本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及阿司匹林在預防和治療eb病毒相關性鼻咽癌的藥物中的應用。

背景技術：

全球90％人類均能被eb病毒(eptein-barrvirus,ebv)感染，且長期處于潛伏感染狀態(tài)。其與與鼻咽癌(npc))的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前臨床治療上主要以放射、化療治療為主。只有在患者處于i、ii期時，放療可獲得較好的治療效果。但實際情況是，鼻咽癌發(fā)病部位隱蔽，大部分患者就診時，病情已經(jīng)發(fā)展到晚期，放化療效果不理想，而且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是導致晚期患者死亡的主要有原因。阿司匹林是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，現(xiàn)多用于預防血栓、心臟病等疾病，尚未有其關于轉(zhuǎn)移方面的研究與應用。eb病毒潛伏膜蛋白1(lmp1)eb病毒的主要癌蛋白，能夠誘導多種信號通路(如，nf-κb、mapkkinase(erk，p38和jnk)、jak/stat)，引起上皮細胞形態(tài)與表型的改變，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)，導致腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。在低分化和未分化鼻咽癌組織中，eb病毒潛伏蛋白1(lmp1)幾乎都能被檢測到，且越來越多的研究結果表明，eb病毒的作用伴隨著鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。前期研究發(fā)現(xiàn)，ebvlmp1與鼻咽癌轉(zhuǎn)移呈正相關。

micrornas是一類高度保守的非編碼小rna，主要通過與靶基因的3'末端非翻譯區(qū)互補配對、從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，抑制基因的表達，調(diào)控機體多種而復雜的生命活動進程。越來越多的證據(jù)表明mirnas表達異常參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系。發(fā)明人前期研究已證明,在ebv相關的鼻咽癌中，lmp1能夠通過nf-κb的活化使mir-203低表達或表達缺失，促進腫瘤細胞emt。

外泌體是一類大小為30至150nm的胞外囊泡亞群。絕大多數(shù)細胞均能產(chǎn)生外泌體。外泌體包含各種生物大分子，包括dna，mirna，mrna，蛋白質(zhì)和其他生物活性分子，其通過轉(zhuǎn)移上述分子介導細胞與細胞間的通信，調(diào)控受體細胞各項復雜生命活動過程，是微環(huán)境中的一種重要介質(zhì)。研究證明，從腫瘤細胞釋放的外泌體能影響腫瘤的形成，生長，轉(zhuǎn)移和耐藥?，F(xiàn)已觀察到ebv陽性腫瘤細胞能夠分泌含有l(wèi)mp1的外泌體。某些蛋白或分子可在外泌體中富集，進入血液，從而比直接檢測更容易。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出阿司匹林(asp)抑制ebv相關鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，為該類型患者提供轉(zhuǎn)移方面的預防和治療新策略。并結合檢測血清外泌體中l(wèi)mp1和mir-203的表達，輔助診斷患者轉(zhuǎn)移發(fā)生的風險性，并及時給予asp的治療，有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，為鼻咽癌的抗轉(zhuǎn)移治療提供了新的策略。

我們研究表明，在鼻咽癌組織樣本中，lmp1與mir-203表達呈負相關。asp處理腫瘤細胞，抑制nf-κb的活化，促進mir-203表達。并且，asp通過抑制ebv陽性細胞中l(wèi)mp1的外泌并增加mir-203的外泌，抑制npc細胞的emt和轉(zhuǎn)移。在外泌體中，lmp1和mir-203也存在負性關系。在裸鼠實驗中，通過注射具有高轉(zhuǎn)移性的npc細胞5-8f，并對實驗組裸鼠給以asp治療，對照組不進行asp處理。結果顯示，與對照組相比，腫瘤細胞5-8f轉(zhuǎn)移到肺組織的概率明顯降低。這些研究結果提示，在ebv相關鼻咽癌中，asp能夠作為抑制鼻咽癌患者轉(zhuǎn)移的預防和治療新藥物(asp能夠抑制具有高轉(zhuǎn)移性鼻咽癌細胞系5-8f的轉(zhuǎn)移)，并結合檢測外泌體中l(wèi)mp1和mir-203的表達，為鼻咽癌患者轉(zhuǎn)移的診斷、預防和治療提供新的方法。asp在eb病毒相關性鼻咽癌轉(zhuǎn)移的治療應用中，具有巨大潛力。

本發(fā)明中判定給予asp治療的輔助性檢測指標與方法，即為檢測血清外泌體中l(wèi)mp1和mir-203的表達。該檢測方法流程為：(1)提取鼻咽癌患者血清外泌體47例，正常人血清11例，提取總rna；(2)以總rna為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cdna；(3)以lmp1和mir-203特異性引物，熒光定量pcr檢測lmp1和mir-203的表達，β-actin和u6分別為內(nèi)參基因。定量δct＝待測基因lmp1與內(nèi)參基因平均δct值的差值，判斷δct是否小于過等與2.46，當δct≤2.46時，提示lmp1高表達，患者轉(zhuǎn)移風險大，考慮給予患者asp治療；或者定量δct＝待測基因mir-203與內(nèi)參基因u6平均δct值的差值，判斷δct是否小于或等于3.15，當δct≤3.15時，提示mir-203高表達，患者腫瘤轉(zhuǎn)移風險小，不需要給予患者asp治療。上述方法中，熒光定量pcr時，所用的lmp1的特異性引物為：正向：5'-tgaacaccaccacgatgact-3'(seqidno.1)

反向：5'-gtgcgcctaggttttgagag-3'(seqidno.2)

所用內(nèi)參基因β-actin引物序列為：

正向：5’-tcaccaactgggacgacatg-3’(seqidno.3)

反向：5’-gtcaccggagtccatcacgat-3’(seqidno.4)

mir-203和u6特異性引物購買于銳博生物公司。

總之，鼻咽癌是一種惡性上皮性腫瘤，具有高度轉(zhuǎn)移性。轉(zhuǎn)移是晚期鼻咽癌治療失敗和患者死亡的主要原因。eb病毒(ebv)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，是公認的致瘤病毒。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，ebv編碼的癌蛋白lmp1能夠通過活化的nf-κb下調(diào)上皮特異性mir-203的表達，促進腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(emt)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換是發(fā)生轉(zhuǎn)移的前奏。阿司匹林(asp)能夠通過抑制nf-κb的活性，促進mir-203的表達，進而抑制鼻咽癌腫瘤細胞的emt。而且，asp抑制ebv陽性細胞中l(wèi)mp1(ebv編碼的潛伏膜蛋白1)的外泌，促進被lmp1抑制的mir-203的上調(diào)并被裝配到外泌體中，將mir-203傳遞到臨近或遠處轉(zhuǎn)移的癌細胞中，從而抑制腫瘤細胞emt和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。這就提示，可以通過檢測待測患者血清中外泌體中l(wèi)mp1和mir-203的表達，預測病人發(fā)生轉(zhuǎn)移的風險，并以此來判定是否給予鼻咽癌患者asp的治療及療效的評估。檢測血液外泌體中l(wèi)mp1和mir-203的表達，既方便，又不會對患者造成創(chuàng)傷。asp應用于鼻咽癌轉(zhuǎn)移抑制治療是該藥物的一種新用途，檢測血液外泌體中l(wèi)mp1和mir-203的水平?jīng)Q定用藥和療效評估。本發(fā)明可以定量檢測各人群中血清樣外泌體樣本中l(wèi)mp1和mir-203的表達情況，從而預測鼻咽癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性，以及對患者進行治療的新策略。

附圖說明

圖1：腫瘤組織中檢測lmp1和mir-203的表達圖；在鼻咽癌患者腫瘤組織中，lmp1高表達，mir-203低表達，并且lmp1與mir-203的表達呈負相關；normal代表正常人鼻咽組織樣本，tumors代表鼻咽癌患者鼻咽部組織樣本；

圖2：asp抑制ebv陽性腫瘤細胞的emt；a和b，分別用asp處理ebv陽性細胞系(c666-1和c2089)，抑制npc重要信號通路nf-κb的活化(p-p65)，促進mir-203以及emt的上皮標志分子e-cadherin的表達，抑制間質(zhì)標志分子n-cadherin，slug，snail和vimentin的表達；dmso為陰性對照；

圖3：asp處理后裸鼠肺組織中的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移；a.對照組發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的he染色，箭頭所指的為腫瘤細胞；b.為實驗組發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的he染色，箭頭所指的為腫瘤細胞。c.正常肺組織，無轉(zhuǎn)移灶。d.asp處理組裸鼠體重明顯比對照組要高，dmso是藥物溶解劑。e.asp處理組的轉(zhuǎn)移灶，顯著少于對照組，dmso是藥物溶解劑；

圖4：asp抑制lmp1外泌；a.asp處理ebv陽性細胞系(c666-1和c2089)，asp抑制lmp1的外泌，促進mir-203的外泌；dmso為陰性對照。cd63為外泌體的標志分子；

圖5：鼻咽癌腫瘤患者血清樣本中，lmp1和mir-203的表達情況；提取鼻咽癌患者和正常人血清樣本中rna，rt-qpcr檢測lmp1和mir-203的表達。結果顯示，在ebv相關性的鼻咽癌血清外泌體組織樣本中l(wèi)mp1高表達，mir-203低表達，且兩者存在負相關。normal代表正常人樣本，tumors代表鼻咽癌患者血清樣本。

具體實施方式

研究表明，lmp1抑制mir-203的表達，且lmp1與鼻咽癌轉(zhuǎn)移呈正相關。在鼻咽癌腫瘤組織中，lmp1與mir-203的表達呈負相關，如圖1所示。asp處理ebv陽性細胞系(c666-1和c2089)，抑制nf-κb的活化，促進mir-203和emt的上皮標志分子e-cadherin的表達，抑制間質(zhì)標志分子n-cadherin，slug，snail和vimentin的表達，進而抑制emt，如圖2所示。

對14只balb/c裸鼠中，注射相同數(shù)量的，具有高轉(zhuǎn)移性鼻咽癌細胞系5-8f。實驗組(裸鼠7只)給予asp治療(按裸鼠體重給藥100mg/kg溶解于飲水中，以口服的方式進行)，對照組(裸鼠7只)不給予asp治療。結果顯示，實驗組，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的裸鼠數(shù)量為4只，轉(zhuǎn)移率為50％，而明顯小于對照組轉(zhuǎn)移率(86％)。而且，對照組發(fā)生肺轉(zhuǎn)移形成的多個轉(zhuǎn)移病灶和病灶大小，明顯多于給予asp治療的實驗組，通過統(tǒng)計，對照組腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的百分比達到86％，而實驗組腫瘤細胞下降到50％，并且對照組裸鼠體重明顯輕于asp處理組(圖3a-3e)。即表明asp有明顯抑制鼻咽癌腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移的作用。在圖4中，asp處理ebv陽性細胞后，抑制lmp1的外泌，促進mir-203外泌，進而抑制emt。通過提取鼻咽癌患者血清外泌體，檢測血清外泌體組織樣本中l(wèi)mp1和mir-203的表達，結果如圖5所示，lmp1高表達，mir-203低表達，且兩者存在負相關。normalsamples代表正常人血清樣本，tumorsserumsamples代表鼻咽癌患者血清樣本。這些結果都表明asp能夠抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，并能通過檢測血清中外泌體中l(wèi)mp1和mir-203給予輔助性診斷。

(一)組織樣本rna提取(trizol)：

利用血清外泌體提取試劑盒，提取每1ml血清樣本中的外泌體。提取外泌體rna。將提取的外泌體置于無菌無酶ep管中，加入1mlrnatrizol；也可在液氮中碾磨組織后加入到1mlrnatrizol中。室溫放置10-20分鐘，加入氯仿0.2ml于ep管中，冰上放置5分鐘，4℃離心，12000rpm，15分鐘；小心區(qū)分上層水相于新的ep管中，可重復氯仿抽提步驟；加入預冷的0.5ml異丙醇，混和均勻，放置冰上15分鐘，4℃，12000rpm離心，10分鐘后，棄去上層清液；加入75％乙醇，4℃離心，7600rpm，5分鐘；室溫干燥5-10分鐘后，加入20ul-50uldepc水。在儀器nanodrop2000中，測定rna濃度，od260/280比值在1.7-2.0之間并進行eb膠電泳檢測rna質(zhì)量，-80℃保存。

(二)逆轉(zhuǎn)錄

對上述提取的總rna進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的反應體系參照thermoscientificrevertaidfirststrandcdnasynthesiskit說明書，進行配置(20ul)：

water,nuclease-free補至20ul總體系

程序：42℃，60分鐘；70℃，5分鐘；反應結束。

mir-203逆轉(zhuǎn)錄特異性引物由長沙銳博省公司設計。

(三)real-timeqpcr

將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋五倍后，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，pcr反應體系(25ul)：

lmp1引物：

正向：5'-tgaacaccaccacgatgact-3'(seqidno.1)

反向：5'-gtgcgcctaggttttgagag-3'(seqidno.2)

mir‐203realtimepcr長沙銳博生物公司設計完成。

所用內(nèi)參基因β-actin引物序列為：

正向：5'-tcaccaactgggacgacatg-3'(seqidno.3)

反向：5'-gtcaccggagtccatcacgat-3'(seqidno.4)

realtimepcr反應體系參照thermoscientificmaximasybrgreenqpcrmastermix(2x)說明書，進行配置(25ul):

2×sybrgreenqpcrmastermix(2x)12.5ul

上下游引物2ul

模板cdna2ul

water,nuclease-free補至25ul總體系。

pcr程序：95℃，10分鐘；①95℃，30秒；②58℃30秒；③72℃30秒；①②③進行45個循環(huán)，終止反應。

(四)判定δct

指標的測定：本實驗數(shù)據(jù)采用相對定量的分析方法，以lmp1或者mir-203作為判定指標，或者兩者結合同時判定。β-actin作為內(nèi)參基因，利用軟件graphpadprism5進行分析。分析發(fā)現(xiàn)，與lmp1在正常鼻咽組織中的表達相比，47例鼻咽癌患者中l(wèi)mp1的表達上調(diào)，其δct≤2.46時，(p≤0.05)，提示lmp1高表達，患者轉(zhuǎn)移風險大，考慮給予患者asp治療；或者當δct≤3.15時，(p≤0.05)，提示mir-203高表達，患者腫瘤轉(zhuǎn)移風險小，不需要給予患者asp治療。

(五)實施案例舉例

以上述方法，檢測正常人10例和40例疑似鼻咽癌患者(新入院初始病人，手術治療前)血清樣本中，lmp1和mir-203表達與正常人相比，表達升高，當δct≤2.46時，提示lmp1高表達，患者轉(zhuǎn)移風險大，考慮給予患者asp治療；或者當δct≤3.15時，提示mir-203高表達，患者腫瘤轉(zhuǎn)移風險小，不需要給予患者asp治療。

以上研究表明，阿司匹林抑制ebv相關鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，并且外泌體中l(wèi)mp1和mir-203可以作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的診斷和治療的分子標志物。檢測患者外泌體中l(wèi)mp1或mir-203的表達，具有很好的穩(wěn)定性，操作簡便，可以應用于ebv相關鼻咽癌患者診斷和治療。

sequencelisting

<110>中南大學

<120>阿司匹林在制備預防和治療eb病毒相關性鼻咽癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應用

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