本發(fā)明涉及抗皮膚致敏藥物，尤其涉及一種自噬誘導(dǎo)劑在制備抗皮膚致敏藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前化妝品行業(yè)入門檻過低，使得一些產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，導(dǎo)致很容易引起化妝品相關(guān)的皮膚疾病。化妝品皮膚病是指人們?nèi)粘Ｉ钪杏捎谑褂没瘖y品而引起的皮膚及附屬器的病變，表現(xiàn)癥狀如紅斑、丘疹、脫屑、皮膚及粘膜干燥、色素沉著、瘙癢或刺痛等?；瘖y品過敏反應(yīng)在皮膚科臨床已是最常見病，尤其是面部皮膚敏感更是使很多愛美人士苦惱不已。醫(yī)學(xué)上過敏反應(yīng)又稱變態(tài)反應(yīng)，是患者身體對一種或多種物質(zhì)的過強(qiáng)反應(yīng)。

2、劣質(zhì)化妝品里含有很多的香精、礦物質(zhì)色素、重金屬等有毒物質(zhì)，對皮膚有很大的刺激。目前在皮膚科門診，遇到了越來越多因使用化妝品不當(dāng)而引起紅斑、丘疹、水皰、色素沉著等皮膚病變的病例，其中最多的是變態(tài)反應(yīng)接觸性皮炎和刺激性皮炎。對于化妝品致敏性研究，尋求一種安全有效的抗皮膚致敏藥物的需求迫在眉睫。

3、隨著有害結(jié)局通路(adverse?outcome?pathway，aop)理論的提出以及毒性測試替代方法的開發(fā)，多項(xiàng)基于皮膚致敏的aop開發(fā)的體外方法已被經(jīng)濟(jì)合作和開發(fā)組織接受為測試指南，包括直接多肽反應(yīng)分析(direct?peptide?reaction?assay，dpra)、keratinosens、u-sens和人細(xì)胞系活化試驗(yàn)(human?cell?line?activation?test，h-clat)等，覆蓋了aop的分子啟始事件、關(guān)鍵事件一(角質(zhì)細(xì)胞反應(yīng))和關(guān)鍵事件二(樹突狀細(xì)胞反應(yīng))。但基于二維細(xì)胞方法如u-sens、h-clat等還存在一定的局限性，如角質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)作為檢測終點(diǎn)存在以下限制：①角質(zhì)致敏反應(yīng)與刺激反應(yīng)不易區(qū)分，需要改造細(xì)胞將致敏的特征性信號(hào)放大以便于檢測；②作用濃度受到限制，例如對于強(qiáng)刺激弱致敏物質(zhì)，過低濃度無法誘發(fā)細(xì)胞致敏反應(yīng)，過高濃度又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；③溶解性限制，無法檢測難溶于水的樣品；④無法模擬角質(zhì)細(xì)胞與thp-1細(xì)胞間的相互作用關(guān)系。致敏反應(yīng)aop是一個(gè)連續(xù)的過程，在角質(zhì)細(xì)胞激活后，其能夠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞因子作用于樹突狀細(xì)胞，對樹突狀細(xì)胞的活化起到激活作用。樹突狀細(xì)胞模型來源主要是誘導(dǎo)培養(yǎng)cd34+造血干細(xì)胞和外周血獲得的樹突狀細(xì)胞，但此類細(xì)胞模型存在著不足：實(shí)驗(yàn)室之間、來源個(gè)體間差異性、費(fèi)用昂貴等。為克服這些限制，目前一些來源廣泛，活力較強(qiáng)的各類單核細(xì)胞系(thp-1、u937和mutz-3等)成為目前研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。h-clat方法是直接將受試物與thp-1細(xì)胞接觸，達(dá)到檢測目的，與人體接觸受試物時(shí)情況有所差異。建立體外重組皮膚模型與thp-1細(xì)胞共培養(yǎng)模型(以下簡稱共培養(yǎng)模型)不僅能夠起到皮膚屏障作用，有可能激活更多的通路和產(chǎn)生擾動(dòng)作用，還能模擬角質(zhì)細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞間的相互作用。

4、自噬是一種高度保守的真核細(xì)胞降解與再循環(huán)過程，其通過細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和大分子的降解以及分解產(chǎn)物的再循環(huán)，在細(xì)胞的生存和維持中起著重要的作用。相關(guān)研究表明，細(xì)胞在正常狀態(tài)下，細(xì)胞自噬處于較低水平，用來維持蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的周轉(zhuǎn)；而在各種生理和病理的應(yīng)激條件下，如生長因子消耗、饑餓、缺氧以及化學(xué)誘導(dǎo)的刺激，細(xì)胞自噬水平會(huì)提高。

5、如前文所述，在如化妝品、藥物等外界致敏物的刺激下，皮膚黏膜可以發(fā)生過敏性接觸性皮炎，對接觸部位的皮膚角質(zhì)細(xì)胞造成損傷，產(chǎn)生諸如水腫型紅斑甚至丘疹、大疤等炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者會(huì)產(chǎn)生表皮松懈甚至壞死。過敏性接觸性皮炎是t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，諸如il-1β、tnf-α等細(xì)胞因子、趨化因子與共刺激分子在過敏性接觸性皮炎的病理過程中均起到了重要的作用，而il-1β、tnf-α等細(xì)胞因子可以對細(xì)胞自噬反應(yīng)起誘導(dǎo)作用；同時(shí)，自噬是保守的自我消化、分解代謝過程，自噬通過細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和大分子的降解以及分解產(chǎn)物的再循環(huán)，在細(xì)胞的生存和維持中起著重要的作用，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)，自噬作為一種自我保護(hù)機(jī)制，通過特異性降解受損或多余的細(xì)胞器、病原體或死細(xì)胞來幫助細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，當(dāng)外界致敏物刺激皮膚致敏時(shí)，皮膚表皮的角質(zhì)細(xì)胞有發(fā)生自噬的可能性。

6、然而，在皮膚致敏過程中是否發(fā)生自噬，自噬與免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系，自噬發(fā)生后有何抗致敏作用，基于自噬能否開發(fā)抗致敏手段等，仍是本領(lǐng)域待研究的核心問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種自噬誘導(dǎo)劑在制備抗皮膚致敏藥物中的應(yīng)用，自噬誘導(dǎo)劑為雷帕霉素，其作為特異性激活劑激活自噬途徑具有潛在的臨床價(jià)值，可能發(fā)展成新的具備改善皮膚致敏療效的藥物。

2、為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種自噬誘導(dǎo)劑在制備抗皮膚致敏藥物中的應(yīng)用，所述自噬誘導(dǎo)劑為雷帕霉素；

4、所述雷帕霉素的濃度為0.1-1μm。所述0.1-1μm，例如可以是0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm等。

5、本發(fā)明中，經(jīng)過試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)雷帕霉素是一種自噬誘導(dǎo)劑，能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞自噬效果，且能夠顯著增強(qiáng)抗皮膚致敏效果。用于科研領(lǐng)域，可以用于探究自噬與免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系，用于開發(fā)更多自噬誘導(dǎo)劑作為抗皮膚致敏藥物等。在上述濃度范圍內(nèi)，能夠顯著降低皮膚致敏。

6、優(yōu)選地，所述皮膚致敏的判斷標(biāo)準(zhǔn)包括il-1β陽性和tnf-α陽性。

7、本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)il-1β陽性和tnf-α陽性，能夠判斷為皮膚致敏，而雷帕霉素能夠顯著降低il-1β和tnf-α的含量，從而能夠顯著增強(qiáng)抗皮膚致敏效果。

8、其中，皮膚致敏為過敏性接觸性皮炎(allergic?contact?dermatitis,acd)是皮膚重復(fù)接觸某種物質(zhì)后機(jī)體產(chǎn)生的免疫介導(dǎo)的皮膚反應(yīng)。

9、優(yōu)選地，所述il-1β陽性為il-1β濃度大于20pg/ml，例如可以是20.1pg/ml、30pg/ml、50pg/ml、80pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml等大于20pg/ml的濃度。

10、優(yōu)選地，所述tnf-α陽性為tnf-α濃度大于15pg/ml，例如可以是15.1pg/ml、30pg/ml、50pg/ml、80pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml等大于15pg/ml的濃度。

11、本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過致敏劑處理后il-1β和tnf-α的含量顯著增高，具體呈現(xiàn)為il-1β大于20pg/ml和tnf-α的濃度大于15pg/ml，即在該條件下，判斷處于皮膚致敏狀態(tài)。

12、優(yōu)選地，所述皮膚致敏的判斷標(biāo)準(zhǔn)還包括thp-1細(xì)胞陽性。

13、優(yōu)選地，所述cd86陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為rficd86≥150，例如可以是150、200、300、500、1000、2000等大于150的數(shù)值。

14、優(yōu)選地，所述cd54陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為rficd54≥200，例如可以是200、300、500、1000、2000等大于200的數(shù)值。

15、所述thp-1細(xì)胞陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)還包括細(xì)胞的存活率大于50％，例如可以是50.1％、55％、90％、95％或100％等大于50％的存活率。

16、優(yōu)選地，所述rfi的計(jì)算公式為：

17、

18、其中，mfi為熒光強(qiáng)度均值(mean?fluorescence?intensity)。

19、優(yōu)選地，所述皮膚致敏的因素包括：致敏劑、溫度、紫外線、合成纖維織物、除臭產(chǎn)品、石油產(chǎn)品或油中的任意一種或至少兩種的組合。

20、優(yōu)選地，所述致敏劑包括所述致敏劑包括：肉桂醛、己基肉桂醛、丁基苯基甲基丙酸、芳樟醇或水楊酸芐酯中的任意一種或至少兩種的組合。

21、優(yōu)選地，所述致敏劑的濃度范圍為3-6μg/ml，例如可以是3μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml、5.5μg/ml或6μg/ml。

22、優(yōu)選地，所述自噬誘導(dǎo)劑的作用細(xì)胞為皮膚角質(zhì)細(xì)胞。

23、優(yōu)選地，所述藥物為藥劑學(xué)上可接受的任意一種劑型。

24、優(yōu)選地，所述藥物還含有藥學(xué)上可接受的輔料。

25、優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的輔料包括載體、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、乳化劑、助溶劑、增溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、包衣材料、著色劑、ph調(diào)節(jié)劑、抗氧劑、抑菌劑或緩沖劑中的任意一種或至少兩種的組合。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

27、1.本發(fā)明創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)雷帕霉素作為一種自噬誘導(dǎo)劑，能夠顯著能夠抑制皮膚致敏相關(guān)細(xì)胞因子il-1β、tnf-α釋放，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素激活皮膚角質(zhì)細(xì)胞自噬，能夠使致敏抗原提呈細(xì)胞thp-1致敏陽性轉(zhuǎn)為致敏陰性。

28、2.雷帕霉素在本發(fā)明限定判斷標(biāo)準(zhǔn)的皮膚致敏范圍內(nèi)，能夠顯著提升抗皮膚致敏的效果，且在限定的雷帕霉素濃度范圍內(nèi)，能夠最大程度產(chǎn)生自噬效果從而抗致敏，用于科研領(lǐng)域，可以用于探究自噬與免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系，用于開發(fā)更多自噬誘導(dǎo)劑作為抗皮膚致敏藥物等。