可以買得到的，更多亞單元和奇數(shù)亞單元的克力克斯(n)芳烴可以按一般的純化方法制得。
在圖9A所示的磺化反應(yīng)中，通常將經(jīng)選擇的亞單元數(shù)目的叔丁基克力克斯芳烴與濃硫酸于75～85℃反應(yīng)4～5小時，以便實質(zhì)上完全地用磺酸基取代4-位叔丁基?；腔磻?yīng)的詳細敘述參見實施例2A。上述方法已用于制備圖8所示n=4的大環(huán)化合物，以及有6和8個苯酚亞單元的有關(guān)大環(huán)化合物。
用于制備部分氧化1位OH基團的磺化克力克斯芳烴的類似方法參見圖9B所示。此時將叔丁基克力克斯芳烴起始原料用濃硫酸于100℃以上，最好于150～170℃進行處理。該反應(yīng)可有效地磺化亞單元環(huán)和部分地氧化內(nèi)側(cè)OH基團。如圖9B所示，部分氧化反應(yīng)可產(chǎn)生共軛的克力克斯(n)芳烴結(jié)構(gòu)(XVⅢ)，其中橋鍵提供非定域的電子。上述共軛結(jié)構(gòu)是有色的，而有色產(chǎn)物的顯譜可用于監(jiān)測氧化反應(yīng)的過程。該反應(yīng)的詳細敘述參見實施例2B。
人們明白，所需的大環(huán)化合物也可以按下法直接地制備在合適的形成橋鍵的條件下，如按上述制備萘亞單元大環(huán)化合物的方法使對磺酸苯酚(或其前體)進行反應(yīng)。詳細敘述參見圖12制備含有羧酸橋鍵基團的大環(huán)化合物的反應(yīng)。在該方法中，按實施例1C所述類似的條件，使苯酚對磺酸與二羥乙酸反應(yīng)，生成XXⅡ所示的環(huán)合結(jié)構(gòu)。在實施例2F中詳細敘述了XXⅡ的合成。
按照以上部分ⅡA所示的通法，可以將以上生成的克力克斯(n)芳烴類化合物進行結(jié)構(gòu)修飾，以便得到經(jīng)選擇的R1基團、經(jīng)修飾的磺酰基、和/或加入R2基團。R1和R2取代基的范圍實質(zhì)上與上述部分ⅡA所述相同。圖10、11和13詳細敘述了改變已經(jīng)生成的大環(huán)化合物的R1或R4基團的各種反應(yīng)方法。在圖10中，將圖8所示的磺化結(jié)構(gòu)用乙酐處理，生成O-乙?；鵕1基團。該反應(yīng)的詳細敘述參見實施例2C。
實施例2G敘述了在R1位置生成甲苯磺酸酯的類似反應(yīng)方法。
圖11詳細敘述了生成磺酰胺類，如圖8化合物的甘氨?；酋０?ⅩⅪ)的通法。類似于圖5所述的反應(yīng)，使磺化的苯基克力克斯(n)芳烴化合物(ⅩⅦ)與氯磺酸反應(yīng)，生成相應(yīng)的磺酰氯類似物(XX)。與經(jīng)選擇的胺(如甘氨酸)進一步反應(yīng)，得到所需的磺酰胺。反應(yīng)的詳細敘述參見實施例2D中R2=SO2NH2化合物的合成，以及實施例2E中甘氨?；酋０坊衔锏暮铣?。
圖13表示基本取代反應(yīng)R1=OH由R1=碳基團取代的非專有的一般合成方法。在實施例2H中詳細敘述了該反應(yīng)方法由作用物(R1=OH，R2=叔丁基，R4＝CH2，n=4)得到一種中間體(R1＝CN，R2=叔丁基，R4=CH2，n=4)。然后再進一步進行改變，得到產(chǎn)物(R1=CO2H，R2=SO3H，R4=CH2，n=4)。
人們明白，在R1位置的取代基的改變可以有選擇地在部分氧化的大環(huán)化合物(如圖9B所示的結(jié)構(gòu))中的OH位置上進行。即對環(huán)OH基團是特異的反應(yīng)將會保留完整的=O基團，結(jié)果得到含有=O基團的混合R1基團。
R3通常為氫，但是可以為不帶電荷的或帶負電荷的取代基，類似于以上部分ⅡA所述的R3的基團。
連接鉻變酸衍生物亞單元的R4橋鍵最好是＞CHR或≥CR，這里R為氫或含有碳的小基團如以上所述的低級烷基、鏈烯基、酮或羧酸基團，或芳基，或者R4為-CH2NR′CH2-，這里R′同樣地為氫或含有碳的小基團如低級烷基。另外，類似于圖4所示的二聚大環(huán)化合物，在大環(huán)化合物中的橋鍵可以是環(huán)結(jié)構(gòu)，包括芳環(huán)結(jié)構(gòu)。
如以上所述，亞單元的數(shù)目可以從4(例如圖8結(jié)構(gòu))至8之間變化，含有4、6和8個亞單元的大環(huán)化合物較好。在下面所述的反應(yīng)式中，生成的大環(huán)化合物可以包括具有不同的亞單元數(shù)目(n)化合物的混合物，例如主要n=4結(jié)構(gòu)(4個亞單元)與另外的含5～8個亞單元結(jié)構(gòu)組成的混合物。
已被合成并測試了其抗病毒活性具有代表性的克力克斯(n)芳烴類化合物是下面表2中被R1、R2和R4取代的化合物。和表1一樣，表2左邊欄中的KY和Y數(shù)字是指相應(yīng)化合物的類似名稱。該表的第2欄表示在R1位置部分氧化的以及有飽和與不飽和橋鍵亞甲基碳基團的化合物。
表2合物號 R1R2R4nY-1 OH SO3-CH2- 8KY-226 O/OH SO3-CH2/=CH- 8Y-49 OH SO3-CH2- 4KY-225 O/OH SO3-CH2/=CH- 4Y-77 OH SO3-CH26Y-48 O/OH SO3-CH2/=CH- 6KY-268 O/OH SO3-CH2/=CH- 3KY-269 O/CO2CH3SO3-CH2/=CH- 4KY-271 O/CO2CH3SO3-CH2/=CH- 3Y-78 O/OH SO2NH2-CH2- 8Y-100 O/OH SO2OCH3-CH2- 8按熟知的方法，根據(jù)以上所述通過在酸中進行反應(yīng)，或在合適的鹽存在下進行反應(yīng)，可以容易地將表2所示化合物以及以上所述化合物的R基團組合物轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N磺酸或磺酸鹽。
C.帶有磺酸衍生物、亞磺酸衍生物、膦酸衍生物和羧酸衍生物基團的大環(huán)化合物根據(jù)本發(fā)明，一類可有用于抑制包膜病毒感染的化合物是克力克斯(n)芳烴類化合物，其中連接橋鍵的環(huán)位置的間位，即帶有取代基R2的4位(圖7)，由帶有末端磺酸衍生物、亞磺酸衍生物、膦酸衍生物或羧酸衍生物基團的帶負電荷的取代基取代。
制備其中在環(huán)4位帶有磺酸衍生物基團的克力克斯(n)芳烴化合物的方法參見實施例2A、2B和2C，包括在環(huán)1位帶有不同取代基的化合物。帶有磺酰胺基團的化合物，包括其末端帶有羧基的化合物分別參見實施例2D和2E。
圖14表示將叔丁基克力克斯(n)芳烴(XXⅤ)轉(zhuǎn)變?yōu)槲幢蝗〈目肆怂?n)芳烴(XXⅥ)的方法，化合物XXⅥ可用作為下面一些合成的起始物質(zhì)。該反應(yīng)的詳細敘述參見實施例2J。
圖15表示將帶有對乙?；目肆怂?n)芳烴(XXⅦ)轉(zhuǎn)變?yōu)閹в袑︳然目肆怂?n)芳烴(XXⅧ)的方法。詳細敘述參見實施例2K。
為了得到圖16所示的對羧甲基化合物(XXXⅠ)，將上面得到的化合物XXⅥ通過與二甲胺和甲醛反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的(二甲氨基)甲基化合物(XXⅨ)。然后將該化合物XXⅨ轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的氰基甲基化合物(XXX)，將此化合物XXX在酸中加熱，轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧聂燃谆衔?XXXⅠ)。詳細敘述參見實施例2L。
圖17表示羧乙基克力克斯(n)芳烴(XXXⅢ)的合成方法。將上面(圖16)得到的中間體XXⅨ依次與Mel和二乙基丙二酸酯的鈉鹽反應(yīng)，得到二乙基丙二?；谆衔?XXXⅡ)。于酸中加熱，得到所需化合物XXXⅢ。詳細敘述參見實施例2M。
圖18表示合成對膦酸(酯)克力克斯(n)芳烴(XXXⅥ)的方法。在該方法中，將上面得到的化合物XXⅥ進行碘化，然后與二乙基亞膦酸酯反應(yīng)，得到二乙基膦酸酯化合物(XXXⅤ)。在酸中回流，得到所需的化合物XXXⅥ。詳細敘述參見實施例2N。
圖19表示膦?；谆肆怂?n)芳烴(XXXⅨ)的合成方法。如圖19所示，將上面得到的化合物XXⅥ進行氯甲基化，得化合物XXXⅦ，再與三乙基亞磷酸酯反應(yīng)，得二乙基膦?；セ衔?XXXⅧ)。于酸中加熱，得到所需的膦?；谆衔镌敿殧⑹鰠⒁妼嵤├?O。須明白的是，氯甲基中間體還可用于合成磺?；谆肆怂?n)芳烴類似物。
圖20表示用于制備膦?；一蚧酋；一肆怂?n)芳烴的對-2-溴乙基化合物的合成，詳細敘述參見實施例2P。參考圖20，將上面制得的化合物XXⅥ在酚羥基上進行烯丙基化，得到化合物XL，然后進行加熱，得到重排產(chǎn)物XLI。進行甲苯磺?；员Ｗo苯基上的羥基，得到化合物XLⅡ，再使其轉(zhuǎn)變?yōu)閷αu乙基衍生物XLⅢ。進一步與三苯基膦二溴化物反應(yīng)，得到所需的對溴乙基化合物XLⅣ。
用類似于上述圖19所示反應(yīng)順序，將對溴乙基克力克斯(n)芳烴XLⅣ用于合成對膦?；一衔颴LⅥ。圖21所示反應(yīng)式的詳細敘述參見實施例2Q。
如圖22所示，以上應(yīng)用的中間體對氯甲基克力克斯(n)芳烴(化合物XXXⅦ)還可用于合成對磺?；谆肆怂?n)芳烴XLⅦ，詳細敘述參見實施例2R。
同樣，如圖23所示，上面所述的對-2-溴乙基中間體XLⅣ可用于合成對磺酰基乙基克力克斯(n)芳烴XLⅨ，詳細敘述參見實施例2S。
人們明白，當需要時，通過圖6所示方法和實施例1D例舉的方法，可以將磺酸衍生物基團轉(zhuǎn)變?yōu)閬喕撬嵫苌锘鶊F。
前面所述的合成方法可用于制備在橋鍵的間位(C4環(huán)位置)有負電荷取代基的克力克斯(n)芳烴化合物，所述負電荷取代基末端帶有磺酸衍生物、亞磺酸衍生物、膦酸衍生物和羧酸衍生物基團。所列出的合成方法表明了酸基直接連接到環(huán)上或通過烷基鍵(如甲基鍵和乙基鍵)連接。由以上討論人們會明白如何制備通過較長的烷基基團連接到環(huán)上的酸基化合物。如以上所述，還可以將酸基轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的鹽。
人們還會明白如何制備本發(fā)明大環(huán)化合物(例如克力克斯芳烴化合物)中末端酸基的各種酯和酰胺。所述衍生物可用作為“前藥”，其中酯或酰胺在體內(nèi)通過酶催化水解(如通過酯酶)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的帶負電荷的酸基。
一般來說，羧酸和磺酸的酯可以按常規(guī)的酯化反應(yīng)制得，其中例如將酸轉(zhuǎn)變成酰氯，然后與醇(如烷基醇)反應(yīng)。羧酸或磺酸的酰胺同樣可以通過酰氯與胺(如烷基胺)反應(yīng)而類似地制得。較好的酯包括芳基和低級烷基(如正丁基烷基)碳酸酯。較好的酰胺包括低級烷基的酰胺。
同樣可以按照常規(guī)的膦酸酯化或酰胺化反應(yīng)的方法，將膦酸克力克斯(n)芳烴轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酯或酰胺。參見圖21，制備二乙基膦酰酯的一個方法上面已經(jīng)敘述。
除了在克力克斯(n)芳烴環(huán)的C4位有極性取代基之外，本發(fā)明還設(shè)想使在其他環(huán)位置和在大環(huán)化合物的橋鍵位置進行取代的克力克斯(n)芳烴應(yīng)用于本發(fā)明方法。例如，C3和/或C5環(huán)位置可以用鹵素(如F或C1)進行取代。如以上所述有關(guān)的幾個萘環(huán)大環(huán)，在“內(nèi)側(cè)”環(huán)位置(在克力克斯(n)芳烴的C1環(huán)位置)進行的取代與抗病毒活性是相適應(yīng)的，同樣，如以上所述，在萘環(huán)大環(huán)的橋鍵位置進行的取代與抗病毒活性是相適應(yīng)的。
圖24和25表示連接羧基到克力克斯(n)芳烴的亞甲基橋鍵上的一個方法。在該方法中，將對叔丁基克力克斯(n)芳烴XXⅤ的羥基進行乙?；?，并在產(chǎn)物L(fēng)的亞甲基橋鍵上進行氧化，得酮橋鍵化合物L(fēng)I。用硼氫化鈉還原，接著與亞硫酰氯進行反應(yīng)，得到在亞甲基橋鍵上氯化的化合物L(fēng)Ⅲ。詳細敘述參見實施例2T和2U。
參見圖25，將化合物L(fēng)Ⅲ進行氰化，然后與酸反應(yīng)，在亞甲基橋鍵上生成羧基。將得到的化合物L(fēng)V與三氯化鋁反應(yīng)，使其脫去叔丁基，結(jié)果得到羧酸化橋鍵的克力克斯(n)芳烴LVI。另外，如以上所述，通過與硫酸反應(yīng)，使化合物L(fēng)V在C4環(huán)位置進行磺化，人們明白，類似的方法可用于生成相應(yīng)的對膦酸或?qū)︳人峥肆怂?n)芳烴類，但是橋鍵羧基和/或環(huán)羥基開始需進行保護。
按圖26所示方法，如圖26左邊所示用合適的銅酸鹽試劑，應(yīng)用上述化合物L(fēng)Ⅲ可以制得各種橋鍵取代基，圖26右邊所示的反應(yīng)表示如何將克力克斯(n)芳烴LⅢ轉(zhuǎn)變?yōu)橛恤燃谆B接到亞甲基橋鍵上的化合物。該反應(yīng)的詳細敘述參見實施例2W和2X?？梢詫⒆罱K反應(yīng)產(chǎn)物(LⅧ)進行對位磺化，或者如以上所述用其他的酸基團在對位進行派生。
圖27表示涉及克力克斯(n)芳烴類和丙烷-1，3-硯的各種派生反應(yīng)。如圖所示，該反應(yīng)可以有效地在環(huán)羥基位置上加成烷基磺酸。該方法提供了制備環(huán)連接磺酸基團的克力克斯(n)芳烴的另一途徑，舉例的反應(yīng)條件參見實施例2P和2Z。
最后，圖28表示制備含有交替苯基和萘基的混合大環(huán)化合物的方法。該大環(huán)化合物在實施例3B中詳述。
Ⅲ.抑制病毒感染該部分試驗含有大環(huán)化合物的組合物對各種包膜病毒感染的抑制作用。試驗的包膜病毒有皰疹病毒、皰疹單純病毒-1(HSV-1)和皰疹單純病毒-2(HSV-2)，它們是雙股DNA病毒(Roizman);人免疫缺陷病毒(HIV)(RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒)(Popovic;Barre-Simoussi);以及流感A和B病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)，它們均為RNA病毒(Chanock)。
為了進行比較，也試驗了經(jīng)選擇的非包膜病毒，它們包括腺病毒(雙股DNA病毒)(Rowe;Hilleman);以及鼻病毒(單股RNA病毒)(Dick)。病毒感染的抑制通常是用抑制在感染的培養(yǎng)細胞中可檢測的細胞致病作用的情況來測定的。HSV-1和HSV-2在培養(yǎng)細胞中的抑制作用也用下述的抑制病毒與可感染的細胞的結(jié)合，以及抑制已感染的細胞中的病毒蝕斑形成來表示。
此外，如實施例4所述，應(yīng)用一組人細胞系，試驗了許多具有代表性的芳基大環(huán)化合物(包括表1和表2所示化合物)在細胞培養(yǎng)中對細胞株的毒性。簡單地說，是將經(jīng)選擇的KY-或Y-化合物以最終濃度5、10、25、50或100μg/ml加到細胞培養(yǎng)物中。3天后洗滌細胞以除去藥物，并用活性染色劑染色，測定各培養(yǎng)物中死細胞的百分數(shù)。IC50藥物濃度(即是使細胞死亡50%的藥物濃度數(shù)值)，KY-143和KY-163為50μg/ml，所有其他受試的KY化合物的IC50為100μg/ml或更大。分子量為1404道爾頓的KY-1其藥物濃度為100μg/ml，相當于約66μM。
A.抑制HSV感染萘亞單元化合物用含有表1和2中一個化合物構(gòu)成的組合物試驗抑制在培養(yǎng)的HSV感染細胞中的細胞致病作用(CPE)。在實施例5報道的方法中，用HSV-1或HSV-2感染Vero細胞，并使其在培養(yǎng)基中生長，直至細胞致病作用明顯地可見。在沒有感染的情況下細胞形成均勻的單層成纖維細胞狀細胞。用HSV感染，細胞致病作用其特征在于，24小時之后混懸液中圓細胞明顯活動，接著在24～72小時之后感染的細胞凝集并溶胞。
在實施例5報道的藥物抑制作用中，使細胞與HSV-1或HSV-2病毒接觸，同時與經(jīng)選擇的芳基大環(huán)化合物接觸，化合物的最終藥物濃度為10μg/ml。24小時之后檢查細胞致病作用。如果藥物濃度為10μg/ml仍未觀察到明顯的細胞致病作用，那么一些化合物用20μg/ml的藥物濃度重復(fù)進行試驗。
下面表3列出了用于本試驗的50個萘亞基大環(huán)化合物。第2欄中的符號“+”表示該化合物在10或20μg/ml時對抑制細胞致病作用是有效的。符號“-”表示在10或20μg/ml劑量下觀察到細胞致病作用(CPE)。
表3CPEHSV-1HSV-2化合物 10,20μg/ml IC50(μg/ml) IC50(μg/ml)KY-1+2.71.7KY-3+2.42.5KY-42+13KY-48 - N1NKY-85-NNKY-97+NNKY-110-NNKY-121+1.51.8KY-123+1.51.5KY-129+11KY-143-NNKY-147-NNKY-148-NNKY-151+1.251.8KY-158-NNKY-171+2.53KY-175-NNKY-176NNNKY-193GCNNKY-194+11KY-280+22KY-272+NNKY-276+1.31.2KY-277+11.2KY-280+1.11KY-281+0.51.5KY-284+11.6KY-285+11.5KY-286+22KY-288+1.72KY-289+2.21.7KY-290+1.21.3KY-291+1.42KY-293+1.92.7KY-294+12.2KY-301+11KY-307+.82KY-308+.91.2KY-345+56.7KY-346+4.46.2
表3CPEHSV-1HSV-2化合物 10,20μg/ml IC50(μg/ml) IC50(μg/ml)KY-352+3.44.1KY-357+43.3KY-359+5.754.2KY-376+2.71KY-395-N9Y-4+5.56.4Y-14+2.53.5Y-20+53.2Y-34+2.52Y-66+NN1N表示在試驗的最大濃度未見抑制CPE，或者預(yù)測的IC50未見有效的抑制作用。
如實施例6所述，用表3中的化合物進一步以蝕斑減少試驗檢查其抗HSV的活性。在培養(yǎng)過夜后使Vero細胞與0.625～10μg/mlKY化合物序列稀釋液以及HSV-1或HSV-2病毒接觸2小時。在洗滌以便除去藥物和細胞外病毒之后，將細胞進一步培養(yǎng)2天，然后染色并計算蝕斑形成。將生成的蝕斑除以受感染而未處理的全部蝕斑測得百分抑制率。由抑制蝕斑的濃度作用曲線(用對照百分率表示可以測出產(chǎn)生50%蝕斑減少所需化合物的濃度(IC50)。在表3右邊欄中列出了由HSV-1和HSV-2感染的IC50值。
參考表1所示化合物結(jié)構(gòu)，下面的R基團可以被認為提供低的活性(在10～20μg/ml劑量下未見能保護細胞免遭細胞致病作用)KY-48、KY-49和KY-110中亞甲基橋鍵中大的側(cè)鏈;KY-143中OH的R3基團，KY-147和KY-148中R2位上帶有非極性烷基的磺酰胺;KY-158和KY-175中R2位上帶有非極性烷基的亞磺酸酯或磺酸酯;KY-395中三甲胺橋鍵與R1位上甲醚取代基的組合。KY-193的“GC”符號意指形成了一些巨大細胞，這表明有部分抑制作用。
下面查看在10～20μg/ml劑量下具有完全抑制細胞致病作用(CPE)的化合物，以下R基團被認為是較好的基團。
R1位置含有OH，包括OH與=O基團的組合;烷基和芳基酯，包括所述酯與=O的組合;烷基醚，包括所述醚與=O的組合。
在R2位置上合適的基團有磺酸或磺酸鹽，亞磺酸及其鹽，帶有極性胺基(如NH2、NHOH、N-苷類(KY-352)和氨基酸類)的磺酰胺。
R3位置上，較好的基團為氫或溴。
合適的橋鍵基團是取代和未取代的亞甲基，其中R基團不是大的烷基，較好的是羧酸基團。
進一步地選擇R基團的指導(dǎo)原則是2個HSV試驗中至少1個其ED50值≤1μg/ml的化合物應(yīng)有以下1個R基團，其特征在于化合物的R1基團為低級烷基醚或酯，或含有末端羧酸基團通常是最具有活性的，尤其是在化合物的其他R1位上有=O基團組合。
R2基團是磺酸或磺酸鹽或帶有末端羧酸的磺酰胺。該特征表明R2位的酸基團有利于增加活性。
R4橋鍵為亞甲基或帶有羧酸基團的亞甲基。
實施例7所述病毒抑制試驗中，評定在經(jīng)選擇的藥物濃度最高至10μg/ml時所選擇的萘亞單元化合物抑制HSV-1和HSV-2病毒得量的能力。簡單地說，是使培養(yǎng)的赫拉細胞株與連續(xù)稀釋的KY化合物和病毒接觸，使其生長24小時，然后冷凍/解凍3次，以便分離病毒顆粒。使Vero細胞感染，按實施例6所述檢查連續(xù)稀釋的病毒溶胞產(chǎn)物的蝕斑數(shù)目。以藥物濃度為函數(shù)，將病毒得量的下降制圖，圖29A和29B分別為化合物KY-1和KY-2的曲線圖取決于藥物和病毒，與劑量有關(guān)的病毒得量的下降在約3～5個數(shù)量級之間。抑制病毒得量的程度通常是HSV-1大于HSV-2。用幾個其他的KY化合物可觀察到類似的結(jié)果。
B.抑制HSV活性克力克斯(n)芳烴類化合物用以上表2所列的幾個克力克斯(n)芳烴類化合物進行類似的抗HSV活性的研究，結(jié)果見表4。由表4的第2欄可以看出，在10～20μg/ml濃度所有試驗的化合物能抑制CPE。在蝕斑減少試驗中受試化合物對HSV-1和HSV-2的抑制作用列在該表右邊的欄目中(IC50以μg/ml表示)。
表4CPEHSV-1HSV-2化合物 10,20μg/ml IC50IC50(μg/ml)(μg/ml)Y-1+77.2KY-226+1.63KY-49+510KY-225+1.81.8KY-77+811Y-48+1.51KY-268+4.41.5KY-269+2.42.3KY-271+4.22.4觀察到的苯亞單元化合物的最高活性與萘亞單元化合物的最高活性相差不大，例如差約1～3μg/ml IC50值。
最有活性的化合物Y-226(n=8)、Y-48(n=6)和Y-225(n=4)均有部分氧化的R1OH/=O基團，各個部分氧化的化合物與其相關(guān)的非氧化同類物相比實質(zhì)上有更高的活性。
部分氧化的n=3化合物KY-268與其n=4、6和8的同類物相比活性稍微低些。在非氧化的化合物中，n=8化合物Y-1與其相應(yīng)的n=4和n=6化合物相比活性稍微高些。
在R1位上加入乙?；?，部分氧化的化合物的活性幾乎沒有產(chǎn)生什么改變，這與萘亞單元化合物得到的結(jié)果是一致的，在R1位上加入烷基酯得到的活性與部分氧化的類似物不相上下。
作為在苯亞單元化合物中選擇最優(yōu)化合物活性的一般指導(dǎo)原則，通常應(yīng)用以上討論相同的規(guī)則。因此，當R2基團以帶負電荷基團(如磺酸)終接時，那么預(yù)計有最高的活性。更一般說來，本發(fā)明設(shè)想將以R2基團為磺酸、膦酸或羧酸基團(包括所述酸的酯或酰胺，它們在體內(nèi)通過水解可解離為相應(yīng)的酸)終接的極性取代基的克力克斯(n)芳烴類化合物用于治療包膜病毒感染。對用于抑制由性傳播的包膜病毒的感染，本發(fā)明設(shè)想應(yīng)用其R2基團為以磺酸衍生物、亞磺酸衍生物、膦酸衍生物或羧酸衍生物基團終接的帶負電荷取代基的大環(huán)化合物。
所述化合物還包括在體內(nèi)通過水解可解離為酸基團的帶負電荷的酯或酰胺。各種磺酸、膦酸和羧酸的酯和酰胺已表明在體內(nèi)經(jīng)水解解離成相應(yīng)的酸(Svensson，1988，1991;Stella;Bundgaard)，所述酯和酰胺包括低級烷基的酯和酰胺。制備該類型的各種實例化合物的方法已在上述部分Ⅱ中敘述。
如以上部分ⅡB和ⅡC所述，具有末端酸基(或可解離為末端酸基的基團)克力克斯(n)芳烴類化合物可以在其他環(huán)位置和橋位置上進行取代。一個較好的實施方案是R1取代基為OH基團，或者如果該化合物是部分氧化的，那么R1取代基為OH與=OH基團的組合。
C.抗-HSV化合物的比較將KY-1對耐藥株HSV-1和HSV-2的抑制作用與幾個用于治療HSV感染的抗病毒劑進行比較。受試驗化合物是核苷類似物無環(huán)鳥苷(ACV)、ganciclovir(DHPG)、鏻甲酸(PFA)和磷酰基甲氧基乙基腺嘌呤(PMEA)。按上述方法測定病毒得量的抑制在野生型或耐藥株HSV-1或HSV-2和經(jīng)選擇的抗病毒化合物的連接稀釋液存在下感染赫拉細胞，并如以上所述用連續(xù)稀釋的赫拉細胞溶胞產(chǎn)物感染Vero細胞。抑制作用的詳細敘述參見實施例8。
表5列出了ID90濃度(該濃度抑制90%病毒得量)。KOS(HSV-1)和333(HSV-2)是野生型病毒;KOS(PMEA)和KOS(PFA)′是具有DNA多聚酶突變的耐藥HSV-1株。333(DHPG)株是具有胸苷酶突變的耐藥HSV-2株。除了作為耐藥株HSV-1抑制劑的DHPG和作為耐藥株HSV-2抑制劑的PMEA以外，當用需要抑制病毒得量的藥物濃度進行測量時，與野生型株HSV-1或HSV-2相比，所有核苷類似物對耐藥株的活性至少約低20倍。相反，對耐藥株HSV-1和HSV-2，芳基大環(huán)化合物顯示出與抗野生型株實質(zhì)上同樣有效的活性。
表5試驗的藥物(ID90)#株/藥KY-1ACVDHPGPFAPMEA病毒物選擇突變位點(ug/ml)(uM)(uM)(uM)(uM)HSV-1KOSNone1.9142180100KOS(PMEA)'DNApol2.6380NT3000>2000KOS(PFA)'DNApol4.31001>1000>1000HSV-2333None3.2≈102150155333(DHPG)TK3.7>100215NT120表5的數(shù)據(jù)表明，在抗野生型病毒有效的類似的藥物濃度下，芳基大環(huán)化合物抗耐藥株HSV是有效的，相反，除了作為HSV-1株抑制劑的DHPG以外，2個耐藥株均對ACV、DHPG、PFA和PMEA顯示出顯著的抗性，這已由抑制病毒需要數(shù)倍高的ID90藥物濃度得到證實。
D.抑制RSV和流感A病毒感染性用表1具有代表性的大環(huán)化合物試驗經(jīng)流感A病毒(A/臺灣株)或RSV病毒感染后在培養(yǎng)的MDCK或HEp2細胞中抑制細胞致病作用。在抑制流感A病毒感染性的方法中，用該病毒感染MDCK細胞，并使該細胞在培養(yǎng)基中生長，直至明顯可見到細胞致病作用。在沒有感染的情況下，細胞形成均勻的單層成纖維細胞樣的細胞層。用病毒感染，細胞致病作用的特征在于觀察到細胞凝集。如實施例9和11所述，對于各個受試化合物，將0.1、1、10、25和100μg/ml的藥物濃度的在病毒感染時加到培養(yǎng)的細胞中。24小時后，根據(jù)在一定的視野區(qū)域內(nèi)總的細胞顆粒凝集細胞的百分比，測定細胞凝集百分率。以藥物濃度為函數(shù)，用抑制凝集繪圖，以便測定相對于對照(未用藥物處理)測定的凝集細胞百分比中減低50%的有效劑量。測得的ED50值見下面表6。
用類似的方法測定在HEp2細胞中抑制RSV細胞致病作用(細胞凝集)的ED50，其結(jié)果見表6。詳細敘述參見實施例9。
表6ED50(μg/ml)化合物流感ARSV(臺灣)KY-1>1880.19KY-360.75KY-42941.50KY-4794>250KY-85>2501KY-9750.5KY-110>2504KY-12331.31KY-151>941.5KY-1935.00.8KY-1947.90.5一般來講，與流感A/臺灣病毒相比，RSV對于化合物的抑制作用明顯地更敏感。在R2位上具有極性胺的磺酰胺(SO2NH2)，以及有經(jīng)選擇的橋鍵基團的，具有最高的IAV活性。除化合物KY-47之外，所有的化合物均具有較高的抗RSV活性。
E.抑制HIV感染性萘亞單元化合物按實施例12所述，用表1具有代表性的大環(huán)化合物試驗其抑制兩個HTLV-Ⅲ株(HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ株)之一感染的細胞的細胞致病作用。簡單地說是，用HTLV-Ⅲ8或RF-ⅡHIV株長期感染的細胞在序列稀釋的經(jīng)選擇的KY化合物存在下進行培養(yǎng)，然后再與指示劑細胞一起共同培養(yǎng)。合胞生成的情況在顯微鏡下觀察記錄。對兩個HIV株產(chǎn)生完全抑制合胞生成的有效濃度(μg/ml)(ED100)列于表7?！癗”是指未用此化合物進行該病毒試驗。
表7抑制合胞體形成HIV-HXBHIV-RF-II化合物 ED100ED100KY-18NKY-316NKY-428NKY-48250NKY-8532NKY-9732NKY-11063NKY-1211616KY-1231616KY-129168KY-143250125KY-147250250KY-148250NKY-15132125KY-1585007500KY-171125250KY-17563250KY-176125250KY-19363500KY-19463125KY-2701632KY-27263250KY-2761632KY-2771632KY-2801632KY-2811632KY-2841632KY-2851632KY-2861632KY-288816KY-2891632KY-2901632KY-2911632KY-2931663KY-2941616KY-30188KY-307832KY-308832KY-34563125KY-3461632
表7抑制合胞體形成HIV-HXBHIV-RF-II化合物 ED100ED100KY-35232125KY-3573263KY-3593263KY-376816KY-395Y-48125Y-141632Y-20416Y-34NNY-66NN從上述結(jié)果可以看出，在對上述兩株病毒的抗病毒活性之間有普遍的關(guān)系，即對HTLV-ⅢB株最有效的化合物對RF-11株也最有效。
參考表1中化合物的結(jié)構(gòu)，下面的R基團被認為可提供次合適的活性(對兩株病毒的ED50值≥63μg/ml)KY-48中亞甲基橋鍵的大支鏈;KY-110中橋鍵的甲基酮基，KY-143中R3羥基;KY-147和KY-148中R2位置上帶有非極性烷基的磺酰胺;KY-158和KY-175中R2位置上具有非極性烷基的亞磺酸酯或磺酸酯;KY-272中R1位置上甲基酯與乙酰基橋鍵的組合。上述特點實質(zhì)上與抗HSV病毒感染降低活性的因素是相同的，即表明在10～20μg/ml劑量下對CPE無抑制作用。
同樣，上述提供高抗HSV活性的因素通常與賦予抗HIV感染性最高活性的因素是相同的。這些因素包括R1位上的基團是OH，包括OH和=O基團的組合(部分氧化);烷基和芳基酯，包括該酯與=O的組合;烷基醚，包括該醚與=O的組合。
R2位上較好的基團是磺酸或磺酸鹽、亞磺酸和其鹽以及帶有極性胺基(如NH2、NHOH、N-苷類(KY-352)和氨基酸)和磺酸的磺酰胺。尤其是磺酸、磺酸鹽和具有末端羧基的磺酰胺具有很高的活性。
R3位上合適的基團是氫，而帶有OH和Br則賦予降低的活性。
橋鍵最好是取代和未取代的亞甲基，如果橋鍵為＞CHR或≥CHR，那么R基團不應(yīng)是大的烷基。
選擇R基進一步指導(dǎo)原則是，化合物對兩個HSV試驗中至少1個的ED50值≤1μg/ml，該化合物有1個下述基團，該基團的特征在于R1基團是低級烷基醚或酯，或者含有一末端羧基的化合物，通常有最大的活性，特別是在化合物的其他R1位上有與=O基團組合。
R2基團為磺酸或磺酸鹽或帶有末端羧酸的磺酰胺。該特點表明R2位的酸基有利于增加活性。
R4橋鍵為亞甲基或帶有羧酸基團的亞甲基。
上述較好的R基團提供指導(dǎo)選擇R1～R4位上的R基團，以便優(yōu)選化合物的效果。
F.抑制HIV感染性克力克斯(n)芳烴化合物如實施例12和以上部分所述，用表2具有代表性的化合物試驗抑制以兩種HTLV-Ⅲ株(HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ)中一種感染的細胞中的細胞致病作用。對HIV的HXB和RS-11株測得的IC50值列于下面表8，單位為μg/ml。
表8HIV-HXBHIV-RF-11化合物 IC50IC50Y-116NKY-22616250Y-49NNKY-22532125Y-77NNY-48NNKY-2683232KY-2693232KY-2713263令人感興趣的是，Y-1化合物和KY-226(相應(yīng)的部分氧化的同類似物)抗HXB株具有相類似的活性，可是KY-226抗HSV病毒具有明顯更高的活性。所有其他受試的化合物均有部分氧化的R1=O基團，并且所有的化合物均有類似的活性。
Ⅳ.關(guān)于包膜病毒的特性本部分研究抑制包膜病毒方法的特性。下面A部分的敘述表明，用于該方法的大環(huán)化合物通過有選擇地結(jié)合病毒包膜蛋白至少部分地起作用，并且該結(jié)合阻止病毒附著在可感染的細胞上，因此抑制病毒感染性。所述研究在美國專利申請系列號647，720(申請日期1991，1，29)(目前美國專利5，196，452)中有詳細敘述，下面B部分研究了大環(huán)化合物對非包膜病毒的抑制作用。
A.病毒感染抑制的機理第一方面，阻止HSV結(jié)合到可感染的細胞上的大環(huán)化合物的能力的研究詳見實施例14。簡單地說，使Vero細胞與放射性同位素標記的HSV-1或HSV-2在沒有KY化合物的情況下，或者在10μg/mlKY-1化合物存在的情況下接觸，在接觸病毒之后最多至4小時測定病毒的結(jié)合。圖30表示在4小時培養(yǎng)期病毒(放射性同位素標記的)與細胞結(jié)合的曲線圖。在沒有藥物存在的情況下，在2小時中結(jié)合的病毒數(shù)量穩(wěn)定地增加，在2-4小時稍微增加。相反，在有藥物存在的情況下，病毒與細胞的結(jié)合以1/2小時為峰頂，估計可能在該時間內(nèi)有效的阻止病毒與細胞的結(jié)合達到了平衡。
第二方面，在用HSV-1感染細胞之前、感染期間或感染之后研究給藥化合物的作用，詳細敘述參見實施例15。在上述研究中，使細胞與一系列增加的KY-2化合物濃度中一個濃度化合物進行接觸，通過在感染24小時后考察蝕斑的數(shù)目測定感染的程度。細胞感染之前(實心方格)、感染期間(實心園)和感染后(空心方格)用藥物處理后蝕斑形成減少的情況以對照組的百分比表示，參見圖31。在與病毒接觸期間細胞用藥物處理時十分明顯地看出病毒抑制作用，這表明病毒抑制作用出現(xiàn)在病毒與可感染細胞結(jié)合并進入可感染細胞的期間。
第三方面，使純化的HSV-1病毒混懸液與KY-1或其鈉鹽或?qū)φ杖芤阂黄鹋囵B(yǎng)1小時，然后序列地稀釋至藥物濃度為101～10-4μg/ml，詳細敘述參見實施例16。加入序列稀釋的病毒混懸液，進行蝕斑記數(shù)，測定一式兩份，參見表9。表中的符號“×”表示蝕斑太多以至于不能計數(shù)。本研究的結(jié)果表明，KY化合物對HSV感染的抑制作用是由于(至少部分由于)藥物與HSV顆粒的結(jié)合。此外，在最終藥物濃度為10-2～10-4μg/ml(該濃度比抑制Vero細胞培養(yǎng)中HSV所需的濃度低得多)的情況下可看出完全的病毒抑制作用。因此可以結(jié)論，藥物結(jié)合/病毒失活事實上是不可逆的，即高倍稀釋效果是不可逆的。
表9KY序列10倍稀釋后的蝕斑數(shù)化合物最初病毒加入量(PFU/細胞) 1 101102103104105對照0.3XXXXXX50,419,40,0(僅有培養(yǎng)基)3XXXXXXXX38,498,4KY10.33,20,00,00,00,00,0(10μg/ml)32,22,117,165,20,00,0KY2170.32,83,30,00,00,00,0(10μg/ml)3X,XX,X6,05,00,00,0第四方面，檢查放射性同位素標記的KY-1化合物與HSV-1和HSV-2病毒蛋白的結(jié)合(實施例17)。在化合物結(jié)合之后，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分級分離病毒蛋白，并且凝膠譜圖通過自動放射照像術(shù)顯跡。圖32A中，圖中A帶和B帶是在有巰基乙醇存在(A帶)和沒有巰基乙醇存在(B帶)下HSV-1蛋白的自動放射照像譜帶，圖中C帶和D帶是HSV-2蛋白類似的譜圖。如圖所示，右邊的譜帶含分子量標示。如從SDS-PAGE測定的一樣，HSV-1中結(jié)合的藥物的主要譜帶有分子量為45、66和約130千道爾頓。在HSV-2中結(jié)合的藥物的主要譜帶有類似的分子量。圖32B中所示KY結(jié)合的主要譜帶相當于HSV糖蛋白gD、gB和gC的分子量。
B.對非包膜病毒的作用對KY化合物抑制由鼻病毒和腺病毒5與7(它們?yōu)榉前げ《?所致的細胞感染的能力同樣地進行了研究。在KY-1(濃度為1～100μg)存在下用鼻病毒感染Vero細胞(105)，在病毒感染24小時后，檢查細胞的細胞致病作用，顯示病毒感染。在受試藥物KY的任一濃度進行考察，結(jié)果表明細胞凝集沒有減少。
在KY-1(其濃度范圍也為1～100μg)存在下用腺病毒感染Vero細胞，病毒感染24小時后，檢查細胞的細胞致病作用。在KY-1藥物的任一濃度進行考察，結(jié)果表明細胞凝集沒有減少。
總的來說，廣泛范圍的大環(huán)化合物對被研究的幾種包膜病毒中的每種包膜病毒的細胞感染均是有效的抑制劑。特別是有關(guān)HSV病毒進行了結(jié)合試驗的研究，結(jié)果表明，本發(fā)明化合物的抗病毒活性取決于與病毒包膜成分的結(jié)合，與病毒包膜成分的結(jié)合反過來又抑制了病毒附著于可感染的細胞。本發(fā)明化合物抑制非包膜病毒的感染明顯地?zé)o效，這與上述機理是一致的。
Ⅴ.大環(huán)化合物與抗病毒的核苷類似物的組合對病毒的抑制本發(fā)明還包括含有以上所述類型的大環(huán)化合物與抗病毒的核苷類似物的組合物。于病毒復(fù)制或轉(zhuǎn)錄階段，核苷類似物能有效地抑制病毒的復(fù)制。
用于本發(fā)明中與大環(huán)化合物組合的核苷類似物有(1)焦磷酸類似物，如磷甲酸(PFA)、膦乙酸(PAA)、甲基二膦酸(MDP)、羰基二膦酸(COMDP)、膦?；胰┧?COPAA)，以及其各種鹵素和/或甲基取代的衍生物，它們是病毒核酸聚合酶的抑制劑。尤其是所述化合物已知可抑制皰疹病毒(BlackburnSidwell)和流感病毒(Sidwell)感染，并可抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒(如人HIV)中逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。
(2)修飾的堿基類似物，如IUDR，三氟胸苷、AraA和疊氮胸苷(AZT)、二脫氧肌苷(DDI)、D4T、二脫氧胞苷(DDC)和三氮唑核苷。三氟胸苷、IUDR和AraA主要抗皰疹病毒是有效的(Nicolson，1984a，1984b)。三氮唑核苷抗幾種RNA和DNA病毒是有效的(Sidwell)，AZT與其他的二脫氧核苷類似物(如DDI)一樣抗HIV是有效的(Fischl)。
(3)修飾的糖類似物，如5′-氨基-2′，5′-二脫氧5′-碘尿苷的N-?；苌铮?′-氨基-5′-脫氧胸苷和2′脫氧-5-乙基尿苷的磺酰胺衍生物，以及N-?；苌铩?′-硫酸和5′-氨基磺酸核苷類似物如核殺菌素、腺苷5′氨基磺酸和三氮唑核苷，它們主要作用是抑制蛋白合成(Martin)。
(4)磷酸類似物，包括無環(huán)核苷磷酸類，如無環(huán)鳥苷和gangiclovir，以及它們的電子等排的磷酸類似物。在核苷三磷酸類似物細胞內(nèi)合成中所述化合物可作為病毒胸苷激酶的病毒選擇性底物(Galbraith)。其次，核苷三磷酸類似物可作為病毒DNA聚合酶的選擇性底物，由于所述類似物不具有鏈延長所必需的雙功能性，因此它們可以起鏈終止劑的作用(Allen)。所述化合物表明具有抗以下病毒的作用皰疹病毒(Collins)，包括HSV-1和HSV-2，水痘帶狀皰疹(VZV)和細胞肥大病毒(CMV)(Smith)。
該類化合物還包括核苷的膦?；谆鸭八鼈兊臒o環(huán)類似物，如N-(3-羥基-2-膦?；籽趸?-(HPMP-)和N-(2-膦?；籽趸一?(PME-)雜環(huán)堿基衍生物。所述化合物特定地抗皰疹病毒、腺病毒、細胞肥大病毒(DeClercq)、痘病毒、痘苗病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。
在實施例18中表明了所述兩類組合物抑制包膜病毒所致病毒感染的能力，如以上所述，實施例18檢查了用序列稀釋的HSV-1或HSV-2顆粒感染Vero細胞之后的病毒得量。
圖34A表示當感染的細胞單獨與增加濃度的大環(huán)化合物Y-1(實心園點)、單獨與增加濃度的濃度的無環(huán)鳥苷(空心園圈)、與增加濃度的無環(huán)鳥苷+25μg/mlY-1化合物(實心方格)、以及與增加濃度的無環(huán)鳥苷+50μg/mlY-1化合物(實心橢圓)接觸時HSV-1病毒得量的下降。單獨應(yīng)用兩種藥物中任何一種，病毒得量的最大減少略小于3個對數(shù)(數(shù)量級)。
以兩個Y-1化合物的濃度試驗組合物的作用。在Y-1化合物較低的濃度(25μg/ml)下，兩種化合物構(gòu)成的組合物抑制病毒得量超過7個對數(shù)，即高于兩個藥物單獨應(yīng)用得到的抑制作用總和的10倍。在Y-1化合物較高的濃度下，與大環(huán)化合物和無環(huán)鳥苷單獨應(yīng)用所得作用的總和相比，兩種化合物構(gòu)成的組合物抑制作用要高幾個數(shù)量級。如圖34B所示，給藥組合的化合物以抑制HSV-2病毒得量，得到了類似的結(jié)果。
上述兩種化合物可配制成例如片劑、凝膠劑、軟膏劑、或注射劑形式，優(yōu)選配制成凝膠形式，大環(huán)化合物與核苷類似物優(yōu)選的重量比例為10∶1～1∶1。圖34A和圖34B的病毒得量曲線表明，當大環(huán)化合物與核苷約5∶1比例構(gòu)成組合物給藥時，抑制作用明顯地增加。組合物中的大環(huán)化合物最好選擇抗靶病毒(如以上所述的皰疹病毒、呼吸道合胞病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)具有合適活性的。同樣，核苷類似物最好選擇抗靶病毒具有活性的(Martin)。
合并藥用組合物的一個好處是實質(zhì)上僅需要用較低劑量的兩個類型化合物就可以達到選擇性病毒抑制作用，這樣就減少了組合物中藥物的副作用，其特點還在于它具有更高的抗病毒活性。
Ⅵ.應(yīng)用組合物治療病毒感染本發(fā)明的治療方法是將本發(fā)明所述的克力克斯(n)芳烴類化合物給藥于由包膜病毒感染個體的感染部位。本發(fā)明的組合物包括新的克力克斯(n)芳烴類化合物以及適用于該化合物口服、局部給藥或非經(jīng)胃腸道給藥的藥物載體。組合物可以單獨地含有克力克斯(n)芳烴類化合物，或者還組合有抗病毒的核苷類似物。
組合物的劑量形式應(yīng)是藥學(xué)上有效的，即可有效抑制宿主細胞的病毒感染。如以上所述，化合物劑量在1～50μg/ml范圍內(nèi)通?？捎行б种萍毎牟《靖腥尽Ｒ虼?，對于許多用途來說，有效劑量最好是在感染部位可產(chǎn)生上述范圍的化合物濃度。對于局部給藥，組合物含有1～5%或1-5%以上的克力克斯(n)芳烴是合適的。
如以上部分所述，在含有克力克斯(n)芳烴和核苷類似物的組合物中，組合物劑量實質(zhì)上可比一個或兩個化合物的劑量更低。
給藥組合物需考慮的一個問題，尤其是當藥物非經(jīng)胃腸道給藥或口服時，該問題是指全身的副作用。進行的支持本發(fā)明的研究表明，克力克斯(n)芳烴化合物(特別是其磺酸化合物)在口服或靜脈內(nèi)給藥之后顯示抗凝血作用。從所述研究中人們得到的一個結(jié)論是給藥聚陽離子化合物如硫酸魚精蛋白(靜脈內(nèi)給藥)，可以有效地阻止血流中克力克斯(n)芳烴的抗凝血作用。將給藥魚精蛋白的時間調(diào)節(jié)至相應(yīng)于克力克斯(n)芳烴的最高血藥濃度期間。按常用的方法，魚精蛋白的劑量相當于約每100單位肝素抗凝血劑用約1mg，靜脈內(nèi)給藥，同時靜脈內(nèi)給藥克力克斯(n)芳烴，或者中口服大環(huán)化合物1～2小時后靜脈內(nèi)給藥一劑魚精蛋白。通常推薦將魚精蛋白緩慢輸注(即10分鐘不超過50mg總量)的方法。
因此在同時給藥克力克斯(n)芳烴化合物的情況下，可以調(diào)節(jié)同時輸注的速度，這樣以致于硫酸魚精蛋白的輸注速度不超過50mg/10分鐘。因此當給藥本發(fā)明化合物吸收到血液中時，本發(fā)明的組合物可以包括魚精蛋白，其用量為可有效減低大環(huán)化合物的抗凝血作用。如果本發(fā)明可減低大環(huán)化合物的抗凝血作用。如果本發(fā)明組合物還含有核苷類似物和更低劑量大環(huán)化合物，由于大環(huán)化合物是低劑量的，那么魚精蛋白用量可以減少或者取消。
A.可注射的組合物關(guān)于靜脈內(nèi)給藥的組合物其效果和藥代動力學(xué)已經(jīng)研究。簡要地說，用于本方法中所述類型的大環(huán)化合物表明當靜脈內(nèi)給藥時，(a)從血液中比較緩慢地消除(t1/2=約5-8小時)，(b)主要以游離態(tài)存在，及(c)在血液中保持抑制病毒(如HSV-1、HSV-2，RSV和HIV)感染的活性。
可注射的組合物包括克力克斯(n)芳烴在合適的注射用溶液中，如無菌生理鹽水溶液。另外該溶液可含有核苷類似物和/或魚精蛋白。
B.局部組合物治療生殖器皰疹損傷為抑制皮膚和粘膜的病毒感染，最好將組合物配制成軟膏劑。應(yīng)用局部組合物治療生殖器皰疹損傷在以下研究中敘述，該研究在實施例13中詳細介紹。簡要地說，用HSV-2使雌性豚鼠經(jīng)陰道內(nèi)感染，然后按實施例13的方法接種HSV-2以后的6小時或48小時之后每天局部治療3次。動物組包括對照動物組(病毒感染后未治療)、安慰劑組(載體治療)、載體中的KY-1組或無環(huán)鳥苷組。得到陰道分泌物化驗標本，按標準的CPE試驗評定病毒活性。最初感染過程中(21天)生殖器損傷的嚴重程度按0-5+級記錄。
接種HSV-2的3～4天后，外生殖器皮膚上出現(xiàn)泡狀損傷。7-8天損傷發(fā)展成潰瘍階段，15～21天逐漸愈合。按損傷發(fā)展嚴重程度，用KY-1制劑局部治療的效果列在表10中。在感染6小時后用安慰劑的治療組日記錄的損傷AUC顯著增加(P＜0.05);但是與未治療的對照組比較，平均最高損傷記分沒有差異。與安慰劑比較，在感染后6小時用5%KY-1治療，按測定的AUC值和平均最高損傷記分均表明損傷程度明顯減少(P＜0.001)，在感染后6小時用1%KY-1治療，AUC明顯減少(P＜0.01)，但平均最高損傷記分無顯著差異。
表10損傷記分治療曲線下面積P值平均最高損傷記分P值對照37.0---3.6---安慰劑+6h47.0<0.053.9NS安慰劑+48h42.8NS3.6NSKY5%+6hr3.8<0.0010.8<0.001KY5%+48h45.7NS3.7NSKY1%+6h30.8<0.012.9NSKY1%+48h46.6NS4.3NSACV5%+6h2.7<0.0010.6<0.001ACV5%+48h45.8NS3.8NS用任一配方均未觀察到皮膚刺激的跡象。在整個治療過程中，生殖器外觀保持正常;未觀察到發(fā)紅或腫脹。在整個研究工作中豚鼠也保持外觀正常和健康。
在用上述豚鼠生殖器模型的另一研究中，用HSV-2使動物感染，然后用KY-1或Y-1局部治療，藥物濃度為2%或5%。按實施例13所述，動物在感染后6或24小時開始治療。對動物治療并每天記錄感染的嚴重程度，共19天。用KY-1和Y-1局部治療感染的效果列于表11中，并與用5%無環(huán)鳥苷(ACV)治療感染進行比較。
在本研究中用安慰劑(僅有載體)治療感染的效果明顯差于未治療組。接種后6小時給藥2%或6%Y-1進行藥物治療，與安慰劑治療組相比有損傷的動物數(shù)目減少，平均損傷記分降低和最高損傷記分降低。而且，接種24小時后用6%KY-1或Y-1或2%KY-1配方進行治療，帶有損傷的動物數(shù)目減少，并且損傷嚴重程度降低。
表11局部使用KY-1和Y-1對HSV-2生殖器損傷的作用%損傷記分治療組時間N動物損傷(AUC)平均峰值未用藥-966.79.11.3安慰劑6h1010029.03.0Y-1(2%)6h966.716.91.8Y-1(6%)6h10308.11.2安慰劑24h1010022.32.7Y-1(2%)24h106022.02.3Y-1(6%)24h104014.71.8KY-1(2%)24h107016.22.2KY-1(6%)24h105017.51.7ACV(5%)24h837.511.71.5
C.局部組合物治療眼部感染在另一實施方案中，為了使化合物適于眼睛給藥，如眼角膜表面給藥局部組合物包括克力克斯(n)芳烴化合物的軟膏劑或合適的溶液劑。組合物還包括對靶病毒感染有效的核苷化合物。
在實施例10所述治療方法中，在用HSV-1感染兔角膜之前，施用逐次變化局部劑量的化合物Y-1。應(yīng)用臨床上用的裂隙燈活組織顯微鏡評定測得的上皮疾病(圖33A)、結(jié)膜炎(圖33B)、虹膜炎(圖33C)和基質(zhì)炎(圖33D)的嚴重程度。
感染7天后，安慰劑治療的動物組中觀察到上皮疾病嚴重程度達到頂點(圖33A)。通過本研究還得到結(jié)膜炎、虹膜炎和基質(zhì)炎的參數(shù)(圖33B-D)。
在所有4個眼睛感染的評價結(jié)果中，藥物治療比安慰劑治療產(chǎn)生的嚴重感染要更少，在減少HSV-1引起的眼科疾病感染發(fā)展方面，各種濃度的Y-1均有效。用各種濃度Y-1治療，在統(tǒng)計學(xué)上互相有差異。
濃度為12.5μg/50μl局部治療是最有效的眼疾療法。感染后6天上皮疾病程度減輕，感染后7天稍微回彈。與其他2個Y-1劑量治療比較，該濃度在降低由HSV-1引起的眼疾的發(fā)展是有效的，并且僅與輕微的結(jié)膜炎、虹膜炎和基質(zhì)炎參數(shù)有關(guān)。較高的濃度(18.75μg/50μl)對降低由HSV-1引起的角膜上皮疾病的發(fā)展也是有效的。但是，該濃度的Y-1對角膜上皮表面和對結(jié)膜炎、虹膜炎和基質(zhì)炎稍微有毒性。該毒性由感染6和7天后所有疾病的參數(shù)值均增加而得到證明。
從接種后0、3、5和7天的淚膜和感染后7天形成的上皮刮出物(試驗品)得到病毒的滴度。如實施例10所述，通過蝕斑減少和多元回歸分析測定病毒的滴定。在淚膜研究中，在給藥局部劑量Y-1的所有動物中考察到病毒滴度顯著降低，雖然在最高劑量(12.5和18.7μg/50μl)時未見差異，但這種降低看來與劑量有關(guān)。在7天后所刮取的刮出物中觀察到病毒滴度減少與劑量有關(guān)。
根據(jù)上述研究，得到有效劑量/范圍。在本研究中化合物的最佳濃度為12.5μg/50μl。
D.口服組合物所進行的支持本發(fā)明的研究表明，口服給藥(如管飼法)后約0.5小時，應(yīng)用的本發(fā)明類型大環(huán)化合物在血漿中是存在的，同時在約2-4小時達到峰值。在靜脈內(nèi)給藥后血液中有效藥物濃度的時間約為4～18小時。當靜脈內(nèi)給藥本化合物時，藥物有較短的分布體積半衰期，這影響藥物分布到體器官外腔隙，較短的分布體積半衰期對具有抗凝血副作用的藥物通常是有益的，因為化合物在血流中的濃度可以較精確地進行測定。
Ⅶ.用作抑制經(jīng)性傳播的包膜病毒感染的局部用組合物本發(fā)明的一個方法是將含有如以上所述的大環(huán)化合物用于可能發(fā)生性接觸的身體某一區(qū)域或幾個區(qū)域。所述區(qū)域可以包括肛門-生殖器區(qū)域和口的皮膚表面，以及陰道、直腸、口和咽喉的粘膜組織。所進行的支持本發(fā)明的研究表明，以上所述的大環(huán)化合物適合于在皮膚和粘膜上局部給藥，即本發(fā)明化合物不會產(chǎn)生刺激作用如腫脹或發(fā)紅。
局部用的組合物可以包括適合用于局部給藥的藥學(xué)上適用的載體。因此，本發(fā)明組合物可以為例如混懸液劑、溶劑劑、軟膏劑、洗劑、性交潤滑劑、乳膏劑、泡沫劑，氣霧劑、噴霧劑、栓劑、植入劑、吸入劑，片劑、膠囊劑、干粉劑、糖漿劑、香脂劑或錠劑。制備上述組合物的方法在制藥工業(yè)上是熟知的。除了含有大分子化合物，本發(fā)明組合物還可以包括以上部分V中討論的抗病毒的核苷類似物。
在一個較好的實施方案中，本發(fā)明的組合物為滑潤的凝膠劑(性交潤滑劑)，它包括潤滑的凝膠載體，并且本發(fā)明的大環(huán)化合物溶于該載體中。在性交接觸中，凝膠載體部分地使磨傷減至最低程度，因此可以減少包膜病毒進入損傷組織然后進入血液的可能性。如以上部分IVA所述，本發(fā)明的大環(huán)化合物可有效地緊密結(jié)合至包膜病毒，因此可以抑制病毒附著于可感染的細胞。這樣，在發(fā)生感染以前凝膠劑中的大環(huán)化合物就可以阻止包膜病毒顆粒。
組合物的劑量形式是藥學(xué)上有效的，即該劑量可以有效地抑制經(jīng)性傳播的包膜病毒的感染。如以上所述，在1～75μg/ml范圍的化合物劑量通常可有效地抑制病毒感染細胞。因此，對許多用途來講，有效劑量最好是在感染部位能產(chǎn)生上述范圍化合物濃度的劑量。對局部用藥，組合物含有1～10%大環(huán)化合物是合適的。除含有本發(fā)明大環(huán)化合物之外還含有抗病毒核苷類似物(如部分V所述)的組合物中，組合物中化合物的劑量實質(zhì)上一個化合物可以是更低的，或者二個化合物的劑量均更低。
A.局部用組合物防止生殖器皰疹病毒感染在實施例19中詳細研究了作為潤滑凝膠劑組合物一部分的化合物Y-1抑制HSV-1和HSV-2感染細胞的細胞致病作用的能力。凝膠制劑由商業(yè)上買到的潤滑劑凝膠(K-YJelly，Johnson&Johnson)和經(jīng)選擇劑量的Y-1化合物構(gòu)成。在本研究中，使細胞與HSV-1或HSV-2接觸，同時與最終藥物濃度為40μg/ml的Y-1凝膠組合物接觸。接種24小時后，檢查細胞的細胞致病作用(即環(huán)細胞形成)。
結(jié)果列于表12。符號“+”表示該濃度的Y-1化合物抑制細胞致病作用(CPE)是有效的。符號“-”表示觀察到了細胞致病作用。
表12組合物Y-1HSV-1HSV-2濃度(KOS)(333)5%Y-1的5ug/ml--K-Y凝膠劑10ug/ml+/-+/-20ug/ml++40ug/ml++10%Y-1的5ug/ml--K-Y凝膠劑10ug/ml+/-+/-20ug/ml++40ug/ml++20%Y-1的5ug/ml--K-Y凝膠劑10ug/ml+/-+/-20ug/ml++40ug/ml++Y-1單獨5ug/ml--10ug/ml+/-+/-20ug/ml++40ug/ml++上述結(jié)果表明，在藥物濃度為約20μg/ml或20μg/ml以上，含有化合物Y-1的凝膠劑組合物可以明顯有效地抑制細胞感染。
B.抑制HIV感染在另一研究中，試驗了含有不同劑量的Y-1化合物的潤滑凝膠組合物抑制下述病毒感染的細胞的細胞致病作用(實施例20)，所用的病毒有兩種HTLV-Ⅲ株中的一種，即HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ。簡單地說，在稀釋的含有經(jīng)選擇的Y-1化合物凝膠組合物存在下，將用HTLV-ⅢB或RF-Ⅱ慢性感染的細胞進行培養(yǎng)，然后再與指示劑細胞一起共同培養(yǎng)。在顯微鏡觀察下以合胞形成的程度進行記分。
表13所示結(jié)果如下，其中“-”表示沒有細胞融合(或完全阻止融合)，4+表示具有與未處理的對照物不能區(qū)別的細胞融合程度。
表13Y-120%Y-110%Y-15%Y-1ug/ml的K-Y的K-Y的K-Y凝膠劑凝膠劑凝膠劑500---250---125---63+/-+/-+/-324+4+4+164+4+4+84+4+4+64+4+4+44+4+4+如以上所示，細胞與濃度大于約63μg/ml的Y-1化合物接觸，產(chǎn)生抑制HIV引起的細胞融合。該結(jié)果表明，凝膠組合物中含有的Y-1化合物可有效地抑制由試驗的HTLV病毒株引起的細胞感染。
Ⅷ.避孕器具另一方面，本發(fā)明還包括與以上所述類型大環(huán)化合物并用的物理障礙類型器具，用于抑制由性傳播的包膜病毒的感染。在一個實施方案中，該器具包括物理障礙類型器具(例如避孕器具)，并用潤滑劑組合物涂在該器具上，所述潤滑劑組合物是含有本發(fā)明的大環(huán)化合物和潤滑劑凝膠載體。
在一實施方案中，所述部件為陰莖套，其中潤滑劑組合物涂在該陰莖套的外表面上。避孕器具還可以是一種陰莖套，其中含有大環(huán)化合物的組合物涂在該陰莖套的內(nèi)層表面，目的在于與射入陰莖套的精液混合。陰莖套可以是用于男性的常規(guī)類型的(即置于男性的陰莖上)，或者可以是插入類型的，例如可以是女性用的。其中該避孕器具包括如在異性間性交開始之前插入陰道的避孕器具。
所述器具還可以是子宮頸帽、隔膜或避孕海綿，可將其置于子宮頸附近，因此，子宮頸帽或隔膜可以用例如含有本發(fā)明大環(huán)化合物的凝膠劑或乳膏劑涂層或注入。同樣，避孕海綿可以用含有本發(fā)明大環(huán)化合物的溶液劑、乳膏劑等浸透。
在評價本發(fā)明的大環(huán)化合物與膠乳陰莖套的并存性研究中，將20%W/WY-1化合物的K-Y凝膠混合物施于幾種牌號的膠乳陰莖套內(nèi)部。50ml園錐狀離心管插入了各個陰莖套以模仿豎直的陰莖，然后各陰莖套的開口端用透析環(huán)封口。再將封口的陰莖套置于37℃雙蒸餾水中保持24小時。
透析之后，水用HPLC法分析以確定是否有Y-1化合物存在。在該靈敏性試驗(5μg/ml)中，對于任一陰莖套均未檢出Y-1化合物，這表明大環(huán)化合物未通過膠乳陰莖套滲出。因此，為了防止在性交時病毒感染的傳播，本發(fā)明的大環(huán)化合物與膠乳避孕器具共存是適用的。
下面的實施例詳細敘述上制備本發(fā)明大環(huán)化合物的方法以及在防治感染中的應(yīng)用，下面的實施例目的在于詳細地敘述而不是限制本發(fā)明的范圍。
原料所有的化學(xué)試驗均由AldrichChemicalCo.或其他商業(yè)公司購得。
實施例1制備萘大環(huán)化合物。
A.KY-1(R1=OH，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CH2)向50ml(41mM)鉻變酸二鈉溶液中加入15ml37%甲醛，得到最后的摩爾比為5∶1甲醛∶鉻變酸。混合物在密塞的燒瓶中于室溫攪拌1周。所得到的70ml暗紅色溶液在真空下過濾，濾液經(jīng)濃縮后加入200ml乙腈使析出沉淀。過濾收集析出的產(chǎn)物并在真空下干燥。KY-1的產(chǎn)率為95%。該化合物有以下特征熔點(M.P.)＞300℃;
HPLC(CH3CN/MeOH/H2O/TFA)14′48″單寬峰;
(IR/KBr)=3425(OH)，1638(Ar)，11811044(SO3)cm-1UV(H2O)238.0，358.5nm分子量經(jīng)質(zhì)譜分析為1505(M+1);
1H NMR(CD3OD)，化學(xué)位移(γ)5.20(CH2)，8.01(ArH)ppm;
C13NMR(D2O)，化學(xué)位移(γ)27.19，120.18121.69，122.06，122.67，133.30，142.97，154.42和181ppm。
元素分析(C22H10O16S4Na4)2×6H2O或(C22H11O16S4Na4)2×5H2O測定值C33.17,H2.54，Na11.93;
計算值C32.75,H2.23,Na11.41;
C33.16,H2.13,Na11.56。
B.KY-3(R1=OH，R2=SO2NH2，R3=H，R4=-CH2-)KY-1(2mM)用5ml氯磺酸處理，混合物于50℃攪拌半小時。將得到的混合物加入20g碎冰中以析出產(chǎn)物，過濾收集并用乙醚洗滌。
粗產(chǎn)物溶于100ml25%氨水溶液中，并于室溫反應(yīng)2小時?；旌衔镌谡婵障聺饪s，殘余的油狀物溶于少量水中并過濾。向濾液中加入乙腈析出產(chǎn)物，過濾收集并用乙腈洗滌。該化合物有以下特征熔點(M.P.)＞300℃;
質(zhì)譜1452(M-7NH2);
HPLC(CH3CN/MeOH/H2O/TFA)11′46″單峰;
(IR/KBr)=3430(OH)，3187，1686(NH2),1637(Ar)，1211,1110,1044(SO3)cm-1UV(H2O)∶246nm;
1H NMR(D2O)，化學(xué)位移(γ)5.15(CH2)，7.5-8.2(ArH)ppm;
元素分析(C44H40O26S10N12Na4)·16H2O
測定值C28.62,H3.93,N8.82，S17.17，Na5.44;
計算值C28.51,H3.89,N9.07S17.28，Na4.97。
C.KY-42(R1=OH，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CHCOOH)將鉻變酸二鈉(10mM)置于50ml水中，在室溫與二羥乙酸(10.0mM)的5ml水溶液和10ml37%鹽酸混合?；旌衔镏蠓?小時，溶液的顏色變成暗紅色。將得到的溶液加入50ml水中并過濾。濃縮濾液并加入乙醇，以析出KY-42產(chǎn)物。產(chǎn)率為87%。該化合物有以下特征熔點(M.P.)＞300℃;
質(zhì)譜1623(M-3H2O);
HPLC(CH3CN/MeOH/H2O/TFA)10′36″單峰;
(IR/KBr)=3452(OH)，1801，1719(Co)，1638(Ar)，1206，1050(SO3)cm-1UV(H2O)238.0，351.5，520nm;
1H NMR(D2O)，化學(xué)位移(γ)∶7.10(CHCO2H)，8.00(ArH)ppm;
C13NMR(D2O)，化學(xué)位移(γ)∶116.04，
118.90,120.94,121.27,122.30,124.30,124.68,126.60,128.37,136.48,136.71,140.50,143.93,144.26,145.75,152.01,154.33,156.01,156.67;
元素分析(C48H4O40S8Na8)4·4H2O測定值C32.74，H2.50;
計算值C32.58，H2.71。
D.KY-123(R1=OH，R2=SO2Na，R3=H，R4=＞CH2)KY-1(2mM)用5ml氯磺酸處理，混合物于50℃攪拌半小時。得到的混合物加入50g碎冰中以析出產(chǎn)物，過濾收集產(chǎn)物，然后用乙醚洗滌。粗制的磺酰氯產(chǎn)物用亞硫酸鈉(20mM)的4ml水溶液處理。分次將少量50%氫氧化鈉加入反應(yīng)混合物中，使反應(yīng)混合物保持弱堿性維持2天。除去溶劑后，加入乙醇以析出產(chǎn)物，加入50%硫酸酸化產(chǎn)物，隨后加入乙醇以便析出硫酸鈉。將乙醇相與乙醚(1∶2，V/V)混合析出所需產(chǎn)物。產(chǎn)物的產(chǎn)率為39%。
E.KY-147(R1=OH，R2=SO2NHCH3，R3=H，R4=＞CH2)通過使鉻變酸(二鈉鹽)與磺酰氯在DMF存在下反應(yīng)生成N-甲基鉻變酸酰氯。該反應(yīng)在攪拌下于80℃進行4小時。在真空下除去溶劑和過量的亞硫酰氯，加入乙醚以析出鉻變酸酰氯，然后通過過濾收集，并用乙醚洗滌。將粗產(chǎn)物加入20ml甲胺中并攪拌2小時。從所得的物質(zhì)中除去全部溶劑，殘余物溶于200ml冷甲醇中并過濾。向濾液中加入乙腈以析出鉻變酸甲基磺酰胺。產(chǎn)率為56%。
將鉻變酸甲基磺酰胺(2mM)置于3ml水中，并與1ml37%甲醛在室溫反應(yīng)1周。加入乙腈以析出產(chǎn)物，過濾收集產(chǎn)物并用乙腈洗滌。產(chǎn)率為85%。
F.KY-151(R1=OCH3，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CH2)將KY-1(50mM)溶于80ml0.2M氫氧化鈉水溶液中并于50℃加熱，緩慢地于1小時內(nèi)加入硫酸二甲酯(0.2M)。連續(xù)再攪拌混合物2小時后在室溫下放置2天。向所得的物質(zhì)中加入100ml飽和氯化鈉溶液并過濾。沉淀依次用乙醇、乙腈和乙醚洗滌。將干燥的物質(zhì)溶于100ml甲醇中并過濾。濃縮濾液并加入乙醚，以析出鉻變酸的二甲醚二鈉。
G.KY-158(R1=OH，R2=SO2CH3，R3=H，R4=＞CH2)由實施例1A得到的KY-1首先用亞硫酰氯處理，得到鉻變酸磺酰氯。該化合物在碳酸氫鈉存在下用過量的亞硫酸鈉還原，得到相應(yīng)的環(huán)化鉻變酸的磺酸鈉鹽(R2=SO2Na)。該磺酸鹽在碳酸氫鈉存在下用硫酸二甲酯按實施例1A所述的方法處理。產(chǎn)物的產(chǎn)率為約21%。
H.KY-175(R1=OH，R2=SO3CH3，R3=H，R4=＞CH2)鉻變酸首先用亞硫酰氯處理，得到鉻變酸磺酰氯。然后該化合物在鈉鹽存在下用甲醇鈉的甲醇溶液處理。該產(chǎn)物按實施例1A所述方法處理，得到大環(huán)化合物。產(chǎn)物的產(chǎn)率為約29%。
I.KY-285(R1=OCOCH3，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CH2)由實施例1A得到的KY-1(0.66mmol)溶于含0.1g氫氧化鈉的3ml水中。向其中加1g乙酰氯(13mmol)，在攪拌下反應(yīng)液于室溫反應(yīng)過夜。除去溶劑，加入25ml乙醇，析出產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶于甲醇中并過濾。將濾液析出沉淀，得到87%產(chǎn)率。
J.KY-346(R1=OH，R2=SO3Na，R3=H，R4＝-CH2-N(CH3)CH2)在攪拌下將鉻變酸二鈉鹽于50℃溶于80ml水中(濃度為50mM)，直至溶液變?yōu)槌吻澹缓笤谙嗤瑴囟认蛏鲜鋈芤褐屑尤肓鶃喖谆陌?50mM)，并再連續(xù)攪拌2小時。在此期間該混合物的顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榘堤m色?；旌衔镌谑覝財嚢?天。將所得的暗蘭色溶液過濾，濾液經(jīng)濃縮并裝入燒瓶蒸發(fā)，隨后用200ml甲醇處理，析出產(chǎn)物KY-346，KY-346的產(chǎn)率為85%。該化合物有以下特征M.P.＞300℃;
HPLC(CH3CN/MeOH/H2O/TFA)13′07″單峰;
(IR/KBr)=3425(OH)，1626(Ar)，1197，1052(SO3)cm-1UV(H2O)232.0，377.5nm元素分析(C13H11O8NS2Na2)4×12H2O測定值C33.17，H3.13，N2.75;
計算值C33.98，H3.59，N2.96。
分子量經(jīng)凝膠過濾為1668。
實施例2制備克力克斯(n)芳烴化合物A.Y-49(R1=OH，R2=SO3H，R4=-CH2-，n=4)在室溫，將10g4-叔丁基克力克斯(4)芳烴用200ml濃硫酸處理半小時，然后置于75～85℃油浴上反應(yīng)4小時。當沒有不溶于水的物質(zhì)被撿出時，反應(yīng)被完成。將所得的油狀物滴入500g碎冰中，溶液用減壓過濾。從濾液中除去水，向殘余物中加入500ml乙腈，放置4小時以析出粗產(chǎn)物，然后過濾收集并用乙腈、乙酸乙酯和乙醚洗滌。產(chǎn)量為8g(73%)。用甲醇-乙醚或甲醇-乙腈系統(tǒng)將粗產(chǎn)物重結(jié)晶，得到純產(chǎn)物。在重結(jié)晶過程中也可形成單晶化合物。
用類似方法合成Y-77(R1=OH，R3=SO3H，R4=-CH2-，n=6)和Y-1(R1=OH，R3=SO3H，R4=-CH2-，n=8)。
B.KY-225(R1=-OH，＝O，R2=SO3H，R4=＞CH2，≥CH，n=4)在室溫，將1g4-叔丁基克力克斯(4)芳烴與10ml95～98%硫酸反應(yīng)半小時，然后在160℃反應(yīng)5分鐘。所得的混合物冷卻后，將其緩慢地倒入100ml碎冰中并過濾。溶液經(jīng)蒸發(fā)，向殘余物中加入300ml乙腈，析出大量沉淀，過濾收集沉淀物，并用乙腈洗滌。將粗產(chǎn)物溶于20ml甲醇中，加入乙醚析出產(chǎn)物。產(chǎn)率為84%。
用類似方法合成Y-48(R1=-OH或=O，R3=SO2H，R4=-CH2-，n=6)和Y-226(R1=-OH或＝O，R2＝SO3H，R4＝-CH2-，n＝8)。
C.Y-1的O-乙?；?R1=-OCOCH3，R2=SO3H，R4=＞CH2，n=8)將0.75gY-1于30ml無水乙酐中攪拌過夜。連續(xù)反應(yīng)直至原料溶于溶劑中。冷至室溫后，過濾懸浮液。固體用乙腈洗滌2次并真空干燥。該物質(zhì)再洗滌并重結(jié)晶。
13CNMR(D20，δ)∶173.9,151.6,144.1,135.6.130.1,34.2和22.4.
D.Y-78(R1=-OH，R2=SO2NH2，R4=＞CH2，n=8)在氮氣氛下，1gY-1與20ml氯磺酸一起于60-70℃加熱1小時。冷至室溫后將油狀物倒入冰水中，過濾沉淀物。用冷水洗滌沉淀物后，將沉淀物加到50ml含5.7g甘氨酸和2.1g氫氧化鈉的溶液中，于室溫攪拌2小時。粗產(chǎn)物溶于100ml25%氨水溶液中，并于室溫反應(yīng)2小時?；旌衔镌谡婵障聺饪s，殘余的油狀物溶于少量水中并過濾。向濾液中加入乙腈，析出產(chǎn)物，過濾收集并用乙腈洗滌。
E.Y-1的甘氨酰磺酰胺(R1=-OH，R2=SO2NHCH2CO2H，R4=＞CH2，n=8)在氮氣氛下，1gY-1和20ml氯磺酸于60-70℃加熱1小時。冷至室溫后，將油狀物倒入冰水中，并過濾沉淀物。用冷水洗滌沉淀物后，將沉淀物加到50ml含5.7g甘氨酸和2.1g氫氧化鈉的溶液中，于室溫攪拌2小時。從生成的物質(zhì)中除去全部溶劑后，殘余物溶于200ml冷甲醇中并過濾。向濾液中加入乙腈以便析出產(chǎn)物。
F.乙?；鶚蜻B的Y-49(R1=-OH，R2=SO3H，R4=-CHCO2H-，n=4)于100℃，將4.3g對羥基苯磺酸與9g二羥乙酸在30ml18%濃鹽酸中的溶液反應(yīng)2小時。反應(yīng)產(chǎn)物在減壓下干燥后，加入50ml甲醇，濾除不溶的雜質(zhì)。向濾液中加入乙醚，析出產(chǎn)物，然后過濾收集并真空干燥。
G.Y-49的甲苯磺酸酯(R1=-SO3C6H4CH3，R2=SO3H，R4=＞CHCO2H，n=4)在氮氣氛下，向1.06g無水碳酸鈉、10ml二甲基甲酰胺和0.75gY-49的懸浮液中加入1.9g甲苯磺酰氯?；亓鬟^夜后，所得的混合物冷至室溫并過濾。濾液用乙醚稀釋以析出粗產(chǎn)物。用乙腈/乙醚溶劑重結(jié)晶，得到產(chǎn)物。
H.Y-49的羧酸衍生物(R1=-CO2H，R2=SO3H，R4=＞CHCO2H，n=4)在氮氣氛下，向用冰冷卻的1.25g2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶和0.65g4-叔丁基克力克斯[4]芳烴的10ml無水二氯甲烷溶液中加入1.0ml三氟甲磺酸酐，于室溫下攪拌過夜后，混合物用10ml戊烷稀釋并過濾。濾液依次用冰冷卻的1N氫氧化鈉水溶液、冰冷卻的1N鹽酸水溶液和飽和氯化鈉水溶液萃取，以無水硫酸鈉干燥，通過硅膠墊過濾并真空濃縮。殘余物溶于10ml無水二異丙基乙胺、0.5ml三甲基氰硅烷和20mg四-(三苯膦)鈀的混合物中，在氮氣氛下回流過夜后再冷至室溫，加入50ml乙醚，并將得到的懸浮液過濾。濾液經(jīng)真空濃縮和硅膠層析(己烷/乙酸乙酯洗脫)后，氰化物中間體和10ml濃硫酸于80℃加熱3小時，用10ml水稀釋并回流過夜。冷至室溫后，將得到的混合物加入到0.5g活性炭和50g冰中。過濾后，得到的濾液在真空下濃縮至約15ml體積，并將得到的固體過濾。固體溶于最少量甲醇中，通過加入乙醚析出沉淀。最后經(jīng)C18反相層析(甲醇/水洗脫)純化，得到產(chǎn)物。
I.Y-1的甲基醚(R1=-OMe，R2=SO3Na，R4＞CH2，n=8)447mgY-1、1.53ml6N氫氧化鈉水溶液和9ml硫酸二甲酯的混合物于60℃加熱20小時。將得到的混合物滴入攪拌著的100ml無水乙醇中。形成的懸浮液離心20分鐘(9000rpm)，然后除去上清液。再次將得到的固體溶于6ml水中，得到的溶液如上述用乙醇處理，離心并除去上清液。殘余的固體經(jīng)冷凍干燥得到420mg產(chǎn)物。
13CNMR(D20，δ)∶161.2，140.9，137.6，129.5，63.6，和33.5.
J.XXⅥ.(R1=-OH，R2=H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)按Gutsche，Levine和Sujeeth，1985所述方法，用4-叔丁基克力克斯(4)芳烴(XXⅤ;圖13)制備克力克斯(4)芳烴XXⅥ。將5.0g(6.75mmol)XXⅥ在250ml甲苯中的熱溶液置于500ml帶機械攪拌器和氣體入口管的三頸園底燒瓶中。溶液冷至50-55℃，用5.0g(37mmol)無水三氯化鋁處理，并在惰性氣體下于50-55℃攪拌2小時?；旌衔镏糜诒≈欣鋮s，并和125ml 1N鹽酸一起攪拌30分鐘，分離有機相并洗滌、干燥和蒸發(fā)，得到黃色殘余物。該殘余物與500ml乙醚一起研磨，不溶物用CHCl3-CH3OH重結(jié)晶，得1.9g(66%)XXⅥ，為米色微晶體，m.p.313-318℃。
K.XXⅧ.(R1=-OH，R2=COOH，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)按Yilmaz和Vural所述方法制備克力克斯(4)芳烴XXⅧ。將已知的1.3g對乙?；肆怂?4)芳烴(XXⅦ)(YilmazandVural，1991;Noetal.，1986)溶于50ml2N氫氧化鈉水溶液中。加入8g碘和20g碘化鉀在40ml水中的溶液，并將混合物攪拌。溶液于水浴上溫?zé)?小時，濾除碘仿，向濾液中加入20g亞硫酸氫鈉。然后向濾液中加入濃鹽酸，得到淡黃色沉淀，再濾出沉淀，用水洗滌并干燥。將粗產(chǎn)物溶于10%亞硫酸氫鈉水溶液，并用活性炭處理。過濾后，溶液用1N鹽酸酸化。過濾收集析出的產(chǎn)物，用蒸餾水洗滌直至無氯離子，于真空干燥器中干燥，得1.04g(79%)XXⅧ。m.p.320℃(分解)。
L.XXⅪ.(R1=-OH，R2=-CH2COOH，R3=R5＝H，R4=-CH2-，n=4)按Gutsche和Nam，1989所述方法，用對(二甲氨基)甲基-克力克斯(4)芳烴(XXⅨ)制備克力克斯(4)芳烴衍生物XXⅪ。
向15.9g(39.5mmol)克力克斯(4)芳烴(XXⅥ)的360mlTHF的溶液中加入45ml乙酸、22.5g(0.2mol)40%二甲胺水溶液和116.2g(0.2mol)37%甲醛水溶液。反應(yīng)混合物于室溫攪拌24小時，在真空下除去溶劑，并將殘余物溶于250ml水中。水溶液用200ml乙醚萃取2次，用10%碳酸鉀溶液中和，用抽濾器過濾沉淀。產(chǎn)物在真空下干燥，然后用氯仿重結(jié)晶，得到19.1g(78%)對(二甲氨基)甲基-克力克斯(4)芳烴XXⅨ，為白色針狀物。
向16.3g對(二甲氨基)甲基-克力克斯(4)芳烴的220ml DMSO溶液中緩慢地加入9.57ml(0.15mol)甲基碘。反應(yīng)混合物于室溫攪拌30分鐘后，加入15g(0.3mol)NaCN，在氮氣氛下混合物于80℃加熱2小時，然后冷卻溶液，用1L冰水處理，用2N鹽酸酸化，過濾并空氣干燥。粗產(chǎn)物用CH3CN重結(jié)晶，得到12.8g(88%)對氰甲基克力克斯(4)芳烴XXX，為淡黃色固體。
向25mlDMSO和5ml濃鹽酸溶液中加入0.5mmol對氰甲基-克力克斯(4)芳烴并回流過夜，在室溫用100ml水稀釋后，過濾收集沉淀，用甲醇重結(jié)晶得到純的XXⅪ。
M.XXXⅢ(R1=-OH，R2=-CH2CH2COOH，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)按Gutsche和Nam，1989所述方法，制備克力克斯(4)芳烴衍生物XXXⅢ。
向3.26g(5mmol)(二甲氨基)甲基-克力克斯(4)芳烴(XXⅨ;實施例L)的80mlDMSO的溶液中加入1.90ml(30mmol)甲基碘?；旌衔飻嚢?0分鐘后，加入由1.20gNa，7.28g丙二酸二乙酯和28mlEtOH制備的二乙基丙二酸鈉，反應(yīng)混合物在氮氣氛下于80℃加熱2小時，然后冷卻溶液，并倒入200ml冰水中，用2N鹽酸酸化，并按常用的方法處理，得到5.50g(99%)對(二乙基丙二酰)甲基-克力克斯(4)芳烴XXⅫ粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶于100mlDMSO和30ml濃鹽酸，并在氮氣氛下于120℃加熱10小時進行水解和脫羧作用。然后冷卻混合物，并倒入500ml冰水中，攪拌10分鐘并過濾，沉淀用丙酮-乙酸乙酯重結(jié)晶，得到2.24g(69%)XXXⅢ，為無色結(jié)晶。m.p.224℃。
N.XXXⅥ(R1=-OH，R2=-PO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)采用Arduini等和Hirao等的方法制備XXXⅥ衍生物。
將克力克斯(4)芳烴(XXⅥ)和Hg(OCOCF3)2于三氯甲烷中回流，得到幾乎定量產(chǎn)率的四-(Hg-OCOCF3)克力克斯芳烴衍生物。接著蒸發(fā)三氯甲烷，通過克力克斯芳烴衍生物與碘在三氯甲烷中反應(yīng)進行金屬碘交換，得到對-碘-克力克斯(4)芳烴XXXⅣ，為棕色化合物，產(chǎn)率為40%。
在氮氣氛下，將HPO(OEt)2(10mmol)、三乙胺(10mmol)、Pd(PPh3)4(0.3mmol)和對-碘-克力克斯(4)芳烴(1.0mmol)的濃縮的甲苯溶液于100℃攪拌3天。在室溫用50ml乙醚稀釋后，將反應(yīng)混合物過濾，然后在高真空下(100℃，氣壓＜0.1mmHg)濃縮。所得的濃縮液經(jīng)硅膠層析純化，得到純的膦酸二酯(XXXⅤ)，然后于5ml6N鹽酸中回流過夜，得到膦酸產(chǎn)物。除去溶劑(100℃，氣壓＜0.1mmHg)后，固體用甲醇重結(jié)晶，得到純的XXXⅥ。
O.XXXⅨ.(R1=-OH，R2=-CH2PO3H，R3＝R5＝H，R4=-CH2-，n=4)按Almi等所述的方法通過對氯甲基-克力克斯(4)芳烴制備克力克斯(4)芳烴衍生物XLⅣ。
向于-10℃冷卻的1.0g(2.4mmol)克力克斯(4)芳烴(XXⅥ)和14.4g(81mmol)氯甲基-正辛基醚的100ml三氯甲烷的溶液中滴加4.7ml(40.3mmol)四氯化錫，約15分鐘內(nèi)加完。然后移去冷卻浴，反應(yīng)混合物在室溫保持到至全部克力克斯芳烴起始物質(zhì)進行了反應(yīng)(約50分鐘后)，用薄層層析(己烷∶乙酸乙酯=4∶3)鑒定。然后緩慢地加入水，分離兩相。有機層用蒸餾水洗滌2次，然后經(jīng)硫酸鈉干燥。隨后除去硫酸鈉，蒸發(fā)溶劑，得到殘余物，再用正己烷洗滌并過濾，得到1.23g(80%)產(chǎn)物對氯甲基-克力克斯(4)芳烴XXXⅦ。
1g(1.6mmol)衍生物XXXⅦ于20ml亞磷酸三乙酯中回流6小時，蒸餾除去過量的亞磷酸三乙酯，所得的固體殘余物(膦酸二酯XXXⅧ)在真空下干燥8小時。加入60ml20%鹽酸溶液，將得到的反應(yīng)混合物回流20小時，隨后蒸發(fā)除去溶劑，所得的沉淀經(jīng)過濾，第1次用甲醇洗滌，隨后用三氯甲烷洗滌，并在真空下干燥，得到1.11g(80%)XXXⅨ，為白色固體。m.p.360℃。
P.XLⅣ.(R1=-OTs，R2=-CH2CH2Br，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)
按Gutsche，Levine和Sujeeth，1985;Gutsche，Dhawan等，1983所述的方法制備對-2-溴乙基-克力克斯(4)芳烴衍生物XLIV。
(a)向2.14g克力克斯(4)芳烴(XXⅥ)的100mlTHF和10mlDMF的溶液中加入2.0g氫化鈉，隨后加入28g烯丙基溴。將混合物回流1小時，然后蒸發(fā)除去THF，殘余物在水和三氯甲烷之間進行分配。三氯甲烷萃取液用水洗滌，干燥和蒸發(fā)，殘余物用95%乙醇重結(jié)晶，得到2.18g(74%)O-烯丙基-克力克斯(4)芳烴XL，為無色針狀物。
(b)在惰性氣體中將1.66g(2.84mmol)O-烯丙基克力克斯(4)芳烴的25mlN，N-二乙基苯胺溶液加熱回流2小時。將溶液冷卻，倒入250ml冰-水中，與250ml濃鹽酸一起攪拌，并過濾，得到粗產(chǎn)物，然后用異丙醇結(jié)晶，得到1.22g(74%)對-烯丙基-克力克斯(4)芳烴XLI，為米色針狀物，m.p.245～248℃。
(c)2.09g(3.57mmol)對-烯丙基-克力克斯(4)芳烴的100ml無水THF的溶液與1.0g(42mmol)氫化鈉反應(yīng)，隨后與4.0g(21mmol)對-甲苯磺酰氯反應(yīng)，將混合物加熱回流1.5小時。蒸發(fā)除去溶劑，得到淡棕色油狀物，該油狀物溶于100ml三氯甲烷中，在冰浴上冷卻，并用100ml冰-水處理。有機相經(jīng)干燥和蒸發(fā)，殘余物用異丙醇重結(jié)晶，得到3.41g(79.5%)甲苯磺酰化的對-烯丙基克力克斯(4)芳烴(XLII)。
(d)3.50g甲苯磺?；膶?烯丙基-克力克斯(4)芳烴的60ml二氯甲烷和40ml甲醇的溶液于干冰-丙酮浴中冷卻，用臭氧處理直至它保持蘭色(10-15分鐘)。將氮氣成泡通入溶液直至蘭色消失，加入2g四氫硼鈉。溶液于室溫攪拌3～4小時，倒入冰冷卻的稀鹽酸溶液中，用常規(guī)方法處理，得到粗產(chǎn)物，為白色樹脂狀物。用3∶5丙酮-己烷重結(jié)晶得到1.51g(43%)微晶對-2-羥乙基-克力克斯(4)芳烴酚氧-甲苯磺酸酯(XLIII)。
(e)由6.5g(25mmol)三苯膦和Br2制備的二溴三苯膦(Schaefer等，1973)的150ml無水乙腈的溶液用步驟(d)產(chǎn)物(由3.25g步驟(c)產(chǎn)物制備)的50ml乙腈的溶液處理。混合物于室溫攪拌2小時并過濾，蒸發(fā)除去溶劑，得到粘性的橙色油狀物。該油狀物與250ml95%乙醇一起攪拌8小時，過濾收集得到3.10g(78%)對-2-溴乙基-O-甲苯磺?；?克力克斯(4)芳烴XLIV，為白色粉狀物。
Q.XLVI(R1=-OH，R2=-CH2CH2PO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)用對-2-溴乙基衍生物XLIV(實施例P)制備克力克斯(4)芳烴XLVI，其方法為由對-氯甲基-克力克斯(4)芳烴(實施例O)制備XXXIX的改良方法。
在氮氣氛下，將純化的溴化物XLIV(1mmol)于10mlP(OEt)3中回流過夜，在高真空(100℃，0.1mmHg)下除去過量的亞磷酸酯后，在氮氣氛下將殘余物(亞磷酸二乙酯XLV)加到5ml DMSO和1ml 6N氫氧化鈉的混合液中，并于100℃加熱過夜，脫去甲苯磺酸酯基團。在高真空(100℃，＜0.1mmHg)下除去DMSO后，殘余物用25ml熱水稀釋，并用濃鹽酸酯化，經(jīng)冷卻得到沉淀，然后過濾收集沉淀。固體用甲醇重結(jié)晶得到純化的XLVI。
R.XLVII.(R1=-OH，R2=-CH2SO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)在室溫向?qū)?氯甲基-克力克斯(4)芳烴(XXⅦ，實施例O;2.5mmol)的10ml95%乙醇的溶液中加入亞硫酸鈉水溶液(2M，11mmol)?；亓鬟^夜后，經(jīng)蒸餾除去溶劑直至析出沉淀。過濾收集沉淀，用冷的氯化鈉飽和水溶液洗滌，然后懸浮于最少量的水中，通過由AmberliteIR-120樹脂和水填充的柱子。在真空下將含產(chǎn)物的對紫外線呈活性的級份濃縮，殘余物用甲醇重結(jié)晶，得到純的XLVII。
S.XLIX.(R1=-OH，R2=-CH2CH2SO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)用溴乙基衍生物XLIV(實施例P)制備克力克斯(4)芳烴衍生物XLIX，其方法如下依次用實施例R的磺化方法得到XLVIII，用實施例Q的水解步驟脫去甲苯磺?；?，用實施例R的AmberliteIR-120步驟得到磺酸XLIX。
T.LII.(R1=-OAc，R2=叔丁基，R3=R5=H，R4=-CH(OH)-，n=4)按以下方法用已知的克力克斯芳烴LI(Gormer等;1990R1=-OAc，R2=叔丁基，R3=R5=H，R4=-C(=0)-，n=4)制備克力克斯芳烴LII。
將1.5g(2.3mmol)對-叔丁基-克力克斯(4)芳烴(XXV)在37ml乙酐和0.1ml濃硫酸的溶液中回流。反應(yīng)混合物加到300ml冰-水中，得到緩慢結(jié)晶的油狀物。收集結(jié)晶固體，用水洗滌數(shù)次，并用石油醚干燥，得到O-乙酰基-對-叔丁基-克力克斯(4)芳烴(L)，為白色結(jié)晶。
向裝有冷凝管、攪拌器和加料漏斗的三頸園底燒瓶中加入1.2g(1.5mmol)O-乙?；?對-叔丁基克力克斯(4)芳烴和70ml乙酐，在20℃和攪拌下，向其中滴加3.5g氧化鉻(Ⅳ)在15ml乙酐和5ml乙酸混合液中的溶液，反應(yīng)物于140℃攪拌8小時，冷卻后，反應(yīng)混合物加入600ml冰-水中并將其靜置12小時，收集得到的黃色沉淀，并用水洗滌。用甲醇重結(jié)晶得到純的酮基衍生物L(fēng)I(O-乙?；?對-叔丁基-克力克斯(4)芳烴，R4=-C(＝O)-)(Gormer等，1990)。m.p.305℃。
在室溫和氮氣氛下，將前面步驟得到的酮基衍生物(1mmol)溶于10ml無不乙醇中，并向其中分成若干小份加入四氫硼鈉(8mmol)。酮基完成還原反應(yīng)后(以紅外光譜觀察167cm-1處的羰基譜線消失來鑒別)，滴加1ml乙酸，得到的混合物攪拌1小時。在高真空(＜0.1mmHg)下除去溶劑，所得到的固體與5ml甲醇一起回流20分鐘。除去溶劑后，殘余物經(jīng)硅膠層析純化，得到純的羥基亞甲基橋鍵連接的O-乙?；?對-叔丁基產(chǎn)物L(fēng)II。
U.LIII.(R1=-OH，R2=R3=R5=H，R4=-CH(Cl)-，n=4)在氮氣氛下，將衍生物L(fēng)II(實施例T;0.5mmol)于5ml二氯亞砜中回流。SO2的逸出停止后，在高真空(＜0.1mmHg)下蒸餾除去過量的二氯亞砜。向殘余物中加入5ml THF，重復(fù)蒸餾以除去殘余的二氯亞砜，得到氯代衍生物L(fēng)III。
V.LVI.(R1=-OH，R2=R3=R5=H，R4=-CH(CO2H)-，n=4)(a)在氮氣氛下，將含有氯代衍生物L(fēng)III(1mmol)和氰化鈉(1.1mmol)在10ml二甲基亞砜中的反應(yīng)混合物于80℃加熱6小時。然后混合物倒入50ml冰-水中，用3N鹽酸酸化，過濾收集得到的沉淀。將濾液加到25ml二甲基亞砜和5ml濃鹽酸混合液中并回流過夜。在室溫用100ml水稀釋，過濾收集得到的沉淀，用三氯甲烷/甲醇重結(jié)晶得到LV。
(b)為了脫去對-叔丁基，在氮氣氛下將由前面步驟得到的產(chǎn)物分數(shù)小份加入到50ml熱的(60℃)三氯化鋁(10mmol)的甲苯懸浮液中。攪拌過夜后，將混合物冷至0℃，并滴加100ml1N鹽酸。加入后分離有機相，并真空濃縮。用三氯甲烷/甲醇重結(jié)晶得到純的LVI。
W.LVII.(R1=-OAc，R2=叔丁基，R3=R5=H，R4=-CH(CH2CH=CH2)-，n=4)將氯代衍生物L(fēng)III(實施例U)溶于最少量的THF中，混合物滴入攪拌的、冷卻(-78℃)的含(CH2CH=CH2)2CuLi(0.2M，3mmol)的THF溶液中。然后使懸浮液溫?zé)嶂潦覝?。攪拌過夜后，懸浮液用5ml 3∶1飽和氯化銨和飽和氨溶液的混合液萃取。有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥、過濾并真空濃縮。殘余物經(jīng)硅膠層析純化，得到O-乙?；?對-叔丁基烯丙基衍生物L(fēng)VII。
如果需要，按以下實施例b部分的方法脫去乙?；褪宥』?。
X.LVIII.(R1=-OH，R2=R3=R5=H，R4=-CH(CH2CO2H)-，n=4)
(a)將克力克斯芳烴(LVII)(1mmol)置于10ml二氯甲烷中，于-78℃進行臭氧化，直至反應(yīng)混合物變成蘭色。然后加入2ml甲酸和1ml過氧化氫，將反應(yīng)混合物溫至室溫，同時通氮氣洗?；旌衔锘亓鬟^夜，然后在真空下除去溶劑，得到LVIIa。
(b)將由前面步驟得到的O-乙?；a(chǎn)物(0.2mmol)于4ml甲醇和1ml6N氫氧化鈉的混合液中回流過夜，以脫去乙?；Ｔ谡婵障鲁ト軇┖?，殘余物用10ml水稀釋，并酸化至pH2。過濾收集得到的沉淀，用三氯甲烷/己烷重結(jié)晶。按實施例V步驟b的方法脫去叔丁基，得到純的LVIII。
Y.LXII.(R1=-O(CH2)3SO3Na，R2=H，低級烷基，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)按Shinkai等，1989，所述的方法制備克力克斯(4)芳烴LXII。
在氮氣氛下于50℃將克力克斯(4)芳烴XXVI(1.54mmol)溶于100mlTHF中。冷卻后加入1.20g氫化鈉(30mmol;60%油分散液)，攪拌混合物直至氫氣逸出停止(約1小時)。然后滴加2.26g丙烷-1，3-砜(18.5mmol)，混合物于室溫攪拌24小時。加入甲醇以分解殘余的氫化鈉，然后在減壓下蒸發(fā)溶劑，殘余物溶于500ml熱水中。通過離心除去不溶物。然后加入乙酸鈉進行鹽析，產(chǎn)物沉淀，得到純化的LXII(產(chǎn)率10%)，m.p.＞300℃。
Z.LXIV.(R1=-O(CH2)3SO3Na，R2=SO3Na，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4)向10ml二甲基亞砜、對-磺?；?克力克斯(4)芳烴(XV，圖8;1mmol)和1ml 6N氫氧化鈉的混合物中加入丙烷-1，3-砜(9mmol)，得到的反應(yīng)混合物于60℃加熱過夜。在真空(＜0.1mmHg)下除去溶劑后，固體殘余物用最少量的水稀釋，在攪拌下滴入100ml乙醇中。過濾收集得到的沉淀，再用最少量的水稀釋，并再次滴入100ml乙醇中。過濾收集得到的沉淀，用甲醇/CH3CN重結(jié)晶，得到純的LXIV。
實施例3制備橋接芳基的大環(huán)化合物A.VII.混合的萘基/苯基大環(huán)10g鉻變酸二鈉的55ml水的溶液用22ml的30ml37%鹽酸處理。向該溶液中加入5gl，2-苯二甲醇的55ml乙酸的溶液，將該反應(yīng)回流6小時。所得的混合物經(jīng)過過濾后加入500ml乙腈，以析出粗產(chǎn)物，過濾收集。粗制化合物進一步經(jīng)LH-20樹脂柱層析純化，用乙醇洗脫。
B.LXXV.萘基-苯基大環(huán)(n=2萘基+2苯基)按Mendoza等提出的方法制備混合的大環(huán)LXXV。
在5ml濃鹽酸存在下鉻變酸(Ⅲ，圖3A;10mmol)和2，5-二羥甲基-3-叔丁基酚(LXXII;1mmol)于100℃加熱過夜。在高真空(100℃，＜0.1mmHg)下除去溶劑后，殘余物溶于最少量的水中，通過SephadexLH-20和水裝填的柱子并洗脫。在2ml濃鹽酸和2，5-二羥甲基-3-叔丁基酚(LXXII;0.6mmol)存在下，含2個鉻變酸單元和1個酚單元的分離產(chǎn)物(LXXIII;0.6mmol)再于100℃加熱過夜。用SephadexLH-20柱分離產(chǎn)物(LXXIV;0.05mmol)，在真空下干燥，然后在氮氣氛下于1ml濃硫酸中于80℃加熱6小時。用5ml冷水稀釋后，用100mg活性炭處理，將所得混合物過濾，在真空(＜0.1mmHg)下除去濾液中大部分水份。殘余物溶于熱的飽和氯化鈉水溶液中。冷至0℃析出沉淀。過濾沉淀，溶于最少量的水中，通過AmberliteIR-120和水裝填的柱子并洗脫。將含純產(chǎn)物的流出液合并，冷凍干燥，得到純的LXXV(0.03mmol)。
實施例4增生細胞的細胞毒性應(yīng)用一組人體細胞系測定藥物的毒性，包括KB(鼻咽癌細胞)，HeLaS3(頸上皮癌細胞)，PLC(肝癌細胞)，HepG2(人體肝癌細胞)，HepG2T14(用HBV轉(zhuǎn)染的肝癌細胞)，WI38(正常人體肺成纖維細胞)，BT549(乳腺癌細胞)，SW480(乳腺癌細胞)和A549(肺癌細胞)。
在24孔的多孔培養(yǎng)板的每個孔中加入1ml含5%胎牛血清(FCS)和青霉素/鏈霉素(P/S)的RPMI-1640培養(yǎng)基，并接種5×104細胞。在接種后的第2天，將表3列出的50個試驗化合物中的一個加入細胞中，濃度為1～100μg/ml。3天后除去培養(yǎng)基，細胞用Commassie Blue的40%甲醇和7%乙酸的溶液染色。結(jié)果已在上面Ⅱ部分討論。
實施例5對HSV病毒活性的抑制作用細胞致病作用于37℃在含7%CO2的調(diào)濕培養(yǎng)箱中將Vero細胞保存在含5%胎牛血清、100單位青霉素/ml和100μg鏈霉素/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中。應(yīng)用病毒株HSV的HSV-1(Kos-1)和HSV-2(333)株。
在96孔微滴板的每個孔中加入0.2ml含5%FCS和0.1%甲基纖維素(15cps)的RPMI-1640培養(yǎng)基，并接種1×105Vero細胞。培育過夜，使細胞進行對數(shù)期倍增后，吸去培養(yǎng)基，以100μl相同培養(yǎng)基代替，此培養(yǎng)基含有2%FCS，和50μl對照液或藥物溶液，以及50μl HSV-1或HSV-2病毒液，藥物的最后濃度為10μg/ml，病毒的含量為大約3個蝕斑形成單位(PFU)/細胞，即6×105PFU/孔。
細胞于37℃培養(yǎng)24小時，在此期間細胞致病作用可清楚地觀察到。在沒有病毒感染的情況下，細胞形成均勻的單層成纖維細胞。在有病毒感染的情況下，細胞形成園形細胞的懸液，隨后細胞凝集，它們的外觀很易與正常的成纖維細胞區(qū)分。如果未觀察到細胞病作用，用10μg/ml重復(fù)試驗。未接種病毒的平行組細胞作為Vero細胞細胞毒性試驗的對照。
上面表1列出了試驗化合物的結(jié)構(gòu)式，表3第2列展示了保護細胞免于細胞致病作用(+)的化合物。
實施例6對HSV病毒活性的抑制作用蝕斑減少將Vero細胞按實施例5的方法保存在含5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。在24孔培養(yǎng)板中加入1ml含5%FCS和0.1%甲基纖維素(15cps)的RPMI-1640培養(yǎng)基，在其中接種4×105Vero細胞。培育過夜，使細胞進行對數(shù)期倍增后，吸出培養(yǎng)基，以100μl相同的培養(yǎng)基代替，該培養(yǎng)基含有2%FCS，其含有50μl對照液或藥物溶液，以及含有50μlHSV-1或HSV-2病毒液，藥物的最后濃度為0.15、2.5、5、10或20μg/ml，病毒的含量為大約1×103PFU/ml，即50PFU/孔。
于37℃培養(yǎng)2小時后，吸去病毒并除去藥物，細胞用PBS洗滌，加入0.5ml含2%FCS和青霉素/鏈霉素(P/S)的1%甲基纖維素(4K cps)的RPMI-1640培養(yǎng)基。2天后除去培養(yǎng)基。細胞用0.8%結(jié)晶紫的50%乙醇溶液染色。將形成的蝕斑計數(shù)，并除以對照組中形成的蝕斑以計算抑制的百分比。ED50值表示50%病毒蝕斑被抑制所需藥物的濃度，ED50是假定對病毒蝕斑以計算抑制作用線性劑量反應(yīng)而算出的。計算出的IC50值在上面表3和表4中列出。
實施例7對HSV病毒活性的抑制作用病毒得量的抑制將5ml含5%FCS和P/S的RPMI-1640培養(yǎng)基加入25T燒瓶中，并接種1×106赫拉S3細胞。24小時后，吸出培養(yǎng)基，以6×106PFU HSV-1或HSV-2，和經(jīng)選擇的KY化合物的序列稀釋液代替，藥物濃度為10、5、2.5、1.25和0.625μg/ml。于37℃在2ml含2%FCS和P/S的RPMI-1640中生長24小時后，細胞于-70℃冷凍直至滴定的時候。為了從細胞中釋放出病毒，將細胞冷凍/融化3次，并序列地進行10倍稀釋。
在24孔多孔培養(yǎng)板的每個孔中加入1ml含5%FCS、P/S和0.1甲基纖維素(15cps)的RPMI-1640培養(yǎng)基，并接種1×105Vero細胞。第2天除去培養(yǎng)基后，加入100μl10倍序列稀釋的病毒，一式二份。于37℃培育2小時后，除去病毒，加入0.5ml甲基纖維素(4Kcps)的RPMI-1640(含2%FCS+P/S)培養(yǎng)基。2天后除去培養(yǎng)基。細胞用0.8%結(jié)晶紫的50%乙醇溶液染色，將形成的蝕斑計數(shù)，由稀釋倍數(shù)計算滴度。
圖29A和29B所示，病毒得量的減少是KY化合物(KY-1和KY-2)濃度的函數(shù)。
實施例8抗耐藥病毒HSV-1和HSV-2株的活性應(yīng)用以下的HSV-1和HSV-2病毒株KOS，為野生型HSV-1病毒;KOS(PMEA)和KOS(PFA)，均為具有DNA聚合酶突變的耐藥HSV-1病毒;333，為野生型HSV-2病毒，以及333(DHPG)，為具有胸苷激酶突變的耐藥HSV-2病毒。
大體上按實施例7所述的方法，用上述5個HSV株中的每一個檢查KY-1、無環(huán)鳥苷(ACV)、DHPG、PFA和PMEA對病毒得量的抑制。簡要地說，將赫拉S3細胞接種置含培養(yǎng)基的25T燒瓶中，24小時后吸出培養(yǎng)基，以6×106PFU經(jīng)選擇的HSV株病毒和KY-1、ACV、DHGP、PFA和PMEA的序列稀釋液代替。于37℃在2ml含2%FCS和青霉素、鏈霉素(P/S)的RPMI-1640中生長24小時后，細胞于-70℃冷凍直至滴定的時候。為了從細胞中釋放出病毒，將細胞冷凍/融化3次，并序列地進行10倍稀釋，序列稀釋液加到Vero細胞培養(yǎng)物中。于37℃培育2小時后，除去病毒，加入0.5ml甲基纖維素(4Kcps)的RPMI-1640培養(yǎng)基(含2%FCS+P/S)。2天后除去培養(yǎng)基。細胞用0.8%結(jié)晶紫的50%乙醇溶液染色。將形成的蝕斑計數(shù)，由稀釋倍數(shù)計算滴度。從藥物劑量反應(yīng)測定IC90濃度值，IC90值表示抑制90%病毒得量所需的各個藥物濃度。該值已列在上面表5中。
實施例9對RSV病毒活性的抑制作用用以下試驗來評定組織培養(yǎng)中KY-和Y-化合物的抗病毒活性在96孔平底組織培養(yǎng)板(Falcon 307)中，按上述細胞毒性試驗中類似的條件進行。在該試驗中，將化合物的2%FCS-MEM溶液進行序列稀釋，用序列的2倍稀釋液一式4份試驗化合物(0.05ml/孔)。除了上述一組作為抗病毒和組織對照孔以外，向所有的孔中加入0.05ml含大約100組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量(TCID50)的合適病毒。接著向每孔中加入大約3×103HEp2細胞(0.1ml)。每個試驗中包括含抗病毒和不含病毒的對照孔(病毒對照)或含培養(yǎng)基不含病毒或抗病毒的對照孔(組織對照)。然后將免疫抗原性病毒反滴定。所有的試驗板置于含5%CO2的培養(yǎng)箱中于35℃培育5～7天。當病毒對照孔顯示70%～100%CPE(包括合胞體)時，觀察所有的孔。與病毒對照孔中的CPE比較，在測定每組一式4份的最后孔中抗病毒的最終濃度顯示＜50%CPE之后，計算半數(shù)有效濃度(IC30)。每個試驗化合物計算的ED30值列在表5中。
實施例10抗皰疹單純病毒(HSV)活性體內(nèi)抗眼部培養(yǎng)物的HSV-1病毒的局部活性用新西蘭白兔作實驗，至少在接種病毒前2天，訓(xùn)養(yǎng)在實驗籠內(nèi)，使其適應(yīng)實驗籠內(nèi)的各種裝置和條件。在適應(yīng)期之后，對這些動物作裂隙燈眼部檢查，淘汰所有的原來就存在的眼前節(jié)缺陷的白兔。然后，給白兔雙眼局部接種含有HSV-1病毒McKrae株的最低必需培養(yǎng)基(MEM.Gibco)80μl，病毒量為每毫升105蝕斑形成單位(105pfu/ml);接種后需按摩眼睛30秒鐘，然后將動物放回實驗籠中，每籠1只白兔。
接種病毒后(PI)的第4天，用裂隙燈顯微鏡檢查白兔雙眼。對眼角膜上皮細胞、虹膜和結(jié)膜病變的嚴重程度，用0+到4+遞增的記分作分級記錄。檢查后將白兔分為4組，每組5只均存在眼角膜、基質(zhì)和結(jié)膜損傷。分組后立即開始作局部治療試驗。治療分組包括第1組白兔5只，用Y-1作局部治療，藥物濃度為6.25μg/50μl，5次/天，共4天。
第2組白兔5只，用Y-1作局部治療，藥物濃度為12.5μg/50μl，5次/天，共4天。
第3組白兔5只，用Y-1作局部治療，藥物濃度為18.75μg/50μl，5次/天，共4天。
第4組白兔5只，用安慰劑(無菌水)治療，5次/天，共5天。
對Y-1遞增劑量濃度的耐受性研究，是基于其90%有效量(ED90)濃度，該ED90濃度是由病毒得量或病毒的細胞致病作用測定所決定。第1組白兔接受含有6.25μg/50μl(即1/2ED90濃度)Y-1局部滴眼治療;第2組白兔接受含有12.5μg/50μl(即為ED90濃度)Y-1局部滴眼治療;第3組白兔接受18.75μg/50μl(即1.5倍ED90濃度)Y-1滴眼治療。Y-1劑量均配制在50μl容量中(標準的滴眼劑)，得到包含上述的濃度。
接種病毒后(PI)第4天，用0-19μgY-1(在50μl內(nèi))開始局部治療，治療持續(xù)到病毒接種后第7天。從接種病毒后第3天到第7天，每天都要對所有的動物作眼裂隙燈檢查，每天記錄HSV-1病毒誘發(fā)的眼病變程度。
此外，在病毒感染第0天(接種前)，第3天，第5天和第7天，對所有動物作眼部取樣檢查，看是否存在感染的HSV-1病毒。簡而言之，用棉拭子輕擦眼下部和上部的結(jié)膜囊，取得淚膜，并將此棉拭子在動物鼻穹窿內(nèi)放置10秒鐘。然后分別將此棉拭子在Hank氏緩沖鹽水(NBSS，Gibco實驗室)中浸洗，按50μl一份病毒-HBSS浸出液，將此病毒在事例的HFF細胞單層上吸附5分鐘。此吸附病毒后的單層細胞加入最低必需培養(yǎng)基(MEM;Gibco實驗室)使成水合物，37℃培養(yǎng)，每天觀察，持續(xù)2周，檢查是否出現(xiàn)與HSV感染相一致的細胞致病作用(HSVCPE)。對于未出現(xiàn)HSVCPE的培養(yǎng)物作細胞盲(目)傳(代)，以確證是否是病毒陰性。
接種病毒后第7天活殺動物，取出眼角膜上皮，HSV病毒在HFF單層細胞上培養(yǎng)得到。對眼角膜上皮作共培養(yǎng)，每天用反轉(zhuǎn)的光學(xué)顯微鏡檢查，對未出現(xiàn)HSVCPE的培養(yǎng)物作盲傳培養(yǎng)，以確證是否是病毒陰性。
用于作單一藥劑治療的3種Y-1濃度的臨床效果與用安慰劑的結(jié)果相比較，在用Y-1各制劑作局部治療的過程中和治療完成之后，對其治愈病毒損傷的效果作相互比較，并與用安慰劑治療的結(jié)果相比較，如圖33(A-D)所示。
實施例11對流感A病毒活性的抑制作用對KY類化合物抗流感A病毒活性的評價方法同實施例9所述，不同是在體外以流感病毒(臺灣A株)感染MDCK細胞(腎細胞系)。
實施例12對人免疫缺損病毒(HIV)誘發(fā)的細胞事例的抑制作用將人CD4+指示細胞(VB)和慢性感染的H9細胞保存在RPMI-1640培養(yǎng)基中，在含有7%CO2的調(diào)濕培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基中補加有5%胎牛血清、青霉素100單位/ml和鏈霉素100μg/ml。所用的HIV病毒株是HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ株(從國家衛(wèi)生研究所(Bethesda，MD)獲得)。
為作細胞融合抑制測定，選用的一個KY類化合物(1mg/ml，在PBS中)用一塊96孔園底培養(yǎng)板，在1∶2和1∶28之間作序列稀釋。然后將此稀釋的KY化合物移入另一塊96孔平底培養(yǎng)板。再將25μg慢性感染的H9細胞(2×106個細胞/ml)或25μg以HIV病毒RF-Ⅱ株慢性感染的細胞加入每個孔內(nèi)，37℃培養(yǎng)45分鐘，然后每孔加入25μl VB細胞(約5×104個細胞)，此細胞和病毒分離體在調(diào)濕培養(yǎng)箱內(nèi)，在含有5%CO2的空氣中培養(yǎng)18小時。合胞體形成的情況在相差顯微鏡下觀察記分，并記錄使合胞體形成完全抑制的KY化合物的濃度(ED100)。結(jié)果見表7。
實施例13局部給藥對生殖器HSV感染的治療效果A.病毒和病毒接種HSV-2病毒MS株用于感染實驗動物。雌性Hartley品系豚鼠(Charles River飼養(yǎng)實驗室，Kingston，紐約)體重250-300g，用棉拭子擦去陰道內(nèi)分泌物后1小時，在陰道內(nèi)接種HSV-2病毒其量為2.0×105蝕斑形成單位。
B.豚鼠的治療在第一項研究中，對每組10只豚鼠進行局部治療，(0.1ml藥物用于陰道內(nèi)，0.1ml藥物用于外生殖器皮膚)，從接種HSV-2病毒后6小時或48小時開始，每天治療3次(約每8小時一次)，共7天。3組未接種感染的動物也用同樣的方式治療，用于測定有無皮膚刺激作用。
在第二項研究中，每組8-10只動物，在接種病毒后6小時或24小時開始治療，用2%或6%的KY-1或Y-1的局部治療制劑，每天治療3次，(如表8B所示)。KY-1或Y-1制劑的配制方法是，將此化合物溶于1.5%甲基纖維素溶液，使化合物的最后濃度為2%或5%(重量/重量)。對照動物(10只)不給任何治療或用安慰劑(1.5%甲基纖維素溶液)治療。
C.樣品收集和病毒測定為了測定藥物治療對陰道內(nèi)病毒復(fù)制的影響，在HSV病毒接種后的第1、3、5、7天和10天，用棉拭子取陰道分泌物，浸入含有2.0ml培養(yǎng)基的小試管內(nèi)，棉拭子在試管內(nèi)攪洗后，在-70℃將此培養(yǎng)基冷凍保存，直至用于HSV-2病毒滴定。當全部樣品收集完成后，將它們解凍，并作序列稀釋，用兔腎細胞以微滴細胞致病作用測定法，測定HSV-2病毒的滴度。
D.效果評價為了測定藥物治療對外生殖器損傷的形成和擴展的影響，在感染初期的全過程內(nèi)(19-21天)，對外生殖器損傷的嚴重程度用0-5+分級記分，損傷記分-天數(shù)曲線面積和病毒滴度-天數(shù)曲線下的面積，和其損傷記分峰值和病毒滴度峰值，在未治療與用安慰劑治療動物之間或在用安慰劑治療與藥物治療動物之間，用Mann-WhitneyU極差總和(Urangesum)測定進行比較。p值等于或小于0.05表示二者有顯著性差異。對此結(jié)果參照表10和表11，在本文上述第Ⅳ部分進行了討論。
動物在接種病毒后，每天對其是否存在損傷以及損傷嚴重程度進行記分，持續(xù)19天(按0-5+分記分)。將損傷記分制作成表，以每天損傷記分對時間(天)曲線下的面積和觀察到的操作記分峰值來表示。見表11提供的數(shù)據(jù)。在試驗中，對8只動物給藥一個已知的抗病毒劑無環(huán)鳥苷(ACV)，藥物配制成5%的濃度，作為陽性對照。
實施例14對HSV-1病毒與Vero細胞結(jié)合的抑制作用如實施例5中所述，Vero細胞保存在RPMI-1640培養(yǎng)基中。將細胞培養(yǎng)過夜，進行對數(shù)期倍增之后，吸出此培養(yǎng)基，以100μl實驗培養(yǎng)基代替，此培養(yǎng)基含有2%胎牛血清(FCS)，由50μl對照液或藥物溶液，以及50μl H3標記的HSV-1病毒液組成，藥物的最后為10μg/ml，病毒的含量為大約3個蝕斑形成單位(PFU)/每個細胞，即6×105PFU/孔。細胞在實驗培養(yǎng)基內(nèi)分別培養(yǎng)5、30、60、120和240分鐘后，將細胞從懸液中吸出，用PBS洗2次，測定結(jié)合在細胞上的病毒量(cpm3H)。結(jié)果見圖30，圖中病毒結(jié)合對照以實心園點表示，藥物抑制病毒結(jié)合以實心方格表示。
實施例15藥物與病毒接觸對HSV抑制的影響Vero細胞保存在RPMI-1640培養(yǎng)基中(如上所述)。將細胞培養(yǎng)過夜，進行對數(shù)期倍增后，吸出此保存培養(yǎng)基，以100μl含有2%胎牛血清的培養(yǎng)基代替，對化合物KY-1作序列稀釋，將50μl濃度在0.625μg/ml和10μg/ml之間的藥物稀釋液加入培養(yǎng)板第一組，并同時加入50μl HSV-1病毒懸液，使每孔含有5×106PFU。細胞在37℃培養(yǎng)2小時，然后用PBS洗滌細胞，并測定病毒蝕斑的數(shù)目，同實施例6所述。
在第二組細胞孔內(nèi)，先將序列稀釋的藥物加至細胞，然后加入HSV-1病毒，細胞在病毒存在下于37℃培養(yǎng)2小時。洗滌細胞以除去游離的藥物之后，加入病毒懸液，每孔含5×106PFU。將此細胞在37℃培養(yǎng)2小時，然后用PBS洗滌細胞后，測定病毒蝕斑數(shù)目，方法如實施例6所述。
在第三組細胞孔內(nèi)，將100μl病毒懸液加至細胞，每孔含5×106PFU，將細胞在37℃培養(yǎng)2小時，然后用PBS洗滌細胞以除去未結(jié)合的病毒。對化合物KY-1作序列稀釋，將濃度在0.625μg/ml和10μg/ml之間的藥物100μl加至細胞。在存在藥物的情況下，細胞在37℃培養(yǎng)2小時，然后用PBS洗滌細胞，再如上所述測定病毒蝕斑的數(shù)目。
將上述每種藥物處理方法中所測定的病毒蝕斑數(shù)目，以未作藥物處理的對照組病毒蝕斑數(shù)目的百分數(shù)來表示，作圖如圖31。實心園點表示細胞同時與藥物和病毒接觸。實心方格表示在加入病毒之前，細胞和藥物一起作預(yù)培養(yǎng)，空心方格表示在加入藥物之前，細胞和病毒一起作預(yù)培養(yǎng)。
實施例16KY類化合物引起的HSV-1病毒的失活經(jīng)純化的HSV-1病毒懸液培養(yǎng)在含有2%FCS、青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中(Gibco實驗室)。將對照溶液，KY-1或KY-217溶液加入等分的病毒懸液中，使藥物的最后濃度為10μg/ml，病毒顆粒最后濃度為6×106或6×105PFU/ml。將此懸液在37℃培養(yǎng)1小時，然后按10倍稀釋法作序列稀釋，使最后藥物濃度為10、100、10-1、10-2、10-3，和10-4μg/ml。再將此序列稀釋的懸液顆粒加至Vero細胞，培養(yǎng)2小時(同實施例6所述)，48小時后測定細胞的病毒蝕斑。在2塊培養(yǎng)板上，對每塊板上的每個病毒濃度和每個藥物濃度，計算細胞病毒蝕斑的數(shù)目，見表9所示。
實施例17KY類化合物與HSV病毒蛋白質(zhì)的結(jié)合A.化合物KY與HSV病毒蛋白質(zhì)的結(jié)合上述HSV-1和HSV-2病毒懸液，濃度都大約為5×107PFU/ml，加入5×105cpm14C標記的化合物KY-1(50μg/ml)，在37℃培養(yǎng)2小時。將每份病毒懸液分成二等份，以0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)作成溶液，含有或不含有1%巰基乙醇。四個樣品溶液在8.5%聚丙烯酰胺凝膠上分級分離，然后按照標準的程序通過自動放射照術(shù)使凝膠顯影。四個樣品的自動放射顯影照片見圖32A，對于HSV-1病毒譜帶，A帶含有巰基乙醇，B帶不含巰基乙醇，對于HSV-2病毒譜帶，D帶含有巰基乙醇，E帶不含巰基乙醇，C帶為標志蛋白質(zhì)。
B.結(jié)合蛋白質(zhì)的鑒定如上所述，HSV-1和HSV-2病毒懸液用SDS作成溶液，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)使之分級分離，每個樣品一式三份作電泳分離，相當于圖32B中譜帶D、B和C，對每條譜帶的二塊凝膠用免疫印跡技術(shù)進行分析，方法如下首先使譜帶D、B和C的凝膠分別與特異性抗HSV病毒糖蛋白gD、gB、和gC的小鼠單克隆抗體反應(yīng)。這些單克隆抗體是自Alabama大學(xué)S.Chatterjee博士處得到。然后將這些凝膠與堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠抗體一起培育，以便標記每條譜帶中的糖蛋白。帶有結(jié)合抗體的糖蛋白，可按標準的方法進行鑒定，即通過在有氮蘭四唑和溴氯吲哚磷酸鹽存在時與H2O2反應(yīng)的方法來鑒定。結(jié)果如圖32B所示。
實施例18組合藥物對HSV病毒的抑制作用A.對HSV-1病毒的抑制作用如實施例7中所述，HSV-1病毒顆粒是獲自感染的赫拉細胞，在24孔的多孔培養(yǎng)板上，每個孔培養(yǎng)1×105Vero細胞，每孔加有1ml RPMI-1640培養(yǎng)基，并含有5%FCS、青霉素和鏈霉素以及0.1%甲基纖維素(15cps)。在第二天，移去培養(yǎng)基后，將按10倍稀釋法序列稀釋的病毒100μl，一式二份加入細胞孔內(nèi)，再分別向Vero細胞培養(yǎng)孔中加入(i)僅加入某一特定濃度的GL-288(最多至50μg/ml)，(ii)僅加入某一特定濃度的無環(huán)鳥苷(最多至50μg/ml)和25μg/ml GL-288;或者(iv)某一特定濃度的無環(huán)鳥苷(最多至50μg/ml)和50μg/ml GL-288。
于37℃培養(yǎng)2小時之后，移去病毒，在細胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入0.5ml含有2%FCS和青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基甲基纖維素(4Kcps)。二天后，移去此培養(yǎng)基。用0.8%結(jié)晶紫的50%乙醇溶液對細胞染色。計數(shù)所形成的病毒蝕斑數(shù)目，從稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。
如圖34A所示，病毒得量的減少，是化合物濃度的函數(shù)(隨藥物濃度增加，病毒得量減少)。
B.對HSV-2病毒的抑制作用如實施例7中所述，HSV-2病毒顆粒是獲自感染的赫拉細胞。同上文A中所述，Vero細胞用只加有GL-288的病毒顆粒序列稀釋液感染，或用只加有無環(huán)鳥苷的病毒稀釋液感染，或者用加入無環(huán)鳥苷和GL-288的病毒稀釋液感染。于37℃培養(yǎng)2小時之后，移去病毒液，在細胞培養(yǎng)孔中加入0.5ml含有2%FCS和青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中的甲基纖維素(4Kcps)。二天后，移去此培養(yǎng)基，細胞用0.8%結(jié)晶紫的50%乙醇溶液染色。計數(shù)所形成的病毒蝕斑數(shù)目，從稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。
如圖34B所示，病毒得量的減少是化合物濃度的函數(shù)。
實施例19對HSV病毒活性的抑制作用細胞致病作用Vero細胞保存在加有5%胎牛血清、青霉素100單位/ml、鏈霉素100μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在含有7%CO2的調(diào)濕培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃培養(yǎng)。試驗用HSV病毒是HSV-1(Kos-1)株和HSV-2(333)株。
化合物Y-1局部用制劑的制備是將Y-1溶于K-Y凝膠中(Johnson&Johnson)，制成5%、10%、15%、和20%(重量/重量)的藥物濃度。然后，將各Y-1制劑在含有2%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中溶解和稀釋。
在一塊96孔的微滴培養(yǎng)板上，每個孔加入0.2ml含有5%FCS和0.1%甲基纖維素(15 cps)和RPMI-1640培養(yǎng)基，將1×105Vero細胞置于每個孔中培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜，使細胞作對數(shù)期倍增之后，吸去培養(yǎng)基，以100μl含有下列成分的RPMI-1640培養(yǎng)基代替2%FCS、50μl對照液或藥物溶液以及50μl病毒HSV-1或HSV-2，藥物的最后濃度分別為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml，病毒的含量大約為3PFU/細胞，即6×105PFU/孔。
細胞在37℃培養(yǎng)24小時，在此時間內(nèi)，細胞致病作用明顯可見。未受病毒感染時，細胞形成均勻的成纖維細胞單層。受病毒感染后，培養(yǎng)細胞變成園形的細胞懸液，隨后細胞凝集，其外觀很容易與正常的成纖維細胞區(qū)分。同時平行作一組未接種病毒的細胞，作為對Vero細胞的細胞毒性對照。單獨使用K-Y凝膠未見任何細胞毒性。試驗結(jié)果如表12所示，表中“+”表示細胞致病作用完全抑制，“-”表示細胞致病作用全未抑制。
實施例20用K-Y凝膠配制的Y-1制劑對HIV病毒誘發(fā)的細胞融合的抑制作用將人CD4+指示細胞(VB)和慢性感染的H9細胞細胞保存在加有5%胎牛血清、100單位/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在含有7%CO2的調(diào)濕培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃培養(yǎng)。所用的HIV病毒是HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ株，從國立衛(wèi)生研究所(Bethesda，MD)獲得。
化合物Y-1局部用制劑的制備是將Y-1溶解于K-Y凝膠(Johnson&Johnson)中，制成5%、10%、15%和20%(重量/重量)的藥物濃度。然后，將各Y-1制劑溶于PBS中，使Y-1的最后濃度為1mg/ml。
為了作細胞融合測定，將各Y-1組合物序列稀釋液移入一塊96孔平底培養(yǎng)板中。再向每個孔加入25μl慢性感染的H9細胞(2×106細胞/ml)，或者加入25μl被RF-Ⅱ株HIV病毒慢性感染的細胞，于37℃培養(yǎng)45分鐘。然后向每個孔加入25μlVB細胞(約5×104細胞)，并且此細胞和病毒分離體在含有5%CO2的濕潤空氣培養(yǎng)箱內(nèi)，共存培養(yǎng)18小時。合胞體形成的程度在相差顯微鏡下觀察記分。合胞體形成完全抑制時記“4+”。未見合胞體形成記“-”。試驗結(jié)果如表13所示。
盡管本發(fā)明已對較好的化合物和應(yīng)用該化合物抑制病毒的實驗方法作了敘述，但可以在不背離本發(fā)明的情況下進行各種修正和改變。
權(quán)利要求
1.抑制包膜病毒感染細胞的方法，該方法包括給感染部位施用治療上有效劑量的衍生的克力克斯(n)芳烴化合物，該化合物在橋鍵連接的環(huán)位置的間位環(huán)位置上帶有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團的極性取代基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中化合物(n)中的亞單元數(shù)目為4～10。
3.權(quán)利要求1的方法，其中克力克斯(n)芳烴化合物部分地被氧化。
4.權(quán)利要求1的方法，其中克力克斯(n)芳烴化合物具有下式的一般結(jié)構(gòu)， 其中n=4、6或8;R1為OH或=O或其混合體;R2為帶有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團的極性取代基;R4為＞CH2或≥CH，或其混合體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中R2為(CH2)mR2′，這里m=1-3，R2′為磺酸衍生物基團。
6.權(quán)利要求5的方法，其中磺酸衍生物基團為SO3R或SO2NRR′，R和R′為低級烷基。
7.權(quán)利要求4的方法，其中R2為(CH2)mR2′，這里m=1-3，R2′為亞磺酸衍生物基團。
8.權(quán)利要求7的方法，其中亞磺酸衍生物基團為SO2R或S(=O)NRR′，R和R′為低級烷基。
9.權(quán)利要求4的方法，其中R2為(CH2)m-R2′，這里m=0-3，R2′為羧酸衍生物基團。
10.權(quán)利要求9的方法，其中羧酸衍生物基團為CO2R或C(O)NRR′，這里R和R′為低級烷基。
11.權(quán)利要求4的方法，其中R2為(CH2)m-R2′，這里m=0-3，R2′為膦酸衍生物基團。
12.權(quán)利要求11的方法，其中膦酸衍生物基團為PO(OR)2，PO(OH)(OR)，PO(OR)(NRR′)，PO(NRR′)2，這里R和R′各自為H或低級烷基。
13.權(quán)利要求1所述的方法，用于治療HIV、RSV、HSV-1或HSV-2病毒感染，其中化合物為口服給藥。
14.權(quán)利要求1所述的方法，用于治療HIV，RSV，HSV-1或HSV-2病毒感染，其中化合物為靜脈內(nèi)給藥。
15.權(quán)利要求1所述用于口服或非胃腸道給藥的方法，該方法還包括給受者施用有效量的硫酸魚精蛋白，以抑制克力克斯(n)芳烴化合物的抗凝血作用。
16.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括給受者施用抗病毒的核苷類似物。
17.抑制經(jīng)性傳播的包膜病毒感染的方法，該方法包括對可能的性接觸區(qū)域局部給予含有預(yù)防有效量的大環(huán)化合物的潤滑凝膠劑組合物，該大環(huán)化合物由通過連接環(huán)的橋鍵連接的芳環(huán)亞單元構(gòu)成，結(jié)果形成了構(gòu)成大環(huán)骨架的連接原子的連續(xù)鏈，并且在該大環(huán)化合物芳基亞單元的非骨架原子上還含有帶負電荷的取代基。
18.權(quán)利要求17的方法，其中組合物與物理障礙類型器具一起應(yīng)用。
19.權(quán)利要求17的方法，其中化合物具有以下形式 其中n=4、6或8;R1為OH或=O，烷基或芳基醚、酯、酸、或其混合體;R2為帶有末端負電荷取代基的極性取代基，末端負電荷取代基選自磺酸衍生物基團、亞磺酸衍生物基團、羧酸衍生物基團和膦酸衍生物基團;R4為＞CH2或≥CH，或其混合體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中R2基團中至少一個為=O。
21.權(quán)利要求17的方法，其中包膜病毒選自肝炎δ病毒、肝炎B病毒、肝炎C病毒、乳頭瘤病毒、HSV-1、HSV-2、HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述的病毒選自肝炎δ病毒、肝炎B病毒和肝炎C病毒。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述的病毒選自HSV-1和HSV-2。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述的病毒選自HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ。
25.具有下式結(jié)構(gòu)的克力克斯(n)芳烴化合物， 其中n=4～10;R1為OH或=O，這里克力克斯(n)芳烴化合物中至少一個R1基團為=O;R2為帶有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團的極性取代基;R4為＞CH2或≥CH，或其混合體。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中R2為(CH2)mR2′，這里m=1-3，R2′為SO3R或SO2NR′R″，其中R，R′和R″各自為H或低級烷基。
27.權(quán)利要求25的化合物，其中R2為(CH2)m-R2′，這里m=0～3，R2′為CO2R′或C(O)NR′R″，這里R，R′和R″各自為H或低級烷基。
28.權(quán)利要求25的化合物，其中R2為(CH2)m-R2′，這里m=0～3，R2′為PO(OR)2或PO(OH)(OR)，這里R為H或低級烷基。
29.具有下式結(jié)構(gòu)的克力克斯(n)芳烴化合物， 其中n=4～10;R1為OH;R2為帶有末端羧酸衍生物或亞磺酸衍生物基團的極性取代基;R4為＞CH2或≥CH或其混合體。
30.抑制包膜病毒感染細胞的藥物組合物，包括給感染部位施用治療上有效劑量的衍生的克力克斯(n)芳烴化合物，該化合物在橋鍵連接的環(huán)位置的間位環(huán)位置上帶有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團的極性取代基。
31.抑制經(jīng)性傳播的包膜病毒感染的藥用組合物，該組合物包括衍生的克力克斯(n)芳烴化合物，該化合物在橋鍵連接的環(huán)位置的間位環(huán)位置上帶有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亞磺酸衍生物或磺酸衍生物基團的極性取代基。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中包膜病毒選自肝炎δ病毒、肝炎B病毒、肝炎C病毒、乳頭瘤病毒、HSV-1、HSV-2、HIV-1、HIV-2、HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ。
33.用于抑制經(jīng)性傳播的包膜病毒感染的物理障礙類型器具，它包括物理障礙類型器具與由載體和溶于載體中的大環(huán)化合物組成的組合物組合應(yīng)用，所述大環(huán)化合物是通過連接環(huán)的橋鍵連接的芳環(huán)亞單元構(gòu)成的，結(jié)果形成了構(gòu)成大環(huán)骨架的連接原子的連續(xù)鏈，并且在該大環(huán)化合物芳基亞單元的非骨架原子上還含有帶負電荷的取代基。
34.權(quán)利要求33的器具，其中該器具為陰莖套、隔膜或子宮頸海綿狀物。
全文摘要
抑制包膜病毒所致細胞感染的方法，即給感染部位施用治療有效量的衍生的克力克斯(n)芳烴化合物，在其環(huán)上連接橋鍵的間位帶有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物或磺酸衍生物基團(包括在體內(nèi)可解離的酯和酰胺)的極性取代基。本發(fā)明化合物可口服或局部給藥，如治療皰疹病毒。本發(fā)明還包括抑制經(jīng)性傳播的包膜病毒感染的方法，即給性接觸的可能區(qū)域局部應(yīng)用含有預(yù)防有效量的上述大環(huán)化合物的組合物。
文檔編號A61K31/19GK1100302SQ9410119
公開日1995年3月22日 申請日期1994年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月4日
發(fā)明者黃國茂, 漆又毛, 劉素瑩, 蔡惠林, 陳正 申請人:基因?qū)嶒炇壹夹g(shù)有限公司