本發(fā)明屬于新型骨組織工程材料領(lǐng)域，是一種對(duì)氧化鈰基納米酶進(jìn)行功能化修飾，使其具有良好的促進(jìn)骨組織再生功能的新型材料的制備工藝。

背景技術(shù)：

1、骨修復(fù)過(guò)程通常分為三個(gè)階段，包括反應(yīng)期（血腫和炎癥期）、修復(fù)期（愈傷組織形成期）和重塑期。早期的急性炎癥是消滅病原體和維持組織穩(wěn)態(tài)的重要生物學(xué)過(guò)程。然而，如果促炎刺激持續(xù)存在，則該過(guò)程可能發(fā)展成慢性炎癥狀態(tài)，慢性炎癥則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子和其他因子的持續(xù)分泌、持續(xù)的組織破壞和內(nèi)環(huán)境的受損，這對(duì)機(jī)體愈合是有害的。

2、當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，先天免疫系統(tǒng)被激活，以重建正常的穩(wěn)態(tài)。在免疫細(xì)胞中，最重要的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞按照其表型和分泌的細(xì)胞因子可以分為兩種極化類(lèi)型：以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎功能的巨噬細(xì)胞稱(chēng)為m1型巨噬細(xì)胞，其主要發(fā)揮針對(duì)微生物的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮宿主免疫功能，也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體正常組織的炎癥損傷。以發(fā)揮降低炎癥反應(yīng)，發(fā)揮組織修復(fù)功能為主的巨噬細(xì)胞稱(chēng)為m2型巨噬細(xì)胞，尤其在炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和纖維變性。更重要的是，巨噬細(xì)胞表面具有豐富的葉酸受體，這為材料和藥物在體內(nèi)的分布和靶向富集奠定了基礎(chǔ)。

3、氧化應(yīng)激是因細(xì)胞內(nèi)活性氧物種（ros）的產(chǎn)生，或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損而導(dǎo)致的氧物種代謝產(chǎn)物的過(guò)量積累，從而對(duì)生物體造成損傷的一種生理狀態(tài)。納米氧化鈰具有模擬超氧歧化酶（sod）和過(guò)氧化氫酶（cat）的抗氧化性質(zhì)，可消除多種ros（o2-，·o2-，h2o2，·oh）。納米氧化鈰可以通過(guò)清除ros緩解促炎m1型極化，同時(shí)通過(guò)消除應(yīng)激刺激引發(fā)的過(guò)度產(chǎn)生的ros，促進(jìn)抗炎m2型極化。

4、理想的骨修復(fù)材料應(yīng)具有可塑性；無(wú)毒并具有良好的生物相容性；降解的速度適當(dāng)且降解的產(chǎn)物無(wú)害性；與骨組織相近的力學(xué)強(qiáng)度；分布均勻合適的孔隙可以供細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)；良好的骨誘導(dǎo)性等性質(zhì)。功能性稀土氧化物被有計(jì)劃地?fù)诫s到其中，賦予了材料新的特征：改善材料的生物相容性，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，改善局部微環(huán)境等。

5、氧化鈰（ceo2）是一種常見(jiàn)的催化材料。在納米尺度下,?由于表面氧缺陷的產(chǎn)生,氧化鈰中部分?ce4+被還原為?ce3+以穩(wěn)定缺陷。此時(shí)材料中的?ce3+和?ce4+能夠可逆的轉(zhuǎn)化,這一性質(zhì)使得納米?ceo2能夠催化分解生物體內(nèi)的過(guò)量自由基,?從而消除超氧自由基(o2·-)、過(guò)氧化氫(h2o2)、羥基自由基(·oh)等。這一性質(zhì)有助于減緩炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活局部免疫調(diào)節(jié)，最終為新骨再生提供有利的微環(huán)境。

6、納米顆粒的表面修飾是一種常見(jiàn)的改性手段。一般情況下，用物理、化學(xué)方法對(duì)離子表面進(jìn)行處理，有目的的改變顆粒表面的物理化學(xué)性質(zhì)，如表面原子層結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，表面親疏水性，電性和反應(yīng)特性等，實(shí)現(xiàn)科研人員對(duì)納米微粒的表面控制。摻雜是另一種改善材料性能常用手段。有目的在某種材料或基質(zhì)中摻入少量其他元素或化合物，可以使材料、基質(zhì)產(chǎn)生特定的物理、電學(xué)、磁學(xué)和光學(xué)等性能，從而使其具有特定的價(jià)值或用途。

7、基于此，本發(fā)明中涉及的這類(lèi)氧化鈰基骨組織工程材料將以納米氧化鈰獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)為基礎(chǔ)，發(fā)明了一類(lèi)具有優(yōu)異的促進(jìn)成骨分化效果的新型材料，以期對(duì)骨修復(fù)材料的發(fā)展起到引導(dǎo)和借鑒作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)分析，提供了用于骨缺損修復(fù)的氧化鈰基納米材料及其制備方法。

2、本發(fā)明的用于骨缺損修復(fù)的氧化鈰基納米材料，其通過(guò)對(duì)氧化鈰基納米酶進(jìn)行表面修飾來(lái)制備，其中，所述表面修飾包括將靶向性配體和/或碳量子點(diǎn)引入氧化鈰基納米酶。

3、進(jìn)一步的，本發(fā)明的用于骨缺損修復(fù)的氧化鈰基納米材料的尺寸分布范圍可以為2?nm至100?nm，優(yōu)選為5?nm。

4、本發(fā)明的用于骨缺損修復(fù)的氧化鈰基納米材料所涉及的氧化鈰基納米酶的晶粒尺寸為5?nm的狹窄分布。更小的尺寸意味著更大的比表面積，更高效的ce3+與ce4+的相互轉(zhuǎn)化。利用鈰離子3+、4+價(jià)轉(zhuǎn)化可以使鈰兼具氧化催化劑和還原催化劑的作用，從而表現(xiàn)出多種酶模擬活性，例如：超氧化物歧化酶（sod）、過(guò)氧化氫酶（cat）的酶活性。

5、進(jìn)一步的，用于表面修飾的靶向性配體包括葉酸、甘露糖、磷脂酰絲氨酸或內(nèi)毒素脂多糖。例如，葉酸配體可以被巨噬細(xì)胞表面的葉酸受體捕獲，從而使氧化鈰基納米材料富集在巨噬細(xì)胞表面。

6、巨噬細(xì)胞作為人體重要的免疫細(xì)胞，按照其表型和分泌的細(xì)胞因子可以分為經(jīng)典活化(classically?activated)的m1型和選擇性活化(alternatively?activated)的m2型巨噬細(xì)胞。伴隨著具有靶向性的氧化鈰基納米材料被細(xì)胞內(nèi)化，氧化鈰基納米材料通過(guò)模擬超氧歧化酶和過(guò)氧化氫酶的抗氧化性質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)的過(guò)量產(chǎn)生的活性氧（ros）的清除，使發(fā)揮促炎作用的m1表型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，發(fā)揮抗炎作用的m2表型巨噬細(xì)胞增加。

7、進(jìn)一步的，用于表面修飾的碳量子點(diǎn)包括含氨基、羥基、羧基或雙鍵的碳量子點(diǎn)，并且經(jīng)含氨基碳量子點(diǎn)表面修飾后的氧化鈰基納米酶在可見(jiàn)光或近紅外光激發(fā)下，發(fā)射出黃色或紅色熒光。

8、進(jìn)一步的，氧化鈰基納米酶通過(guò)以下方法制備：溶劑熱法，熱分解法或溶膠-凝膠法。

9、本發(fā)明還公開(kāi)了一種氧化鈰基復(fù)合骨支架，其通過(guò)將氧化鈰基納米酶和/或氧化鈰基納米材料與骨組織工程材料經(jīng)過(guò)復(fù)合步驟來(lái)制備。

10、進(jìn)一步的，上述復(fù)合步驟包括球磨、共價(jià)接枝或物理吸附。

11、進(jìn)一步的，上述骨組織工程材料包括生物玻璃、羥基磷灰石、聚己內(nèi)酯中的一種或更多種。

12、進(jìn)一步的，上述氧化鈰基納米酶和/或氧化鈰基納米材料在氧化鈰基復(fù)合骨支架中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1wt.%至20wt.%。

13、上述用于骨缺損修復(fù)的氧化鈰基納米酶和/或氧化鈰基納米材料被摻雜在骨支架材料中，隨著支架的降解而被釋放到骨缺損部位。

14、本發(fā)明公開(kāi)的用于骨缺損修復(fù)的氧化鈰基納米材料的制備方法，包括以下步驟：

15、1）制備氧化鈰基納米酶；

16、2）將靶向性配體和/或碳量子點(diǎn)引入所述氧化鈰基納米酶。

17、其中，制備氧化鈰基納米酶的步驟包括：

18、步驟一：將硝酸鈰銨與結(jié)晶乙酸鈉溶于水，加入乙酸酸化，攪拌溶解并轉(zhuǎn)移到襯有聚四氟乙烯的高壓釜中，在鼓風(fēng)烘箱內(nèi)經(jīng)溶劑熱反應(yīng)得到乳白色懸濁液。

19、步驟二：將步驟一所得的懸濁液洗滌、離心，最后真空冷凍干燥獲得氧化鈰基納米酶。

20、進(jìn)一步的，在步驟一中，硝酸鈰銨與結(jié)晶乙酸鈉的摩爾比為1:12至1:16，優(yōu)選為1:15；溶劑熱反應(yīng)的溫度為220?℃，時(shí)長(zhǎng)為12小時(shí)。

21、在本發(fā)明中，通過(guò)上述方法制備的氧化鈰基納米酶一般為乳白色蓬松粉末。

22、在本發(fā)明中，將靶向性配體和/或碳量子點(diǎn)引入氧化鈰基納米酶的步驟包括：

23、步驟一：將氧化鈰基納米酶加入至聚丙烯酸和二乙二醇的混合溶液中，并在惰性氣體環(huán)境下加熱攪拌，然后冷卻至室溫后加入無(wú)水乙醇，產(chǎn)生棕色沉淀，經(jīng)洗滌、離心、真空冷凍干燥，獲得羧基修飾的氧化鈰基納米酶。

24、步驟二：將羧基修飾的氧化鈰基納米酶分散于2-(n-嗎啡啉)乙磺酸溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）和n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）以活化羧基，得到包含羧基活化的氧化鈰基納米酶的分散液。

25、步驟三：將包含羧基活化的氧化鈰基納米酶的分散液與含氨基碳量子點(diǎn)混合攪拌，經(jīng)洗滌、離心、真空冷凍干燥，獲得碳量子點(diǎn)復(fù)合氧化鈰基納米酶。

26、步驟四：將包含羧基活化的氧化鈰基納米酶的分散液與聚乙烯亞胺水溶液混合攪拌，經(jīng)洗滌、離心、真空冷凍干燥，獲得氨基修飾的氧化鈰基納米酶。

27、步驟五：將氨基修飾的氧化鈰基納米酶分散到水中，與預(yù)先用edc和nhs活化羧基的葉酸配體混合并攪拌，經(jīng)洗滌、離心、真空冷凍干燥，獲得葉酸修飾的氧化鈰基納米酶，即，靶向性氧化鈰基納米酶。

28、進(jìn)一步的，在步驟一中，聚丙烯酸與所述氧化鈰基納米酶的摩爾比為1:6，加熱溫度為240?℃，時(shí)長(zhǎng)為1.5小時(shí)，反應(yīng)環(huán)境為惰性氣體。

29、進(jìn)一步的，在步驟二中，2-(n-嗎啡啉)乙磺酸溶液的ph為5.5。

30、進(jìn)一步的，在步驟二和步驟四中，edc和nhs的摩爾比為2:5，活化羧基的時(shí)間為0.5至2小時(shí)。

31、進(jìn)一步的，在步驟三中，碳量子點(diǎn)復(fù)合氧化鈰基納米酶在可見(jiàn)光或近紅外光激發(fā)下，發(fā)射出黃色或紅色熒光。

32、有益效果

33、本發(fā)明的至少具有如下技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)。

34、氧化鈰基納米材料具有出色的清除活性氧的功能，從而可以緩解炎癥并促進(jìn)骨組織的再生?？梢哉{(diào)節(jié)局部微環(huán)境，降低骨缺損部位的炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了良好的骨免疫調(diào)節(jié)。

35、在氧化鈰基納米材料中包含的氧化鈰基納米酶的刺激下，巨噬細(xì)胞將分泌成骨和成血管相關(guān)的生物因子，刺激下游成骨細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞分別向新生的骨組織和血管轉(zhuǎn)化。與此同時(shí)，兩種細(xì)胞之間還能實(shí)現(xiàn)生物因子的交叉刺激，同時(shí)促進(jìn)骨形成和血管生成，最終實(shí)現(xiàn)體內(nèi)骨整合。