本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及硫氫化鈉在制備治療脊髓小腦性共濟失調(diào)藥物中的應用。

背景技術：

sca(脊髓小腦性共濟失調(diào))發(fā)病率約占神經(jīng)遺傳病的10％左右，其中sca3發(fā)病率最高，神經(jīng)遺傳病的致病蛋白存在突變，進而導致了結(jié)構(gòu)的不正常折益，這也導致大量的分子伴侶被招募到致病蛋白上，進而可能影響細胞內(nèi)功能正常的蛋白質(zhì)的正常折疊的進行。

另一sca主要的病理生理學機制為線粒體功能障礙，線粒體dna突變導致sca延遲顯性及表型高度異質(zhì)性。已有研究表明，線粒體損傷在sca3發(fā)病機制中起著重要作用，線粒體的主要功能是合成atp，其損傷直接影響合成atp。atp生成的減少也能造成細胞水腫和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，若進一步加重則將導致細胞變性壞死和細胞功能的喪失。

髓鞘的損傷和脫落會影響到神經(jīng)元的功能。有研究表明：記憶、認知功能降低與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有髓神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)的改變存在著密切的聯(lián)系。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，組成髓鞘的主要成分之一是髓鞘堿性蛋白(mbp)，約占30-40％。mbp起到維持cns髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定、維持髓鞘結(jié)構(gòu)和腦發(fā)育的作用，是判斷有無髓鞘脫失的特異性生化指標。有學者證明，mbp有促進軸突再生的作用。髓鞘內(nèi)mbp含量的正常依賴于線粒體的正常能量供應。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案是，硫氫化鈉作為活性成分在制備治療脊髓小腦性共濟失調(diào)藥物中的應用，尤其是在治療脊髓小腦性共濟失調(diào)3型藥物中的應用。

本發(fā)明所述藥物為單一成分的硫氫化鈉或者為硫氫化鈉和其它化合物組成的復方藥物。

本發(fā)明所述藥物包括硫氫化鈉和藥學上可接受的載體。

本發(fā)明所述藥物的劑型為任意一種臨床可接受的口服給藥劑型、注射給藥劑型或外用給藥劑型。

本發(fā)明所述藥物的劑型為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、注射劑、煎膏劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、氣霧劑或貼劑等。

本發(fā)明所述藥物中硫氫化鈉的活性劑量為0.06-0.62mg/kg/d。

進一步，本發(fā)明所述藥物中硫氫化鈉的活性劑量為0.31mg/kg/d，上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥。本發(fā)明給藥劑量取決于多種因素，如患者或動物的性別、年齡、體重、所患疾病的嚴重程度、自身的肝、腎功能狀態(tài)及給藥途徑等。因此，本發(fā)明的劑量可以有一定范圍的變化。

本發(fā)明檢測sca3小鼠、wt小鼠海馬內(nèi)硫化氫的含量，同時也通過免疫組化的方法測出mbp含量在wt小鼠和sca3小鼠大腦海馬有髓神經(jīng)纖維通路的差異。

本發(fā)明通過morris水迷宮篩選建立癡呆小鼠模型，經(jīng)過小鼠定位航行試驗和空間探索試驗，在學習記憶能力、生化指標上進行科學的評估，證明了海馬中的h2s與小鼠生長過程中的空間學習和記憶有更多的關系，通過改變海馬硫化氫的含量能夠改善其線粒體的功能，進而有可能使海馬有髓神經(jīng)纖維通路mbp含量增加來減輕其髓鞘損傷，或許就可以改善sca3小鼠的記憶障礙?？梢?，本發(fā)明為今后治療脊髓小腦性共濟失調(diào)應用于臨床提供參考依據(jù)。

附圖說明

圖1為不同小鼠組在morris水迷宮平均行駛距離；

圖2為不同小鼠組在morris水迷宮平均平臺潛伏期；

圖3為不同小鼠組在morris水迷宮平均游泳速度；

圖4為不同小鼠給與nahs后海馬組織h2s含量；

圖5為空白對照組小鼠海馬有髓神經(jīng)纖維的絲狀著色圖；

圖6為sca3模型組小鼠海馬有髓神經(jīng)纖維的絲狀著色圖；

圖7為sca3低劑量小鼠組小鼠海馬有髓神經(jīng)纖維的絲狀著色圖；

圖8為sca3中劑量小鼠組海馬有髓神經(jīng)纖維的絲狀著色圖；

圖9為sca3高劑量小鼠組海馬有髓神經(jīng)纖維的絲狀著色圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

1.1模型建立

雄性sca3基因小鼠和雄性野生型(wt)小鼠均來源于鄭州大學實驗動物中心，體重20-23g，年齡12個月，在所有實驗中使用。pcr鑒定，從中隨機選出sca3模型組和空白對照組。給藥，每天新鮮配制100mmol/lnahs母液(用無菌生理鹽水配制)，nahs：10μmol/kg組以100份生理鹽水稀釋、50μmol/kg組用20份生理鹽水稀釋、1000μmol/kg組用10份生理鹽水稀釋，每日腹腔注射一次。每周監(jiān)測小鼠的體重和h2s含量，根據(jù)小鼠體重的改變相應調(diào)整給藥量，連續(xù)4周。wt小鼠組每日等量腹腔注射生理鹽水做為空白組，sca3小鼠分為低劑量組(n＝12)nahs10μmol/kg，中劑量組(n＝12)nahs50μmol/kg，高劑量組(n＝12)nahs100μmol/kg，大約28天，期間進行稱重，h2s含量檢測。

1.2學習和記憶能力評價

1.2.1水迷宮測試

1.2.1.1實驗前的準備工作

實驗開始前，水溫調(diào)整至22-24℃。向水池內(nèi)加入無毒的白色涂料污染至水不透明，水面高度調(diào)節(jié)至使水沒過平臺0.5cm。實驗前先將所有實驗動物進行morris水迷宮初篩，以篩選出先天性癡呆及其他條件不符合實驗條件的小鼠。

1.2.1.2定位航行實驗

實驗時長4d，按逆時針方向每天改變小鼠游泳的開始象限，每只小鼠每天訓練4次，每個象限1次，兩次訓練的時間間隔約為25min。用攝像頭記錄小鼠的游泳軌跡，通過視頻信號采集卡進行視頻信號的采集和數(shù)字轉(zhuǎn)換，用行為學記錄軟件ethovisionxt8(noldus公司，德國)進行信號的記錄與分析。每次游泳訓練小鼠找到水下平臺后，讓其停留在平臺上30s，以鞏固其記憶。小鼠每次游泳訓練的最大時長為120s，如果小鼠在120s內(nèi)沒有自行找到水下平臺，則將其引導至水下平臺上并讓其在平臺上停留30s。

1.2.1.3空間探索實驗

定位航行實驗結(jié)束后24h開始進行訓練空間探索實驗，水下平臺即被移除，小鼠的游泳時間依舊為120s。用行為學記錄軟件ethovisionxt8記錄這段時間內(nèi)小鼠在迷宮內(nèi)游泳軌跡。

1.2.1.4統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均值(mean)±標準誤(sem)表示，組間進行方差分析(anova)和t檢驗和線性回歸分析，p<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

1.2.2標本的固定、取材和制作

將各組小鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射完全麻醉后，在大腦海馬上按照“快、輕、小、準”的四字原則，選用鋒利的刀片快速取材(冰上操作)，操作完畢置液氮中保存，為方便電鏡和硫化氫測定的使用次日將其移入-80℃冰箱保存。各組其余的小鼠經(jīng)過全身麻醉后，開胸暴露心臟，在右心耳處切一小口，將針頭經(jīng)左心室插人升主動脈內(nèi)，向內(nèi)注人4℃冰生理鹽水至右心耳流出液澄清后，再注人4％多聚甲醛250ml，速度先快后慢地持續(xù)約1h左右，斷頭取腦。將腦組織置于4％多聚甲醛中在4℃冰箱內(nèi)固定6h，經(jīng)脫水后用石蠟包埋制成切片。

1.3測定h2s含量

分光光度法間接測定腦組織中h2s含量。開顱取腦，分離出雙側(cè)海馬組織、前腦皮質(zhì)和紋狀體放入液氮保存?zhèn)溆?，?～4℃的50mmol/l磷酸鉀緩沖液(ph8.0)勻漿(12％質(zhì)量體積比)，勻漿液離心(20000r,15min,4℃),上清液(75μl)移至另一離心管中，在室溫下加入0.25ml1％醋酸鋅及0.45ml雙蒸水孵育10min,然后加入10％三氯乙酸0.25ml，再次離心(14000r,10min,4℃)，收集清澈的上清液，加入20mmol/ln,n-二甲基苯二胺·7.2mol/lhcl緩沖液133μl及30mmol/lfecl3·1.2mol/lhcl緩沖液133μl,充分混勻，20min后，用全自動酶標儀在波長670nm測定吸光度，根據(jù)h2s標準曲線計算溶液中的h2s含量，腦組織中硫化氫含量以單位重量的組織硫化氫的量(nmol/g)表示。

1.4測定mbp的表達情況

每組均隨機選取4只小鼠，全部用作免疫組化檢測，各組所取小鼠經(jīng)4％多聚甲醛(溫度：4℃)灌注，斷頭取腦，進行固定、脫水、透明、浸蠟后制作蠟塊，石蠟切片經(jīng)脫蠟復水后，進行抗原修復和免疫組化，dab顯色，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察并攝片。在高倍顯微鏡下每張切片上隨機攝取雙側(cè)海馬各4個視野的圖片，用image-pro-plus6.0圖像處理軟件對mbp的陽性表達情況進行分析，以其平均光密度值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，統(tǒng)計后取其平均值作為判斷mbp的陽性表達情況。

1.5統(tǒng)計學處理

采用成組設計隨機對照研究，每組樣本計量結(jié)果用p表示，組間比較采用t檢驗，p<0.05為差異具有顯著性，p<0.01差異具有極顯著性。

結(jié)果

sca3小鼠，wt小鼠和sca3nahs低、中、高劑量組小鼠在morris水迷宮實驗中空間學習和記憶的差異。

2.1.1距離

不同小鼠組在morris水迷宮平均行駛距離如圖1所示，在morris水迷宮定位航行訓練中，12月齡的wt小鼠組(n＝12)，sca3小鼠組(n＝12)，sca3nahs低劑量小鼠組(n＝12)，sca3nahs中劑量小鼠組(n＝12)，sca3nahs高劑量小鼠組(n＝12)游泳距離。**p<0.01或***p<0.001。

4天的訓練試驗的數(shù)據(jù)說明，在morris水迷宮平均行駛距離中12月齡的sca3小鼠組比同齡wt小鼠組明顯延長(967.4±71.4cmvs653.3±64.5cm,p<0.01)；同樣12月齡sca3nahs小鼠組比sca3模型小鼠組平均行駛距離明顯縮短(高劑量組：713.2±68.6cm；中劑量組：823.4±64.5cm；低劑量組：881.7±77.2cm；sca3模型組：967.4±71.4cm,p<0.01或<0.001)。

2.1.2平臺潛伏期

不同小鼠組在morris水迷宮平均平臺潛伏期如圖2所示，在morris水迷宮定位航行訓練中，12月齡的wt小鼠組(n＝12)，sca3小鼠組(n＝12)，sca3nahs低劑量小鼠組(n＝12)，sca3nahs中劑量小鼠組(n＝12)，sca3nahs高劑量小鼠組(n＝12)的平均平臺潛伏期。**p<0.01或***p<0.001。

4天的訓練試驗的數(shù)據(jù)說明，在morris水迷宮平均平臺潛伏期中12月齡的sca3小鼠組比同齡wt小鼠組明顯延長(43.8±3.4svs31.4±3.2s，p<0.01)；同樣12月齡sca3nahs小鼠組比sca3模型小鼠組平均平臺潛伏期明顯縮短(高劑量組：32.5±3.0s；中劑量組：35.3±2.4s；低劑量組：38.2±3.5s；sca3模型組：43.8±3.4s,p<0.01)。

2.1.3游泳速度

不同小鼠組在morris水迷宮平均游泳速度如圖3所示，在morris水迷宮定位航行訓練中，12月齡的wt小鼠組(n＝12)，sca3小鼠組(n＝12)，sca3nahs低劑量小鼠組(n＝12)，sca3nahs中劑量小鼠組(n＝12)，sca3nahs高劑量小鼠組(n＝12)的游泳速度。

4天的訓練試驗的數(shù)據(jù)說明，在morris水迷宮游泳速度中12月齡wt小鼠組和sca3小鼠組間沒有統(tǒng)計學差異(p>0.05)，同樣12月齡sca3nahs小鼠組(高、中、低劑量)比sca3模型小鼠組間也沒有統(tǒng)計學差異(p>0.05)。

2.2sca3小鼠海馬h2s含量

免疫組化結(jié)果顯示，12月齡sca3小鼠海馬h2s含量下降，給予nahs后海馬h2s含量增加。如表1所示，sca3模型小鼠組(m)與正常對照組(nc)相比，sca3模型小鼠組(m)海馬組織h2s含量明顯降低(p<0.01)；給予nahs干預后，sca3低劑量小鼠組(nl)與sca3模型小鼠組(m)比較，海馬組織h2s濃度無統(tǒng)計學差異(p>0.05)；sca3nahs中劑量小鼠組(nm)和sca3高劑量小鼠組(nh)與sca3模型小鼠組(m)相比，海馬組織h2s含量非常顯著增加(p均<0.01)。

表1sca3小鼠給予nahs后海馬組織h2s含量

注：nc組：正常對照組；m組：sca3模型組,與nc組比較p＝0.000000014(p<0.01)；nl組：sca3小鼠nahs低劑量組，與nc組比較p＝0.000000167(p<0.01)；nm組：sca3小鼠nahs中劑量組；與nc組比較p＝0.000007620(p<0.01)，與m組比較p＝0.000000058(p<0.01)。nh組：sca3小鼠高劑量給予nahs組,與nc組比較p＝0.000120234(p<0.01)，與m組比較p＝0.0000000099(p<0.01)?！c正常對照組(nc)比較p<0.01；★與sca3模型組(m)比較p<0.01。

2.312月齡sca3小鼠與wt小鼠海馬有髓神經(jīng)纖維mbp陽性表達

sca3模型小鼠組(m)與正常對照組(nc)相比，期海馬有髓神經(jīng)纖維mbp平均光密度明顯降低，絲狀著色減少(p<0.01)；給予nahs干預后，sca3中、高劑量小鼠組(nm和nh)與sca3模型組(m)小鼠相比，海馬有髓神經(jīng)纖維mbp平均光密度均升高，絲狀著色增加(p<0.01)。海馬有髓神經(jīng)纖維mbp免疫組化平均光密度值如表2所示。不同組小鼠的海馬有髓神經(jīng)纖維的絲狀著色圖如圖5－9所示。

表2海馬有髓神經(jīng)纖維mbp免疫組化平均光密度值

注：nc組：正常對照組；m組：sca3模型組；nl組：sca3小鼠低劑量給予nahs組；nm組：sca3小鼠中劑量給予nahs組；nh組：sca3小鼠高劑量給予nahs組?！鴓<0.01與正常對照組(nc)比較；★p<0.01與sca3模型組(m)比較。

本實驗已測出sca3小鼠的記憶能力明顯低于wt小鼠，sca3小鼠海馬內(nèi)硫化氫的量明顯低于wt小鼠。海馬中的h2s與sca3小鼠生長過程中的空間學習和記憶有更多的關系。并已通過免疫組化的方法測出mbp含量在wt小鼠和sca3小鼠大腦海馬內(nèi)的差異，sca3小鼠的大腦海馬內(nèi)有髓神經(jīng)纖維通路的mbp含量明顯低于wt小鼠。

因此，我們有理由認為，sca3小鼠記憶功能障礙可能是由于其海馬內(nèi)有髓神經(jīng)纖維通路髓鞘堿性蛋白含量的降低引起的。我們推測硫氫化鈉治療sca3小鼠的機制可能是：硫氫化鈉通過上調(diào)海馬內(nèi)硫化氫的含量能夠改善其線粒體的功能，進而有可能使海馬有髓神經(jīng)纖維通路mbp含量增加來減輕其髓鞘損傷，或許就可以改善sca3小鼠的記憶障礙。