本發(fā)明屬于醫(yī)藥和/或保健品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種過山厥素在制備預(yù)防和改善肥胖癥藥物方面的新應(yīng)用。

背景技術(shù)：

過山厥素，化學(xué)名稱山萘酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-7-o-α-l-鼠李糖苷，具有抗氧化、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、腸平滑肌、阻斷α-受體，阻斷β-受體的作用，是一種已知的天然化合物，多從植物中提取分離獲得。

肥胖癥是遺傳、環(huán)境等多種因素引起的體內(nèi)脂肪堆積過多、體重增加的慢性代謝性疾病。與2型糖尿病、血脂異常密切相關(guān)。攝入的能量超過消耗的能量會(huì)導(dǎo)致脂肪的堆積。脂肪組織的增大是由脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多和體積增大引起的。脂肪組織的增殖、分化失常會(huì)引起脂肪組織的堆積。體內(nèi)脂肪組織過多堆積會(huì)分泌一系列的激素和脂肪細(xì)胞因子干擾胰島素在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，引發(fā)胰島素抵抗，胰島素抵抗是指體內(nèi)外周組織（肌肉、脂肪）對(duì)胰島素的敏感性降低，使得外周組織對(duì)葡萄糖的攝取減少，導(dǎo)致血糖升高，從而誘發(fā)2型糖尿病。肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病率不斷上升，已成為全球性的健康問題。開發(fā)預(yù)防和改善治療肥胖癥的天然產(chǎn)物意義尤為深遠(yuǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種過山厥素在制備預(yù)防和改善肥胖癥藥物方面的新應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

過山厥素在制備預(yù)防和和改善肥胖癥藥物方面的新應(yīng)用，即其具有潛在的減肥功效。

上述的應(yīng)用，具體的可以是：過山厥素在制備抑制前脂肪細(xì)胞分化的藥物和/或保健品方面的應(yīng)用。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了過山厥素可以抑制前脂肪細(xì)胞分化，可能成為治療肥胖、2型糖尿病的一種新型化合物。因此，可被用作制備制備預(yù)防和改善肥胖癥藥物和/或保健品。

附圖說明

圖1為油紅o染色試驗(yàn)結(jié)果，圖中，上部為對(duì)照組油紅分化形態(tài)圖，下部為過山厥素油紅分化染色圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。

過山厥素是一種已知的天然化合物，多從植物中提取分離獲得。本發(fā)明中過山厥素從植物女貞花（于2015年6月采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)濕地公園，由貴州大學(xué)張前軍教授鑒定為女貞（ligustrumlucidumait.）的花）中提取獲得。具體提取分離步驟如下：

1）取475g干燥女貞花，添加石油醚至浸沒女貞花，然后加熱回流提取2次，每次回流提取2h，回流提取結(jié)束后，過濾，所得殘?jiān)鼡]干石油醚，用70%乙醇室溫下浸漬提取3次（70%乙醇添加量以浸沒殘?jiān)鼮橐耍?，每次浸漬提取3天，合并提取液并濃縮，得到女貞花總浸膏；

2）女貞花總浸膏用50%乙醇溶解后，用d101型大孔樹脂吸附分離，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫五個(gè)柱體積，每個(gè)柱體積2000ml，洗脫液濃縮后，分別得到水部位浸膏、20%乙醇部位浸膏7g、40%乙醇部位浸膏60g、60%乙醇部位浸膏24g、95%乙醇部位16g；

3）40%乙醇部位浸膏（50g），經(jīng)200-300目硅膠柱色譜進(jìn)行分離，二氯甲烷/甲醇（v/v，100:0、50:1、25:1、20:1、15:1、5:1、2:1）進(jìn)行洗脫，分離得到2個(gè)組分。其中的第1組分（10g）經(jīng)過硅膠h減壓柱色譜，二氯甲烷/甲醇（v/v，10:1、7:1、5:1、3:1、2:1、1:1）洗脫，然后經(jīng)過sephadexlh-20凝膠柱色譜純化，甲醇洗脫，分離得到化合物1（54mg），剩下的組分繼續(xù)用反相半制備高效液相色譜純化，用甲醇-水(0-40min,40%甲醇-100%甲醇；40-60min，100%甲醇，tr=46min)洗脫，分離得到化合物2(71mg)。其中的第2組分（5.6g）經(jīng)過硅膠h減壓柱色譜和sephadexlh-20凝膠柱色譜分離純化得到化合物3（547mg）。化合物1、化合物2、化合物3經(jīng)鑒定分別為山奈苷、10-羥基橄欖苦苷、過山蕨素，具體結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下。

化合物1：黃色針晶（甲醇），分子量：578，分子式：c27h30o14，¹h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.79(2h,d,j=8hz,h-2′,6′),6.92(2h,d,j=8hz,h-3′,5′),6.79(1h,d,j=4hz,h-8),6.46(1h,d,j=4hz,h-6),5.55(1h,d,7-o-rha,h-1),5.30(1h,d,j=4hz,3-o-rha,h-1),1.13(3h,d,j=4hz,7-o-rha,h-6),0.80(3h,d,j=8hz,3-o-rha,h-6).¹³c-nmr(dmso-d6,100mhz)δ:177.97(c-4),161.73(c-7),160.96(c-5),160.26(c-4′),157.84(c-9),156.14(c-2),134.56(c-3),130.76(c-2′,6′),120.38(c-1′),115.47(c-3′,5′),105.82(c-10),101.90(7-o-rha,c-1),99.51(3-o-rha,c-1),98.43(c-6),94.63(c-8),71.62(7-o-rha,c-4),71.13(3-o-rha,c-4),70.73(7-o-rha,c-3),70.34(3-o-rha,c-3),70.26(7-o-rha,c-2),70.11(3-o-rha,c-2),70.11(7-o-rha,c-5),69.85(3-o-rha,c-5),17.97(7-o-rha,c-6),17.52(3-o-rha,c-6)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)（陳艷,鄧虹珠,梁磊.細(xì)梗胡枝子黃酮類成分的研究[j].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(05):858-860.）中化合物ⅳ比對(duì)，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為山奈苷。

化合物2：白色固體，分子量：556，分子式：c25h32o14。¹h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:6.64(1h,d,j=8hz),6.60(1h,s),6.47(1h,d,j=8hz)為苯環(huán)上的質(zhì)子，7.53(1h,s),6.00(1h,t)為兩個(gè)烯氫質(zhì)子，4.66(1h,d,j=8hz)為葡萄糖端基質(zhì)子，3.64(1h,s,c-11-och3)。¹³c-nmr(dmso-d6,100mhz)δ:170.70(c-7),166.15(c-11),153.42(c-3),145.15(c-3′),143.82(c-4′),129.24(c-1′),128.36(c-8),128.26(c-9),119.54(c-6′),116.22(c-2′),115.59(c-5′),107.61(c-4),99.14(glc-1″),92.66(c-1),77.42(glc-3″),76.63(glc-5″),73.32(glc-2″),69.95(glc-4″),65.16(c-β),61.13(glc-6″),57.28(c-10),51.34(c-11-och3),39.90(c-6),33.71(c-α),30.69(c-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（馮雪松,許磊,高慧媛,吳立軍.關(guān)東丁香化學(xué)成分的分離與鑒定[j].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(09):697-700）中化合物5比對(duì)，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2為10-羥基橄欖苦苷。

化合物3：黃色粉末（甲醇），分子量：594，分子式：c27h30o15，mp243～246℃,¹h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:8.09(2h,d,j=8hz,h-2′,6′),6.89(2h,d,j=8hz,h-3′,5′),6.83(1h,s,h-8),6.44(1h,d,j=4hz,h-6),5.55(1h,s,3-o-glu,h-1),5.49(1h,d,j=8hz,7-o-rha,h-1),1.12(3h,d,j=4hz,7-o-rha,h-6).¹³c-nmr(dmso-d6,100mhz)δ:177.70(c-4),161.62(c-7),160.92(c-5),160.17(c-4′),156.80(c-9),156.03(c-2),133.51(c-3),130.07(c-2′,6′),120.82(c-1′),115.20(c-3′,5′),105.71(c-10),100.77(3-o-glu,c-1),99.44(7-o-rha,c-1),98.41(c-6),94.54(c-8),77.62(3-o-glu,c-5),76.45(3-o-glu,c-3),74.26(3-o-glu,c-2),71.64(7-o-rha,c-4),70.28(3-o-glu,c-4),70.12(7-o-rha,c-3),69.95(7-o-rha,c-2),69.87(7-o-rha,c-5),60.89(3-o-glu,c-6),17.98(7-o-rha,c-6)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)（袁琳,黃文忠,梁德強(qiáng),馬銀海,杜芝芝.合柄鐵線蓮中黃酮苷類化學(xué)成分研究[j].中國(guó)藥學(xué)雜志,2015,50(06):497-501.）中化合物3比對(duì)，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3為過山蕨素（山萘酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-7-o-α-l-鼠李糖苷）。

應(yīng)用試驗(yàn)1、過山厥素對(duì)3t3-l1前脂肪細(xì)胞活性的影響

儀器材料：儀器：制備型高效液相色譜儀（waters2535q）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（eyela，東京理化器械株式會(huì)社）；lc-3000高效液相制備柱色譜（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；am-400超導(dǎo)核磁共振儀（bruker）；電子天平（美國(guó)mettler-toledo公司）；tgl-16gr高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；雙人單面凈化工作臺(tái)（型號(hào)：sw-cj-2fd型廠家：蘇州凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)：3111型，廠家：thermoscientific）；倒置顯微鏡（ckx31型，olympus）；全溫振蕩培養(yǎng)箱（hzp型上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；離心沉淀器（800型上海手術(shù)器械廠）；各種規(guī)格移液槍（transferpette）；數(shù)碼相機(jī)（canoneos450d）倒置顯微鏡（nikoneclipsets100）；gf254硅膠薄層板（煙臺(tái)匯友硅膠開發(fā)有限公司）；40~80目硅膠、200~300目硅膠和硅膠h（煙臺(tái)匯友硅膠開發(fā)有限公司）；sephadexlh-20（瑞典pharmacia公司）；d101型大孔樹脂（天津海光化工有限公司）；c-18（德國(guó)merk公司）；其余試劑均為分析純；葡萄糖測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，20161105147）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20161001）；小鼠游離脂肪酸測(cè)定試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：201609）；胎牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司，批號(hào)：20160923）；dmem高糖培養(yǎng)液（北京索萊寶科技公司，批號(hào)：f08hv090）；青霉素鏈霉素混合液（solarbio，批號(hào)：20161029）；胰酶細(xì)胞消化液（碧云天，編號(hào)：c0210）二甲基亞砜（sigmashbc3313v）；胰島素（sigma）；噻唑藍(lán)（上海華藍(lán)科技有限公司）；油紅o（sigmaslbp5248v）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（sigma，bcbh1214v）；地塞米松（sigmabcbm4557v）。羅格列酮片（成都恒瑞制藥有限公司）；洛伐他汀膠囊（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，20160109）；細(xì)胞株：3t3-l1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)。

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)與凍存：

3t3-l1前脂肪細(xì)胞，用含15%胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)液（青霉素：10u/ml、鏈霉素10μg/ml）在37℃、5%co2飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合至80%后，棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶液1ml，作用1min左右，加入2倍體積培養(yǎng)液終止消化，用吹打管將貼壁細(xì)胞吹打入培養(yǎng)液。將細(xì)胞懸液移入無菌離心管，1000rpm離心5min，棄上清。細(xì)胞傳代：1個(gè)培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞沉淀用1ml新培養(yǎng)液吹散，按1：2比例傳代。細(xì)胞凍存：2個(gè)培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞沉淀用1.2ml凍存液（含10%dmso的胎牛血清）吹散轉(zhuǎn)入凍存管放入程序降溫盒，然后放入-80℃冰箱過夜，取出凍存管放入液氮罐中保存。

細(xì)胞毒活性檢測(cè)：

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3t3-l1前脂肪細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔2×10⁵的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。將細(xì)胞置于37℃、5%co2及飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合至60%-70%，加入濃度梯度的藥物，每個(gè)板設(shè)正常對(duì)照組、溶媒對(duì)照組（0.1%dmso）、給藥組，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μlmtt溶液（5g/l），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100μldmso置震蕩培養(yǎng)箱（100r/min）中震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度值（od值）。

表1：過山厥素對(duì)3t3-l1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞毒活性的影響（n=6）

由表1可知，正常對(duì)照組和溶媒對(duì)照組吸光度值相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明溶媒對(duì)細(xì)胞活力不產(chǎn)生影響。過山蕨素300μm劑量組吸光度值低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001）。說明過山蕨素在300μm時(shí)具有細(xì)胞毒性，不能作為給藥劑量。過山蕨素100、33和11μm劑量組與正常對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明過山蕨素在100、33和11μm劑量時(shí)均沒有細(xì)胞毒作用。即過山蕨素100μm劑量范圍以下均可設(shè)為給藥劑量。

應(yīng)用試驗(yàn)2、過山厥素對(duì)3t3-l1前脂肪細(xì)胞分化的影響

以3t3-l1前脂肪細(xì)胞為細(xì)胞模型，在誘導(dǎo)分化過程中加入過山厥素，油紅o染色鑒定3t3-l1前脂肪細(xì)胞分化程度。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3t3-l1前脂肪細(xì)胞傳代培養(yǎng)，按1.5×10⁵的密度接種到96孔板中，細(xì)胞完全融合后，接觸抑制48h，然后更換含分化誘導(dǎo)劑a（0.5mmibmx、1μmdex、10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養(yǎng)液，同時(shí)加藥（分為空白組，模型組、洛伐他汀組（50μm），給藥組）。3d后換成含誘導(dǎo)分化劑b（含有10μg/mlinsulin）的dmem高糖培養(yǎng)液（含15%的胎牛血清），2d后換常規(guī)培養(yǎng)液，此后隔天換液，培養(yǎng)至12d，小心吸除培養(yǎng)液，冰冷pbs洗2次，晾干，每孔加入50μl4%多聚甲醛固定40min，pbs再洗2遍，晾干，加入油紅o染色30min，pbs洗2次，超純水洗2次，倒置顯微鏡下數(shù)碼相機(jī)拍照（100×）。每孔加入100μl異丙醇，40min后使用酶標(biāo)儀在495nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。結(jié)果如下。

數(shù)據(jù)處理：結(jié)果采用均值±sd值表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用spss19.0軟件單因素方差分析法（one-wayanova）比較其顯著性差異。

表2：過山厥素對(duì)3t3-l1前脂肪細(xì)胞分化的影響（n=6）

由圖1、表2可知，與模型組相比，洛伐他汀組油紅染色水平顯著降低（p<0.05），說明洛伐他汀組能夠抑制3t3-l1前脂肪細(xì)胞分化。過山蕨素100、33μm劑量組油紅染色水平顯著降低（p<0.01），說明過山蕨素100、33μm劑量組能夠抑制3t3-l1前脂肪細(xì)胞的分化，說明過山厥素具有用于預(yù)防和改善肥胖癥的潛質(zhì)。

結(jié)論：過山厥素能夠抑制3t3-l1前脂肪細(xì)胞的分化，說明其具有用于預(yù)防和改善肥胖癥的潛質(zhì)。