本發(fā)明具體涉及臘梅屬植物提取物在預(yù)防/治療由致病菌所引起疾病的藥物的應(yīng)用，特別是預(yù)防/治療由耐藥菌引起的感染，所述的臘梅屬植物包括柳葉臘梅、浙江臘梅和山臘梅，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：：1.臘梅屬植物臘梅柳葉臘梅、山臘梅和浙江臘梅同屬蠟梅科臘梅屬植物，我國(guó)特產(chǎn)，主要分布于我國(guó)亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)域的鄂、湘、川、渝、貴、豫、浙、贛、皖等省。蠟梅屬柳葉蠟梅(chimonanthussalicifoliuss.y.hu)、浙江蠟梅(chimonanthuszhejiangensism.c.liu)或山臘梅(chimonanthusnitensoliv.)等為畬族民間習(xí)用藥，從北宋年間起其干燥葉就作為服用的食涼茶，近千年來用于治療和預(yù)防感冒?，F(xiàn)代研究又有進(jìn)展，其中，山臘梅提取物制備的顆粒制劑，有良好治療/預(yù)防感冒功效，已在市場(chǎng)銷售；柳葉蠟梅和浙江臘梅已載入2005和2015年的《浙江省中藥炮制規(guī)范》，主要成分為揮發(fā)油，含有1.8-桉葉素、β-蒎烯、α-萜品烯醇、芳樟烯、欖香醇等40多種成分。傳統(tǒng)用途：性味微苦，辛，涼，歸肺、脾、胃經(jīng)，用于治療感受風(fēng)寒而引起肚脹、肚痛腹瀉，因飲食不當(dāng)引起的消化不良、腹部脹痛和小兒疳積等癥狀。浙江臘梅為臘梅科臘梅屬常綠灌木，產(chǎn)于浙江。群體遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)浙江臘梅和山臘梅相對(duì)近緣，山臘梅在湖南、福建、廣西貴州等地均有分布，而浙江臘梅未見分布，浙江臘梅僅分布于浙江龍泉，因此，結(jié)合形態(tài)、分子及地理分布特征，我們認(rèn)為浙江蠟梅是山蠟梅分布區(qū)的最東邊界的一個(gè)群體，可能只是山蠟梅的一種生態(tài)型(ecotype)，而不是獨(dú)立的分類單位。山臘梅(chimonanthusnitens)為常綠灌木，又稱之為毛山茶、巖馬桑(《新華本草綱要》)、亮葉臘梅(《經(jīng)濟(jì)植物手冊(cè)》)、香風(fēng)茶(《安徽中草藥》)、野臘梅(《云南中藥資源名錄》)。產(chǎn)于安徽、浙江、江蘇、江西、福建、湖北、湖南、廣西、云南、貴州和陜西等省區(qū)。民間使用歷史悠久，具有防治感冒、痰喘、咳嗽、慢性支氣管炎、細(xì)菌感染、發(fā)熱疼痛、炎癥、蚊蟲叮咬及高血壓、高血脂等作用，亦有抗腫瘤、防治心腦血管疾病、改善微循環(huán)和抗衰老、抗氧化等作用，另外還具有調(diào)節(jié)人體機(jī)能、增強(qiáng)體質(zhì)、提高機(jī)體免疫力、減少體脂、減肥等保健功能。該植物主產(chǎn)于江西德興大茅山區(qū)、婺源懷玉山區(qū)、安徽徽州齊云山一帶，在浙江、福建、陜西等省亦有分布，資源較豐富。山臘梅揮發(fā)油中主要成分是烯烴、醇類和烷酸類物質(zhì)，分別為脫氫香橙烯、△-杜松烯、e-環(huán)氧金合歡烯、石竹烯、(-)-氧化石竹烯、α-杜松醇(7.08％)、(+)-匙葉桉油烯醇、杉木醇、十六烷酸。欖香烯等倍半萜類合物具有較好的抗腫瘤活性，黃酮類成分具有防治心腦血管疾病、改善微循環(huán)和抗衰老等多種功效。山臘梅藥片的溫?zé)嵴舭l(fā)物可抑制病毒，山臘梅揮發(fā)油可抑制和殺滅病毒。1982年，《江西省藥品標(biāo)準(zhǔn)》就記載了“山臘梅片”和“山臘梅沖劑”，作為防治感冒和流行性感冒制劑在臨床上應(yīng)用，市售良好。與山臘梅同屬的柳葉蠟梅和浙江臘梅雖在民間使用普遍，但在市場(chǎng)上還未有適合的制劑。co2超臨界萃取技術(shù)具有低溫、快速、效率高、無污染、提取物純度高、易分離等優(yōu)點(diǎn)，適用于揮發(fā)油的提取。賀建云采用超臨界co2萃取小試設(shè)備，不加夾帶劑提取柳葉蠟梅中物質(zhì)，總收率為3.68％，但未見超臨界二氧化碳萃取柳葉蠟梅物質(zhì)的應(yīng)用報(bào)道。本發(fā)明在已有研究的基礎(chǔ)上，采用新的未見報(bào)道的提取方案，優(yōu)化已有制備柳葉臘梅提取物的工藝條件、參數(shù)以及研究柳葉臘梅新提取物的新用途；研究適合柳葉蠟梅提取物的軟膠囊、滴丸等制劑；為柳葉蠟梅提取物用于致病菌感染預(yù)防和治療提供有益支持。2.耐藥菌近年來，濫用化藥的抗菌藥情況比較普遍，致使耐藥性越來越嚴(yán)重，導(dǎo)致急需的臨床治療難度增大，療效差，嚴(yán)重威脅患者生命健康2.1.革蘭氏陽性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)，能產(chǎn)生多種毒素、酶及抗原蛋白，具有較強(qiáng)的致病力，能引起皮膚軟組織感染，血液及全身各臟器感染。該菌具有廣譜耐藥性，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素g和頭孢類抗生素如頭孢吡肟、頭孢唑啉、頭孢噻肟的耐藥率均為100％，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如克林霉素、氨基糖苷類抗生素如慶大霉素、四環(huán)素的耐藥率均高于60％，對(duì)利福平的耐藥性已上升且大于50％。多重耐藥性導(dǎo)致該菌所致感染治療困難，病死率高。表皮葡萄球菌(mrse)是機(jī)會(huì)致病菌，可引發(fā)尿路感染、菌血癥、術(shù)后傷口感染和心肌炎、瓣膜修復(fù)術(shù)后心內(nèi)膜炎、骨髓炎、透析性腹膜炎等，死亡率可達(dá)63％-74％。近年來發(fā)現(xiàn)，耐甲氧西林表皮葡萄球菌占表皮葡萄球菌的2/3，對(duì)頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢噻肟、去甲萬古霉素均有耐藥性。2.2.革蘭氏陰性菌耐藥的肺炎克雷伯菌是腸桿菌科克雷伯氏菌屬中最為重要的一類菌(俗稱肺炎桿菌)，在院內(nèi)感染的敗血癥中，與綠膿桿菌均為重要病原菌，病死率較高，也均為革蘭氏陰性菌?，F(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺類光譜抗生素也產(chǎn)生較為嚴(yán)重的多重耐藥性。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌是嚴(yán)重的耐藥致病菌，耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中致病菌能夠打開β-內(nèi)酰胺環(huán)，使具該結(jié)構(gòu)的抗生素如青霉素類、頭孢類失去活性。2.3.胃腸致病菌2.3.1.志賀菌志賀氏菌屬(shigellaspp)，是一類不形成芽孢的細(xì)菌，能夠侵襲大腸引起典型菌痢癥狀(發(fā)熱、腹痛、腹瀉)，是一種具有高度傳染性和嚴(yán)重危害性的腸道傳染病，嚴(yán)重危害人類的健康和生命安全。福氏志賀氏菌(s.flexneri)是發(fā)展中國(guó)家的主要感染菌株，2a是主要的血清型，近幾年來我國(guó)每年大約有2000萬人次感染痢疾，年累計(jì)發(fā)病數(shù)一直位于第三位。由于志賀氏菌感染劑量極低(10-100個(gè)細(xì)菌)，主要傳播途徑為糞口途徑，所以最常見的擴(kuò)散形式是人與人之間的傳播，加之多重耐藥株的出現(xiàn)，其主要感染人群為5歲以下的兒童和免疫障礙的人群。世界衛(wèi)生組織推薦治療菌痢的首選藥物為環(huán)丙沙星，其次為頭抱曲松和匹美西林。2.3.2.沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium.)是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一，可以感染各種動(dòng)物和人，是一種重要的人畜共患傳染性細(xì)菌。在人，主要引起小腸結(jié)腸炎，是小兒沙門氏菌感染中最常見者，絕大多數(shù)患兒為兩歲以下的嬰幼兒。2.3.3.弧科菌副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)是一種噬鹽性弧菌，呈弧狀、桿狀、絲狀等多種形狀，無牙孢。廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚貝類中的海洋性細(xì)菌，為海產(chǎn)食品引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，經(jīng)常由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)食品，引起爆發(fā)性食物中毒。在非沿海地區(qū)，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦時(shí)有發(fā)生。3.抗菌藥研究現(xiàn)狀調(diào)研顯示，已有一些臘梅屬植物對(duì)金黃葡萄球菌、大腸桿菌等的研究報(bào)道，但未見其胃腸致病菌的志賀、副溶、鼠傷寒、羅森、腸炎、斯坦利報(bào)道，也未見普通致病菌中的甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(mrsa)、甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌(mrse)、大腸埃希菌(eco+)、肺炎克雷伯(kpn+)的耐藥株，以及甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(msse)、肺炎克雷伯(kpn-)的敏感株報(bào)道。中醫(yī)藥是解決耐藥菌感染的一種新選擇，此系本研究選題的初衷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明概述本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的抗致病菌的藥物，具體而言，本發(fā)明提供了一種臘梅屬植物、臘梅屬植物提取物在制備抗致病菌的藥物中的應(yīng)用。所述的臘梅科臘梅屬植物包括：柳葉蠟梅或浙江臘梅或山臘梅。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述的提取物為以下一種或多種：(1)水提物；(2)醇水混合提取物；(3)水蒸氣蒸餾揮發(fā)油；(4)超臨界二氧化碳萃取。本發(fā)明第二方面提供了上述臘梅屬植物提取物的制備方法。本發(fā)明第三方面公開含有臘梅屬植物提取物的制劑，所述的藥物與藥學(xué)上接受的輔料制成藥劑學(xué)上接受的口服制劑。發(fā)明詳述本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的抗致病菌的藥物，具體而言，本發(fā)明提供了一種臘梅屬植物、臘梅屬植物提取物在制備抗致病菌的藥物中的應(yīng)用。特別是本發(fā)明提供了一種臘梅屬植物、臘梅屬植物提取物在制備預(yù)防/治療由耐藥菌引起的感染的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中所述的藥材或原藥材是指臘梅屬植物，具體包括柳葉臘梅、浙江臘梅、山臘梅。本發(fā)明中所述的生藥也是指臘梅屬植物，具體包括柳葉臘梅、浙江臘梅、山臘梅。本發(fā)明的臘梅屬植物包括臘梅屬植物的鮮品或干品；臘梅屬植物的藥用部位選自臘梅屬植物的全株、地上部分、地下部分、莖、莖皮、花、葉、種子或任意組合；優(yōu)選的藥用部位選自臘梅屬植物的地上部分、莖、莖皮、葉或任意組合；更優(yōu)選的藥用部位選自臘梅屬植物的莖或葉；最優(yōu)選的藥用部位選自臘梅屬植物的葉。本發(fā)明第一方面提供的柳葉蠟梅或浙江臘梅或山臘梅在制備抗菌藥物的應(yīng)用。所述的病菌選自革蘭氏陽性菌甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌s.aureus(methicllin-resistant，mrsa)、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌s.aureus(methicin-suseptable)、甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis，mrse)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis，msse)，還選自革蘭氏陰性菌多耐藥銅綠假單胞菌、多耐藥肺炎克雷伯菌、多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌(esbls)eco+、肺炎克雷伯(esbls)kpn+、大腸埃希菌(非esbls)eco、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，pae)、腸炎沙門氏菌、斯坦利沙門氏菌、羅森沙門氏菌、福氏志賀氏、鮑曼不動(dòng)桿菌。本發(fā)明第一方面，還提供了臘梅屬植物提取物用于(1)治療家畜、家禽和伴侶動(dòng)物、野生動(dòng)物、鳥類的細(xì)菌感染的疾?。?2)畜牧飼料或飼料添加劑；(3)消殺劑。本發(fā)明的第二方面提供了臘梅屬植物提取物的制備方法。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述的臘梅屬植物提取物為以下用水提、醇提、水蒸氣蒸餾及超臨界二氧化碳提取一種或多種：(1)水提物；(2)醇提物；(3)水蒸氣蒸餾揮發(fā)油；(4)超臨界二氧化碳提取物。為了加快提取速度，提高提取收率，可以對(duì)臘梅屬原藥材進(jìn)行粉碎，粉碎后的平均粒徑優(yōu)選10-80目，更優(yōu)先是20-65目，最優(yōu)選是30-50目。本發(fā)明提供的提取物的第一種制備方法：所述提取物是按照包括如下步驟制備：原藥材臘梅屬植物加入溶劑提取，過濾并濃縮濾液，干燥獲得。所述的溶劑：本領(lǐng)域常用的溶劑均可以用于本發(fā)明。優(yōu)選溶劑水和c1-c5的醇類。c1-c5的醇類選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其混合物。選自水、無水乙醇、乙醇水溶液；更優(yōu)選溶劑選自乙醇水溶液。乙醇或乙醇水溶液和其他溶劑相比，具有低毒，防腐，污染小，價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，更適合于本發(fā)明應(yīng)用于藥物產(chǎn)品工業(yè)化大生產(chǎn)。乙醇水溶液的濃度(乙醇水溶液中含有的乙醇的體積百分比)：優(yōu)選30％-100％的乙醇水溶液，更優(yōu)選50％-95％的乙醇水溶液，進(jìn)一步優(yōu)選60％-80％的乙醇水溶液，最優(yōu)選75％的乙醇水溶液。溶劑的量是指提取每公斤原藥材所用的溶劑量，即提取每公斤藥材計(jì)使用溶劑的重量(單位kg)或體積(單位l)。溶劑用量是原藥材用量的2-30倍；更優(yōu)選5-16倍；進(jìn)一步優(yōu)選6-15倍；最優(yōu)選8-10倍。提取的溫度：優(yōu)選是室溫到溶劑回流的溫度；更優(yōu)選是40℃-溶劑回流的溫度；進(jìn)一步優(yōu)選是50℃-溶劑回流的溫度；最優(yōu)選是溶劑回流的溫度。提取的次數(shù)：可以是1～5次；優(yōu)選是2～3次。提取的時(shí)間：每次0.5～5小時(shí)；優(yōu)選每次0.5～3小時(shí)；更優(yōu)選每次1～3小時(shí)。濃縮的溫度：可以是55～90℃；優(yōu)選62～80℃；更優(yōu)選65～75℃。濃縮后稠膏的相對(duì)密度為1.1～1.5，優(yōu)選1.2～1.4。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)水提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)3-30倍的水提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)5-16倍的水提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)8-16倍的水提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)乙醇提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)3-30倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)3-30倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)3-30倍的65％-80％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)5-15倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)5-15倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)5-15倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)8-10倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)8-10倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經(jīng)8-10倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是按照包括如下步驟制備：原藥材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、無水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小時(shí)(包括0.5～3小時(shí)，包括1～3小時(shí))，過濾并濃縮濾液，干燥獲得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是按照包括如下步驟制備：原藥材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、無水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小時(shí)(包括0.5～3小時(shí)，包括1～3小時(shí))，過濾并合并提取液，經(jīng)濃縮至相對(duì)密度為1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，減壓干燥，即得。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述提取物是按照包括如下步驟制備：原藥材加5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的30～99％的乙醇水溶液回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小時(shí)(包括0.5～3小時(shí)，包括1～3小時(shí))，過濾并合并提取液，60～90℃(包括65～75℃)濃縮至相對(duì)密度為1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，減壓干燥，即得。本發(fā)明提供的提取物的第二種制備方法：所述提取物是原藥材臘梅屬植物經(jīng)水蒸氣蒸餾并獲得的水蒸氣蒸餾揮發(fā)油。本發(fā)明提供的提取物的第三種制備方法：所述提取物是原藥材經(jīng)超臨界二氧化碳提取并獲得。本發(fā)明的超臨界提取物，其特征在于，所述提取物是原藥材臘梅屬植物經(jīng)二氧化碳超臨界提取，在分離釜中獲得提取物，提取的條件可以是一種或多種，例如：(1)不加夾帶劑的提取物；(2)加夾帶劑的提取物；(3)不加夾帶劑提取后再加夾帶劑的提取物。超臨界二氧化碳提取的條件如下：萃取釜：萃取溫度為30-70℃；優(yōu)選為35-60℃；更優(yōu)選為40-50℃；最優(yōu)選43-47℃。萃取溫度可以選自40℃，42℃，45℃，47℃，50℃。萃取壓力為10-40mpa；優(yōu)選為13-35mpa；優(yōu)選為16-24mpa；更優(yōu)選為18-22mpa。萃取壓力可以選自15mpa，20mpa，20.6mpa，29.6mpa，30mpa。萃取釜可以是1個(gè)或多個(gè)分離釜，例如1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，5個(gè)或更多。如果是多個(gè)萃取釜的，可以是并聯(lián)或串聯(lián)。為了盡量節(jié)約原藥材的加料和卸料時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，優(yōu)選是多個(gè)萃取釜并聯(lián)。在一部分萃取釜加料或卸料的時(shí)候，另外的萃取釜同事進(jìn)行萃取。萃取劑流速：萃取劑二氧化碳的流速會(huì)對(duì)本發(fā)明的生產(chǎn)效率產(chǎn)生重大的影響。如果二氧化碳的流速過快，二氧化碳和萃取溶質(zhì)不能充分接觸，會(huì)降低每體積二氧化碳的萃取效率；如果二氧化碳的流速過慢，會(huì)降低單位時(shí)間的生產(chǎn)效率。因此，萃取劑二氧化碳的流速需要一個(gè)合適的流速。萃取劑二氧化碳的流速為每公斤藥材每小時(shí)20-150升(以每公斤藥材每小時(shí)計(jì)，單位為l/h·kg生藥)，即20-150l/h·kg；優(yōu)選的萃取劑二氧化碳的流速為23-125l/h·kg；更優(yōu)選為33-80l/h·kg；進(jìn)一步優(yōu)選為50-70l/h·kg；最優(yōu)選為55-65l/h·kg。萃取劑二氧化碳的流速可以選自23.1l/h·kg；23.8l/h·kg；28.5l/h·kg；32.3l/h·kg；32.8l/h·kg；36.2l/h·kg；38.3l/h·kg；35.3l/h·kg；44.8l/h·kg；50.7l/h·kg；55.4l/h·kg；75.6l/h·kg；82.2l/h·kg。萃取時(shí)間分鐘(min)：30-400min，優(yōu)選120-160min，更優(yōu)選120-160min，最優(yōu)選120-160min。萃取時(shí)間可以是60-70min，70-80min，80-100min，110-120min，120-130min，140-150min，155-165min。例如萃取時(shí)間可以是62min，70min，83min，100min，120min，132min，145min，160min。夾帶劑：本發(fā)明的超臨界提取方案中，可以選擇性的使用夾帶劑或不使用夾帶劑；優(yōu)先是使用夾帶劑。本領(lǐng)域常用的溶劑均可以作為本發(fā)明的夾帶劑。例如本發(fā)明的夾帶劑可以選自：0％-100％v/v的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮等中至少一種，即作為帶劑的溶劑可以是單一溶劑，或其中任何一種溶劑與另一種、及多種溶劑間的彼此混合溶劑等。本文中100％v/v的乙醇水溶液表示無水乙醇；本文中0％v/v的乙醇水溶液表示沒有醇的水。例如本發(fā)明的夾帶劑可以選自：水、無水乙醇、30％-100％v/v的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮。優(yōu)選的夾帶劑選自水、無水乙醇、30％-99％v/v的乙醇水溶液。更優(yōu)選的夾帶劑選自75％-95％v/v的乙醇水溶液。最優(yōu)選的夾帶劑選自95％v/v的乙醇水溶液。夾帶劑的量(以每公斤藥材計(jì)為l/kg，kg/kg；或以每克藥材計(jì)為ml/g，g/g)：夾帶劑的量為0.10-2.5l/kg；；優(yōu)選0.20-1.5l/kg；，更優(yōu)選0.30-0.80l/kg；最優(yōu)選0.40-0.60l/kg；分離釜：分離釜的溫度為25-70℃，優(yōu)選為30-60℃；更優(yōu)選為35-55℃，最優(yōu)選為40-50℃，。分離釜的溫度可以選自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。分離釜的壓力為2-17mpa；優(yōu)選為3-15mpa；更優(yōu)選為4-12mpa；最優(yōu)選為4.5-10mpa。分離釜的壓力可以選自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa，5.6mpa，5.7mpa，5.8mpa，6mpa，7mpa，8mpa，8.5mpa，9mpa，9.5mpa，10mpa。分離釜可以是1個(gè)或多個(gè)分離釜，例如1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，5個(gè)或更多。如果是多個(gè)分離釜的，可以是并聯(lián)或串聯(lián)，優(yōu)選是多個(gè)分離釜串聯(lián)。分離釜i壓力和溫度：分離釜i的溫度為30-70℃，優(yōu)選為50-60℃；更優(yōu)選為53-57℃；最優(yōu)選為55℃。分離釜i的溫度可以選自53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。分離釜i的壓力為4-17mpa；優(yōu)選為5-15mpa；更優(yōu)選為6-12mpa；最優(yōu)選為8-10mpa。分離釜i的壓力可以選自8mpa，8.5mpa，9mpa，9.5mpa，10mpa。分離釜ii壓力和溫度：分離釜ii的溫度為25-50℃，優(yōu)選為30-45℃；更優(yōu)選為32-42℃；最優(yōu)選為35-40℃。分離釜ii的溫度可以選自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。分離釜ii的壓力為2-8mpa；優(yōu)選為3-7mpa；更優(yōu)選為4-6mpa；最優(yōu)選為4.5-5.5mpa。分離釜ii的壓力可以選自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa。分離iii壓力和溫度：分離釜iii的溫度為25-50℃，優(yōu)選為30-45℃；更優(yōu)選為32-42℃；最優(yōu)選為35-40℃。分離釜iii的溫度可以選自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。分離釜iii的壓力為2-8mpa；優(yōu)選為3-7mpa；更優(yōu)選為4-6mpa；最優(yōu)選為4.5-5.5mpa。分離釜iii的壓力可以選自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa。分離釜中得到的提取物，就是本發(fā)明的臘梅屬植物提取物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，是對(duì)原藥材不加夾帶劑的進(jìn)行超臨界提取，原藥材加入萃取釜，萃取釜溫度為40℃-50℃，壓力為15mpa-40mpa，二氧化碳?xì)怏w通過萃取釜的流量為100-250kg/小時(shí)，萃取時(shí)間為90-300分鐘，分離釜i的溫度為50℃-60℃，壓力為7.5mpa-9mpa，分離釜ii的溫度為35℃-45℃，壓力為4.8mpa-6mpa，分離釜中的得到的提取物即為本發(fā)明的提取物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，是對(duì)原藥材加夾帶劑進(jìn)行超臨界提取，原藥材加入萃取釜，萃取釜溫度為40℃-50℃，壓力為15mpa-40mpa，加入夾帶劑，二氧化碳?xì)怏w通過萃取釜的流量為23-125l/h·kg生藥，萃取時(shí)間為90-300分鐘，分離釜i的溫度為50℃-60℃，壓力為7.5mpa-9mpa，分離釜ii的溫度為35℃-45℃，壓力為4.8mpa-6mpa；分離釜中的得到的提取物即為本發(fā)明的提取物。所述的夾帶劑選自水、無水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一種，即作為帶劑的溶劑可以是單一溶劑，或其中任何一種溶劑與另一種、及多種溶劑間的彼此混合溶劑等。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，是對(duì)原藥材先不加夾帶劑進(jìn)行超臨界提取后再加夾帶劑的進(jìn)行提取，原藥材加入萃取釜，萃取釜溫度為40℃-50℃，壓力為15mpa-40mpa，分離釜i的溫度為50℃-60℃，壓力為7.5mpa-9mpa，分離釜ii的溫度為35℃-45℃，壓力為4.8mpa-6mpa；二氧化碳?xì)怏w通過萃取釜的流量為23-125l/h·kg生藥，萃取時(shí)間為90-300分鐘；放出分離釜中的提取物；再加入夾帶劑，二氧化碳?xì)怏w通過萃取釜的保持流量為23-125l/h·kg生藥，再萃取90-300分鐘；分離釜中再次得到的提取物即為本發(fā)明的提取物。所述的夾帶劑選自水、無水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一種，即作為帶劑的溶劑可以是單一溶劑，或其中任何一種溶劑與另一種、及多種溶劑間的彼此混合溶劑等。本領(lǐng)域常用的干燥均可以用于本發(fā)明，例如：減壓干燥、噴霧干燥、冷凍干燥、熱風(fēng)干燥、遠(yuǎn)紅外線干燥或微波干燥?；蚵?lián)合使用上述一種或多種干燥方式。本發(fā)明提供的提取物的第四種制備方法：所述提取物是原藥材經(jīng)二氧化碳超臨界提取后，其剩余的藥材再加入溶劑提取，過濾并濃縮濾液，干燥獲得。具體的提取方法和第一種方式相同。在本發(fā)明中，術(shù)語“提取”可以是常溫下的浸漬，或者超臨界狀態(tài)下的提取，或者在升高的溫度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者這些操作方式的結(jié)合。還可以進(jìn)一步包括對(duì)提取物進(jìn)行進(jìn)一步處理，例如進(jìn)一步純化，例如除溶劑、沉淀除雜質(zhì)、溶劑萃取、樹脂吸附分離等。如本文所述的，術(shù)語“提取物”將包括可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明任何目的的任何純度的提取物，提取物的提取純度可以在較大的范圍內(nèi)變化。本發(fā)明第三方面公開含有臘梅屬植物提取物的制劑，所述的藥物與藥學(xué)上接受的輔料制成藥劑學(xué)上接受的制劑。本發(fā)明第三方面的制劑，其特征在于，所述的制劑為柳葉蠟梅或浙江臘梅或山臘梅的提取物制劑。為了使用的方便本發(fā)明中的組合物還包含一種或多種無毒生理學(xué)可接受的載體。所述的可接受的載體包括本領(lǐng)域公知的任何輔料及起控釋作用的輔料。常用的輔料包括稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、致孔劑、增塑劑、填充劑、增溶劑和乳化劑。稀釋劑可以是但不限于淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤(rùn)劑可以是但不限于水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是但不限于干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤(rùn)滑劑和助流劑可以是但不限于滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇；增溶劑和乳化劑可以是但不限于乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯及它們的混合物。起緩控釋作用的輔料可以選自親水性凝膠材料、蠟脂類材料和不溶性材料的一種或多種。所述的親水性凝膠材料可以選自羥丙基甲基纖維素、卡波普、羧甲基纖維素鈉和海藻酸鹽，所述的蠟脂類材料可以選自十六醇、十八醇、蜂蠟、山崳酸甘油酯、硬脂酸和巴西棕櫚蠟，所述的不溶性材料可以選自乙基纖維素、丙烯酸樹脂、聚氧乙烯和聚乙烯。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。為此本發(fā)明還涉及包含藥物組合物和藥學(xué)上可接受的載體制成的制劑?？赏ㄟ^將組合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動(dòng)物使用的任何劑型。該制劑可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。本發(fā)明第三方面的制劑，其特征在于，所述制劑優(yōu)選口服制劑、噴霧劑、吸入劑；更優(yōu)選噴霧劑、吸入劑。有益技術(shù)效果用水、醇、水蒸氣蒸餾、超臨界不同提取方法獲得臘梅屬提取物研究中，發(fā)現(xiàn)具有抑制甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌、甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌、多耐藥銅綠假單胞菌、多耐藥肺炎克雷伯菌、多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌(esbls)eco+、肺炎克雷伯(esbls)kpn+的作用，為從畬藥民族藥尋找嚴(yán)重危害人類健康與生命的耐藥菌等預(yù)防/治療用藥提供新途徑。而超臨界加夾帶劑提取在臘梅屬提取物中應(yīng)用也是首次。其中：1.革蘭氏耐藥陽性菌1.1甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌柳葉蠟梅揮發(fā)油(lyy)、柳葉蠟梅水提物(lys)、柳葉蠟梅醇提物(lyc)、柳葉蠟梅不加夾帶劑萃取物(lylw)、柳葉蠟梅加夾帶劑萃取物(lylj)對(duì)6株甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌抑制的mic范圍分別4-8g/ml，1-4g/ml，2g/ml，1-8g/ml，1-4g/ml；1.2甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌柳葉蠟梅揮發(fā)油(lyy)、柳葉蠟梅水提物(lys)、柳葉蠟梅醇提物(lyc)、柳葉蠟梅不加夾帶劑萃取物(lylw)、柳葉蠟梅加夾帶劑萃取物(lylj)對(duì)甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌抑制作用，其對(duì)6株甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌的mic范圍分別4-8mg/ml，1-4mg/ml，2-4mg/ml，4-8mg/ml，4mg/ml。2.革蘭氏耐藥陰性菌2.1肺炎克雷伯(esbls)，kpn+柳葉蠟梅揮發(fā)油(lyy)、柳葉蠟梅水提物(lys)、柳葉蠟梅醇提物(lyc)對(duì)2株能產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌有抑制作用，其mic均為64mg/ml；2.2多耐藥銅綠假單胞菌(pr)柳葉蠟梅加夾帶劑萃取物(lylj)對(duì)3株多耐藥銅綠假單胞菌的mic為64mg/ml；2.3多耐藥肺炎克雷伯(kr)柳葉蠟梅揮發(fā)油(lyy)、柳葉蠟梅加夾帶劑萃取物(lylj)對(duì)3株多耐藥銅綠假單胞菌的mic為64mg/ml；2.4多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(ar)柳葉蠟梅揮發(fā)油(lyy)、柳葉蠟梅不加夾帶劑萃取物(lylw)、柳葉蠟梅加夾帶劑萃取物(lylj)對(duì)5株多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(ar)有抑制作用，其mic范圍分別為16mg/ml，16-64mg/ml，16-64mg/ml。3腸道致病菌柳葉蠟梅揮發(fā)油(lyy)、柳葉蠟梅水提物(lys)、柳葉蠟梅醇提物(lyc)、柳葉蠟梅加夾帶劑萃取物(lylj)、柳葉蠟梅不加夾帶劑萃取物(lylw)、山臘梅揮發(fā)油(syy)、浙江臘梅揮發(fā)油(zyy)對(duì)11株腸道致病菌有抑制作用，其mic的范圍為0.26-16.72mg/ml，4-64mg/ml，4-64mg/ml，32-128mg/ml，0.015-30.3mg/ml，16.46-131.67mg/ml，33.75。4抗菌體內(nèi)篩選3個(gè)柳葉蠟梅提取物lylw-(2-2)、lylj-2-y(2-6)、lyy經(jīng)預(yù)防給藥對(duì)小鼠系統(tǒng)感染甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌mrsa15-2和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌mssa15-5具有一定的保護(hù)作用。具體實(shí)施方式提取物制備案例實(shí)施例1-11水提：取粉碎后藥材，裝入圓底燒瓶中，分兩次加水回流提取。第一次加10-16倍水，提取1小時(shí)后過濾，第二次加水8-12倍水，提取1小時(shí)，合并兩次濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮或水浴鍋上濃縮，水浴75℃、轉(zhuǎn)速80rpm，濃縮至比重為1.18-1.22時(shí)，傾倒入不銹鋼盤中置減壓干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。醇提：取粉碎后藥材，裝入圓底燒瓶中，分兩次加70％乙醇回流提取。第一次加10倍70％的乙醇，提取1小時(shí)后過濾，第二次加8倍70％乙醇，提取1小時(shí)，合并兩次濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，水浴65℃、轉(zhuǎn)速80rpm，濃縮至比重為1.18-1.22時(shí)，傾倒入不銹鋼盤中置減壓干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。揮發(fā)油：水提時(shí)，裝好揮發(fā)油提取器，待油產(chǎn)生后收集。詳細(xì)參數(shù)及結(jié)果如下：實(shí)施例12開啟電熱控制系統(tǒng)和制冷系統(tǒng)。稱取6.4kgly，置于24l萃取釜中。稱取3.2kg95％乙醇，放置于副泵的儲(chǔ)箱中，開啟副泵(r＝9.1r/min)，60min內(nèi)加夾帶劑結(jié)束。萃取釜ii、分離釜i、分離釜ii、分離釜iii的壓力分別為20.7mpa、8.5mpa、5mpa、5mpa，溫度分別為45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的轉(zhuǎn)速r＝30.5r/min，二氧化碳流速為220-240l/h。萃取135min，后處理后，分離釜i收集到1.3g產(chǎn)品，分離釜ii收集到產(chǎn)物200.4g，編號(hào)lylj-2(2-6)，總收率3.15％。實(shí)施例13稱取6.05kgly，置于24l萃取釜中。當(dāng)壓力穩(wěn)定時(shí)，萃取開始。萃取釜ii、分離釜i、分離釜ii、分離釜iii的壓力分別為20mpa、8mpa、5.2mpa、5.2mpa，溫度分別為45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的轉(zhuǎn)速r＝30.6r/min，二氧化碳流速為350-370l/h，萃取72min，后處理，收集到151g紅褐色油狀物，收率2.50％，編號(hào)lylw(2-5)。實(shí)施例14稱取6.5kgly，置于24l萃取釜中。1萃取釜ii、分離釜i、分離釜ii、分離釜iii的壓力分別為20mpa、8mpa、5mpa、5mpa，溫度分別為45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的轉(zhuǎn)速r＝30.5r/min，二氧化碳流速為210-230l/h，萃取103min，后處理，收集到紅褐色油狀物101g，收率2.05％，編號(hào)lylw(2-2)。實(shí)施例15在實(shí)施例11的基礎(chǔ)上，開啟副泵(r＝15.5r/min)，15min加入1.55kg95％乙醇，萃取110min，后處理后，收集到產(chǎn)物138.7g，收率2.29％，編號(hào)lylwj(2-3)。實(shí)施例16稱取6.5kgly，置于24l萃取釜中。16:20開始升壓，16:30萃取開始。萃取釜ii、分離釜i、分離釜ii、分離釜iii的壓力分別為20mpa、8mpa、5.5mpa、5.5mpa，溫度分別為45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的轉(zhuǎn)速r＝30.5r/min，二氧化碳流速為330-360l/h，萃取62min，后處理，收集到紅褐色油狀物150.9g，收率2.32％，編號(hào)lylw(2-3)。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，開啟副泵(r＝15.5r/min)，10min加入1.05kg95％乙醇。萃取62min，后處理，收集到248.43g，收率3.84％，編號(hào)lylwj(2-1)。藥理實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)例1抗耐藥菌及敏感菌篩選1.試驗(yàn)菌株及其培養(yǎng)方法葡萄球菌：mh培養(yǎng)基(oxoid生產(chǎn))加2％nacl，35-37℃孵育24h。其它菌種：常規(guī)mh培養(yǎng)基，35-37℃孵育16-18h觀察結(jié)果。表體外抗菌活性篩選的受試臨床分離菌株備注：表中標(biāo)注*為耐藥菌2.體外抗菌試驗(yàn)方法中藥樣品體外抗菌最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)的測(cè)定參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，clsi)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作規(guī)程【(performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；twenry-thirdinformationalsupplement)m02-a11、m07-a9和m11-a8，2013】推薦的瓊脂二倍稀釋法。2.1頭孢吡肟對(duì)照品稱取藥品9.5mg，加入4.1ml的生理鹽水，混勻，各吸取1ml于兩個(gè)培養(yǎng)皿中，再加入15ml的培養(yǎng)基，使其終濃度為145ug/ml，再吸取2ml于西林瓶中，再在該西林瓶中加入2ml的生理鹽水，混勻，各吸取1ml加入兩個(gè)平皿中，再加入15ml的培養(yǎng)基，使其終濃度為72.4ug/ml，依照此法倍比稀釋，使平皿內(nèi)所含藥物終濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008ug/ml。待冷卻后用多點(diǎn)接種儀(mit-p，sukuma)接種細(xì)菌，接種菌量約為104cfu/ml，每皿接種27株菌，2個(gè)皿接種54株菌，蓋上皿蓋。置于35-37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-20h，觀察記錄結(jié)果。以平皿內(nèi)未見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度，判斷為最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)。2.2樣品分別取藥品于燒杯中，加入50ml的培養(yǎng)基，混勻，各吸取15ml于兩個(gè)培養(yǎng)皿中，使其終濃度為0.167ml/ml，再在燒杯中加入30ml的培養(yǎng)基，再各吸取15ml于兩個(gè)培養(yǎng)皿中，使其終濃度為0.083ml/ml，依照此法倍比稀釋，使藥物終濃度依次為0.167、0.083、0.042、0.021、0.010ml/ml。待冷卻后用多點(diǎn)接種儀(mit-p，sukuma)接種細(xì)菌，接種菌量約為104cfu/ml，每皿接種27株菌，2個(gè)皿接種54株菌，蓋上皿蓋。置于35-37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-20h，觀察記錄結(jié)果。以平皿內(nèi)未見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度，判斷為最低抑菌濃度(mic)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)方法以平皿內(nèi)未見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度，判斷為最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)。統(tǒng)計(jì)各受試藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的mic值及其mic值范圍，并與對(duì)照樣品進(jìn)行比較。表1中藥mic測(cè)定結(jié)果表(瓊脂二倍稀釋法)*注：mrsa：甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌mssa：甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌mrse：甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌msse：甲氧西林敏感表皮葡萄球菌eco-：非產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(esbls)大腸埃希菌eco+：產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(esbls)大腸埃希菌kpn-：非產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(esbls)肺炎克雷伯菌ar：多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌kpn+：產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(esbls)肺炎克雷伯菌kr：多耐藥肺炎克雷伯菌pae：銅綠假單胞菌pr：多耐藥銅綠假單胞菌試驗(yàn)例2抗腸道致病菌篩選1.儀器多點(diǎn)接種儀；培養(yǎng)箱(用于37℃恒溫培養(yǎng))；接種環(huán)(環(huán)狀部分需細(xì)絲狀)；二級(jí)生物安全柜；一次性滅菌培養(yǎng)皿(材質(zhì)：塑料；數(shù)量：160個(gè)；規(guī)格：直徑9mm)；麥?zhǔn)媳葷峁?品牌：梅里埃)或麥?zhǔn)媳葷醿x；mh培養(yǎng)基；電熱爐(用于培養(yǎng)基配制時(shí)加熱)；小試管(規(guī)格：10*100mm，數(shù)量：80個(gè))及試管塞；酒精燈：20ul移液槍及槍頭；分析天平；注射器(規(guī)格：20ml；數(shù)量：15個(gè))；試管架2個(gè)；燒杯(規(guī)格：500ml；數(shù)量：6個(gè))；小藥芍6個(gè)；2.試劑mh培養(yǎng)基；0.9％生理鹽水200ml；新潔爾滅；3.菌株表4.體外抗菌實(shí)驗(yàn)方法中藥樣品體外抗菌最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)的測(cè)定參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，clsi)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作規(guī)程【(performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；twenty-thirdinformationalsupplement)m02-a11、m07-a9和m11-a8，2013】推薦的瓊脂二倍稀釋法。5.樣品及對(duì)照品配制及接菌移取樣品約4g于燒杯中，加入30ml的培養(yǎng)基，混勻，吸取15ml于培養(yǎng)皿中，使其終濃度為133.333mg/ml，再在燒杯中加入15ml的培養(yǎng)基，再吸取15ml于培養(yǎng)皿中，使其終濃度為66.667mg/ml，依照此法倍比稀釋，共15個(gè)濃度。待冷卻后用多點(diǎn)接種儀(mit-p，sukuma)接種細(xì)菌，接種菌量約為106cfu/ml，每皿接種13株菌，蓋上皿蓋。置于35-37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-20h，觀察記錄結(jié)果。以平皿內(nèi)未見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度，判斷為最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)方法以平皿內(nèi)未見細(xì)菌生長(zhǎng)的樣品最低濃度，判斷為最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)。統(tǒng)計(jì)各受試樣品對(duì)試驗(yàn)菌株的mic值及其mic值范圍，并與對(duì)照樣品進(jìn)行比較。7.實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表2試驗(yàn)例3抗菌體內(nèi)篩選1.供試品3個(gè)中藥提取物供試品信息見表1表供試品信息2.試驗(yàn)菌株和動(dòng)物2.1.受試菌株根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌mrsa15-2(感染菌量3.0×107cfu/ml)和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌mssa15-5(感染菌量3.0×107cfu/ml)作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的測(cè)試菌株。2.2.試驗(yàn)動(dòng)物健康4周齡左右昆明種小鼠，體重為18-22g，雌雄各半，spf級(jí)。動(dòng)物使用許可證：syxk(川)2013-119(四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)頒發(fā))3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)方法3.1.1.菌液配備將試驗(yàn)用菌于感染前一天，挑取2-3個(gè)單菌落接種于2mlmh肉湯，37℃培養(yǎng)6h，取此菌液0.1ml轉(zhuǎn)種于10mlmh肉湯中，37℃培養(yǎng)18h，該菌液即為原菌液。將該菌液用5％干酵母液進(jìn)行倍比稀釋備用(當(dāng)日新鮮配制)。3.1.2.最小致死菌量【minimumlethal(bacteriaamount)dose，mld】試驗(yàn)取健康昆明種小白鼠，體重18～22克，隨機(jī)分組，每組5只小鼠，雌雄兼用，吸取上述不同稀釋濃度菌液，分別腹腔注射入小鼠體內(nèi)，每20g鼠重注射0.5ml，感染后觀察7-14天，并記錄小鼠死亡數(shù)，以引起小鼠100％死亡的最低菌量作為最小致死菌量【minimumlethal(bacteriaamount)dose，mld】，用該菌量作為體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)的感染菌量。3.1.3.藥液配備及給藥途徑藥液配備：柳葉蠟梅提取物lylw-(2-2)、lylj-2-y(2-6)、lyy及對(duì)照藥tqs和蓮花請(qǐng)瘟顆粒均用0.5％cmc(羧甲基纖維素)配制成所需濃度的混懸液，備用(灌胃)。給藥途徑：灌胃給藥給藥容量：0.5ml/20g鼠重3.1.4.體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)方法采用預(yù)防給藥(感染細(xì)菌前3天給藥，每日1次)，分別于第3日給藥后1小時(shí)感染受試菌液，4小時(shí)后再給藥1次，此后每日給藥1次(聯(lián)續(xù)給藥3天)，至給藥組出現(xiàn)死亡，各給藥組停止給藥，觀察各給藥組動(dòng)物的臨床癥狀及死亡時(shí)間和死亡動(dòng)物數(shù)。給藥劑量：參考有關(guān)該類中藥的臨床有關(guān)資料及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬設(shè)給藥劑量為2.0、1.0、0.5g/kg，精確稱取受試藥物，用藥均用0.5％cmc(羧甲基纖維素)配制成所需濃度混懸液，劑量組間矩為1∶0.5。將小鼠于試驗(yàn)前18小時(shí)停食供水，按體重隨機(jī)分組，每組10只小鼠，雌雄各半，分別腹腔注射感染試驗(yàn)菌液，每20g鼠重注射0.5ml；感染后1h、4h按設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥，每20g鼠重給予0.5ml；觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察7-14天，根據(jù)小鼠死亡數(shù)，用孫瑞元等主編das1.0軟件按bliss法計(jì)算半數(shù)有效劑量ed50及95％可信限。同時(shí)設(shè)感染對(duì)照組、空白對(duì)照組、高劑量藥物對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(感染對(duì)照組：只感染細(xì)菌不給藥，感染細(xì)菌后即灌胃等體積的生理鹽水；空白對(duì)照組：不感染細(xì)菌，灌胃等體積的生理鹽水；高劑量藥物對(duì)照組：不感染細(xì)菌，灌胃等體積的高劑量藥物；溶劑對(duì)照組：不感染細(xì)菌，灌胃等體積的溶劑(0.5％cmc)。4.試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)柳葉蠟梅提取物lylw-(2-2)、lylj-2-y(2-6)、lyy及對(duì)照藥tqs、蓮花請(qǐng)瘟顆粒全身系統(tǒng)感染模型的體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3、表4及附表1和附表2。3個(gè)中藥提取物及對(duì)照藥tqs在本次實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌mrsa15-2和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌mssa15-5所致小鼠全身系統(tǒng)感染呈現(xiàn)有抗菌保護(hù)作用；對(duì)甲氧西林敏感金葡菌mssa15-5的體內(nèi)保護(hù)作用強(qiáng)于耐藥金葡菌mrsa15-2，在2g/kg給藥劑量下其死亡率分別依次為40、60、50、30％和60、80、60、40％(見表3、表4)。其半數(shù)有效劑量ed50分別依次為1.59、2.26、1.82、1.01g/kg和2.26、＞2.00、2.17、1.60g/kg。3個(gè)中藥提取物的體內(nèi)抗菌保護(hù)作用與對(duì)照tqs相當(dāng)，較蓮花請(qǐng)瘟顆粒(死亡率均為100％)強(qiáng)。各給藥組感染受試菌后1-2天臨床癥狀均表現(xiàn)為自主活動(dòng)明顯減少，精神萎靡；死亡動(dòng)物多發(fā)生在感染細(xì)菌后1-3天內(nèi)；未死亡動(dòng)物7-14天臨床癥狀未見明顯逆轉(zhuǎn)。藥物高劑量組：柳葉蠟梅提取物lylw-(2-2)、lylj-2-y(2-6)、lyy及對(duì)照藥tqs、蓮花請(qǐng)瘟顆粒在2g/kg給藥劑量(高劑量藥物對(duì)照組)下均無動(dòng)物死亡，臨床癥狀未見異常。表明該給藥劑量為無毒劑量。5.結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果表明：3個(gè)柳葉蠟梅提取物lylw-(2-2)、lylj-2-y(2-6)、lyy經(jīng)預(yù)防給藥對(duì)小鼠系統(tǒng)感染甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌mrsa15-2和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌mssa15-5具有一定的保護(hù)作用。本次試驗(yàn)所選用的動(dòng)物模型為小鼠系統(tǒng)感染敗血癥模型，對(duì)于金葡菌所致感染一般在24-48小時(shí)即可至動(dòng)物死亡，因此本次試驗(yàn)中3個(gè)柳葉蠟梅提取物lylw-(2-2)、lylj-2-y(2-6)、lyy未達(dá)到100％的保護(hù)率，這可能與中藥抗細(xì)菌感染的起效比較緩慢有關(guān)。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12