本發(fā)明涉及藥食兩用中藥發(fā)酵產(chǎn)物，特別涉及酸棗仁和茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物，具體屬于一種酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗Ziziphus jujuba Spinosa(Bunge)Huex H.F.Chou的干燥種子，味甘，性平，有寧心安神、養(yǎng)肝、斂汗生津之效，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在治療失眠中藥排行榜上位列第一，使用頻率高達(dá)為67.3％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他常用安神類中藥。目前市場上銷售的酸棗仁產(chǎn)品，大多數(shù)是直接以酸棗仁為原料，或者利用酸棗仁粗提物為原料加工成合適劑型的粗加工產(chǎn)品；也沒有酸棗仁微生物共發(fā)酵相關(guān)產(chǎn)品。盡管酸棗仁具有較好的改善睡眠活性，但是缺少高附加值的產(chǎn)品，其豐富的資源沒有得到充分利用。

茯苓(Poria)為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，是中醫(yī)藥最常用的藥用真菌之一?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將茯苓列為上品，言其“久服，安魂養(yǎng)神，不饑延年”，說明茯苓具有較好的益智、改善記憶、寧心安神的作用。茯苓作為我國傳統(tǒng)中藥，是多種方劑及中成藥的原料，有“十藥九茯苓”之說。目前茯苓作為中華九大“仙草”之一的藥用真菌，其固體發(fā)酵或者液體深層發(fā)酵研究均已十分成熟，但將其作為工程菌用于中藥發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)的報(bào)道幾乎未見。

中醫(yī)藥對藥用真菌的使用可追溯到2500年前，其代謝產(chǎn)物在疾病治療、預(yù)防及抑制或保健方面體現(xiàn)出尤為重要的作用。藥用真菌本身具有強(qiáng)大而豐富的酶系統(tǒng)，可以擔(dān)負(fù)中藥發(fā)酵工程菌的角色。利用藥用真菌對中藥進(jìn)行發(fā)酵具有多方面的優(yōu)點(diǎn)：①藥用真菌與中藥共發(fā)酵可以提高已知成分的相對含量，增強(qiáng)中藥的療效；②藥用真菌與中藥共發(fā)酵可以產(chǎn)生新的活性成分，為中藥活性成分的結(jié)構(gòu)修飾提供新的途徑；③藥用真菌與中藥共發(fā)酵可以對中藥起到減毒增效的作用；④藥用真菌與中藥共發(fā)酵可以有效的提高中藥資源的利用率；⑤藥用真菌與中藥共發(fā)酵反應(yīng)在常溫、常壓等較為溫和的條件下進(jìn)行，能最大限度地保護(hù)中藥活性成分。這些均體現(xiàn)了中藥發(fā)酵的技術(shù)優(yōu)勢。

酸棗仁、茯苓是我國衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)公布的既是食品又是中藥材物質(zhì)，目前兩者均是開發(fā)改善睡眠藥物、保健食品、功能食品的熱點(diǎn)研究對象。本發(fā)明借鑒現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)，以我國具有資源優(yōu)勢的藥食同源藥材酸棗仁為培養(yǎng)基質(zhì)，利用藥用真菌茯苓為工程菌，對酸棗仁進(jìn)行微生物發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，茯苓菌株利用酸棗仁的非藥用部位(淀粉、蛋白、脂肪油等)作為其生長繁殖所需的營養(yǎng)要素，產(chǎn)生茯苓三萜、茯苓多糖等有效成分；同時(shí)茯苓對酸棗仁非藥用部位進(jìn)行代謝利用，在一定程度上減少酸棗仁非藥用部位，從而減少酸棗仁的服用量；此外，茯苓菌株中豐富的酶系統(tǒng)，可以催化酸棗仁中化學(xué)成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，產(chǎn)生新的活性成分，從而提高酸棗仁改善睡眠作用。通過酸棗仁與茯苓的配伍和茯苓的生物發(fā)酵作用，既強(qiáng)化了酸棗仁、茯苓各自的寧心安神效果，又起到了減少服用量的作用，可將酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物開發(fā)成高附加值的中藥新藥、中藥保健食品、中藥功能食品等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、綠色安全的酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法；本發(fā)明的另一目的是提供酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物在制備治療失眠藥品、改善睡眠保健食品或功能性食品中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，包括以下步驟：

1)稱取葡萄糖、磷酸氫二鉀、酵母膏、玉米粉，裝入搖瓶中，加入蒸餾水搖勻，紗布及牛皮紙封口，于蒸汽滅菌器中121℃,滅菌20min，即得茯苓種子液培養(yǎng)基；

2)將步驟1)制備好的茯苓種子液培養(yǎng)基中接入茯苓菌絲，用紗布及牛皮紙封口，放入搖床中，于22～34℃，120～200rpm條件下，搖瓶避光振蕩培養(yǎng)3～5天后，即得茯苓種子液；

3)取酸棗仁，粉碎，過篩；稱取酸棗仁粉末置于搖瓶中，加入蒸餾水，混勻；瓶口用紗布及牛皮紙封口，在121℃條件下滅菌20min后，即得酸棗仁培養(yǎng)基；

4)將步驟2)茯苓種子液按照酸棗仁培養(yǎng)基質(zhì)量的2～10％接種量，轉(zhuǎn)接于步驟3)所得酸棗仁培養(yǎng)基中；將已接種茯苓的酸棗仁培養(yǎng)基放入搖床中，于培養(yǎng)溫度22～34℃，搖床轉(zhuǎn)速120～240rpm，避光發(fā)酵7～21天；

5)將步驟4)所得發(fā)酵產(chǎn)物，冷凍干燥，粉碎過篩，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物。

步驟1)中所述茯苓種子液培養(yǎng)中葡萄糖、磷酸氫二鉀、酵母浸膏、玉米粉、蒸餾水的質(zhì)量比為(0.25～1.5)︰(0.125～0.375)︰(0.1～0.4)︰(0.25～0.75)︰(25～75)。

步驟3)中所述酸棗仁粉碎后過24目～100目篩；所述酸棗仁培養(yǎng)基中酸棗仁粉末、蒸餾水加入量質(zhì)量比為(0.5～1.5)︰(3～7)；酸棗仁培養(yǎng)基的PH值為5～7。

步驟5)中所述冷凍干燥條件：凍結(jié)溫度為-10～-30℃，冷阱溫度為-29～-31℃，真空度為10～20Pa，凍干最終溫度為40～80℃；所述酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物粉碎后過24目～100目篩。

本發(fā)明同時(shí)對酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物改善睡眠作用進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物均能顯著抑制小鼠的自主活動(dòng)，增加閾下劑量戊巴比妥鈉引起的小鼠入睡率，縮短戊巴比妥鈉閾上劑量小鼠進(jìn)入睡潛伏期的時(shí)間，表明酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物具有顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用，可以根據(jù)使用需要應(yīng)用于不同的藥品、保健食品和功能食品中。

本發(fā)明所述的酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物可以被制成各種劑型產(chǎn)品，如膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸、軟膠囊劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、分散片、袋茶、口服液、保健飲料、功能性餅干等。

本發(fā)明制備的酸棗葉提取物具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：

(1)本發(fā)明選取在我國華北地區(qū)具有豐富野生植物資源的酸棗仁為研究對象，利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)對其深入開發(fā)，豐富了酸棗仁的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)了藥用植物資源的綜合利用。

(2)本發(fā)明選取中醫(yī)臨床常用藥用真菌茯苓為發(fā)酵工程菌，利用液體深層發(fā)酵技術(shù)，通過響應(yīng)曲面發(fā)優(yōu)化了酸棗仁-茯苓的發(fā)酵工藝，相較于茯苓傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法，極大地減少了茯苓培養(yǎng)時(shí)間，在原有茯苓藥用功效基礎(chǔ)上拓展了茯苓的在中藥生物工程領(lǐng)域的用途。

(3)本發(fā)明發(fā)酵工藝操作簡便，發(fā)酵周期短、不易污染、能耗成本較低，安全可靠，綠色環(huán)保，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物制備工藝的單因素考察

發(fā)酵溫度的考察。制備酸棗仁培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下接種茯苓種子液，接種量1ml，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，分別于22℃、25℃、28℃、31℃、34℃條件下避光培養(yǎng)5天。利用可見分光光度法測定共發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷與總多糖含量。綜合考慮不同溫度條件下總皂苷與總多糖含量，選取25～31℃為最佳培養(yǎng)溫度。

搖瓶轉(zhuǎn)速的考察。制備酸棗仁培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下接種茯苓種子液，接種量1ml，溫度28℃，分別在90r/min、120r/min、150r/min、180r/min、210r/min條件下避光培養(yǎng)5天。利用可見分光光度法測定共發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷與總多糖含量。綜合考慮不同轉(zhuǎn)速條件下總皂苷與總多糖含量，選取120～180r/min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

培養(yǎng)基初始PH值的考察。配制酸棗仁培養(yǎng)基，用10％的鹽酸將酸棗仁液體液體培養(yǎng)基分別調(diào)PH值至1、2、3、4、5、6、7、8，高壓蒸汽121℃滅菌20min后，無菌環(huán)境下接種茯苓種子液，接種量1ml，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下避光培養(yǎng)5天。利用可見分光光度法測定共發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷與總多糖含量。綜合考慮不同PH值條件下總皂苷與總多糖含量，選取PH值5～7為最佳PH值條件。

接種量的考察。制備酸棗仁培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下接種茯苓種子液，接種量分別為酸棗仁培養(yǎng)基質(zhì)量的0.5％(0.5ml)，2％(1ml)，4％(2ml)，6％(3ml)，8％(4ml)，10％(5ml)，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下避光培養(yǎng)5天。利用可見分光光度法測定共發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷與總多糖含量。綜合考慮不同接種量條件下總皂苷與總多糖含量，選取0.5％～4％為最佳接種量條件。

料液比的考察。分別按照料液比為2.5g/50ml、5.0g/50ml、7.5g/50ml、10.0g/50ml、12.5g/50ml、15.0g/50ml制備酸棗仁培養(yǎng)基，高壓蒸汽121℃滅菌20min后，無菌環(huán)境下接種茯苓種子液，接種量1ml，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下避光培養(yǎng)5天。利用可見分光光度法測定共發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷與總多糖含量。綜合考慮不同料液比條件下總皂苷與總多糖含量，選取7.5～12.5g/50ml為最佳料液比條件。

發(fā)酵時(shí)間的考察。制備酸棗仁培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下接種茯苓種子液，接種量1ml，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下，分別避光培養(yǎng)1至28天。利用可見分光光度法測定共發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷與總多糖含量。綜合考慮不同發(fā)酵時(shí)間條件下總皂苷與總多糖含量，選取12～16天為最佳發(fā)酵時(shí)間。

茯苓種子液菌齡的考察。制備酸棗仁培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下分別接種培養(yǎng)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天的茯苓種子，接種量1ml，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下避光培養(yǎng)5天(每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn))。利用可見分光光度法測定共發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷與總多糖含量。綜合考慮不同茯苓種子液菌齡條件下總皂苷與總多糖含量，選取3～5天為最佳茯苓種子液菌齡條件。

(2)茯苓～酸棗仁共發(fā)酵工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化

對上述各單因素條件下共發(fā)酵產(chǎn)物總皂苷和總多糖含量進(jìn)行t-檢驗(yàn)，表明影響茯苓-酸棗仁共發(fā)酵的主效應(yīng)因素為發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、pH值。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、pH值等3個(gè)因素為自變量，進(jìn)一步優(yōu)化茯苓-酸棗仁共發(fā)酵工藝。按照軟件設(shè)計(jì)出17組不同因素水平進(jìn)行試驗(yàn)后，測定共發(fā)酵產(chǎn)物總皂苷和總多糖含量，結(jié)果見表1。

表1響應(yīng)曲面面設(shè)計(jì)及結(jié)果

在Design expert軟件中，進(jìn)一步對模型進(jìn)行典型性分析，設(shè)置皂苷含量與多糖含量為最大值，軟件自動(dòng)預(yù)測的最佳發(fā)酵條件，預(yù)測在此條件下酸棗仁-茯苓共發(fā)酵共發(fā)酵產(chǎn)物中皂苷含量為7.60362mg/g，多糖含量為120.538mg/g。綜合考慮，選用發(fā)酵條件為溫度25～31℃，發(fā)酵時(shí)間為12～16天，PH為5～7為最佳發(fā)酵條件。

實(shí)施例2

稱取葡萄糖1g、磷酸氫二鉀0.375g、酵母膏0.25g、玉米粉0.5g，裝入250ml搖瓶中，加入50ml蒸餾水搖勻，紗布及牛皮紙封口，于蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min，即得茯苓種子液培養(yǎng)基。制作好的茯苓種子液培養(yǎng)基中接入茯苓菌絲，紗布封口，放入搖床中，28℃，150rpm搖瓶振蕩培養(yǎng)，4天后即得茯苓種子液。取酸棗仁，粉碎，過篩。稱取酸棗仁粉末置于搖瓶中，加入蒸餾水，酸棗仁粉末與蒸餾水質(zhì)量比為1:5，混勻，調(diào)整Ph值為6。瓶口用紗布及報(bào)紙封口，在121℃條件下滅菌20min后，即得酸棗仁培養(yǎng)基。將茯苓種子液按照2％接種量轉(zhuǎn)接于酸棗仁培養(yǎng)基中，放入搖床中，于培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵周期14天，冷凍干燥，粉碎過60目篩，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物。

實(shí)施例3

稱取葡萄糖1.2g、磷酸氫二鉀0.125g、酵母膏0.3g、玉米粉0.25g，裝入250ml搖瓶中，加入50ml蒸餾水搖勻，紗布及牛皮紙封口，于蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min，即得茯苓種子液培養(yǎng)基。制作好的茯苓種子液培養(yǎng)基中接入茯苓菌絲，紗布封口，放入搖床中，22℃，180rpm搖瓶振蕩培養(yǎng)，3天后即得茯苓種子液。取酸棗仁，粉碎，過篩。稱取酸棗仁粉末置于搖瓶中，加入蒸餾水，酸棗仁粉末與蒸餾水質(zhì)量比為2:5，混勻，調(diào)整Ph值為7。瓶口用紗布及報(bào)紙封口，在121℃條件下滅菌20min后，即得酸棗仁培養(yǎng)基。將茯苓種子液按照8％接種量轉(zhuǎn)接于酸棗仁培養(yǎng)基中，放入搖床中，于培養(yǎng)溫度22℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，發(fā)酵周期7天，冷凍干燥，粉碎過60目篩，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物。

實(shí)施例4

稱取葡萄糖0.8g、磷酸氫二鉀0.5g、酵母膏0.35g、玉米粉0.75g，裝入250ml搖瓶中，加入50ml蒸餾水搖勻，紗布及牛皮紙封口，于蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min，即得茯苓種子液培養(yǎng)基。制作好的茯苓種子液培養(yǎng)基中接入茯苓菌絲，紗布封口，放入搖床中，25℃，120rpm搖瓶振蕩培養(yǎng)，4天后即得茯苓種子液。取酸棗仁，粉碎，過篩。稱取酸棗仁粉末置于搖瓶中，加入蒸餾水，酸棗仁粉末與蒸餾水質(zhì)量比為1:3，混勻，調(diào)整Ph值為5。瓶口用紗布及報(bào)紙封口，在121℃條件下滅菌20min后，即得酸棗仁培養(yǎng)基。將茯苓種子液按照4％接種量轉(zhuǎn)接于酸棗仁培養(yǎng)基中，放入搖床中，于培養(yǎng)溫度34℃，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，發(fā)酵周期21天，冷凍干燥，粉碎過60目篩，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物。

實(shí)施例5

稱取葡萄糖1.5g、磷酸氫二鉀0.5g、酵母膏0.4g、玉米粉0.5g，裝入250ml搖瓶中，加入50ml蒸餾水搖勻，紗布及牛皮紙封口，于蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min，即得茯苓種子液培養(yǎng)基。制作好的茯苓種子液培養(yǎng)基中接入茯苓菌絲，紗布封口，放入搖床中，28℃，150rpm搖瓶振蕩培養(yǎng)，4天后即得茯苓種子液。取酸棗仁，粉碎，過篩。稱取酸棗仁粉末置于搖瓶中，加入蒸餾水，酸棗仁粉末與蒸餾水質(zhì)量比為1:10，混勻，調(diào)整Ph值為6。瓶口用紗布封口，在121℃條件下滅菌20min后，即得酸棗仁培養(yǎng)基。將茯苓種子液按照6％接種量轉(zhuǎn)接于酸棗仁培養(yǎng)基中，放入搖床中，于培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵周期7天，冷凍干燥，粉碎過60目篩，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物。

實(shí)施例6酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物制備

稱取實(shí)施例2酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物，置于40～60℃烘箱內(nèi)干燥，干燥產(chǎn)物過50～80目篩。取酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物粉末，置于圓底燒瓶中，加8倍量蒸餾水，浸泡30min，加熱回流1h，用8層紗布過濾，濾渣再加8倍量蒸餾水回流1h，濾過，合并濾液。濃縮至1.125g/ml生藥濃度，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取液；提取液濃縮至干，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物，可用于以下實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例7酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物膠囊制備方法

取實(shí)施例6制備的酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物100g，微粉硅膠適量，混合均勻，采用膠囊制備工藝制備，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物膠囊。

實(shí)施例8酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物滴丸制備方法

取實(shí)施例6制備的酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物100g，加到200g熔融的聚乙二醇6000中，采用滴丸制備工藝制備，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物滴丸。

實(shí)施例9酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物片劑制備方法

取實(shí)施例6制備的酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物100g，糊精200g，混合均勻，制粒，過篩，干燥，即得酸棗仁-茯苓發(fā)酵提取物的顆粒劑；或?qū)⒅频玫念w粒經(jīng)進(jìn)一步壓片，干燥，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物片劑。

實(shí)施例10酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物分散片制備方法

取實(shí)施例6制備的酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物100g，微晶纖維素120g，羧甲基纖維素鈉30g，微粉硅膠1g，混合均勻，壓片，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物分散片。

實(shí)施例11酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物軟膠囊制備方法

取實(shí)施例6制備的酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物100g，植物油250g，混勻，用明膠作囊殼材料，壓制成軟膠囊，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物軟膠囊。

實(shí)施例12酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物保健飲料的制備方法

(1)按實(shí)施例6中制備得到酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取液；

(2)調(diào)配：為了使口感更為甘甜可口，進(jìn)行調(diào)配，配方為：取酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取液(濃度為0.25g/mL)為原料1000mL，再以其總體積計(jì)，加入白砂糖：4.5％；檸檬酸：0.05％；木糖醇：2.0％；β～環(huán)狀糊精：2.0％；麥芽糊精：1.5％；蜂蜜：1.5％；混合均勻后經(jīng)過灌裝，滅菌，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵保健飲料。

實(shí)施例13酸棗仁-茯苓共發(fā)酵餅干的制備方法

將30g綿白糖、6g全脂奶粉、12.5g黃油(加熱融化)、1.5g食鹽及酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物20g混合攬拌，攬拌后混合物溫度降至25℃，再加入3g小蘇打混合。將稱量好的75g低筋面粉(過篩)、9g玉米淀粉與預(yù)調(diào)的配料混合后，放入和面機(jī)進(jìn)行調(diào)制面團(tuán)，面團(tuán)成型后靜置5min。輥印面團(tuán)，使面胚成型.最后送入烘箱設(shè)以面火170℃、底火150℃，烘烤9～13min。烘烤完成后，冷卻餅干，即得酸棗仁-茯苓共發(fā)酵餅干成品。

實(shí)施例14酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物改善睡眠活性研究

(1)對自主活動(dòng)的影響

取小鼠75只，隨機(jī)分成5組，每組15只。空白組給予蒸餾水。酸棗仁提取物組地西泮組，共發(fā)酵提取物組按表2中的劑量灌胃給藥。由于酸棗仁經(jīng)茯苓發(fā)酵后，其質(zhì)量平均會(huì)減少到原來的90％，所以共發(fā)酵提取物低、中劑量組選擇給予5.625g/kg，11.25g/kg。給藥體積為0.2ml/10g，每天給藥1次，連續(xù)給藥7d，末次給藥30min后，將小鼠放入自主活動(dòng)儀的中心區(qū)域，待小鼠適應(yīng)2min后，按曠場法記錄5min內(nèi)小鼠穿過的格數(shù)。

表2酸棗仁提取物、酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物對小鼠自主活動(dòng)的影響

與空白組比較，﹡P＜0.05

與空白組比較，6.25g/kg酸棗仁提取物組、5.625g/kg共發(fā)酵提取物組和地西泮組小鼠穿過的格數(shù)明顯縮短(P＜0.05)，活動(dòng)能力減弱，而11.25g/kg共發(fā)酵提取物組沒有顯著變化，結(jié)果表明酸棗仁茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物對小鼠有一定的鎮(zhèn)靜作用，且服用量較酸棗仁明顯減少。

(2)閾上劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用比較

取小鼠75只，隨機(jī)分成5組，每組15只。空白組給予蒸餾水。酸棗仁提取物組，地西泮組，共發(fā)酵提取物組按表3中的劑量灌胃給藥。。由于酸棗仁經(jīng)茯苓共發(fā)酵后，其質(zhì)量平均會(huì)減少到原來的90％，所以共發(fā)酵提取物選擇給予5.625g/kg，11.25g/kg。給藥體積為0.2ml/10g，每天給藥1次，連續(xù)給藥7d，各組小鼠末次給藥30min后，腹腔注射戊巴比妥鈉55mg/kg。提起小鼠尾部，將小鼠腹部朝上放在310K的熱板上，觀察并記錄小鼠的睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間。結(jié)果見表3。

表3酸棗仁提取物、酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物對小鼠潛伏期與睡眠時(shí)間影響

與空白組比較，﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01

與空白組比較，6.25g/kg酸棗仁提取物組和5.625g/kg、11.25g/kg共發(fā)酵提取物組可以顯著縮短睡眠潛伏期(P＜0.05)。同時(shí)提示酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物在相同改善睡眠效果條件下，可以明顯減少口服劑量。

(3)閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用比較

取小鼠75只，隨機(jī)分成5組，每組15只?？瞻捉M給予蒸餾水。酸棗仁提取物組，地西泮組，共發(fā)酵提取物組按表4中的劑量灌胃給藥。由于酸棗仁經(jīng)茯苓共發(fā)酵后，其質(zhì)量平均會(huì)減少到原來的90％，所以共發(fā)酵提取物選擇給予5.625g/kg，11.25g/kg。給藥體積為0.2ml/10g，每天給藥1次，連續(xù)給藥7d，各組小鼠末次給藥30min后，腹腔注射戊巴比妥鈉25mg/kg。提起小鼠尾部，將小鼠腹部朝上放在310K的熱板上，觀察并記錄小鼠的睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間。結(jié)果見表4。

表4酸棗仁提取物、酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物對小鼠入睡率影響

與空白組比較，^**P＜0.01

與空白組比較，6.25g/kg酸棗仁提取物組和5.625g/kg共發(fā)酵提取物可以顯著提高小鼠入睡率。同時(shí)提示酸棗仁-茯苓共發(fā)酵產(chǎn)物提取物在改善睡眠效果相同的條件下，可以明顯減少口服劑量。