本發(fā)明涉及藥物提取，具體涉及一種奶牛胎盤肽在制備保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂制品中的用途。

背景技術(shù)：

1、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，cy)作為化療藥物被廣泛使用，可導(dǎo)致腸道細菌種群豐富度降低和潛在病原體數(shù)量增加，并誘導(dǎo)部分革蘭氏陽性細菌轉(zhuǎn)移到次級淋巴器官中。胎盤組織含有多肽、環(huán)肽、甾體、膠原蛋白和氨基酸等大量生物活性物質(zhì)。沈留紅等和張鉞等通過不同蛋白酶酶解奶牛胎盤并預(yù)測酶解產(chǎn)物抗氧化活性，并發(fā)現(xiàn)奶牛胎盤酶解后獲得的多肽具有較強過渡金屬螯合能力、還原力和清除abts自由基能力，并可通過提高抗氧化酶活性來抑制衰老模型小鼠的氧化應(yīng)激，延緩皮膚衰老和肝臟衰老。但目前這些奶牛胎盤酶解物是一種多肽混合物，其中發(fā)揮活性的奶牛胎盤肽成分尚不明確。因此，本發(fā)明應(yīng)用色譜法，通過離子交換、分子篩色譜柱和rp-hplc逐步分餾，經(jīng)lc-ms/ms鑒定分餾產(chǎn)物中多肽序列后，選擇豐度最高奶牛胎盤肽，應(yīng)用并證實奶牛胎盤肽可保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如式ⅰ所示的一種奶牛胎盤肽在制備保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂制品中的用途；

2、

3、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的奶牛胎盤肽的制備方法，包括以下步驟：

4、步驟1、奶牛胎盤剪碎后采用組織勻漿機勻漿，加入木瓜蛋白酶，在ph?6.5，溫度55℃條件下作用4.7h，沸水浴滅活10min后離心，收集上清，冷凍干燥，制得奶牛胎盤酶解物凍干粉；

5、步驟2、將步驟1獲得的奶牛胎盤酶解物凍干粉進一步采用離子交換色譜分離；取25ml30deae纖維素離子交換樹脂填料裝入2×20cm的玻璃層析柱中，采用3倍柱體積磷酸鹽緩沖液(ph值＝7.4)沖洗平衡色譜柱；取適量奶牛胎盤酶解物凍干粉加至磷酸鹽緩沖液(ph值＝7.4)中制得50mg/ml樣品溶液，并距柱面2cm處添加樣品溶液；上樣后采用含氯化鈉(0，0.2，0.4，0.6mol/l)的磷酸鹽緩沖液(ph值＝8.0)梯度洗脫，洗脫速率為2ml/min；每管2ml收集洗脫液，在280nm下檢測吸光度，繪制洗脫曲線；根據(jù)洗脫曲線將洗脫液分為多個餾分；測定各餾分dpph自由基清除能力(各餾分濃度均為5mg/ml)，得到步驟2抗氧化性最強餾分；

6、步驟3、將步驟2抗氧化性最強餾分使用分子篩色譜分離；稱取20g?sephadex?g25凝膠填料，加入200ml去離子水沸水浴溶脹2h，調(diào)節(jié)ph值至6.5，傾倒懸浮在水面上雜質(zhì)，然后緩慢裝入2×30cm玻璃層析柱，距離柱上端約5cm為止，用去離子水以3ml/min平衡3個柱體積；取步驟2所得抗氧化活性最強餾分，加入去離子水配制為20mg/ml樣品溶液，然后取1ml樣品溶液，在距柱面2cm處添加樣品溶液，之后以去離子水為洗脫液，流速3ml/min進行洗脫，最后每管2ml收集洗脫液，在280nm處檢測吸光度，繪制洗脫曲線；根據(jù)洗脫曲線將洗脫液分為多個餾分，凍干后測定dpph自由基清除能力(濃度為5mg/ml)，得到步驟3抗氧化活性最強餾分；

7、步驟4、將步驟3抗氧化活性最強餾分使用rp-hplc分離；采用waters2695高效液相色譜儀分離，取步驟3所得抗氧化活性最強餾分；將餾分凍干粉配制為5mg/ml樣品溶液，以c18反相色譜柱(4.6x250mm)為分析柱，98％超純水、2％乙腈為流動相a，2％超純水、98％乙腈為流動相b，上樣后采用線性梯度洗脫，流速為0.7ml/min，洗脫條件，0～5min，流動相b5％～8％；5～40min，流動相b?8％～18％；40～62min，流動相b18％～32％；62～64min，流動相b?32％～95％；在214nm處檢測吸光度，根據(jù)液相色譜圖可將洗脫液分為多個餾分；凍干各餾分后，測定dpph自由基清除能力(各餾分濃度均為0.1mg/ml)，得到步驟4抗氧化活性最強餾分；

8、步驟5、將步驟4抗氧化活性最強餾分使用lc-ms/ms鑒定；采用easy-nlc高效液相色譜儀串聯(lián)q-exactive質(zhì)譜儀，鑒定步驟4所得抗氧化活性最強餾分中多肽氨基酸序列；將該餾分溶解0.1％甲酸水溶液中，作為樣品溶液；液相色譜條件，以c18反相色譜柱(0.15mm×150mm，3μm)為分析柱，0.1％甲酸水溶液為流動相a，0.1％甲酸和80％乙腈水溶液為流動相b，上樣后采用線性梯度洗脫，流速為600nl/min，洗脫條件，0～2min，流動相b?4％～8％；2～45min，流動相b?8％～28％；45～55min，流動相b?28％～40％；55～56min，流動相b40％～95％；質(zhì)譜分析條件如下，一級質(zhì)譜參數(shù)，resolution為70000，agctarget為3e6，maximumit為100ms，scanrange為100to?1500m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)，resolution為17500，agctarget為1e5，maximumit為50ms，topn為20，nce/steppednce為28；最后，選擇鑒定結(jié)果中豐度最高的奶牛胎盤肽；

9、步驟6、根據(jù)奶牛胎盤肽氨基酸序列，可通過固相法合成奶牛胎盤肽，純度大于95％。

10、本發(fā)明的一種奶牛胎盤肽為qpglpgpag(h-gln-pro-gly-leu-pro-gly-pro-ala-gly-oh)，分子式c35h56n10o11，分子量792.89da，可作為在制備保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂制品。

11、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

12、以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

技術(shù)特征：

1.一種如式ⅰ所示的奶牛胎盤肽在制備保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂制品中的用途；

2.如權(quán)利要求書1所述的用途，其特征在于，奶牛胎盤肽的制備包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的用途，其特征在于：所述奶牛胎盤肽為qpglpgpag(h-gln-pro-gly-leu-pro-gly-pro-ala-gly-oh)，分子式c35h56n10o11，分子量792.89da。

4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的用途，其特征在于：所述奶牛胎盤肽可作為在制備保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂制品。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種如式Ⅰ所示的奶牛胎盤肽在制備保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂制品中的用途；奶牛胎盤肽為QPGLPGPAG(H?Gln?Pro?Gly?Leu?Pro?Gly?Pro?Ala?Gly?OH)，分子式C<subgt;35</subgt;H<subgt;56</subgt;N<subgt;10</subgt;O<subgt;11</subgt;，分子量792.89Da，可作為在制備保護環(huán)磷酰胺致腸道菌群紊亂制品。

技術(shù)研發(fā)人員：沈留紅,盧煒,丁瑜琰,張澤茹,樊磊,唐安國
受保護的技術(shù)使用者：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9