專利名稱:利用剩磁測量進(jìn)行分析物檢測的方法和復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用剩磁測量對(duì)液相和固相中的分析物進(jìn)行定量和/或定性檢測的方法，以及適合于這個(gè)用途的復(fù)合物，和在分析化學(xué)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
與其他結(jié)合分析方法(如受體結(jié)合分析)一樣，定量免疫分析使測定大量物質(zhì)成為可能，這些物質(zhì)也可以是在各種不同組分的樣品中生物學(xué)相關(guān)的。但一般來說，用這些方法，在一次分析中，每個(gè)樣品只能測定一個(gè)參數(shù)。T.Chard對(duì)現(xiàn)有的各種方法作了一個(gè)概述(參見《放射免疫分析及其相關(guān)技術(shù)簡介生化及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，第四版，Elsevier科學(xué)出版社，阿姆斯特丹，1990)。所有結(jié)合分析的基本原理是，用同位素標(biāo)記或其他方法，使化合物具有高度的探測靈敏度，并結(jié)合高特異性的配體-受體反應(yīng)。
但現(xiàn)有的分析方法有以下缺點(diǎn)·對(duì)同一個(gè)樣品中多個(gè)分析物同時(shí)進(jìn)行探測的方法，是基于讓分析物結(jié)合多種放射的、熒光的或是酶標(biāo)探針。而定量測定分析物的探針是否結(jié)合一般是在下一步的分離和洗滌之后進(jìn)行的。因此，合適的不同的探針標(biāo)記的數(shù)量是很有限的。例如，用不同的放射性同位素作探針標(biāo)記時(shí)，所謂的重疊現(xiàn)象就會(huì)發(fā)生，從而導(dǎo)致各獨(dú)立信號(hào)的精度銳減。用多種酶作為探針標(biāo)記會(huì)引起可比性問題，這個(gè)障礙是由于必須研究反應(yīng)條件，以使同時(shí)檢測同一系統(tǒng)中的多個(gè)酶學(xué)反應(yīng)成為可能。
在JP3-220442A公開出版物中描述的方法中，通過測量抗體中介凝集(凝集作用)的程度的抗原滴定度測定是借助于如下方法來進(jìn)行的，即，在該公開物中公開的測定凝集磁性顆粒的大小。測定顆粒大小方法的要點(diǎn)是連接穿過靜止、沉積的試樣，并測量集聚磁性顆粒的殘留的磁通量密度。
從US-4,661,408的公開出版物已知含有由二氧化鉻與抗體偶聯(lián)構(gòu)成的超順磁性顆粒的鐵磁流體。它要求具有極短的內(nèi)稟弛豫時(shí)間的顆粒；因此，這些顆粒不能滿足剩磁測量的需要。
·這類方法的探測靈敏度受到例如基質(zhì)和探針之間非特異性相互作用，或是探針的標(biāo)記能力(低特異性活性)的限制。
·這類方法的成功的實(shí)施經(jīng)常需要一步一步地得到樣品材料(例如，先從全血中取出血清或血漿，接著用有機(jī)溶劑提取樣品，再用層析方法濃縮分析物，等等步驟)。
·為成功地實(shí)施該方法，確保結(jié)合與未結(jié)合受體或配體分離步驟的分離和洗滌是必不可少的。
·在進(jìn)行放射免疫分析時(shí)，必須使用放射性核素，而這既昂貴又不易于操作。
·在實(shí)踐中，所使用的標(biāo)記物的儲(chǔ)存常引起問題，因?yàn)樗鼈円床环€(wěn)定(如在放射性免疫分析時(shí))并因此必須經(jīng)常更換，要么因?yàn)槠漭^強(qiáng)的反應(yīng)活性而影響環(huán)境。
本發(fā)明的目的是要發(fā)現(xiàn)一種新的比上述的現(xiàn)有技術(shù)要先進(jìn)的方法和物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果將穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性(ferromagnetic)或亞鐵磁性(ferrimagnetic)物質(zhì)作為磁標(biāo)探針用于免疫分析或是結(jié)合分析，而將樣品的剩余磁化強(qiáng)度作為要被檢定的測量參數(shù)，則在液相和/或固相對(duì)分析物進(jìn)行定量的和/或定性的檢測是可行的。
以下，第一次描述了克服已知方法的缺點(diǎn)的方法按照本發(fā)明的方法基于膠體狀的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)，也即下文所說的磁標(biāo)，它與要檢測的物質(zhì)，也即下文所說的分析物--或是結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)相結(jié)合。這種磁標(biāo)與分析物或是結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)的結(jié)合物也即下文所說的磁學(xué)標(biāo)識(shí)物。術(shù)語膠體狀物質(zhì)的使用一方面說明顆?；蛭镔|(zhì)的大小尺寸和膠體一個(gè)量級(jí)，即從1納米到約1000納米，另一方面說明它們是在一種合適的分散介質(zhì)，大多數(shù)情況是以水性的中的分散相中使用的。當(dāng)然，出于提高保質(zhì)期和運(yùn)輸性能的目的，膠體狀物質(zhì)，也即下文所說的顆粒也可以干態(tài)或冷凍存在；但在實(shí)際測量時(shí)，它們一般以液相分散態(tài)存在。
本發(fā)明涉及的一個(gè)重要理論是，當(dāng)外部磁場關(guān)閉后，高鐵磁性或亞鐵磁性的膠體物質(zhì)的磁化強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系非常敏感的依賴于材料以及所用顆粒的形狀(所用顆粒材料的各向異性常數(shù))、體積和溫度。這是由于顆粒的內(nèi)稟磁化矢量的旋轉(zhuǎn)造成的。這即所謂的Neelian弛豫。如果顆粒磁化強(qiáng)度衰減的時(shí)間尺度小于測量的時(shí)間尺度，這種超順磁性就認(rèn)為是物質(zhì)內(nèi)在的。如果顆粒的Neelian弛豫時(shí)間比觀察周期長得多，這種顆粒就被稱為剩磁顆?；蚴欠€(wěn)定顆粒。如果顆粒的Neelian弛豫時(shí)間與觀察周期在同一數(shù)量級(jí)，就稱其為準(zhǔn)穩(wěn)定顆粒。
本發(fā)明涉及的另一個(gè)重要理論是，當(dāng)外部磁場關(guān)閉后，自由運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定和準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性膠體顆粒整體的磁化強(qiáng)度在測量時(shí)間尺度內(nèi)的衰減歸因于另一個(gè)機(jī)制。在這種情況下，全體膠體顆粒在包圍它們的液體中發(fā)生旋轉(zhuǎn)，從而，時(shí)間常數(shù)與顆粒(包括其外殼)的流體力學(xué)尺寸、載流體的粘滯性以及溫度有關(guān)。這些參數(shù)主要是由顆粒所處的環(huán)境決定的。這個(gè)機(jī)制被稱之為Brownian弛豫或外稟超順磁性(extrinsic superparamagnetism)。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)液相和固相的分析物的定性的和/或定量的檢測方法按以下步驟實(shí)施(i)首先用高鐵磁性或亞鐵磁性材料對(duì)結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記并形成膠體顆粒，所用的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的內(nèi)稟Neelian弛豫時(shí)間要大于測量時(shí)間，然后(ii)將這些膠體顆粒用于要檢測的樣品中，(iii)從樣品外部用一個(gè)合適強(qiáng)度的磁場對(duì)其進(jìn)行磁化，(iv)關(guān)閉外部磁場后，用磁場傳感器測量膠體顆粒的剩余磁化強(qiáng)度，由于特異性結(jié)合而產(chǎn)生的剩磁及其大小被用于分析。
在結(jié)合和未結(jié)合標(biāo)識(shí)物之間僅在特殊情況下才有可能的差別在按本發(fā)明的方法中使在液相中未結(jié)合的磁學(xué)標(biāo)識(shí)物的衰退剩磁(外稟超順磁性)的應(yīng)用成為了可能。而所有結(jié)合了磁性的標(biāo)識(shí)物顯示出了可測的剩磁，其剩磁與顆粒的材料有關(guān)。這樣，在對(duì)待測樣品的剩磁進(jìn)行測量時(shí)，只有結(jié)合了的磁學(xué)標(biāo)識(shí)物的剩磁的那部分可以被測到。這一方法，即下文所說的對(duì)結(jié)合剩磁的測量或結(jié)合剩磁測量，是基于對(duì)結(jié)合了的結(jié)構(gòu)特異性標(biāo)識(shí)物的定量檢測的。
換句話說，對(duì)分析物的檢測可以不需要昂貴的分離和洗滌步驟，因?yàn)橹挥斜环治鑫餅楂@得特異性而與結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)結(jié)合的特異性結(jié)合的穩(wěn)定的或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性的物質(zhì)才有剩磁，而同時(shí)在樣品中存在的未結(jié)合的穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性的物質(zhì)(盡管也結(jié)合著結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì))的剩磁卻在開始測量前就由于外稟超順磁性而衰減了。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)方法可以作如下改變，即讓分析物本身而不是結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)與穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性的物質(zhì)結(jié)合，就如同在競爭性的放射免疫分析中常采用的方法。當(dāng)然，結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)還是得另外加入到樣品中。
本方法亦可以用于多分析物分析，即同時(shí)直接檢測液相或固相中的多個(gè)不同分析物。要達(dá)到這個(gè)目的，必須首先對(duì)各分析物用不同的高鐵磁性或亞鐵磁性的膠體狀物質(zhì)，且這些物質(zhì)必須有足夠的可區(qū)分的矯頑磁場強(qiáng)度，進(jìn)行標(biāo)記。在磁學(xué)標(biāo)識(shí)物的結(jié)合過程中，施加一個(gè)磁場(初始磁場)使樣品中包含的所有磁學(xué)標(biāo)識(shí)物都與樣品的磁軸同向。
然后，測量樣品剩磁。進(jìn)一步的步驟是，用一個(gè)外部的反向磁場(與初始磁場反向)，其強(qiáng)度與磁標(biāo)的矯頑磁場強(qiáng)度相符，來逐步使樣品退磁。這樣，只要標(biāo)記物矯頑磁場強(qiáng)度小于外加磁場，這些標(biāo)識(shí)物總是會(huì)特異性地重新取向的。這樣，在每一步退磁之間，樣品的剩磁被再一次重新測定。
結(jié)合磁學(xué)標(biāo)識(shí)物的不同部分就可以通過在各個(gè)單個(gè)退磁步驟中對(duì)樣品剩磁的測量來量化。
這個(gè)方法使對(duì)每一樣品中多個(gè)分析物的同時(shí)檢測成為可能。
本發(fā)明所采用的方法以及該方法的各種變化可以用于生育力(fertility)，組織相容性，過敏學(xué)，傳染病學(xué)，衛(wèi)生學(xué)，遺傳學(xué)，病毒學(xué)，細(xì)菌學(xué)，毒理學(xué)，病理學(xué)，環(huán)境分析及醫(yī)學(xué)診斷。
結(jié)合剩磁的測量是用適合于這一目的的已有的測量儀器，如超導(dǎo)量子干涉器件(SQUIDs)來進(jìn)行的，這樣，首先用一個(gè)合適的磁場進(jìn)行磁化，然后在關(guān)閉磁場后，由靈感的磁場傳感器測量磁化了的結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)的剩磁或是與此有關(guān)的信號(hào)。
在測量過程中，樣品的移動(dòng)是有助于測量的，通過振動(dòng)或旋轉(zhuǎn)樣品來調(diào)制信號(hào)對(duì)測量尤其有利。這可以保證將直流測量信號(hào)轉(zhuǎn)換到一個(gè)高頻區(qū)段。
在測量中--除了上面所說的量子干涉器件(SQUIDs)外--如斜度計(jì)般鉤吊著的感應(yīng)線圈，飽和式磁力儀，高磁阻效應(yīng)傳感器，或磁阻轉(zhuǎn)換器也可以使用。
在使用那些能測量直流磁場的傳感器(如，SQUIDs、飽和式磁力儀，高磁阻效應(yīng)傳感器，或磁阻轉(zhuǎn)換器)時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行磁化后就可以測量剩磁而不移動(dòng)樣品。
一個(gè)合理的測量方案由
圖1的實(shí)施例所描述。下文的實(shí)施例也采用這樣的方案。
本發(fā)明的另一方面涉及對(duì)結(jié)合剩磁的測量所用的復(fù)合物。合適的復(fù)合物由膠體狀的懸浮物、高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)及結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物組成。
在本發(fā)明所涉及的范圍之內(nèi)，結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)是指所有與所要求研究的結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如，抗體，抗體片斷，生物素，或是與生物素能特異性結(jié)合的物質(zhì)，如卵白素或鏈霉親和素，能與受體特異性結(jié)合的激動(dòng)劑如細(xì)胞因子、淋巴因子、內(nèi)皮縮血管肽(endothelins)或它們的拮抗劑，特異性肽和蛋白質(zhì)，受體，酶，酶的底物，核苷酸，核糖核酸，脫氧核糖核酸，碳水化合物，脂蛋白等等。其中，優(yōu)選其中那些結(jié)合常數(shù)在105-1015(mol/l)-1的物質(zhì)，尤其是結(jié)合常數(shù)在107-1015(mol/l)-1的物質(zhì)。
對(duì)于高鐵磁性或亞鐵磁性膠體物質(zhì)，所有內(nèi)稟Neelian弛豫時(shí)間大于或等于測量時(shí)間，即所謂穩(wěn)定的或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)都可以使用。
尤其合適的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)在20℃時(shí)其弛豫時(shí)間大于10-4秒。尤其合適的是所有的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的弛豫時(shí)間大于1秒。
讓高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)帶一個(gè)由寡聚糖或多聚糖，蛋白質(zhì)，肽，核苷酸，表面活性劑，合成多聚物和/或脂構(gòu)成的外殼將有利于其穩(wěn)定。
高鐵磁性或亞鐵磁性顆粒的大小在1納米到1000納米之間是有利的。尤其優(yōu)選2納米到500納米大小之間的顆粒。(關(guān)于顆粒大小的值與其流體力學(xué)尺寸有關(guān)。)高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)，尤其是由鐵氧化物(Fe3O4，γ-Fe2O3)，鐵酸鋇，鐵酸鍶，純鐵，二氧化鉻，鎳，鈷，以及鐵氧化物與錳、銅、鎳或鈷的加合物(如在DE 30 27 012和DE 41 16 093中描述的)組成的穩(wěn)定的或準(zhǔn)穩(wěn)定的膠體顆粒是合適的。
本發(fā)明所用的、由穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)組成的、并能與結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物接合的復(fù)合物的制備方法是借助與免疫化學(xué)、多肽化學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的相似的方法進(jìn)行的。這樣，結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物就通過共價(jià)鍵與形成高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的起穩(wěn)定作用的外殼的物質(zhì)相連接。作為這些起穩(wěn)定作用的外殼，如碳水化合物，多肽，核苷酸，蛋白質(zhì)，脂，表面活性劑或是多聚物是合適的。尤其合適的鍵合方法有，例如用碳化二亞胺的活化和偶聯(lián)〖Jakoby and Wilchek，eds.，(1974)Methods Enzymol 34〗；在含碳水化合物的復(fù)合物上通過高碘酸鹽的作用形成希夫氏堿〖Wichek and Bayer，eds.，Methods Enzym 18477〗，并可以為了進(jìn)一步穩(wěn)定而再進(jìn)行還原；用戊二醛進(jìn)行偶聯(lián)〖Heitzmann and Richards，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71(1994)3537〗；溴乙?；衔镱w粒與硫解物質(zhì)(thiolylated substances)的交聯(lián)〖Angerer et al.，Cell 9(1976)81 〗，以及還原烷化作用〖Bayer et al.，J.Histochem.Cytochem.24(1976)933〗。
高鐵磁性或亞鐵磁性膠體顆粒也可以用結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物自身形成其穩(wěn)定外殼來產(chǎn)生，即通過在顆粒制成后取出直接投入結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物的溶液中，同時(shí)可以選擇性的加入一些輔助物，如蛋白質(zhì)，碳水化合物，以及天然的、人工合成的或部分人工合成的表面活性劑，或者可以直接在有結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物存在的情況下產(chǎn)生顆粒。
為了進(jìn)行多分析物分析，就要使用含多種不同磁學(xué)標(biāo)識(shí)物的復(fù)合物的混合物，為此，不同的磁學(xué)標(biāo)識(shí)物就由待測的不同的結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物與不同的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的結(jié)合組成。本發(fā)明采用不同磁學(xué)標(biāo)識(shí)物之結(jié)合的原理是，用具有不同矯頑磁場強(qiáng)度(Hc)的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)作為磁標(biāo)分別標(biāo)記待測的不同的結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)或分析物，為此，不同磁標(biāo)的矯頑磁場強(qiáng)度(Hc)和剩余磁化強(qiáng)度(MR)要預(yù)先用一些已知的方法分別測出來，因而是已知的。
標(biāo)記了高鐵磁性或亞鐵磁性膠體顆粒的結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)也可以以干態(tài)存在(如凍干)，可選擇與易于干燥或能提高干態(tài)產(chǎn)物穩(wěn)定性(如凍干物)的其他輔助物的結(jié)合。在使用前，用合適的懸浮介質(zhì)可以立即將這種凍干物進(jìn)行重新懸浮以備使用。
本發(fā)明的另一方面還涉及在合適的懸浮介質(zhì)中用于結(jié)合剩磁測量的高鐵磁性或亞鐵磁性膠體顆粒。
至于懸浮介質(zhì)，所有能讓膠體顆粒自由運(yùn)動(dòng)的液體都是合適的。如果在測量的進(jìn)行不需要分離和洗滌，那么，懸浮介質(zhì)的粘滯性就必須和高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的Neelian弛豫時(shí)間以及測量時(shí)間相匹配，因?yàn)閼腋〗橘|(zhì)基本上決定了Brownian弛豫的時(shí)間常數(shù)。否則，例如，在高粘度的懸浮介質(zhì)(如80％的甘油)中使用弛豫時(shí)間短的顆粒(如，0.01秒)，而測量時(shí)間又很短(如在關(guān)閉外磁場后0.0001秒就進(jìn)行測量)，這樣的話，Brownian弛豫(外稟超順磁性)的衰減就會(huì)很慢，以至于不能區(qū)分結(jié)合和未結(jié)合的結(jié)構(gòu)特異性標(biāo)識(shí)物。通常有利的是使用粘度小于100mPas的懸浮介質(zhì)。
作為懸浮介質(zhì)，水，表面活性輔助物(如表面活性劑、寡聚或多聚碳水化合物及蛋白質(zhì))的水溶液，或醇與水的混合物，如甘油和聚乙二醇的水溶液是合適的，由于水適合于注射，故是優(yōu)選的。懸浮介質(zhì)還可以含有能改變滲透壓的輔助物，如普通的鹽。另外，可含有決定pH的緩沖性物質(zhì)，如磷酸鹽。
本發(fā)明的另一目的是所說的復(fù)合物在本發(fā)明的方法中用于測量結(jié)合剩磁中的應(yīng)用。
根據(jù)結(jié)合識(shí)別的物理機(jī)制，非特異性測量信號(hào)(本底現(xiàn)象)大部分被排除了。這樣，該方法的特異性就只取決于結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)“真的”特異性(抗體的交叉反應(yīng)，配體的非特異性結(jié)合)。
由于本發(fā)明所用的方法的高靈敏性，它容易保持在其他結(jié)合分析方法經(jīng)常遇到的檢測極限之下。
和已知的方法(JP-235774和WO91/15243)相反的是，在本發(fā)明所用的方法中，磁化不是靜態(tài)的，結(jié)合剩磁或信號(hào)所基于的測量不是在有外部磁場存在時(shí)測量的，而是在沒有磁場的情況下測量的。只有這樣，處于結(jié)合態(tài)的標(biāo)識(shí)物的數(shù)據(jù)才能測得。
另外，這樣可以防止測量信號(hào)受到抗磁的或是順磁的組份或污染物的干擾，從而進(jìn)一步提高測量的靈敏度。
本發(fā)明所說的結(jié)合剩磁測量方法，還可以用于檢測高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)在體內(nèi)的滯留部位。由于可以用高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合剩磁測量，這就避免了放射性同位素格外危險(xiǎn)的應(yīng)用，并且，本發(fā)明所用方法的靈敏性達(dá)到了常用的γ閃爍譜儀(gamma scintigraphy)及正電子發(fā)射層面X射線照相術(shù)等核醫(yī)學(xué)方法的精度。并且，事先不需要對(duì)在血液中循環(huán)的非結(jié)合的標(biāo)識(shí)物進(jìn)行分離，因?yàn)榕c發(fā)射性診斷方法相反，這些未結(jié)合的標(biāo)識(shí)物并不會(huì)產(chǎn)生“干涉信號(hào)”，因此不會(huì)影響對(duì)特異性結(jié)合的標(biāo)識(shí)物的檢測。
按照本發(fā)明，給病人施用穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的懸浮液。局部給藥，口服給藥及各種非腸道給藥的給藥方式都可以。血管內(nèi)的給藥形式是尤其適合的。
膠體物質(zhì)在有機(jī)生物體里擴(kuò)散，故它在體內(nèi)的分布形式將受到給藥方法以及各種藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。施用這些穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)后，在不同的時(shí)間進(jìn)行結(jié)合剩磁的位置鑒別測定，檢測體內(nèi)的病理狀態(tài)，而這些病理狀態(tài)可能正是由不正常的聚集或是不能聚集的發(fā)生為特征的。
為了實(shí)現(xiàn)人體病理結(jié)構(gòu)的可視化，采用結(jié)合了結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)的穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)(磁學(xué)標(biāo)識(shí)物)是尤其有利的。因?yàn)椋艑W(xué)標(biāo)識(shí)物與病理結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的結(jié)果表現(xiàn)為一個(gè)特異性的信號(hào)，而這個(gè)信號(hào)可以按照本發(fā)明用所描述用于進(jìn)行結(jié)合分析的結(jié)合剩磁方法進(jìn)行體內(nèi)測量。
作為按照本發(fā)明的穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)與結(jié)合剩磁測量方法的結(jié)合應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例，可以提及使用腫瘤特異性磁學(xué)標(biāo)記物檢測體內(nèi)的腫瘤。腫瘤特異性標(biāo)識(shí)物可以是，例如，穩(wěn)態(tài)或準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)與腫瘤特異性物質(zhì)，如抗體，抗體片段，肽，受體，蛋白質(zhì)，核酸，寡核苷酸，以及單-、寡-或多聚碳水化合物的結(jié)合物。
在另一些可能的應(yīng)用實(shí)例中，如凝塊、動(dòng)脈硬化斑、炎性反應(yīng)、風(fēng)濕或類風(fēng)濕病等的可視化，用本發(fā)明的穩(wěn)定的或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性材料與對(duì)應(yīng)病理結(jié)構(gòu)的特異性物質(zhì)磁學(xué)標(biāo)識(shí)物結(jié)合物也是有利的。
按照本發(fā)明，給人施用的穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的磁學(xué)標(biāo)識(shí)物在體內(nèi)的空間分布的測量，可以按以下兩種不同情況進(jìn)行1、在身體的有利部位產(chǎn)生一個(gè)盡可能均勻的磁場，然后關(guān)閉磁場，用一個(gè)SQUID-多通道傳感器，就象例如在生物磁性檢測〖cf.D.Drung，IEEE Trans.Appl.Supercond.，5(1995)2112-2117〗時(shí)所用的，測量結(jié)合剩磁的空間分布。這個(gè)傳感器應(yīng)當(dāng)盡可能完全地包圍測量對(duì)象。為了獲得充分多的測量信息，用連續(xù)光柵對(duì)測量對(duì)象進(jìn)行重復(fù)測量將是有利的。
2、依次產(chǎn)生一個(gè)空間上受到限制的磁場，然后關(guān)閉磁場，用一個(gè)單通道傳感器測量空間結(jié)合剩磁。當(dāng)然也可以用多通道傳感器。
用這兩種方法，優(yōu)選在所有三個(gè)空間方向上對(duì)檢測對(duì)象進(jìn)行磁化并對(duì)產(chǎn)生的磁場進(jìn)行測量，以保證最大限度的信息采集。
對(duì)測量數(shù)據(jù)的分析，可以用適當(dāng)近似的方法。如，磁偶極子，多極子，或多-偶極子的模型可用來作為離散的點(diǎn)。這個(gè)模型的一些特定參數(shù)，尤其是磁偶極子、磁多極子的定位，可以通過采用一些近似方法來得到，從而使測量結(jié)果與模型參數(shù)的偏差最小。磁性顆粒的空間分布可以用本領(lǐng)域的已知方法從這些參數(shù)得到。
類似的方法已為人所知，并已在生物電流的磁場分析研究中得到證明。
在體內(nèi)測量結(jié)合剩磁時(shí)，用于體外測試的物質(zhì)或由其制備的試劑基本上還是可用的。
能夠被生物降解并具有相容性的磁標(biāo)在體內(nèi)應(yīng)用是特別合適。尤其是由鐵氧化物或鐵氧化物與錳和鈷的結(jié)合物組成的磁標(biāo)更是如此。按現(xiàn)有的方法，如磁自旋層面X射線照相術(shù)，也就是在WO92/12735，WO92/22586，以及EP0 186 616中描述的方法，也使用能夠被結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)鍵合的磁性顆粒。本發(fā)明的另一個(gè)方面還涉及到使用磁標(biāo)在體內(nèi)測量結(jié)合剩磁的應(yīng)用。
與結(jié)合剩磁測量在體內(nèi)應(yīng)用相聯(lián)系的結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)尤其定義為所有能與所要鑒別的人體的結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的物質(zhì)。尤其合適的是抗體、抗體片段、能與其受體特異性結(jié)合的激動(dòng)劑或它們的拮抗劑、特定的多肽和蛋白質(zhì)、受體、酶、酶的底物、核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸、碳水化合物或脂蛋白。能與受體結(jié)合的激動(dòng)劑中，尤其合適的是細(xì)胞因子、淋巴因子或內(nèi)皮縮血管肽(endothelins)。
所有結(jié)合常數(shù)在105-1015(mol/l)-1之間的結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)都是合適的，尤其是結(jié)合常數(shù)在107-1015(mol/l)-1之間的結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)。
具體實(shí)施方式
下面的一些實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的目的的更具體的解釋，并不是說本發(fā)明只限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1將100微克的膠原III單克隆抗體，下文稱之為抗膠原III，溶解于500微升0.1M的碳酸氫鈉溶液中。1毫升以葡聚糖包裹的磁鐵礦懸浮液(Meito Sangyo出品)，其中，鐵含量為1摩爾/升，顆粒大小為40納米左右(流體力學(xué)直徑)，用0.1M的碳酸氫鈉溶液在Sephadex柱(Pharmacia PD10)中進(jìn)行緩沖。將0.5毫升含10毫摩爾高碘酸鈉的溶液加入該懸浮液中。溶液在黑暗中放置2小時(shí)。然后，用0.1M碳酸氫鈉溶液在PD10中洗脫。再將抗膠原III溶液加入到懸浮液中。混合溶液在4℃黑暗中放置3小時(shí)。接著加入5毫克NaBH4固體，略微旋轉(zhuǎn)振蕩?；旌衔镌僭?℃黑暗環(huán)境中放置8小時(shí)。然后，磁標(biāo)記了的抗膠原III(下文稱為磁抗膠原III)用磷酸緩沖的普通鹽溶液(PBS，pH＝7.4)通過PD10柱進(jìn)行洗脫。
將在200微升緩沖液(磷酸緩沖的普通鹽溶液(PBS))中的5微克膠原III溶液置于聚苯乙烯樣品皿中培養(yǎng)。(樣品皿在這里作為固相，一部分膠原可以吸附在上面)。然后棄去液相。再用含0.1％的吐溫20(下文稱為PBST)沖洗樣品皿3次，以洗去未附著的膠原III。接著，用溶解在200微升PBST中的5微升磁抗膠原III加到樣品皿中。在室溫下保溫1小時(shí)。然后，樣品在一個(gè)磁屏蔽室里，用位于超導(dǎo)量子干涉器件探測器下方4厘米處、強(qiáng)度為2mT的磁場進(jìn)行磁化(參見圖1)。關(guān)閉磁場后對(duì)樣品進(jìn)行測量。為此，樣品在測量期間被從磁化線圈中取出。在關(guān)閉磁場后，將樣品從測量場中取出前和取出后，而剩磁則由于檢測磁場強(qiáng)度的變化而產(chǎn)生。在本例情況下，剩磁被發(fā)現(xiàn)了。
實(shí)施例2將在200微升pH7.4的PBS緩沖溶液中的5微克膠原V溶液，置于一由聚苯乙烯制成的樣品皿中進(jìn)行培養(yǎng)。然后，去除液相物質(zhì)。樣品皿用pH7.4的PBST緩沖溶液沖洗3次。將在200微升PBST中的按實(shí)施例1制備的5微克磁抗膠原III加到樣品中。在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。接著在一磁屏蔽室里，用磁場強(qiáng)度為2mT、位于超導(dǎo)量子干涉器件(SQUID)檢測器下4厘米的磁場對(duì)樣品進(jìn)行磁化(參見圖1)。關(guān)閉磁場，對(duì)樣品進(jìn)行測量。為此，樣品在測量期間被從磁化線圈中取出。在此樣品中含有膠原V，沒有檢測到剩磁現(xiàn)象。
實(shí)施例3由10ml 1.9mg/ml膠原III的PBS(pH7.4)溶液，各制備了5ml(如下稀釋液1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml。
從各個(gè)稀釋液中各吸取1ml用移液管移到聚苯乙烯(試管2.5ml容量)中。3個(gè)樣品試管在37℃下抑制1小時(shí)。然后去除試管中的內(nèi)容物。試管分別用1ml的PBST沖洗3次。
分別將1ml的根據(jù)實(shí)施例1中所述方法制備的磁標(biāo)抗體的1∶100稀釋液加到每個(gè)試管中。然后將試管在室溫下放置1小時(shí)。接著，用圖1所示的測量裝置對(duì)樣品進(jìn)行磁化(2mT)，關(guān)閉磁場后，對(duì)樣品進(jìn)行測量。為此，樣品在測量期間被從磁化線圈中取出。被測信號(hào)的估計(jì)量即是結(jié)合剩磁的量度，并得到如圖2如示的關(guān)系。
權(quán)利要求
1.用于定量和/或定性地對(duì)液相或固相分析物進(jìn)行檢測的方法，其中，(i)首先用高鐵磁性或亞鐵磁性材料對(duì)結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記并形成膠體顆粒，所用的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的內(nèi)稟Neelian弛豫時(shí)間要大于測量時(shí)間，然后(ii)將這些膠體顆粒用于要檢測的樣品中，(iii)從樣品外部用一個(gè)合適強(qiáng)度的磁場對(duì)其進(jìn)行磁化，(iv)關(guān)閉外部磁場后，用磁場傳感器測量膠體顆粒的剩余磁化強(qiáng)度，由于特異性結(jié)合而產(chǎn)生的剩磁及其大小被用于分析。
2.如權(quán)利要求
1的方法，其中代替結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)，要檢測的分析物也可以用高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，并且在要測量的樣品中加入結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求
1或2的方法，其中，結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)是抗體，抗體片段，生物素或是能與生物素特異性結(jié)合的物質(zhì)，能與受體特異性結(jié)合的激動(dòng)劑或它們的拮抗劑，特定的肽和蛋白質(zhì)，受體，酶，酶的底物， 核苷酸，核糖核酸，脫氧核糖核酸，糖類，或脂蛋白。
4.如權(quán)利要求
3的方法，其中，所述能與生物素特異性結(jié)合的物質(zhì)是卵白素或鏈霉親和素。
5.如權(quán)利要求
1的方法，其中，結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)在105-1015(mol/l)-1的范圍內(nèi)。
6.如權(quán)利要求
5的方法，其中，結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)在107-1015(mol/l)-1的范圍內(nèi)。
7.如權(quán)利要求
1的方法，其中，測量時(shí)樣品被移動(dòng)，從而樣品信號(hào)被調(diào)制。
8.如權(quán)利要求
1的方法，其中，像斜度計(jì)般鉤吊著的感應(yīng)線圈、飽和式磁力儀、高磁阻效應(yīng)傳感器、或磁阻轉(zhuǎn)換器被用作磁場傳感器。
9.如權(quán)利要求
1的方法，其中，超導(dǎo)量子干涉器件被用作磁場傳感器。
10.如權(quán)利要求
1的方法，其中，對(duì)液相或固相的幾個(gè)不同分析物的同時(shí)檢測是通過對(duì)待測樣品逐步磁化來進(jìn)行的。
11.如權(quán)利要求
10的方法，其中，為對(duì)幾個(gè)分析物同時(shí)進(jìn)行定量檢測，使用了具有矯頑場強(qiáng)度的不同的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求
1的方法，其中所用的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的Neelian弛豫時(shí)間在20℃時(shí)要大于10-4秒。
13.如權(quán)利要求
12的方法，其中，所用的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的Neelian弛豫時(shí)間在20℃時(shí)要大于1秒。
14.如權(quán)利要求
1的方法，其中，高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的顆粒大小在1-到1000納米的范圍內(nèi)。
15.如權(quán)利要求
14的方法，其中，高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)的顆粒大小在2-500納米的范圍內(nèi)。
16.如權(quán)利要求
1的方法，其中，高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)用由寡聚或多聚碳水化合物，蛋白質(zhì)，肽，核苷酸，表面活性劑，合成聚合物，和/或脂類構(gòu)成的外殼來穩(wěn)定。
17.用于如權(quán)利要求
1所述的方法中的復(fù)合物，其中，它們是由穩(wěn)定的或準(zhǔn)穩(wěn)定的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)與結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)的結(jié)合物組成的，該高鐵磁性或亞鐵磁性顆粒的Neelian弛豫時(shí)間要大于10-4秒。
18.如權(quán)利要求
17的復(fù)合物，其中，高鐵磁性或亞鐵磁性顆粒的Neelian弛豫時(shí)間要大于1秒。
19.如權(quán)利要求
17的復(fù)合物，其中，結(jié)構(gòu)特異性物質(zhì)是抗體，抗體片段，能與受體特異性結(jié)合的激動(dòng)劑，細(xì)胞因子、淋巴因子、內(nèi)皮縮血管肽，或它們的拮抗劑，其他特異的肽和蛋白質(zhì)，受體，酶，酶的底物，核苷酸，核糖核酸，脫氧核糖核酸，糖類，或脂蛋白。
20.如權(quán)利要求
17的復(fù)合物，其中，高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)是由鐵氧化物，鐵酸鋇，鐵酸鍶，純鐵，二氧化鉻，鎳和鈷，以及鐵氧化物與錳、銅、鎳或鈷的加合物構(gòu)成的穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的膠體顆粒。
21.如權(quán)利要求
17的復(fù)合物，其中，它們包含幾種具有不同矯頑場強(qiáng)度的高鐵磁性或亞鐵磁性物質(zhì)。
專利摘要
本發(fā)明涉及借助于結(jié)合剩磁測量對(duì)液相和固相中的分析物進(jìn)行定量檢測的方法，適用于此目的的復(fù)合物，以及在分析化學(xué)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/533GKCN1144048SQ96192282
公開日2004年3月31日 申請(qǐng)日期1996年2月29日
發(fā)明者維爾納·魏奇斯, 維爾納 魏奇斯, 羅曼·考蒂茨, 考蒂茨, 盧茨·特拉姆斯, 特拉姆斯, 邦特, 托馬斯·邦特 申請(qǐng)人:舍林公開股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan