本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種炎癥抑制因子Numbl作為靶基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其是由胰島素分泌不足和（或）作用缺陷所引起。糖尿病主要分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病等。其中，Ⅱ型糖尿病最多見，約占總糖尿病患者的90%-95%。當(dāng)前，全世界的糖尿病患病率、發(fā)病率以及糖尿病患者數(shù)量急劇上升。且隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展、生活方式西方化和人口老齡化，肥胖率上升，我國(guó)糖尿病患病率也呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)：現(xiàn)成年人糖尿病患病率達(dá)9.7%，而糖尿病前期的比例更高達(dá)15.5%。更為嚴(yán)重的是我國(guó)約有60%的糖尿病患者未被診斷，且已接受治療的患者，糖尿病控制的狀況也不理想。因此，對(duì)糖尿病的防治是非常迫切的。非酒精性脂肪肝病是指除外酒精和其他明確肝損傷因素，以肝臟細(xì)胞發(fā)生脂肪變性和脂質(zhì)積聚為主要病理特征的慢性肝臟疾病，其也是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)。非酒精性脂肪肝病是肝酶異常和慢性肝病最常見的原因。在我國(guó)，隨著生活水平得到改善，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，非酒精性脂肪肝病的發(fā)病率日益上升，且呈低齡化趨勢(shì)，其已成為僅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病。雖然有許多治療方法對(duì)非酒精性脂肪肝病患者有益，但是仍無確切的治療藥物。研究結(jié)果顯示，在糖尿病人群中，非酒精性脂肪肝患病率可高達(dá)80%[1]。在有些患者中，肝臟脂肪沉積可能是影響其Ⅱ型糖尿病發(fā)展的主要因素[2]。另一方面，如果Ⅱ型糖尿病控制不佳或充分發(fā)展，不僅促進(jìn)脂肪肝生成，而且使肝損傷加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維變性、肝硬化及肝細(xì)胞癌[3]。這些均啟示著在臨床上不能將這兩個(gè)疾病孤立看待，Ⅱ型糖尿病與非酒精性脂肪肝是互為發(fā)生、相互作用的，可能存在潛在的共同機(jī)制。Numbl基因與Numb基因有高度的同源性，因此稱為Numb-like基因。Numbl基因和Numb基因在結(jié)構(gòu)上都含有磷酸絡(luò)氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PTB），因此其都可通過減弱下游信號(hào)通路和減少Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量來拮抗Notch信號(hào)通路；他們都在神經(jīng)發(fā)生和形成中發(fā)揮重要作用，如在胚胎神經(jīng)發(fā)生中維持神經(jīng)祖細(xì)胞的數(shù)量[4-6]；通過調(diào)節(jié)腦室區(qū)神經(jīng)母細(xì)胞的存活和室管膜的完整性來影響腦室區(qū)的神經(jīng)形成；在血管生成、心臟形成和心臟祖細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[7、8]；在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9、10]。Numb有富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域，而Numbl沒有；Numbl有多聚谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域，而Numb沒有。Numb分布在細(xì)胞膜上，而Numb分布在細(xì)胞漿中。因Numbl和Numb在結(jié)構(gòu)上的差異和定位上的不同，也導(dǎo)致其發(fā)揮的作用也不盡相同[11、12]。目前發(fā)現(xiàn)Numbl還可與TAB2和Traf6直接結(jié)合，并通過促進(jìn)Traf6以K48方式連接的多聚泛素化，而不影響Traf6總的泛素化水平及以K63方式連接的多聚泛素化[13、14]等。參考文獻(xiàn)（1）FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.JHepatol.2009;50:204-210.（2）LoriaP,LonardoA,AnaniaF.Liveranddiabetes.Aviciouscircle.HepatolRes.2013;43:51-64.（3）CusiK.Treatmentofpatientswithtype2diabetesandnon-alcoholicfattyliverdisease:Currentapproachesandfuturedirections.Diabetologia.2016;59:1112-1120.（4）PetersenPH,ZouK,HwangJK,JanYN,ZhongW.Progenitorcellmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneurogenesis.Nature.2002Oct31;419(6910):929-34.（5）PetersenPH,ZouK,KraussS,ZhongW.ContinuingroleformouseNumbandNumblinmaintainingprogenitorcellsduringcorticalneurogenesis.Natureneuroscience.2004Aug;7(8):803-11.（6）KuoCT,MirzadehZ,Soriano-NavarroM,RasinM,WangD,ShenJ,SestanN,Garcia-VerdugoJ,Alvarez-BuyllaA,JanLY,JanYN.PostnataldeletionofNumb/Numblikerevealsrepairandremodelingcapacityinthesubventricularneurogenicniche.Cell.2006Dec15;127(6):1253-64.（7）vanLessenM,NakayamaM,KatoK,KimJM,KaibuchiK,AdamsRH.Regulationofvascularendothelialgrowthfactorreceptorfunctioninangiogenesisbynumbandnumb-like.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology.2015Aug;35(8):1815-25.（8）ZhaoC,GuoH,LiJ,MyintT,PittmanW,YangL,ZhongW,SchwartzRJ,SchwarzJJ,SingerHA,TallquistMD,WuM.Numbfamilyproteinsareessentialforcardiacmorphogenesisandprogenitordifferentiation.Development.2014Jan;141(2):281-95.（9）TaoT,ChengC,JiY,XuG,ZhangJ,ZhangL,ShenA.NumblinhibitsgliomacellmigrationandinvasionbysuppressingTRAF5-mediatedNF-kappaBactivation.Molecularbiologyofthecell.2012Jul;23(14):2635-44.（10）YingjieL,JianT,ChanghaiY,JingboL.Numblikeregulatesproliferation,apoptosis,andinvasionoflungcancercell.Tumourbiology:thejournaloftheInternationalSocietyforOncodevelopmentalBiologyandMedicine.2013Oct;34(5):2773-80.（11）ZhongW,JiangMM,WeinmasterG,JanLY,JanYN.DifferentialexpressionofmammalianNumb,NumblikeandNotch1suggestsdistinctrolesduringmousecorticalneurogenesis.Development.1997May;124(10):1887-97.rogenitorcellmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneurogenesis（12）LiuL,LannerF,LendahlU,DasD.NumblikeandNumbdifferentiallyaffectp53andSonicHedgehogsignaling.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2011Sep30;413(3):426-31.（13）MaQ,ZhouL,ShiH,HuoK.NUMBLinteractswithTAB2andinhibitsTNFalphaandIL-1beta-inducedNF-kappaBactivation.Cellularsignalling.2008Jun;20(6):1044-51.（14）ZhouL,MaQ,ShiH,HuoK.NUMBLinteractswithTRAF6andpromotesthedegradationofTRAF6.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2010Feb12;392(3):409-14。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種炎癥抑制因子Numbl基因的表達(dá)與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因Numbl的新用途，進(jìn)而把Numbl基因應(yīng)用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治療。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明以野生型C57小鼠與肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因敲除小鼠（簡(jiǎn)稱Numbl-LKO）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型（dietinducedobesity，DIO）研究Numbl基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對(duì)比，肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重、空腹血糖水平及胰島素水平明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因敲除小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力明顯減弱。小鼠肝臟重量和肝臟/體重比以及脂質(zhì)成分含量測(cè)定的結(jié)果等均說明HFD組（Highfatdiet，高脂飲食）的Numbl-LKO小鼠脂肪肝病變明顯嚴(yán)重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因敲除會(huì)加劇脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因能夠抑制脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。本發(fā)明人的研究證明了：在高脂誘導(dǎo)的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，Numbl具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，特別是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。針對(duì)Numbl的上述功能，提供Numbl作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)肝臟及糖代謝的藥物中的應(yīng)用。針對(duì)Numbl的上述功能，提供Numbl作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。以上藥物是指能夠促進(jìn)Numbl基因表達(dá)的藥物。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：（1）本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Numbl基因的新功能，即Numbl基因具有能夠保護(hù)脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。（2）基于Numbl在保護(hù)脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。附圖說明圖1是肝臟特異性Numbl基因敲除小鼠構(gòu)建策略圖。圖2是WT和Numbl-LKO小鼠的體重、空腹血糖和空腹胰島素結(jié)果圖；A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，C為空腹胰島素水平統(tǒng)計(jì)圖（*：p＜0.05vsWTNC組，**：p＜0.01vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組，##：p＜0.01vsWTHFD組）。圖3是WT和Numbl-LKO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）比較圖（**：p＜0.01vsWTNC組，##：p＜0.01vsWTHFD組）。圖4是Numbl-LKO和WT小鼠的肝臟重量和肝臟脂質(zhì)含量；A為肝臟重量、肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖，B為肝臟甘油三酯、肝臟膽固醇和肝臟游離脂肪酸統(tǒng)計(jì)柱狀圖（##：p＜0.01vsWTHFD組）。具體實(shí)施方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6小鼠（WT）和Numbl肝臟特異性基因敲除（Numbl-LKO）小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，Numbl肝臟特異性基因敲除小鼠（Numbl-LKO）由Numbl-floxed小鼠與受蛋白啟動(dòng)子控制、肝細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠Albumin-Cre（購自TheJacksonLaboratory，貨號(hào)003574）雜交得到，構(gòu)建策略見圖1。肝臟特異性Numbl基因敲除小鼠的構(gòu)建：根據(jù)基因信息，利用CRISPRDesign（網(wǎng)址：http://crispr.mit.edu/）分別在內(nèi)含子2和3中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)。靶序列分別為：Numbl-sgRNA1:TTTAGAGTTTTAGACGTCCAGGGNumbl-sgRNA2:AGCACATTGCCTGCACACGCTGG此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒（DonorVector），它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII（NEB，R0104L）和EcoRV（NEB，R0195L）雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測(cè)序正確的載體用BamHI（NEB，R0136L）和SpeI（NEB，R0133L）雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。供體載體（DonorVector）的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物（表1）用于擴(kuò)增供體載體的左右同源臂（LA和RA）以及中間的外顯子部分（M）。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后得到3個(gè)片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。引物名稱引物序列酶切位點(diǎn)NumblLA-FCCGCTCGAGCCAAAGAATGACCTGGGAAAXhoINumblLA-RCCCAAGCTTCCAGGGTTTGAATGGGAAGAHindIIINumblM-FTCTACCGGTACGTCTAAAACTCTAAAGCCCATGAgeINumblM-RACGCTTAAGCGCTGGGCCTCACACTCAflIINumblRA-FCGACGCGTTGTGCAGGCAATGTGCTTACMluINumblRA-RATAAGAATGCGGCCGCGAGGAAACGGGAGACACAGANotI表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分（負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA）分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體（pST1374-Cas9）用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒（AM1345，Ambion）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒（Ambion）對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscript?Kit（AM1354，Ambion公司）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit（Qiagen，217084）進(jìn)行純化。Numbl-floxed條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得Numbl-floxed純合小鼠。肝臟特異性Numbl基因敲除小鼠的制作將上述Numbl-floxed小鼠與肝臟特異性Albumin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到Numblfloxed/floxed/ALB-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因敲除小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方：高脂飼料（HFD）（購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12942）：熱量百分比：蛋白質(zhì):20%；碳水化合物:20%；脂肪:60%，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料（NC）（購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12450B）：熱量百分比：蛋白質(zhì):20%；碳水化合物:70%；脂肪:10%，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。飼養(yǎng)環(huán)境及條件：SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫在22-24℃之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食?！緦?shí)施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型（dietinducedobesity，DIO）獲得（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和Numbl-LKO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂飼料（Normalchow，NC）飼養(yǎng)，即WTNC組，LKONC組，WTHFD組，LKOHFD組共4個(gè)組別。（2）模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：采用WT和LKO小鼠，建立DIO模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確Numbl基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和Numbl-LKO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂飼料（Normalchow，NC）飼養(yǎng)，即WTNC組，LKONC組，WTHFD組，LKOHFD組共4個(gè)組別。每周均詳細(xì)記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔1周檢測(cè)1次。實(shí)驗(yàn)第10周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)（IPGTT），以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)葡萄糖耐受能力，第12周終末取材?！緦?shí)施例2】小鼠體重、血糖水平測(cè)定（1）小鼠空腹體重檢測(cè)1）體重檢測(cè)。①禁食：上午8:00將待實(shí)驗(yàn)小鼠禁食（不禁水），下午2:00開始實(shí)驗(yàn)操作。②稱重：分別在第0周、2周、4周、6周、8周、10周和12周稱重，將一塑料小桶放在動(dòng)態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測(cè)量體重記錄數(shù)據(jù)。（2）空腹血糖水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將所有待實(shí)驗(yàn)的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食（不禁水），即禁食6小時(shí)后開始實(shí)驗(yàn)操作。①血糖儀準(zhǔn)備：檢查血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司，ONETOUCH）電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進(jìn)入待測(cè)狀態(tài)。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對(duì)折，用拇指和食指捏住毛巾對(duì)折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。④血糖檢測(cè)：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計(jì)時(shí)5秒顯示讀數(shù)。（3）空腹血清胰島素水平檢測(cè)①試劑及耗材準(zhǔn)備：樣品（冰凍血清），去離子水一瓶（1000mL），小鼠胰島素ELISA試劑盒（Millipore，貨號(hào)EZRMI-13K）含胰島素ELISA酶標(biāo)板（1塊，儲(chǔ)存于2-8℃）、酶標(biāo)板封口膜（1片）、10×HRP洗脫緩沖液（2瓶，每瓶50mL,使用前使用去離子水稀釋10倍）、胰島素標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每種量為0.25mL）、胰島素質(zhì)量對(duì)照buffer（0.25mL）、基質(zhì)溶液（0.5mL）、分析緩沖液（20mL）、胰島素檢測(cè)抗體（10mL）、酶溶液（12mL）、底物（12mL）、終止溶液（12mL）。②實(shí)驗(yàn)步驟：A.確認(rèn)溫箱開啟，熟悉酶標(biāo)儀操作，將待檢測(cè)的血清標(biāo)本從-80℃冰箱中找出；B.將待檢測(cè)的血清在室溫下復(fù)融至液態(tài)，準(zhǔn)備檢測(cè)；C.稀釋10×HRP洗脫緩沖液，每瓶用450mL去離子水稀釋；D.將取下來的酶標(biāo)板條安裝到一個(gè)空的酶標(biāo)板架上300μLTBS洗脫緩沖液洗滌3次。洗滌完畢將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，輕輕拍幾次，將殘液吸凈（注意：在進(jìn)行下一步之前避免酶標(biāo)板干燥，將未使用的酶標(biāo)板條密封在裝酶標(biāo)板的袋子里，2-8℃保存）；E.將10μL分析緩沖液加入非特異性孔(NSB)和所有的樣品孔；F.在NSB孔，標(biāo)準(zhǔn)孔和對(duì)照孔加入10μL基質(zhì)溶液；G.在預(yù)設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)孔里加入10μL胰島素標(biāo)準(zhǔn)品；H.在預(yù)設(shè)的質(zhì)量對(duì)照孔里加入胰島素質(zhì)量對(duì)照buffer1和2各10μL；I.在每個(gè)樣品孔里加入10μL樣品；J.每孔中加入80μL胰島素檢測(cè)抗體（以上所有加樣步驟在1個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成，室溫孵育2小時(shí)，在此期間將酶標(biāo)板至于酶標(biāo)板振蕩器上，調(diào)整轉(zhuǎn)速為400-500rpm震蕩）；K.取下封口膜，棄去液體，在吸水紙上輕輕拍打，吸凈殘液；L.使用洗脫緩沖液洗板3次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液；M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室溫下酶標(biāo)板振蕩器震蕩30分鐘，取下封口膜，棄去溶液，拍打吸干；N.使用洗脫緩沖液洗板6次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液加入100μL底物溶液，酶標(biāo)板震蕩器上震蕩15分鐘左右。此時(shí)可以看到標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)深淺漸變的藍(lán)色。（注意：在這一步，藍(lán)色的出現(xiàn)和進(jìn)展可能明顯快于15分鐘，也可能明顯慢于15分鐘，取決于室溫溫度。請(qǐng)通過視覺來判斷孵育的時(shí)間?；蛘呤褂妹笜?biāo)儀370nm波長(zhǎng)檢測(cè)，讀數(shù)在1.2到1.8之間，則為合適的孵育時(shí)間）O.加入100μL終止溶液，震蕩酶標(biāo)板確保充分的混勻，此時(shí)藍(lán)色變?yōu)辄S色。5分鐘內(nèi)在450nm和590nm處分別讀取吸光值。根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過吸光值換算出濃度。Ⅱ型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括體重、血糖和胰島素等水平，體重、血糖、胰島素水平變化結(jié)果如圖2所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與Numbl-LKO小鼠12周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第6周開始HFD組的Numbl-LKO小鼠體重明顯高于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第12周（見圖2A）；經(jīng)空腹血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第2周、4周、6周、8周、10周和12周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對(duì)照組升高，HFD組的Numbl-LKO小鼠空腹血糖水平也明顯高于WT組（見圖2B）；經(jīng)空腹胰島素檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠在第12周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對(duì)照組升高，HFD組的Numbl-LKO小鼠空腹胰島素水平也明顯高于WT組小鼠（見圖2C）。以上結(jié)果表明肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，即Numbl基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力。因此，Numbl基因在高脂誘導(dǎo)引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用?！緦?shí)施例3】葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT）實(shí)驗(yàn)第10周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)（IPGTT），以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)糖耐受能力。（1）在測(cè)血糖之前，先測(cè)量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計(jì)算葡萄糖的注射體積。（2）先檢測(cè)葡糖糖注射前即0分鐘時(shí)空腹血糖，在檢測(cè)完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。（3）腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注射：從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時(shí)針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。（4）分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時(shí)間點(diǎn)剪尾測(cè)小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測(cè)時(shí)間。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT）來評(píng)估各組小鼠對(duì)葡萄糖的處理能力，在實(shí)驗(yàn)第10周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和Numbl-LKO小鼠血糖水平在15分鐘時(shí)間點(diǎn)劇增達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平（0分鐘時(shí)血糖），在2小時(shí)時(shí)恢復(fù)至空腹血糖水平；且在HFD組，Numbl-LKO小鼠血糖水平一直高于WT小鼠的血糖水平（圖3A）。比較各組小鼠血糖曲線下面積（areaunderthecurve，AUC），發(fā)現(xiàn)WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，Numbl-LKOHFD組的AUC顯著大于WTHFD組的AUC（圖3B），表明Numbl對(duì)維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強(qiáng)大的調(diào)控能力?！緦?shí)施例4】肝臟質(zhì)量及肝臟組織脂質(zhì)成分測(cè)定（1）終末肝臟組織取材1）小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤(rùn)濕。2）用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。3）迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。（2）肝臟脂質(zhì)成分測(cè)定①從-80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇（2:1）共孵育過夜。②以12000g高速離心15min后，收集管底脂質(zhì)層物質(zhì)，風(fēng)干，以去除水分。③將分離出的脂質(zhì)層物質(zhì)溶于200μL含1%TritonX-100的PBS溶液中，仔細(xì)吹吸混勻。④開啟電腦labman軟件，打印機(jī)，再開啟生化分析儀；⑤選擇并清洗檢測(cè)探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設(shè)定的參考范圍；⑥在labman軟件上檢查所需檢測(cè)指標(biāo)試劑是否足夠，設(shè)定檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)順序等。⑦將制得的混勻液上機(jī)檢測(cè)，分析。在HFD組的Numbl-LKO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠高（如圖4A）。對(duì)肝臟中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在HFD組的Numbl-LKO小鼠肝臟中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸均較HFD組的WT小鼠高（如圖4B）。這些結(jié)果說明肝臟細(xì)胞特異性Numbl基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。上述結(jié)果顯示Numbl-LKO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結(jié)果表明Numbl基因?qū)Ω纳脾蛐吞悄虿『椭靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明Numbl基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>炎癥抑制因子Numbl在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>Numbl-sgRNA1<400>1tttagagttttagacgtccaggg23<210>2<211>23<212>DNA<213>Numbl-sgRNA2<400>2agcacattgcctgcacacgctgg23<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>loxp2-<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>NumblLA-F<400>7ccgctcgagccaaagaatgacctgggaaa29<210>8<211>29<212>DNA<213>NumblLA-R<400>8cccaagcttccagggtttgaatgggaaga29<210>9<211>33<212>DNA<213>NumblM-F<400>9tctaccggtacgtctaaaactctaaagcccatg33<210>10<211>26<212>DNA<213>NumblM-R<400>10acgcttaagcgctgggcctcacactc26<210>11<211>28<212>DNA<213>NumblRA-F<400>11cgacgcgttgtgcaggcaatgtgcttac28<210>12<211>36<212>DNA<213>NumblRA-R<400>12ataagaatgcggccgcgaggaaacgggagacacaga36當(dāng)前第1頁1 2 3