專利名稱：新的抗腫瘤抗生素的制作方法
本申請描述的主題與1990年1月12日提交的美國專利申請序號464，046(CT-1970)中所公開的主題有關。
已知可通過發(fā)酵多種類型的微生物來生產(chǎn)抗生素。某些生物學活性發(fā)色團是以它們與蛋白質部分結合形成色蛋白復合物這樣一種方式產(chǎn)生的。“Neocarzinostatinchromophore”，Napier，M.A.，etal.Biochem.Biophys，Res.Commun.89，635-642(1979)和“AuromomycinChromophore，Suzuki，H.，etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.94，255-261(1980)中描述了已研究過的色蛋白?？鼓[瘤抗生素C-1027便是衍生于球孢鏈霉菌C-1027(StreptomycesglobisporusC-1027)的發(fā)色團部分。T，Otani等人在“IsolationandCharacteriza-tionofNon-proteinChromophoreanditsDegradationProductfromAntibioticC-1027”，JournalofAntibiotics，44，564-568(1991)中描述了該抗生素的分離，特性及生物學活性。
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)的菌株得到的化合物BMY-46164，其組合物和其使用方法，以及其分離方法。應注意的是，申請人提到的“化合物”包括該化合物的所有醫(yī)藥上可接受的衍生物。
基于高分辨率快原子轟擊質譜(FABMS)的分析數(shù)據(jù)，可以相信該新的發(fā)酵產(chǎn)物分子式為C40H43N2O12Cl，分子量為778。其為無色的、有下列性質的非晶形固體。
該發(fā)酵產(chǎn)品為非蛋白質、非共價結合的發(fā)色團，據(jù)信該產(chǎn)物通過發(fā)色團與馬杜拉放線菌屬的菌株產(chǎn)生的蛋白質相結合。
已發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵產(chǎn)物具有對抗多種革蘭氏陽性菌如糞腸球菌(En-terococcusfaecalis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusau-reus)及枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)的抗微生物活性。它還具有抗腫瘤模型如P388白血病的活性。
可在深層通氣條件下，在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵BMY-46164生產(chǎn)菌株或其突變體，得到新的抗生素，直到由所說的微生物在所說的培養(yǎng)基中產(chǎn)生實質量的BMY-46164。發(fā)酵后，從培養(yǎng)基中回收基本上沒有共產(chǎn)生之物質的BMY-46164。
產(chǎn)生本發(fā)明化合物的馬杜拉放線菌屬的Q473-8菌株的生物學純培養(yǎng)物已寄存在Rockville，MD美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并給予保藏登記號ATCC53806。
該菌株的培養(yǎng)物也作為親液培養(yǎng)物保存在Wallingford，Conn-ecticut的Bristol-MyersSquibbCompanyPharmaceuticalResearchInstituteActinomycetesCultureCollection。
在本申請申請之日前即已完成了ATCC寄存，并已完全符合35U.S.C.112條款的要求。


圖1顯示BMY-46164在甲醇中的紫外光譜。
圖2顯示BMY-46164(KBr壓片)的紅外光譜。
圖3顯示BMY-46164在d6-DMSO中的質子NMR譜。
圖4顯示BMY-46164在d6-DMSO中的碳NMR譜。
稱為化合物BMY-46164的發(fā)酵產(chǎn)物具有經(jīng)驗式C40H43N2O12Cl，和778的分子量。
生產(chǎn)BMY-46164的一個優(yōu)選方法包括下列步驟(1)發(fā)酵放線菌的適當菌株，(2)提取蛋白質類發(fā)酵產(chǎn)物，(3)使步驟(2)的產(chǎn)物變性，并(4) 分離經(jīng)驗式為C40H43N2O12Cl，分子量為778的化合物。
這種無色的非晶形固體物的化學結構尚未確定，但已知其具有下列性質質譜KratosMS50TC質譜儀。FABMS778.2527。另外在294.1339和149.0603處有優(yōu)勢的碎片離子。
紫外光譜Hewlett Packard 8452A Diode Array 光譜儀;濃度1.0mg/100ml甲醇。中性溶液給出下列最大吸光值λnmmax(E1%1cm)278(635)。
紅外光譜Perkin-Elmer 1800 FTIR光譜儀，KBr壓片，cm-13424，3076，2934，2838，2170，1640，1578，1520，1490，1462，1424，1376，1292，1248，1184，1156，1112，1072，1046，952，900，880，832，810，754，682，666，648，576，524.
500MHz1H-NMRBruker Model AM-500光譜儀。雙重碳一質子探頭，5mm。溶劑 d6-DMSO。觀察到的化學位移(ppm)是9.18(br.5，1H)，8.09(dd，1H)，7.40(d，1H)，7.25(d，1H)，6.97(d，1H)，6.81(d，1H)，6.58(d，1H)，6.37(t，1H)，5.41(s，1H)，5.37(dd，1H)，5.27(m，1H)，5.13(br.s，1H)，4.91(s，1H)，4.89(m，1H)，4.65(d，1H)，4.22(br.d，1H)，4.13(ddd，1H)，3.94(m，1H)，3.80(dd，1H)，3.54(s，3H)，3.46(dd，1H)，3.21(d，1H)，3.12(s，3H)，2.94(ddd，1H)，2.73(m，1H)，2.71(dd，1H)，2.58(dd，1H)，2.31(dd，1H)，2.19(s，3H)，2.10(s，3H)，1.26(s，3H).
125 MHz13C NMRBruker Model AM-500光譜儀。質子去偶光譜。雙重碳一質子探頭，5mm。溶劑 d6-DMSO。觀察到的化學位移(ppm)是168.4，168.1，153.3，152.8，139.3，138.5，133.0，131.4，131.3，131.0，130.8，126.8，124.7，124.3，122.5，122.1，121.0，109.2，97.5，95.7，94.3，94.2，93.3，90.1，74.0，73.2，70.9，69.8，69.6，66.3，62.5，55.4，54.4，52.3，43.2，37.5，33.6，22.7，19.5，16.1.
在本文所述的所有檢測中，均使用下列參數(shù)溶劑在使用前未經(jīng)重蒸餾。甲醇、乙酸乙酯、氯仿、己烷、二乙醚、二氯甲烷和乙腈均為ACS級試劑。HPLC使用的水是指經(jīng)Barns-teadNanopureⅡ系統(tǒng)處理的去離子水。HPLC使用的甲醇和乙腈是B&JBrandHPLC級溶劑。醋酸銨是FisherHPLC級的。DEAE纖維素是Schleicher和Schuell陰離子交換纖維素(批號2932和2893)。Tris緩沖液〔三(羥甲基)氨基甲烷〕是酶級超純試劑(BethesdaResearchLaboratories)，0.05M，pH7.4。代卡利特(Dicalite)是快速高級助濾劑(GrefcoMinerals)。
正相薄層層析(TLC)在硅膠60，F(xiàn)254平板(EMReagents，cat.＃5765，5×10cm，0.25mm厚)上進行。用WhatmanMKC18平板(cat.＃4803-110，0.2mm厚)完成反相TLC。平板在帶蓋和含有10ml洗脫液的Whatman圓筒形缸中展層。用254nm紫外光觀察作為UV驟冷帶的發(fā)色團。
在硅膠60，F(xiàn)254平板(EMReagents，cat.＃5766，20×20cm，2mm厚)上進行制備性薄層層析(PLC)。平板在帶蓋和含有100ml洗脫液的玻璃罐中展層。
真空液相層析(VLC)裝置由Buchner漏斗(Kontes，Art.＃K-954100)構成，其包括一個密封的燒結玻璃皿(M孔隙度)、一個連接真空的側面軟管和一個接通接收瓶的低位24/40接頭。通過在真空下抽吸起始洗脫液平衡漏斗以形成緊密充填的5cm吸附床高度。將樣品預吸附到吸附劑上并作為在起始洗脫液中形成的漿液加入漏斗中。使用預定體積有漸增極性的洗脫液進行梯度洗脫。然后分別吸干漏斗內容物。在旋轉蒸發(fā)器上濃縮各部分，并基于體外生物學檢測結果及HPLC-UV和TLC分析結果合并之。
代卡利特層析是指在硅藻土上進行的吸附層析。將樣品溶解于氯仿-甲醇(2∶1)中并吸附到代卡利特硅藻土上。將所得粉末加在己烷中制成漿液并裝入燒結玻璃VLC漏斗中。通過硅藻土(代卡利特)將預定體積的溶劑推入已在旋轉蒸發(fā)器上濃縮過的圓底燒瓶中。
排阻層析裝置由下列部分構成裝有抗溶劑特弗隆(Teflon)端板的Glenco柱(2.5 I.D.X100cm);FluidMetering，Inc.FMI實驗室泵(RP-G150型);Glenco玻璃儲存器(500ml);Isco328型分級收集器。用在洗脫溶劑中預溶脹的SephadexLH-20(Pharmacia)漿液裝柱。在用實驗室泵控制流速的條件下，通過柱向下放出溶劑。
在由下列部分組成的BeckmanSystemGold裝置上進行HPLC純化126型溶劑輸送組件;166p型程序可控檢測器;溶劑儲存藥盒;Altex注射器;Dynamax60°A半制備柱;正向硅膠(25cm×10mm，8微米，Si-83-111-c或25cm×21.4mm，8微米，Si-83-121-c)和反向硅膠(25cm×10mm，8微米，C18-83-211-C)。
可經(jīng)發(fā)酵放射菌的BMY-46164生產(chǎn)菌株生產(chǎn)本發(fā)明的抗菌素抗腫瘤劑。優(yōu)選的生產(chǎn)菌是從在Athens，Greece收集的土壤樣品中分離的放線菌，并定名為Q473-8菌株。如上所述，Q473-8菌株的生物學純培養(yǎng)物已保藏在ATCC。
在美國專利申請系列號464，046中詳細描述了對Q473-8菌株的分類學研究。Q473-8菌株的化學分類學資料以及形態(tài)學特征表明該生物體為馬杜拉放線菌屬的成員，其形態(tài)學和碳利用特性更接近于Actinomaduramadurae〔參見Williamsetal，“TheProkaryotes，Vol.Ⅱ”，pp.2103-17，1981(Starr，Stolp，Truper，BalowsandSchlegel，eds)〕。
為了確定Q473-8是否具有與最近提出的新的Nonomuria菌屬相一致的性質，還須進行包括甲基萘醌分析在內的其他鑒定?！矃⒁奀oodfellowetal，“BiologyofActinomycetes，1988”PP.223-38，1988(Okami，BeppuandOgawara，eds.)〕。
應明確的是，本發(fā)明不限于使用上述的特定優(yōu)選菌株或充分明確其特征的微生物。本發(fā)明特別傾向于包括可通過常規(guī)方法，如x射線照射、紫外光照射、用氮芥處理，接近噬菌體等方法產(chǎn)生的、能生產(chǎn)BMY-46164的上述微生物的其他變異體或突變體。
可在深層通氣條件下在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)馬杜拉放線菌的BMY-46164生產(chǎn)菌株，最好是Q473-8菌株或其變異體或突變體以產(chǎn)生BMY-46164。
該微生物體可生長于含有可同化之碳源如蔗糖、乳糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、蜜二糖、甘油或可溶性淀粉的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基還應含有可同化的氮源，如胨、魚粉、大豆粉、花生餅粉、棉籽粉、玉米浸泡液的濃縮液、酵母浸膏或銨鹽。必要時可加入無機鹽，如氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸鹽等。
需要時還可向培養(yǎng)基中加入銅、錳、鐵、鋅等微量元素，或將它們作為培養(yǎng)基其他成分的雜質補入培養(yǎng)基中。
可在能使生產(chǎn)菌得以充分生長的溫度下，如大約16℃至41℃的溫度下生產(chǎn)BMY-46164。較好在大約25℃至35℃，最好在大約27℃至32℃下進行發(fā)酵生產(chǎn)。培養(yǎng)基較好為中性pH。抗生素的生產(chǎn)一般進行大約4至5天。
發(fā)酵過程可在培養(yǎng)瓶或不同容量的實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐內進行。當使用罐發(fā)酵時，可通過用微生物斜面或凍干培養(yǎng)物接種小體積培養(yǎng)基在營養(yǎng)培養(yǎng)液中產(chǎn)生營養(yǎng)種子菌。
以這種方式得到活性種子菌后，可將其無菌轉移到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，以大批量產(chǎn)生BMY-46164。用于產(chǎn)生營養(yǎng)種子菌的培養(yǎng)基可以是與發(fā)酵罐所利用的培養(yǎng)基相同或不同的，只要它能使生產(chǎn)菌得到良好生長即可。發(fā)酵期間可由機械葉輪提供攪拌。必要時可加入常規(guī)消泡劑，如豬脂油或硅油。
可用常規(guī)溶劑提取及層析技術從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離BMY-46164抗生素并純化BMY-46164。亦可通過下述方法進行分離。
用代卡利特助濾劑過濾全發(fā)酵液(90升)。向濾液內加入1kgDEAE纖維素，充分混合并冷卻至4℃。過濾回收DEAE纖維素并用新鮮的冷(4℃)Tris緩沖液沖洗之。通過在6升甲醇-乙酸乙酯(1∶1)混合物中靜置1小時以提取DEAE纖維素網(wǎng)墊。過濾該提取混合物并再用乙酸乙酯(3升)沖洗所得到的纖維素網(wǎng)墊。向合并的有機提取物中加入6升冷水。分離乙酸乙酯層并在減壓下濃縮，得到1.0g粗制發(fā)色團提取物。
得到發(fā)色團提取物的另一種方法是在分配步驟中用二氯甲烷代替乙酸乙酯。為此，向一體積從提取蛋白質結合的DEAE纖維素網(wǎng)墊得到的甲醇內加入2體積冷水(4℃)和1體積二氯甲烷。在旋轉蒸發(fā)器上濃縮有機層以得到粗制發(fā)色團提取物。
使發(fā)色團提取物吸附到3.5gUniversal硅膠(63-200微米)
表1BMY-46164作為抗菌劑的效能初步MIC值(μg/ml)微生物BMY-46164青霉素糞腸球菌A2068880.25糞腸球菌A25707425糞腸球菌A2570880.5金黃色葡萄球菌A953740.06金黃色葡萄球菌/NCCLS菌株160.06金黃色葡萄球菌160.5大腸桿菌A15119>5001大腸桿菌/NCCLS菌株>5002大腸桿菌A9751>5000.25肺炎克氏桿菌A20468>50016肺炎克氏桿菌A20468>50032普通變形桿菌A21559>50032銅綠假單胞菌A9843>500>128銅綠假單胞菌A20235>50032銅綠假單胞菌/NCCLS菌株>500>128枯草芽胞桿菌A9506-A641
將5ml該營養(yǎng)培養(yǎng)物轉移到含100ml由2%葡萄糖、2%胨和0.5%碳酸鈣組成之生產(chǎn)培養(yǎng)基的500ml培養(yǎng)瓶中。再次在旋轉振蕩器(250轉/分鐘)上28℃保溫4～5天。在發(fā)酵周期的大約第4天培養(yǎng)物產(chǎn)生最大水平的BMY-46164。
實施例2在實驗室發(fā)酵罐內發(fā)酵生產(chǎn)BMY-46164為了在50升標定體積的Biolafitte發(fā)酵罐內發(fā)酵而使用兩階段營養(yǎng)培養(yǎng)基。將實施例1制得的16ml營養(yǎng)培養(yǎng)物轉移到含有400ml由2%葡萄糖、2%胨和0.5%碳酸鈣組成之第二營養(yǎng)培養(yǎng)基的2升培養(yǎng)瓶中。將該第二營養(yǎng)培養(yǎng)物在旋轉振蕩器(250轉/分鐘)28℃保溫3天。
將1200ml該營養(yǎng)培養(yǎng)物轉移到4升Vitro瓶中，然后接種于含30升由2%葡萄糖、2%胨和0.5%碳酸鈣組成之生產(chǎn)培養(yǎng)基的50升標定體積的Biolafitte發(fā)酵罐內。使微生物在下述條件下生長攪拌，250rpm;溫度，28℃;通氣，30升/分鐘;使用消泡劑(聚丙二醇2000，DowChcmical)以控制泡沫形成。在發(fā)酵周期開始后的4～5天內，BMY-46164達到最大生產(chǎn)水平。
實施例3抗菌活性研究使用下述方法將BMY-46164與氨芐青霉素相比較，以研究BMY-46164對一系列微生物的抗菌效能。結果示于表1中。
上并加入含25g Lichroprep Si 60硅膠(EM Science，Art.9390，25-40微米)的60ml VLC漏斗內。用300ml洗脫液進行氯仿-甲醇梯度洗脫。用體外檢測法檢測第3-5管中洗脫的活性。這些部分內洗脫液組成分別是含3%MeOH、5%MeOH和8%MeOH的氯仿。然后使用CHCl3-MeOH(90∶10)作展層劑的制備性薄層層析法(PLC)進一步純化這些合并的洗脫物(202mg)。
使用Dynamax半制備硅膠柱(Si-83-111-C)經(jīng)HPLC再次純化所收集的主活性帶(Rf0.37，48mg)，其中利用等容條件(CHCl，MeOH94∶6)以4ml/分鐘的速度洗脫。經(jīng)UV檢測(254nm)表明在13.3分鐘時洗脫出主峰。收集該峰并蒸發(fā)至干。將殘留物(28mg)加于第二塊MerckPLC板上。使用氯仿-乙腈(60∶40)展層。所回收的主帶(Rf0.15)量為16.5mg。
使用Dynamax半制備柱(C18-83-211-C)，以反相HPLC法進行最后的純化。在40分鐘內按20%A-80%B→40%A-60%B的次序進行梯度洗脫，其中A＝乙腈，B＝0.1M醋酸銨-甲醇(3∶1)。在30.9分鐘時洗脫出所需的發(fā)色團(11mg)并定名為BMY-46164。
從發(fā)色團粗提物中得到BMY-46164的另一個純化方法是將粗提物(12.9g)溶解于氯仿-甲醇(2∶1)中并吸附于300g代卡利特(硅藻土)上。用1升下列溶劑洗代卡利特床己烷、二乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷及甲醇。在二乙醚和乙酸乙酯中濃縮BMY-46164，兩部分合并的質量為0.6g。
將該殘留物溶解于5ml氯仿-甲醇(1∶1)中并加于用相同溶劑預溶脹的SephadexLH-20柱上。洗脫流速為1.5ml/分鐘。共收集5管。所洗脫的BMY-46164主要在占0.7柱床體積的第三管中。濃縮后，稱得該部分的重量為143mg。
使用21.4mmDynamax制備柱(Si-83-121-C)以正向HPLC法作最后的純化，其中洗脫速度為10ml/分鐘。在40分鐘內進行從氯仿-甲醇(95∶5)到氯仿-甲醇(85∶15)的梯度洗脫。檢測300nm吸光率。BMY-46164(34mg)在27.7分鐘時洗脫。
作為藥物組合物，除化合物BMY-46164和/或其酸或堿加成鹽外可含有適當量的其他成分。一般含有大約0.001-99.99%的一種或多種醫(yī)藥上可接受的賦形劑，如充填劑、載體、穩(wěn)定劑、膠凝劑、著色劑、香料等。組合物中的藥物含量一般為大約0.01%至10%，較好為大約0.17%至5%。
下列優(yōu)選的具體實施例旨在進一步舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)BMY-46164在試管中維持Q473-8菌株，并轉移到添加有CaCO3之酵母浸膏一麥芽提取物的瓊脂斜面上。該培養(yǎng)基由4.0g葡萄糖、4.0g酵母浸膏、10g麥芽提取物、1.5g碳酸鈣和15g瓊脂組成，并加蒸餾水至1升。接種菌株的瓊脂斜面在28℃上保溫5至7天。
為制備生產(chǎn)階段使用的種子菌，將斜面培養(yǎng)物的表面生長菌轉移到含100ml營養(yǎng)培養(yǎng)基(含20%葡萄糖、1%魚粉和0.5%碳酸鈣)的500ml培養(yǎng)瓶中。然后在旋轉振蕩器(250轉/分鐘)上28℃保溫3天。
使用培養(yǎng)液(Difco)以系列培養(yǎng)液稀釋法檢測BMY-46164的抗菌譜。
實施例4抗腫瘤活性研究使用小鼠動物模型檢測BMY-46164作為抗腫瘤劑的抗P388白血病性能。表2中列出對橄欖霉素A和BMY-46164作比較試驗的結果。
表2BMY-46164作為抗腫瘤劑的性能腫瘤:P388治療AWC小鼠數(shù)材料和載體MG/KG/劑量、MED.%GM存活數(shù)/總數(shù)程序或稀釋度S.T.T/CD.6D.5(30)移植量和部位1×10(6)細胞,IP橄欖霉素A0.8 IP,Q01D×5;115.0150-0.26/6BMY332720.414.51450.96/6PBSC39174 W000225 IP,Q01D×5;112.5125-2.14/4G443BMY461641014.0140-0.94/4DMSO+PBS515.51550.34/4214.01400.24/4對照10.01002.510/10
“TransplantedAnimalTumors”，Bradner，W.T.，CancerandChemotherapyVol.1，PP.221-227，1980(S.T.CrookeandA.W.Prestayko，eds.)AcademicPress中描述了用于得到表2所示數(shù)據(jù)的方法。
這些實施例舉例說明了主題化合物及其醫(yī)學上可接受的衍生物在治療宿主的細菌性感染及惡性腫瘤中的實用性。
“宿主”不僅是指體外試驗細胞和小鼠，還包括高等生物體，如哺乳動物。人被試者或病人是最優(yōu)選的試驗對象。
可將本發(fā)明的化合物或組合物通過各種途徑給予適當宿主如患有細菌性感染和/或腫瘤的病人。給藥途徑包括口服、胃腸道外給藥、局部或鼻內給藥，以及含服或滴眼等多種方式。
在不背離本發(fā)明范圍的情況下，本領域技術人員可對本發(fā)明作各種可能的改動。
權利要求
1.一種生產(chǎn)由發(fā)酵馬杜拉放線菌Q473-8菌株衍生之藥理學活性化合物的方法，該方法包括下列步驟(1)發(fā)酵適當?shù)姆啪€菌菌株，(2)提取蛋白質類發(fā)酵產(chǎn)物，(3)使步驟(2)的產(chǎn)物變性，以及(4)分離試驗式為C40H43N2O12Cl，和分子量為778的化合物。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(2)和(3)是在離子交換樹脂存在下完成的。
全文摘要
適當處理馬杜拉放線菌Q473-8菌株的某些發(fā)酵產(chǎn)物，以產(chǎn)生具有抗菌和抗腫瘤活性的化合物。
文檔編號A61K35/74GK1071950SQ9211155
公開日1993年5月12日 申請日期1992年10月20日 優(yōu)先權日1991年10月22日
發(fā)明者D·R·施羅德, S·L·金, J·M·維齊 申請人:布里斯托爾-米爾斯·斯奎布公司