本發(fā)明涉及羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉材料，尤其涉及一種可用作抗菌骨修復(fù)材料的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

感染性骨缺損是臨床的棘手問題，目前臨床的常用治療方法是清創(chuàng)、使用大量的抗生素和骨移植。骨組織工程是骨修復(fù)的研究熱點(diǎn)，在抗菌骨修復(fù)材料上，目前研究大多數(shù)使用加入抗生素的辦法打到抑菌效果。然而，抗生素產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥性問題，也成為了感染治療中新的難題。殼聚糖和海藻酸鈉都是自然界存量豐富的天熱多糖，在骨修復(fù)材料中具有很好的應(yīng)用前景。大量研究已經(jīng)證明殼聚糖和海藻酸鈉具有良好的生物相容性：無毒性、致敏性低和具有生物降解性。同時，殼聚糖還有抗菌、促進(jìn)骨修復(fù)等多種生物功能。

金屬離子的抗菌作用也是研究的熱點(diǎn)，如銀離子、銅離子等具有很強(qiáng)的殺菌作用。由于銀的價格昂貴而且人體中不含銀離子，銀在應(yīng)用上有一定的限制。銅是自然界儲量豐富的金屬，也是人體所需的微量元素，應(yīng)用前景良好。目前，合成含銅的骨修復(fù)支架材料，多數(shù)研究通常通過加入銅離子溶液達(dá)到使支架材料含銅的效果。然而，該合成方法易出現(xiàn)溶液立即交聯(lián)的現(xiàn)象，導(dǎo)致制備困難、銅離子分布不均勻，嚴(yán)重限制其實(shí)際應(yīng)用。目前報道的含銅骨修復(fù)支架中，使用納米銅合成的報道幾乎沒有。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供了一種含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的制備方法，制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架具有多孔結(jié)構(gòu),同時具有良好的生物相容性和抗菌效果。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的制備方法，其包括以下步驟：

(1)用超純水配制納米銅溶液；

(2)將羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉加入步驟(1)制得的納米銅溶液中，混合均勻，得到混合溶液；

(3)將步驟(2)得到的混合溶液凍干，得到凍干后的初始支架；

(4)向步驟(3)得到的凍干后的初始支架中加入cacl2溶液交聯(lián)，清洗，得到交聯(lián)后的支架；

(5)將步驟(4)得到的交聯(lián)后的支架凍干，即得所述含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉抗菌骨修復(fù)支架。

在以上技術(shù)方案中，先將納米銅溶液與羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉均勻混合，其后將混合溶液凍干后得到多孔結(jié)構(gòu)，納米銅即可均勻、穩(wěn)定地分散在羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉中；加入交聯(lián)劑cacl2溶液后，羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉遇cacl2即發(fā)生凝結(jié)，使得材料的強(qiáng)度進(jìn)一步增加。

羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的選擇是發(fā)明人通過大量的創(chuàng)造性試驗(yàn)從眾多材料中篩選得到的，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合使用可以有效的彌補(bǔ)各自的不足。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)單純使用羧甲基殼聚糖制備得到的支架脆性大，單純使用海藻酸鈉制備得到的支架強(qiáng)度不足，而羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的聯(lián)合使用具有協(xié)同增效的作用，可有效降低支架的脆性，提高支架強(qiáng)度，從而使得抗菌骨修復(fù)支架的性能更優(yōu)。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(1)中，納米銅溶液的濃度為0.01-10mm。當(dāng)納米銅濃度高于10mm時，會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而當(dāng)其低于0.01mm時，則抗菌性不佳。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(2)中，混合溶液中，羧甲基殼聚糖的濃度為0.5-2.5％w/v，海藻酸鈉的濃度為0.5-2.5％w/v。當(dāng)兩者的濃度過高時，制備的支架不能成型，當(dāng)濃度過低時，則存在制備困難的問題。發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)羧甲基殼聚糖的濃度為0.5-2.5％w/v，海藻酸鈉的濃度為0.5-2.5％w/v時，制得的抗菌骨修復(fù)支架能夠更好的滿足抗菌骨修復(fù)支架的要求。

需要說明的是，若無特別說明，本文中涉及的濃度單位％w/v的計算公式為：(物質(zhì)的質(zhì)量/溶液的體積)×100％，其中物質(zhì)的質(zhì)量/溶液的體積的單位為g/ml；例如，此處的海藻酸鈉的濃度是通過(海藻酸鈉的質(zhì)量/組分a的體積)×100％得到的。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(2)中，羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的重量比為1:1。此時，制得的抗菌骨修復(fù)支架強(qiáng)度更佳。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(2)中，混合溶液中，羧甲基殼聚糖的濃度為1.5％w/v，海藻酸鈉的濃度為1.5％w/v。該濃度制備的支架孔隙大小更為適宜，制得的支架性能更好。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(3)通過以下步驟實(shí)施：將混合溶液移入容器中，-80℃冷凍過夜后，移至凍干機(jī)內(nèi)凍干；優(yōu)選地，所述步驟(3)中，凍干時間為45～50h，更優(yōu)選為48h。48h時既可保證混合溶液徹底凍干，同時制成的多孔結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定、適宜。

所述容器可為培養(yǎng)板，例如48孔培養(yǎng)板。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(4)中，cacl2溶液的濃度為1.5～2.5％w/v，優(yōu)選為2％w/v。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(4)中，交聯(lián)時間為25～35min，優(yōu)選為30min。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(5)中，凍干時間為20～30h，優(yōu)選為24h。24h既可保證支架徹底凍干，同時節(jié)省時間，得到的支架的性能更好。

另一方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)以上所述的制備方法制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架。

又一方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)以上所述的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架作為抗菌骨修復(fù)材料的應(yīng)用。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小主要90～130μm之間分布。

(2)本發(fā)明的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的制備方法，加入納米銅的過程中不會發(fā)生支架材料立即交聯(lián)，制備過程簡單，銅分布更加均勻。

(3)本發(fā)明制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的相對細(xì)胞活性在80％以上，沒有細(xì)胞毒性，溶血性低于5％，沒有溶血性，具有良好的生物相容性。

(4)本發(fā)明制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架制備方法對金黃色葡萄球菌的抗菌性可達(dá)99％以上，具有良好的抗菌效果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架外觀。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的掃描電鏡照片。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的細(xì)胞毒性檢測結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的溶血性檢測結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的抗菌性檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

用超純水配置10ml濃度為10mm的納米銅溶液，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至均勻。逐漸加入150mg的羧甲基殼聚糖和150mg海藻酸鈉，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至完全溶解。將上述混合溶液加入48孔培養(yǎng)板中，放入-80℃冰箱中冷凍過夜。將48孔板移至凍干機(jī)內(nèi)凍干48h。加入2％cacl2溶液交聯(lián)30min，超純水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷凍過夜，使用凍干機(jī)凍干24h后得到支架，即為含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架。

將所得到的支架與10⁵個成纖維細(xì)胞l929共培養(yǎng)，分別于1、3、5天棄去培養(yǎng)基，加入10％的mtt溶液，4h后加入dmso溶解紫色結(jié)晶，于490nm測量吸光度，檢測支架的細(xì)胞毒性。將所得支架與稀釋后的健康人外周血共培養(yǎng)1h，離心后吸取上清，于545nm測量吸光度，檢測支架的溶血性。將所得到的支架與10⁶cfu的金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)24h，稀釋1000倍后涂板，培養(yǎng)24h后進(jìn)行計數(shù)，檢測支架的抗菌性。本實(shí)施例1制備得到的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架外觀如圖1所示。

圖2為本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的掃描電鏡圖，由圖2可知，本實(shí)施例1制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架為多孔結(jié)構(gòu)。

圖3為本實(shí)施例1制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的細(xì)胞毒性檢測結(jié)果，由圖2可知，本實(shí)施例1制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架與空白培養(yǎng)板相比，在1、3、7天的相對細(xì)胞活性分別為97.76％、114.99％和102.95％，所制備材料無細(xì)胞毒性。

圖4為本實(shí)施例1制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的溶血性檢測結(jié)果，本實(shí)施例1制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的溶血性為1.13％，由圖3可知，所制備的支架無明顯的溶血性。

圖5為本實(shí)施例1制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的抗菌性檢測結(jié)果，由圖4可知，本實(shí)施例1制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架對金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)99.86％，具有良好的抗菌性。

實(shí)施例2

用超純水配置10ml濃度為稱取1mm的納米銅溶液，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至均勻。逐漸加入150mg的羧甲基殼聚糖和150mg海藻酸鈉，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至完全溶解。將上述混合溶液加入48孔培養(yǎng)板中，放入-80℃冰箱中冷凍過夜。將48孔板移至凍干機(jī)內(nèi)凍干48h。加入2％cacl2溶液交聯(lián)30min，超純水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷凍過夜，使用凍干機(jī)凍干24h后得到支架，即為含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架與空白培養(yǎng)板相比，在1、3、7天的相對細(xì)胞活性分別為85.81％、132.19％和106.99％，所制備材料無細(xì)胞毒性。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的溶血性為1.37％。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架對金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)99.38％，具有良好的抗菌性。

實(shí)施例3

用超純水配置10ml濃度為稱取0.1mm的納米銅溶液，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至均勻。逐漸加入150mg的羧甲基殼聚糖和150mg海藻酸鈉，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至完全溶解。將上述混合溶液加入48孔培養(yǎng)板中，放入-80℃冰箱中冷凍過夜。將48孔板移至凍干機(jī)內(nèi)凍干48h。加入2％cacl2溶液交聯(lián)30min，超純水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷凍過夜，使用凍干機(jī)凍干24h后得到支架，即為含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架與空白培養(yǎng)板相比，在1、3、7天的相對細(xì)胞活性分別為94.97％、133.8％和113.15％，所制備材料無細(xì)胞毒性。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的溶血性為1.08％。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架對金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)98.67％，具有良好的抗菌性。

實(shí)施例4

用超純水配置10ml濃度為稱取10mm的納米銅溶液，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至均勻。逐漸加入50mg的羧甲基殼聚糖和50mg海藻酸鈉，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至完全溶解。將上述混合溶液加入48孔培養(yǎng)板中，放入-80℃冰箱中冷凍過夜。將48孔板移至凍干機(jī)內(nèi)凍干48h。加入2％cacl2溶液交聯(lián)30min，超純水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷凍過夜，使用凍干機(jī)凍干24h后得到支架，即為含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架與空白培養(yǎng)板相比，在1、3、7天的相對細(xì)胞活性分別為95.72％、122.59％和104.16％，所制備材料無細(xì)胞毒性。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的溶血性為1.17％。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架對金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)99.83％，具有良好的抗菌性。

實(shí)施例5

用超純水配置10ml濃度為稱取10mm的納米銅溶液，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至均勻。逐漸加入250mg的羧甲基殼聚糖和250mg海藻酸鈉，磁力攪拌器于常溫條件下攪拌至完全溶解。將上述混合溶液加入48孔培養(yǎng)板中，放入-80℃冰箱中冷凍過夜。將48孔板移至凍干機(jī)內(nèi)凍干48h。加入2％cacl2溶液交聯(lián)30min，超純水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷凍過夜，使用凍干機(jī)凍干24h后得到支架，即為含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架與空白培養(yǎng)板相比，在1、3、7天的相對細(xì)胞活性分別為88.25％、105.83％和98.61％，所制備材料無細(xì)胞毒性。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架的溶血性為1.64％。

本實(shí)施例制備的含銅羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉支架對金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)99.91％，具有良好的抗菌性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受所述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。