發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、或nrlp3炎性體-相關(guān)疾病的新療法。具體地，本發(fā)明提供了ntcp抑制劑，優(yōu)選前s1肽抑制劑，和包含其的組合物，用于治療所述疾病。也提供了使用ntcp抑制劑，優(yōu)選前s1肽抑制劑治療所述疾病的方法。

背景技術(shù)：

1、動(dòng)脈粥樣硬化

2、動(dòng)脈粥樣硬化，也稱為動(dòng)脈硬化性血管疾病或asvd，是一種與血液白細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞的侵入和積聚，和隨后內(nèi)膜增生和斑塊出現(xiàn)相關(guān)的疾病。

3、動(dòng)脈粥樣硬化是由動(dòng)脈內(nèi)膜中低密度脂蛋白(ldl)的積聚引發(fā)的，并且ldl膽固醇升高是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。hmgcoa還原酶抑制劑(他汀類藥物)已被廣泛用于降低血漿ldl膽固醇水平并降低主要血管事件和心血管死亡的發(fā)生率。除了他汀類藥物之外，過(guò)去幾十年的研究已經(jīng)研發(fā)了一些影響膽固醇自穩(wěn)態(tài)的藥物。例如，依澤替米貝抑制尼曼-匹克c1樣1(npc1l1)的作用，這種蛋白質(zhì)在腸刷狀緣膜上，其在膽固醇吸收中起著重要作用。膽汁酸螯合劑抑制膽固醇吸收以及膽汁酸重吸收。另一方面，高密度脂蛋白(hdl)膽固醇水平與疾病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，并且hdl介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)并展現(xiàn)抗氧化活性。已經(jīng)研究了試圖提高h(yuǎn)dl膽固醇水平或改善hdl功能的藥物療法，但迄今為止所獲成功有限(shih等，2013)。

4、盡管有可以選擇的治療選項(xiàng)，但動(dòng)脈粥樣硬化的治療仍存在大量未滿足的醫(yī)療需求。尤其是，晚期癥狀性動(dòng)脈粥樣硬化患者現(xiàn)有斑塊負(fù)荷的減少是一個(gè)未解決的問(wèn)題。

5、原發(fā)性膽汁性肝硬化

6、原發(fā)性膽汁性肝硬化，也稱為原發(fā)性膽道膽管炎(pbc)，是一種原因不明的慢性膽汁淤積性肝病。來(lái)自門靜脈和門靜脈周炎癥的進(jìn)行性膽管損傷可能導(dǎo)致進(jìn)行性纖維化和最終的肝硬化。迄今為止的證據(jù)表明免疫和遺傳因素在該疾病中起作用。受影響個(gè)體通常是中年女性，其血清肝生化指標(biāo)無(wú)癥狀升高。初次出現(xiàn)疲勞，瘙癢或不明原因的高脂血癥也可能提示原發(fā)性膽汁性肝硬化的診斷。

7、目前的證據(jù)支持原發(fā)性膽汁性肝硬化是免疫介導(dǎo)的疾病的概念。已經(jīng)注意到細(xì)胞和體液異常。門靜脈和門靜脈周區(qū)域t淋巴細(xì)胞的免疫組化染色顯示cd4陽(yáng)性和cd8陽(yáng)性t細(xì)胞。此外，報(bào)道了受影響個(gè)體的無(wú)癥狀一級(jí)親屬中的異常抑制性t細(xì)胞活性。在上皮細(xì)胞損傷區(qū)域表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)粘附分子(例如，icam-1)也可能參與原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)病機(jī)制(talwalkar和lindor，2003)。還觀察到白介素-1β(il-1β)可能通過(guò)改變免疫功能和纖維化而在pbc的發(fā)病機(jī)制中起作用(mueller等，1995)。

8、目前唯一獲批的pbc治療方案是使用熊去氧膽酸(udsa)和奧貝膽酸(oca)的膽汁酸療法。兩種藥物在pbc中的作用機(jī)制與它們激活fxr和tgfr-5的能力有關(guān)，從而發(fā)揮抗炎作用。udca于1997年被fda批準(zhǔn)用于治療pbc。然而，約40％的用udca治療的患者未達(dá)到足夠的生化反應(yīng)。

9、對(duì)于最近批準(zhǔn)的oca，參加關(guān)鍵試驗(yàn)的患者中有90％患有具有基線處的正常總膽紅素(tb)和正常白蛋白水平的早期pbc，而在該研究中包括的大多數(shù)患者接受了udca治療。盡管由于入選人群的性質(zhì)，主要終點(diǎn)被預(yù)先指定為堿性磷酸酶(alp)和tb的減少，但主要終點(diǎn)僅由alp驅(qū)動(dòng)。在第12個(gè)月的3期臨床試驗(yàn)中，與安慰劑組中10％患者相比，oca滴定組中總共46％的患者和oca?10mg組中47％的患者達(dá)到了主要終點(diǎn)(主要?dú)w因于alp的減少)。

10、因此，pbc治療中存在顯著的醫(yī)療需求，特別是對(duì)于晚期疾病患者。

11、nrlp3炎性體相關(guān)疾病和nash

12、炎性體是由核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和含富亮氨酸重復(fù)蛋白(nlr)或aim2，銜接蛋白asc和胱冬酶-1組成的胞質(zhì)多聚蛋白復(fù)合物。它在抵御病原體和炎癥的宿主防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用(davis等，2011；martinon等，2006)。炎性體的激活涉及幾種炎性病癥的發(fā)病機(jī)理，包括2型糖尿病，動(dòng)脈粥樣硬化，痛風(fēng)和阿爾茨海默氏病。特別是，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，2型糖尿病是一種炎性疾病。長(zhǎng)期卡路里過(guò)量驅(qū)動(dòng)的巨噬細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的涌入和隨后放大的促炎環(huán)境在b細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗中起關(guān)鍵作用。臨床上，升高的循環(huán)il-1β是人類2型糖尿病發(fā)展的危險(xiǎn)因素。小鼠模型和人體臨床試驗(yàn)表明il-1β的拮抗作用可能是2型糖尿病的有希望的治療方法(schroder等，2010；guo等，2016)。

13、眾所周知，膽汁酸結(jié)合并激活幾種核受體，包括法尼醇x受體(fxr)。fxr在肝臟和腸中高度表達(dá)，調(diào)節(jié)涉及膽汁酸，脂質(zhì)和葡萄糖代謝的特定靶基因的轉(zhuǎn)錄。最近的研究表明，膽汁酸也可作為g蛋白偶聯(lián)受體tgr5(或g蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體-1)的配體。tgr5在各種組織和細(xì)胞類型中表達(dá)，在膽囊，腸，胎盤和脾臟中表達(dá)相對(duì)較高。先前的體外研究顯示tgr5的活化抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的吞噬作用。體內(nèi)研究表明，tgr5的免疫抑制特性還包括對(duì)代謝性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病的保護(hù)作用，其中組織浸潤(rùn)和免疫細(xì)胞活化是其發(fā)生和發(fā)展的標(biāo)志。fxr和tgr5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗炎和抗纖維化特性可成功用于治療非酒精性脂肪性肝炎(nash)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了用于治療對(duì)象的原發(fā)性膽汁性肝硬化(pbc)的方法中的ntcp抑制劑。還提供了通過(guò)向有需要的對(duì)象提供有效量的ntcp抑制劑來(lái)治療對(duì)象的原發(fā)性膽汁性肝硬化的方法。預(yù)計(jì)ntcp抑制劑的給予導(dǎo)致原發(fā)性膽汁性肝硬化的改善，包括生化參數(shù)的正常化以及炎癥和纖維化進(jìn)展的減少。根據(jù)本發(fā)明使用的ntcp抑制劑可單獨(dú)或與其他藥物一起和/或組合給予對(duì)象用于治療原發(fā)性膽汁性肝硬化。

2、本發(fā)明還提供了用于治療對(duì)象的動(dòng)脈粥樣硬化的方法中的ntcp抑制劑。還提供了通過(guò)向有需要的對(duì)象提供有效量的ntcp抑制劑來(lái)治療對(duì)象的動(dòng)脈粥樣硬化的方法。設(shè)想給予ntcp抑制劑導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病癥的改善，包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的減少，再吸收或消除。根據(jù)本發(fā)明使用的ntcp抑制劑可單獨(dú)或與其他藥物一起和/或組合給予對(duì)象用于治療動(dòng)脈粥樣硬化。

3、本發(fā)明還提供了用于治療對(duì)象的其他nrlp3炎性體相關(guān)疾病的方法中的ntcp抑制劑。具體而言，提供了對(duì)2型糖尿病，動(dòng)脈粥樣硬化，痛風(fēng)，阿爾茨海默氏病和nash的治療。還提供了通過(guò)向有需要的對(duì)象提供有效量的ntcp抑制劑來(lái)治療對(duì)象的上述定義的nrlp3炎性體相關(guān)疾病的方法。設(shè)想ntcp抑制劑的給予導(dǎo)致nrlp3炎性體相關(guān)疾病的改善，包括生化參數(shù)的正常化和疾病進(jìn)展的改善。根據(jù)本發(fā)明使用的ntcp抑制劑可單獨(dú)或與其他藥物一起和/或組合給予對(duì)象用于治療nrlp3炎性體相關(guān)疾病。

4、在一個(gè)方面，本發(fā)明的ntcp抑制劑可以是前s1肽抑制劑，其中前s1肽抑制劑包含含有氨基酸序列nplgfx0p(seq?id?no：15)的肽，并且其中x0是任何氨基酸，優(yōu)選f或l，更優(yōu)選f。前s1肽抑制劑可進(jìn)一步在nplgfx0p(seq?id?no：15)的n末端處包含至少4個(gè)氨基酸的n末端序列。n末端序列可以具有4個(gè)氨基酸以上的任何長(zhǎng)度，但優(yōu)選不超過(guò)19個(gè)氨基酸。優(yōu)選n末端序列的至少一個(gè)氨基酸在側(cè)鏈上具有氨基。因此，前s1肽抑制劑可以包含氨基酸序列nx1sx2x3(seq?id?no：16)，其中x1，x2和x3是在n末端處的任何氨基酸，優(yōu)選直接連接到nplgfx0p(seq?id?no：15)。優(yōu)選x1是l，i或q，優(yōu)選l；x2是t，v，a或不存在，優(yōu)選t或v，更優(yōu)選t；和/或x3是p，s，t或f，優(yōu)選p或s，更優(yōu)選s。因此，前s1肽抑制劑可以包含氨基酸序列nx1sx2x3nplgfx0p(seq?id?no：17)，其中x0是任何氨基酸；x1是l，i或q，優(yōu)選l；x2是t，v，a或不存在，優(yōu)選t或v，更優(yōu)選t；x3是p，s，t或f，優(yōu)選p或s，更優(yōu)選s。

5、前s1肽抑制劑可進(jìn)一步在nplgfx0p(seq?id?no：15)的n末端處包含至少1個(gè)氨基酸的c末端序列。c末端序列可以具有任何長(zhǎng)度，優(yōu)選不超過(guò)93個(gè)氨基酸，不超過(guò)35個(gè)氨基酸，不超過(guò)20個(gè)氨基酸或不超過(guò)10個(gè)氨基酸。前s1肽抑制劑可以包含c端氨基酸序列x4hqldp(seq?id?no：18)，其中x4是任何氨基酸。優(yōu)選x4是d，e或s，優(yōu)選d或e，更優(yōu)選d。c末端序列優(yōu)選直接連接到nplgfx0p(seq?id?no：15)。因此，前s1肽抑制劑可以包含氨基酸序列nplgfx0px4hqldp(seq?id?no：19)，其中x0是任何氨基酸；并且x4是d，e或s，優(yōu)選d或e，更優(yōu)選d。

6、前s1肽抑制劑可以包含氨基酸序列nx1sx2x3nplgfx0px4hqldp(seq?id?no：20)，其中x0是任何氨基酸；x1是l，i或q，優(yōu)選l；x2是t，v，a或不存在，優(yōu)選t或v，更優(yōu)選t；x3是p，s，t或f，優(yōu)選p或s，更優(yōu)選s；并且x4是d，e或s，優(yōu)選d或e，更優(yōu)選d。

7、前s1肽抑制劑可以具有7至119個(gè)氨基酸，15至47個(gè)氨基酸，或15至25個(gè)氨基酸的任何長(zhǎng)度。前s1肽抑制劑可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、74、80、85、90、95、100、110個(gè)氨基酸等的長(zhǎng)度。

8、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)前s1肽編號(hào)，包含在前s1肽抑制劑中的氨基酸序列nplgfx0p(seq?idno：15)對(duì)應(yīng)于hbv病毒的前s1肽的氨基酸位置9至15。上述氨基酸序列nx1sx2x3(seq?id?no：16)和x4hqldp(seq?id?no：18)分別對(duì)應(yīng)于hbv病毒的前s1肽的氨基酸位置4至8和16至21。

9、因此，前s1肽抑制劑可以包含hbv病毒的前s1肽或其功能片段?？梢岳缁谄浣Y(jié)合ntcp、抑制ntcp或降低ntcp活性的能力來(lái)評(píng)估片段的功能性。

10、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)前s肽編號(hào)，前s1肽抑制劑可以至少包含hbv病毒的前s1肽的氨基酸9至15。或者，前s1肽抑制劑可進(jìn)一步包含hbv病毒的前s1肽的氨基酸16，16至17，16至18，16至19，16至19，16至20或16，和/或前s1肽的氨基酸4至8，3至8，2至8。前s1肽抑制劑可包含hbv病毒的前s1肽的氨基酸2至48或2至21或由其組成。還考慮了具有與任何上述序列至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的相同性的序列的前s1肽抑制劑。

11、hbv病毒可能是任何hbv病毒，例如hbv株α1，hbv株lsh，土撥鼠hbv，絨毛猴hbv(wmhbv)，猩猩hbv，黑猩猩hbv，大猩猩hbv，人類hbv，hbv亞型ad，adr，adw，adyw，ar或ayw，或hbv基因型a，b，c，d，e，f，g或h。

12、示例性的前s1肽抑制劑包含hbv前s1共有序列的位置2和48之間的氨基酸序列：

13、gtnl?svpnp?lgffp?dhqld?pafra?nsnnp?dwdfn?pnkdh?wpean?kvg(seq?id?no：12)，或

14、hbv前-s1基因型c序列的2至48位的氨基酸序列：

15、gtnl?svpnp?lgffp?dhqld?pafga?nsnnp?dwdfn?pnkdh?wpean?qvg(seq?id?no：14)，或

16、hbv前-s1基因型c序列的2至48位的氨基酸序列，其中第46位具有氨基酸取代(gin(q)→lys(k))：

17、gtnl?svpnp?lgffp?dhqld?pafga?nsnnp?dwdfn?pnkdh?wpean?kvg(seq?id?no：13)，或

18、hbv前-s1基因型d序列的2至48位的氨基酸序列：

19、gqnl?stsnp?lgffp?dhqld?pafra?ntanp?dwdfn?pnkdt?wpdan?kvg(seq?id?no：5)。

20、還考慮了長(zhǎng)度為至少15個(gè)氨基酸的上述氨基酸序列的片段，以及與上述示例性序列具有至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的相同性的序列，其中保持前s1肽抑制劑的活性。該活性包括ntcp結(jié)合，ntcp抑制，ntcp活性降低中的任一種。該活性還可以是預(yù)防或減少hbv與ntcp的結(jié)合。

21、前s1肽抑制劑可以在n末端處或其周圍被一個(gè)或多個(gè)疏水部分修飾。疏水部分修飾可以通過(guò)?；缬萌舛罐Ⅴ；蛴仓；M(jìn)行?；?。

22、優(yōu)選的前s1肽抑制劑具有g(shù)tnl?svpnp?lgffp?dhqld?pafga?nsnnp?dwdfn?pnkdhwpean?kvg(seq?id?no：13)的氨基酸序列，其中該肽在n末端被肉豆蔻?；揎棥?/p>

23、優(yōu)選的前s1肽抑制劑是具有以下化學(xué)式的myrcludex?b：

24、n-肉豆蔻酰-甘氨酰-l-蘇氨酰-l-天冬酰胺酰-l-亮氨酰-l-絲氨酰-l-纈氨酰-l-脯氨酰-l-天冬酰胺酰-l-脯氨酰-l-亮氨酰-甘氨酰-l-苯丙氨酰-l-苯丙氨酰-l-脯氨酰-l-天冬氨酰-l-組氨酰-l-谷氨酰胺酰-l-亮氨酰-l-天冬氨酰-l-脯氨酰-l-丙氨酰-l-苯丙氨酰-甘氨酰-l-丙氨酰-l-天冬酰胺酰-l-絲氨酰-l-天冬酰胺酰-l-天冬酰胺酰-l-脯氨酰-l-天冬氨酰-l-色氨酰-l-天冬氨酰-l-苯丙氨酰-l-天冬酰胺酰-l-脯氨酰-l-天冬酰胺酰-l-賴氨酰-l-天冬氨酰-l-組氨酰-l-色氨酰-l-脯氨酰-l-谷氨酰-l-丙氨酰-l-天冬酰胺酰-l-賴氨酰-l-纈氨酰-甘氨酰胺，乙酸鹽。

25、可以進(jìn)一步在c末端或其它地方修飾該前s1肽抑制劑以保護(hù)該肽免于降解?？捎糜诖四康牡氖纠员Ｗo(hù)部分是d-氨基酸、環(huán)狀氨基酸、修飾的氨基酸、聚糖、天然或合成聚合物如聚乙二醇(peg)。

26、本發(fā)明的前s1肽抑制劑，特別是myrcludex?b可以以這樣的劑量給予患者，使得在ntcp位點(diǎn)(即肝細(xì)胞中)的前s1肽抑制劑的濃度等于或高于約1至10nm的ki。因此，前s1肽抑制劑的日劑量可以在0.1mg至50mg，0.5mg至20mg，1mg至15mg，1mg至10mg，1mg至5mg之間，例如1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，11mg，12mg，13mg，14mg，15mg，16mg，17mg，18mg，19mg，或20mg，優(yōu)選2mg，5mg，或10mg，最優(yōu)選5mg。前s1肽抑制劑的每日劑量也可以在約0.0014mg/kg體重至約0.7mg/kg體重之間，優(yōu)選在約0.014mg/kg體重至約0.28mg/kg體重(1mg至20mg)。

27、前s1肽抑制劑可以給予持續(xù)2周，3周，4周，5周，6周，12周，24周，36周，48周，60周，1年，1.1年，1.2年，1.3年，1.4年，1.5年，1.6年，1.7年，1.8年，1.8年，1.9年，或2.0年，或3年，或4年或更長(zhǎng)。

28、前s1肽抑制劑可以通過(guò)任何合適途徑例如皮下，靜脈內(nèi)，經(jīng)口，經(jīng)鼻，肌內(nèi)，透皮，通過(guò)吸入或栓劑，優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下給予。

29、在另一方面，ntcp抑制劑可以是阻止或減少ntcp的產(chǎn)生和/或功能的前s1肽抑制劑以外的化合物或試劑。

30、本發(fā)明的ntcp抑制劑可以單獨(dú)或一起給予。具體地，上述的前s1肽抑制劑可以與另一種ntcp抑制劑一起給予。兩種或更多種ntcp抑制劑可以同時(shí)/伴隨給藥。根據(jù)該給藥時(shí)間表，兩種或更多種ntcp抑制劑的給藥在時(shí)間上重疊。兩種或更多種ntcp抑制劑的給藥持續(xù)時(shí)間可以相同或基本相同。例如，前s1抑制劑和其它ntcp抑制劑可以給予持續(xù)至少一個(gè)周期或包含一個(gè)或多個(gè)周期(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)周期)的療程。一個(gè)周期的持續(xù)時(shí)間可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12周或更長(zhǎng)。一個(gè)周期的持續(xù)時(shí)間可以至少是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12周。一個(gè)療程的持續(xù)時(shí)間可能是12周，24周，36周，48周，60周，1年，1.1年，1.2年，1.3年，1.4年，1.5年，1.6年，1.7年，1.8年，1.8年，1.9年，或2.0年，或3.0年，或4.0年。例如，24周的前s1肽抑制劑myrcludes?b療程可以與24周的另一種ntcp抑制劑療程同時(shí)進(jìn)行。在該給藥方案中，myrcludex?b可以每天給予，而ntcp抑制劑可以每周給予。在該給藥方案中，可以同時(shí)給予前s1肽抑制劑和另一種ntcp抑制劑，例如基本上同時(shí)或以單一組合物給予。

31、取決于成分的類型，前s1肽抑制劑和另外的ntcp抑制劑可以通過(guò)各種遞送途徑給予對(duì)象。給藥途徑包括腸內(nèi)途徑(例如，經(jīng)口和直腸)，胃腸外途徑(例如靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下腹膜內(nèi))，局部途徑。優(yōu)選地，前s1肽抑制劑皮下遞送。

32、根據(jù)本發(fā)明使用的ntcp抑制劑可以在包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，賦形劑，佐劑的藥物組合物中。

33、本發(fā)明主要用于人類治療；然而，任何哺乳動(dòng)物的治療也包括在內(nèi)。