本發(fā)明涉及一種藥物治療癌作用機制的分析方法，具體涉及一種天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌作用機制的分析方法。

背景技術(shù)：

1、明確結(jié)直腸癌（crc）發(fā)生、發(fā)展的分子機制并尋找療效顯著、價格低廉、毒副作用少的藥物具有重大現(xiàn)實意義。

2、天馬ⅲ號方是一種基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的新型中藥方劑，主要用于治療特定類型的腫瘤或相關(guān)疾病。

3、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是指在多組學(xué)技術(shù)指導(dǎo)下運用高通量技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)，通過構(gòu)建藥物成分、靶點、疾病及通過的關(guān)系，確定藥物與疾病之間的作用機制。中醫(yī)藥與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法契合，通過將兩者相結(jié)合，為研究中藥及其復(fù)方的作用機制及科學(xué)內(nèi)涵提供了強有力的保障和新思路。

4、目前，現(xiàn)有技術(shù)中篩選疾病靶點的方法多局限于從一到兩個數(shù)據(jù)庫中獲取數(shù)據(jù)，而這些數(shù)據(jù)庫在數(shù)據(jù)來源、更新頻率以及涵蓋的疾病靶點范圍上存在顯著差異。如cn117352045a公開了一種心脈舒一號口服液治療心臟病的分子作用機制的分析方法，是通過使用gene?cards數(shù)據(jù)庫篩選得到心臟病的治療靶點；cn117409854a公開了一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接分析白楊素治療結(jié)直腸癌作用機制的方法，是選用了geo、disgenet、pharmgkb和ttd數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)直腸癌的靶點。但是，由于這些數(shù)據(jù)庫之間的數(shù)據(jù)不一致性且覆蓋不全，上述方法獲得的結(jié)直腸癌基因并不全面，前者僅使用單一數(shù)據(jù)庫gene?cards，盡管后者的數(shù)據(jù)庫選擇較多，但仍然存在覆蓋不全面的問題，特別是未包含最大疾病靶點數(shù)據(jù)庫genecards，且geo數(shù)據(jù)庫的篩選結(jié)果因選擇不同數(shù)據(jù)集而可能產(chǎn)生較大誤差。此外，geo數(shù)據(jù)庫的篩選結(jié)果因不同數(shù)據(jù)集的選擇可能會出現(xiàn)較大的誤差，增加了分析的不確定性。因此，現(xiàn)有方法不僅在覆蓋范圍上存在缺陷，還容易因為數(shù)據(jù)庫內(nèi)部及跨庫差異導(dǎo)致篩選結(jié)果的不穩(wěn)定性。

5、因此，針對現(xiàn)有疾病靶點選擇的不全面，亟待找到一種分析系統(tǒng)全面，分析誤差少，預(yù)測速度和效率高，降低藥物篩選、開發(fā)成本，為結(jié)直腸癌的防治提供科學(xué)依據(jù)，給其它復(fù)方的研究提供參考價值的天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌作用機制的分析方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種分析系統(tǒng)全面，分析誤差少，預(yù)測速度和效率高，降低藥物篩選、開發(fā)成本，為結(jié)直腸癌的防治提供科學(xué)依據(jù)，給其它復(fù)方的研究提供參考價值的天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌作用機制的分析方法。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：一種天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌作用機制的分析方法，包括以下步驟：

3、（1）先分別從多個數(shù)據(jù)庫中篩選結(jié)直腸癌疾病靶點，再刪除上述多個數(shù)據(jù)庫所得結(jié)直腸癌疾病靶點的重復(fù)值，得篩選的結(jié)直腸癌疾病靶點；

4、（2）先通過多個數(shù)據(jù)庫檢索天馬ⅲ號方的藥物組成，分別得有效活性成分及其靶點，再整合刪除上述多個數(shù)據(jù)庫所得有效活性成分及其靶點的重復(fù)值，得天馬ⅲ號方有效活性成分靶點；

5、（3）將步驟（1）所得篩選的結(jié)直腸癌疾病靶點與步驟（2）所得天馬ⅲ號方有效活性成分靶點取交集，得交集靶點；

6、（4）構(gòu)建步驟（1）所得結(jié)直腸癌疾病靶點與步驟（2）所得天馬ⅲ號方活性成分及其靶點的天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌的“成分-靶點-疾病”共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，得共表達(dá)靶點；將所述共表達(dá)靶點進行蛋白-蛋白互作分析，得多個蛋白蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，進一步使用插件分析，得天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌的潛在核心靶點；

7、分析方法一：先將步驟（3）所得交集靶點進行靶點id轉(zhuǎn)化，再將轉(zhuǎn)化后的id進行g(shù)o和kegg通路富集分析，進一步將kegg富集網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行可視化分析；

8、分析方法二：將步驟（4）所得潛在核心靶點的3d結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵化合物分子進行分子對接，并將對接結(jié)果可視化；

9、分析方法三：采用體外實驗驗證天馬ⅲ號方抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖以及促進結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的情況；

10、分析方法四：采用實時熒光定量法驗證天馬ⅲ號方對步驟（4）所得潛在核心靶點mrna表達(dá)水平的影響。

11、本發(fā)明方法的發(fā)明思路是：本發(fā)明方法的核心在于綜合利用多種疾病靶點數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，系統(tǒng)性地篩選天馬ⅲ號方中對結(jié)直腸癌有潛在作用的活性成分和靶點；通過多數(shù)據(jù)庫交叉驗證和整合分析，可以克服單一數(shù)據(jù)庫信息不全或偏差較大的問題，確保獲得更加全面、準(zhǔn)確的靶點數(shù)據(jù)；再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具，可以構(gòu)建復(fù)方的成分-靶點-通路的多層次網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)解析出天馬ⅲ號方的藥理作用途徑。為了判斷這種組合分析方法是否接近真實的生物機制，本發(fā)明進一步通過體外實驗進行驗證；體外實驗可以從細(xì)胞水平驗證該方劑對結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用是否與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析所預(yù)測的靶點和通路一致，這樣可以通過實驗數(shù)據(jù)支撐和驗證理論分析的準(zhǔn)確性，使得所揭示的機制更接近真實的生物學(xué)作用過程。因此，本發(fā)明方法通過多靶點、多通路、多途徑的協(xié)同作用的綜合分析和實驗驗證，能有效揭示天馬ⅲ號方抑制結(jié)直腸癌的真實機制，提高機制研究的科學(xué)性和可信度。

12、優(yōu)選地，步驟（1）中，所述數(shù)據(jù)庫包括：tcga、geo、genecards、omim、pharmgkb、ttd和disgenet等。與現(xiàn)有選擇的數(shù)據(jù)庫相比較，本發(fā)明方法通過首次全面整合tcga、geo及其它五個數(shù)據(jù)庫（genecards、omim、pharmgkb、ttd和disgenet）的疾病靶點數(shù)據(jù)，顯著區(qū)別于現(xiàn)有僅整合一到多個數(shù)據(jù)庫的研究。這一整合不僅引入了高質(zhì)量的患者樣本數(shù)據(jù)，還增強了跨平臺數(shù)據(jù)比較的能力，促進了對疾病機制的理解和靶點識別的效率。此外，結(jié)合多元數(shù)據(jù)源的分析技術(shù)，不僅有助于基礎(chǔ)研究，還可以推動臨床應(yīng)用的發(fā)展。

13、優(yōu)選地，所述tcga數(shù)據(jù)庫的篩選方法為：從tcga數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸癌rna患者測序數(shù)據(jù)，使用perl腳本對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行處理，并將其轉(zhuǎn)換為基因符號，并提取mrna數(shù)據(jù)，進一步以log?|fc|≥1，adjp≤0.05為篩選條件，通過r語言分析，得差異表達(dá)疾病靶點。本發(fā)明方法首次將tcga數(shù)據(jù)收集為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)疾病數(shù)據(jù)。

14、優(yōu)選地，所述geo數(shù)據(jù)庫的篩選方法為：在geo數(shù)據(jù)庫中，以結(jié)腸癌“colorectalcancer”為檢索詞，獲取gse37364數(shù)據(jù)集，下載正常癌旁組織和腫瘤組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，進一步通過perl軟件分組、r語言分析時，以log?|fc|≥1，adjp≤0.05為篩選條件，得結(jié)腸癌患者組織中的差異表達(dá)基因，將其中的上調(diào)基因和下調(diào)基因作為geo的潛在疾病靶點。

15、優(yōu)選地，所述genecards、omim、pharmgkb、ttd或disgenet數(shù)據(jù)庫的篩選方法為：在上述五個數(shù)據(jù)庫中，分別以結(jié)腸癌“colorectal?cancer”為檢索詞，將五個數(shù)據(jù)庫所得相關(guān)基因，分別通過r語言venn包取并集，分別得結(jié)直腸癌疾病靶點。

16、優(yōu)選地，步驟（2）中，所述數(shù)據(jù)庫包括：傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫、pubchem數(shù)據(jù)庫或pubmed數(shù)據(jù)庫等中的一個或多個。

17、優(yōu)選地，步驟（2）中，以口服生物利用度≥30%、藥物相似度≥0.18為過濾條件進行檢索。

18、優(yōu)選地，步驟（2）中，所述天馬ⅲ號方的藥物組成為：半夏、白花蛇舌草、半枝蓮、三棱、海藻、黃芪和大黃。

19、優(yōu)選地，步驟（2）中，通過perl腳本整合刪除上述多個數(shù)據(jù)庫所得有效活性成分及其靶點的重復(fù)值。

20、優(yōu)選地，步驟（3）中，通過r語言venn包取交集。

21、優(yōu)選地，步驟（4）中，所述構(gòu)建是指：通過perl腳本將天馬ⅲ號方有效活性成分及其靶點和結(jié)直腸癌疾病靶點整合分類為基因組、類型組和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系文件，并將上述分組采用cytoscape軟件進行整合。

22、優(yōu)選地，步驟（4）中，將所述共表達(dá)靶點通過sting數(shù)據(jù)庫，設(shè)置條件中物種信息選擇人類，隱藏未連接的節(jié)點，進行蛋白-蛋白互作分析。

23、優(yōu)選地，步驟（4）中，使用cytoscape軟件的cytohubba插件分析。

24、優(yōu)選地，步驟（4）中，取中心性degree分析排名的前5位作為潛在核心靶點。

25、優(yōu)選地，分析方法一中，采用r語言org.hs.eg包將步驟（3）所得交集靶點進行靶點id轉(zhuǎn)化。

26、優(yōu)選地，分析方法一中，采用clusterprofiler、dose和enrichment?plot包以p＜0.05為篩選條件，將轉(zhuǎn)化后的id進行g(shù)o和kegg通路富集分析。

27、優(yōu)選地，分析方法一中，進一步使用cytoscape軟件將kegg富集網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行可視化分析。使用cytoscape軟件進行kegg富集網(wǎng)絡(luò)的可視化分析，能夠識別出關(guān)鍵靶點和不同通路之間的交互作用，揭示天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌復(fù)雜的生物調(diào)控機制。通過分析網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點，可以確定對特定生物過程影響最顯著的靶點。同時，網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)展現(xiàn)了信號通路之間的關(guān)系，幫助定位功能模塊，發(fā)現(xiàn)潛在的天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物，并為后續(xù)研究提供新的假說。

28、優(yōu)選地，分析方法二中，通過pubchem數(shù)據(jù)庫下載步驟（4）所得潛在核心靶點的3d結(jié)構(gòu)，利用autodocktools1.5.6軟件對蛋白質(zhì)進行去除結(jié)晶水和蛋白質(zhì)受體中的原有配體、對受體蛋白加氫操作，然后利用autodock?vina1.1.2及pymol2.1、discovery?studiov2019軟件將潛在核心靶點的3d結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵化合物分子進行分子對接，其對接結(jié)果以結(jié)合自由能的高低作為與關(guān)鍵化合物分子結(jié)合程度的評價標(biāo)準(zhǔn)。評估潛在核心靶點與關(guān)鍵化合物之間的結(jié)合親和力，顏色越紅代表結(jié)合越穩(wěn)定。此外，通過對接結(jié)果可以篩選出與核心靶點高親和力結(jié)合的化合物，幫助識別出潛在的藥物候選分子。

29、優(yōu)選地，分析方法二中，所述關(guān)鍵化合物分子包括槲黃素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）、黃芩素（baicalein）或β-谷固醇（beta?sitosterol）等中的一種或幾種。關(guān)鍵化合物篩選的個數(shù)可由自己確定，比如本發(fā)明方法選擇了有效活性成分含量排名的前六個。

30、優(yōu)選地，分析方法二中，所述可視化包括：使用r語言pacman包將所述結(jié)合自由能通過熱圖可視化，以及分別將步驟（4）所得潛在核心靶點與關(guān)鍵化合物分子的對接模式可視化。

31、優(yōu)選地，分析方法三中，采用cck8法驗證天馬ⅲ號方抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的情況。通過cck8法驗證天馬ⅲ號方對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，可以定量評估其抗癌活性，包括抑制效果和劑量依賴性。實驗結(jié)果將揭示天馬ⅲ號方呈現(xiàn)顯著的細(xì)胞增殖抑制，并為其作為潛在治療藥物提供初步依據(jù)。此外，該研究可為探討其作用機制提供進一步的支持，幫助理解其通過何種生物學(xué)途徑抑制細(xì)胞增殖。

32、優(yōu)選地，所述cck8法具體為：將結(jié)直腸癌細(xì)胞以1×103～10×103個細(xì)胞/孔密度接種于96孔板上，分為天馬ⅲ號方含藥血清預(yù)設(shè)濃度分別為0～20%的多組，各組均設(shè)4～6個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜后，按照含藥血清預(yù)設(shè)濃度進行分組干預(yù)，均干預(yù)20～28h后，按照80～120μl/孔加入完全培養(yǎng)基配制的cck8溶液，在35～39℃，4～6%?co2下，繼續(xù)孵育1～2h后，分別分析450nm處的吸光度值，組內(nèi)復(fù)孔取均值。

33、優(yōu)選地，分析方法三中，采用流式細(xì)胞術(shù)驗證天馬ⅲ號方促進結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的情況。通過流式細(xì)胞術(shù)驗證天馬ⅲ號方對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的促進作用，可以定量評估細(xì)胞凋亡的百分比和類型，揭示其促凋亡的效果。該分析能夠顯示天馬ⅲ號方處理后細(xì)胞凋亡率的顯著增加，提供相關(guān)信號通路的初步線索，并為進一步探討其作用機制奠定基礎(chǔ)。這些結(jié)果有助于確立天馬ⅲ號方在結(jié)直腸癌治療中的潛在應(yīng)用價值。

34、優(yōu)選地，所述流式細(xì)胞術(shù)具體為：天馬ⅲ號方含藥血清以0～20%的梯度濃度分別干預(yù)結(jié)直腸癌細(xì)胞和陰性對照組細(xì)胞20～28h，分別用預(yù)冷pbs洗滌干預(yù)后的結(jié)直腸癌細(xì)胞和陰性對照組細(xì)胞2～3次，分別加入180～220μl?1×annexin?v結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×106～5×106個細(xì)胞/ml后，再在細(xì)胞懸浮液中加入8～12μl?annexin?v-fitc染色液，輕輕混勻后，于3～5℃避光條件下，孵育5～10min，最后加入8～12μl?pi染色液，輕輕混勻后，于3～5℃避光條件下，孵育5～10min，立即用流式細(xì)胞儀檢測。

35、優(yōu)選地，所述陰性對照組細(xì)胞的預(yù)處理方法為：pbs清洗胰酶消化細(xì)胞，35～39℃，800～1200rpm/min下，離心8～12min，收集胰酶消化細(xì)胞。

36、優(yōu)選地，分析方法三中，所述結(jié)直腸癌細(xì)胞包括：hct116、sw480、dld1、sw620或ht29等中的一種或幾種。

37、優(yōu)選地，分析方法四中，所述實時熒光定量法驗證的具體方法為：收集分析方法三所得天馬ⅲ號方干預(yù)后的結(jié)直腸癌細(xì)胞，采用trizol提取總rna，進一步按照cdna逆轉(zhuǎn)錄劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，建立總反應(yīng)體系體積為18～22μl，在23～27℃下，進行8～12min預(yù)變性處理，擴增條件為：93～97℃下，反應(yīng)25～35s，在55～65℃下，退火25～35s的35～45個循環(huán)；將β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-δδct法對mrna的相對表達(dá)量進行分析。通過實時熒光定量法驗證天馬ⅲ號方對結(jié)直腸癌細(xì)胞的干預(yù)效果，可以定量分析干預(yù)后bcl2、jun、caspase3、xiap和caspase9的mrna相對表達(dá)量。結(jié)果將揭示天馬ⅲ號方對特定基因表達(dá)的影響，為理解其抗癌機制提供重要信息，并有助于識別潛在的生物標(biāo)志物。由于β-actin在多種細(xì)胞類型和不同處理條件下均具有穩(wěn)定的表達(dá)水平，不受實驗條件的影響，因此，選擇β-actin作為內(nèi)參基因。

38、本發(fā)明方法的有益效果為：本發(fā)明方法充分利用生物信息學(xué)方法和計算機技術(shù)，首次將七個疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫聯(lián)用以獲得靶點，減少由于篩選不完善所導(dǎo)致的后續(xù)分析誤差，展現(xiàn)了新的研究手段，并首次構(gòu)建了天馬ⅲ號方治療結(jié)直腸癌的“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，表明其發(fā)揮藥效過程涉及多種過程，主要涉及bcl2、jun、caspase3、xiap及caspase9等多個靶點，主要路徑包括pi3k-akt、il-17、tnf、mapk、p53、細(xì)胞衰老及凋亡等多條通路，發(fā)揮作用核心化合物有槲黃素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、黃芩素和β-谷固醇等，為探究天馬ⅲ號方發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌的作用機制提供了新的研究思路，并結(jié)合實驗驗證，系統(tǒng)全面的揭示了天馬ⅲ號方通過“多靶點、多通路、多途徑”協(xié)同作用抑制結(jié)直腸癌的機制，不僅提高預(yù)測速度和效率，而且降低了藥物篩選、開發(fā)的成本，這些結(jié)果將在后續(xù)研究中進一步驗證，從而為結(jié)直腸癌的防治提供科學(xué)依據(jù)，同時給其它復(fù)方的研究提供參考價值以及新的思路和見解。

39、本發(fā)明中的縮寫說明：crc：結(jié)直腸癌；tmⅲ：天馬ⅲ號方；id：身份標(biāo)識號碼；degree：度值；go：基因本體論；kegg：京都基因和基因組百科全書；tcga：癌癥基因組圖譜；geo：基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫；genecards：人類基因組數(shù)據(jù)庫；omim：人類基因及遺傳病數(shù)據(jù)庫；pharmgkb：藥物基因組知識庫；ttd：藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫；disgenet：疾病基因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫；perl：實用報表提取語言；log?|fc|：log之后的差異倍數(shù)；adjp：校正后的p值；tcmsp：傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺；pubchem：公共化學(xué)數(shù)據(jù)庫；pubmed：ncbi?pubmed生物醫(yī)學(xué)信息檢索平臺；sting：刺激干擾素基因數(shù)據(jù)庫；cck8：細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8；2-δδct法：2的負(fù)δδct法；β-actin：β-肌動蛋白；bp：生物學(xué)過程；cc：細(xì)胞組分；mf：分子功能；pi3k-akt：磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶b通路；il-17：白細(xì)胞介素-17；tnf：腫瘤壞死因子；mapk：絲裂原活化蛋白激酶；p53：腫瘤抑制基因p53；?bcl2：b細(xì)胞淋巴瘤2；jun：jun蛋白；caspase3（casp3）：半胱天冬酶3；xiap：x-linked抑制細(xì)胞凋亡蛋白；caspase9（casp9）：半胱天冬酶9；pbs：磷酸鹽緩沖液。