本發(fā)明涉醫(yī)學(xué)工程，具體為一種富含nampt的創(chuàng)傷修復(fù)外泌體水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、創(chuàng)傷是指擦傷、裂傷、切創(chuàng)、挫傷、燒傷導(dǎo)致組織表面缺損的狀態(tài)，創(chuàng)傷修復(fù)由傷后增生的細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)充填、連接或代替缺損的組織；外泌體是一種具有細(xì)胞間通訊功能的納米級(jí)細(xì)胞囊泡，是細(xì)胞在靜止或應(yīng)激條件下釋放到細(xì)胞外空間的脂質(zhì)雙層膜結(jié)合囊泡，能夠攜帶蛋白質(zhì)、mrna和mirna等多種生物活性分子，在細(xì)胞間通訊和信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用，如免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生、血管生成和組織愈合、創(chuàng)傷修復(fù)等。

2、外泌體半衰期相對(duì)較短、蓄積性差、清除率快，導(dǎo)致外泌體在創(chuàng)傷修復(fù)應(yīng)用中存在局限性，nampt(煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)能夠在創(chuàng)傷處細(xì)胞修復(fù)時(shí)提供能量，有助于創(chuàng)傷處細(xì)胞的愈合，但nampt加載到外泌體中，其穩(wěn)定性較差，易于釋放，影響生物利用度和創(chuàng)傷治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種富含nampt的創(chuàng)傷修復(fù)外泌體水凝膠及其制備方法，解決了外泌體半衰期相對(duì)較短、蓄積性差、清除率快和nampt穩(wěn)定性較差、易于釋放影響創(chuàng)傷修復(fù)的問(wèn)題。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案：

3、一種富含nampt的創(chuàng)傷修復(fù)外泌體水凝膠的制備方法，包括以下制備步驟：

4、s1.采用間充質(zhì)干細(xì)胞提取外泌體，得到間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體；

5、s2.將nampt、黃芪甲苷、中鏈甘油三酯和大豆磷脂混合反應(yīng)，得到脂質(zhì)納米顆粒；

6、s3.將脂質(zhì)納米顆粒與間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體混合，得到負(fù)載脂質(zhì)納米顆粒的外泌體；

7、s4.將負(fù)載脂質(zhì)納米顆粒的外泌體、甘藍(lán)提取物、多糖提取物混合，得到復(fù)合物；

8、s5.將復(fù)合物、殼聚糖溶液、β-甘油磷酸鈉溶液混合，在36-38℃下攪拌5-10min，得到富含nampt的創(chuàng)傷修復(fù)外泌體水凝膠。

9、進(jìn)一步地，負(fù)載脂質(zhì)納米顆粒的外泌體、甘藍(lán)提取物、多糖提取物質(zhì)量比為(0.5-1):(0.2-0.4):(0.1-0.3)。

10、進(jìn)一步地，復(fù)合物、殼聚糖溶液、β-甘油磷酸鈉溶液用量比為(0.06-0.1)g:(6-8)ml:(0.5-1.5)ml。

11、進(jìn)一步地，步驟s5具體為：將0.2g殼聚糖加入到10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2％的乙酸溶液中，攪拌均勻，得到殼聚糖溶液，將7ml殼聚糖溶液和1ml濃度為0.5-1.5g/ml的β-甘油磷酸鈉溶液混合，攪拌均勻，加入濃度為0.4-0.6mol/l的碳酸氫鈉水溶液和復(fù)合物，在36-38℃下攪拌5-10min，得到富含nampt的創(chuàng)傷修復(fù)外泌體水凝膠。

12、進(jìn)一步地，殼聚糖、乙酸溶液用量比為(0.1-0.3)g:(8-12)ml。

13、進(jìn)一步地，殼聚糖分子量為0.7-1×106，天津希恩思生化科技有限公司。

14、進(jìn)一步地，負(fù)載脂質(zhì)納米顆粒的外泌體具體由以下步驟制得：

15、a1.將間充質(zhì)干細(xì)胞用原代間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合率達(dá)80-81％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取培養(yǎng)至3-5代的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液置于離心管中，進(jìn)行離心收集細(xì)胞上清液，細(xì)胞上清液用0.2-0.23μm濾膜過(guò)濾后，離心收集外泌體沉淀，再加入磷酸鹽緩沖溶液，得到間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體放于-(70-90)℃保存；

16、a2.將黃芪甲苷加入到無(wú)水乙醇中，攪拌均勻，在80-90℃下旋蒸除去乙醇后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3-0.7％的聚氧乙烯硬脂酸酯溶液和nampt，在180-220w下進(jìn)行超聲5-7s，得到膠體；

17、a3.將中鏈甘油三酯和大豆磷脂加入到去離子水中，攪拌均勻，加入膠體，在500-700rpm下攪拌25-35min，冷凍干燥，得到脂質(zhì)納米顆粒；

18、a4.將脂質(zhì)納米顆粒與間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體混合，在36-38℃下攪拌1-2h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9-1.1％的氯化鈉溶液，經(jīng)100-120kda的超濾管過(guò)濾，得到負(fù)載脂質(zhì)納米顆粒的外泌體。

19、進(jìn)一步地，上述a1反應(yīng)過(guò)程中，采用間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行離心收集細(xì)胞上清液以去除細(xì)胞碎片和游離蛋白等較小的雜質(zhì)，用0.22μm的過(guò)濾篩進(jìn)行過(guò)濾以去除微小雜質(zhì)后，離心收集de1外泌體沉淀重懸于磷酸鹽緩沖溶液中，得到間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。

20、進(jìn)一步地，上述a2反應(yīng)過(guò)程中，將黃芪甲苷溶解在無(wú)水乙醇中，能夠有效地溶解黃芪甲苷，在80-90℃下旋蒸能夠除去乙醇進(jìn)而形成黃芪甲苷濃縮物，超聲處理后，聚氧乙烯硬脂酸酯能夠滲透至黃芪甲苷濃縮物中形成黃芪甲苷膠體，將nampt加入到黃芪甲苷膠體中，nampt攜帶的苯環(huán)和脂基結(jié)構(gòu)能夠與黃芪甲苷膠體溶液中黃芪甲苷膠分子上的苯環(huán)和羥基通過(guò)氫鍵結(jié)合，使得nampt分散在黃芪甲苷膠體中，有利于nampt包封在脂質(zhì)納米顆粒中，且提高nampt在水凝膠中的穩(wěn)定性。

21、進(jìn)一步地，上述a3反應(yīng)過(guò)程中，中鏈甘油三酯能夠與大豆磷脂相互作用，形成空腔結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，且形成脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)過(guò)程中，分散有nampt的膠體能夠嵌入到脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的空腔內(nèi)，使得nampt嵌入到脂質(zhì)納米顆粒中，形成脂質(zhì)納米顆粒。

22、進(jìn)一步地，上述a4反應(yīng)過(guò)程中，外泌體也具有類(lèi)似于脂質(zhì)體的特有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與含有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)納米顆粒具有較好的生物相容性，使得外泌體膜蛋白吸附到脂質(zhì)納米顆粒表面，實(shí)現(xiàn)外泌體包封脂質(zhì)納米顆粒，形成負(fù)載脂質(zhì)納米顆粒的外泌體。

23、進(jìn)一步地，步驟a1中，所述培養(yǎng)條件具體為：36-38℃，含4-6％的二氧化碳，飽和濕度；所述離心收集細(xì)胞上清液具體為：離心溫度為3-5℃，300×g離心8-12min；2000×g離心15-25min；10000×g離心25-35min。

24、進(jìn)一步地，步驟a2中，所述黃芪甲苷、無(wú)水乙醇、聚氧乙烯硬脂酸酯溶液、nampt用量比為(0.03-0.07)g:(8-12)ml:(3-7)ml:(0.02-0.04)g。

25、進(jìn)一步地，步驟a3中，所述中鏈甘油三酯、大豆磷脂、去離子水、膠體用量比為(0.5-1.5)g:(2-4)g:(15-25)ml:(0.2-0.3)g。

26、進(jìn)一步地，步驟a4中，所述脂質(zhì)納米顆粒、間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體、氯化鈉溶液用量比為(0.3-0.5)g:(8-12)ml:(0.01-0.03)ml。

27、進(jìn)一步地，甘藍(lán)提取物具體由以下步驟制得：

28、將甘藍(lán)用去離子水洗滌雜質(zhì)，干燥后，置于粉碎機(jī)中粉碎，將粉碎的甘藍(lán)加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75-85％的乙醇水溶液中，超聲處理25-35min，在300-400rpm下離心10-15min，收集上清液，經(jīng)真空濃縮，得到甘藍(lán)提取物。

29、進(jìn)一步地，粉碎的甘藍(lán)、乙醇水溶液用量比為(0.3-0.7)g:(8-12)ml。

30、進(jìn)一步地，多糖提取物具體由以下步驟制得：

31、將凍干的蘆薈凝膠加入到去離子水中，攪拌均勻，超聲處理后，離心收集上清液，將上清液加入到無(wú)水乙醇中，靜置，收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥，得到多糖提取物。

32、進(jìn)一步地，凍干的蘆薈凝膠、去離子水用量比為(0.5-1.5)g:(80-120)ml。

33、進(jìn)一步地，上清液、無(wú)水乙醇用量比為(8-12)g:(25-35)ml。

34、本發(fā)明具有以下有益效果：

35、(1)本發(fā)明技術(shù)方案中，將nampt分散在黃芪甲苷膠體中，能夠?qū)ampt包封在脂質(zhì)納米顆粒中，有利于提高nampt在水凝膠中的穩(wěn)定性，且黃芪甲苷可顯著促進(jìn)角化細(xì)胞的遷移，促進(jìn)新生血管生成，從而促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)；將分散有nampt的膠體嵌入到脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的空腔中，形成脂質(zhì)納米顆粒，形成的脂質(zhì)納米顆粒的小尺寸結(jié)構(gòu)，能夠?qū)ampt有效地遞送到創(chuàng)傷部位，且可以保護(hù)nampt免受體內(nèi)環(huán)境的降解，提高nampt的生物利用度和治療效果。

36、(2)本發(fā)明技術(shù)方案中，nampt能夠參與nad+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的生物合成，nad+是細(xì)胞內(nèi)能量代謝和氧化還原反應(yīng)的關(guān)鍵輔酶，為細(xì)胞提供能量，且nad+對(duì)傷口愈合過(guò)程有非常重要的調(diào)控能力，將nampt應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)中，能夠?yàn)閯?chuàng)傷處細(xì)胞修復(fù)時(shí)提供能量，并維持細(xì)胞的正常生理功能，有助于創(chuàng)傷處細(xì)胞的愈合。

37、(3)本發(fā)明技術(shù)方案中，采用外泌體包埋脂質(zhì)納米顆粒，能夠有效緩解脂質(zhì)納米顆粒的釋放和降解，進(jìn)一步延長(zhǎng)脂質(zhì)納米顆粒藥物的生物利用度和治療效果，與脂質(zhì)納米顆粒在保護(hù)nampt免受體內(nèi)環(huán)境的降解、延長(zhǎng)創(chuàng)傷修復(fù)功效方面具有協(xié)同作用，且外泌體通過(guò)胞吐作用和內(nèi)吞作用途徑表現(xiàn)出細(xì)胞間通訊，能夠在細(xì)胞之間遞送蛋白質(zhì)和核酸的天然載體，能夠被吸收到創(chuàng)傷處的細(xì)胞群中，參與免疫系統(tǒng)激活和組織再生，進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)。

38、(4)本發(fā)明技術(shù)方案中，甘藍(lán)提取物中富含黃酮類(lèi)化合物和花青素，能夠刺激新血管的形成，確保更好的組織營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)受損組織的快速恢復(fù)，具有很高的創(chuàng)傷修復(fù)能力；多糖提取物能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)具有較高的藥用價(jià)值，且具有較好的抗炎作用。

39、(5)本發(fā)明技術(shù)方案中，負(fù)載脂質(zhì)納米顆粒、甘藍(lán)提取物、多糖提取物復(fù)合作為創(chuàng)傷修復(fù)藥物，加入到水凝膠中，作為創(chuàng)傷修復(fù)劑，能夠有效提高創(chuàng)傷修復(fù)能力；將復(fù)合物與殼聚糖溶液混合，甘油磷酸鈉含有的硫酸根基團(tuán)，能夠與殼聚糖的氨基發(fā)生靜電相互作用，進(jìn)行凝膠化，形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)水凝膠，且復(fù)合物在凝膠化過(guò)程中填充至殼聚糖交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，形成富含nampt的創(chuàng)傷修復(fù)外泌體水凝膠，水凝膠作為天然組織的多功能材料，用作復(fù)合物的遞送載體，有效控制復(fù)合物的釋放的能力，避免復(fù)合物中的植物提取物、多糖提取物、外泌體從血液循環(huán)中快速排出，影響創(chuàng)傷修復(fù)效果。