本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種聚乙二醇化葡激酶及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

天然葡激酶(staphylokinase,SAK)是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種胞外蛋白質(zhì)，由136個氨基酸殘基組成，分子量為15.5KD。葡激酶本身沒有蛋白酶活性，是一種“間接型”的纖溶酶原激活劑，通過與纖溶酶原(plasminogen，F(xiàn)lg)按1：1的比例特異性結(jié)合生成無活性的SAK-Flg復(fù)合物，在血栓表面痕量纖溶酶(plasmin，F(xiàn)lm)的作用下進一步轉(zhuǎn)化成有活性的SAK-Flm復(fù)合物，催化另一分子纖溶酶原形成纖溶酶,從而激活纖溶系統(tǒng)。AK具有一定的纖維蛋白特異性、不會耗竭纖維蛋白酶原的優(yōu)點，且對血小板為主的白色血栓作用相當明顯，使其成為極具研究價值的溶栓藥物。但是，在首次靜脈注射2周后，血液中即開始出現(xiàn)大量的中和抗體，且這些抗體至少在體內(nèi)存在7周以上。免疫原性是限制SAK臨床應(yīng)用的最主要因素。

SAK作為優(yōu)秀的溶栓劑，由于該溶栓劑進入體內(nèi)后會迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體的缺點，極大的限制了其在臨床上的使用。因此如何降低其免疫原性成為了目前研究SAK的熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種聚乙二醇化葡激酶及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明的聚乙二醇化葡激酶與現(xiàn)有的同類產(chǎn)品比較，不僅有效降低了天然葡激酶的免疫原性，也保留了足夠的溶栓活性。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種聚乙二醇化葡激酶，其結(jié)構(gòu)中包括聚乙二醇和突變葡激酶，所述聚乙二醇和突變葡激酶相偶聯(lián)。

優(yōu)選地，所述聚乙二醇和突變葡激酶的摩爾比例為1：1。

優(yōu)選地，所述聚乙二醇和突變葡激酶之間通過硫醚鍵相偶聯(lián)。

優(yōu)選地，所述突變葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

優(yōu)選地，所述聚乙二醇偶聯(lián)在所述突變葡激酶的N端第82位半胱氨酸的巰基上。

優(yōu)選地，所述聚乙二醇的分子量為5～40kDa。

本發(fā)明的第二方面，提供前述聚乙二醇化葡激酶的制備方法，包括：

(1)提供突變葡激酶；

(2)將突變葡激酶與馬來酰亞胺修飾性聚乙二醇反應(yīng)，獲得聚乙二醇化葡激酶。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述突變葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

優(yōu)選地，步驟(1)，包括：構(gòu)建含有突變葡激酶基因序列的表達載體，然后將含突變葡激酶基因序列的表達載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞中誘導(dǎo)表達，從表達產(chǎn)物中分離獲得所述的突變葡激酶。進一步地，所述突變葡激酶基因序列如SEQ ID NO.5所示。

本發(fā)明第三方面，提供了前述聚乙二醇化葡激酶在制備抗凝、溶栓藥物中的用途。

本發(fā)明第四方面，提供了一種低免疫原性抗凝、溶栓藥物組合物，含有有效劑量的聚乙二醇化葡激酶及至少一種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：

本發(fā)明首次制備了聚乙二醇化葡激酶，與現(xiàn)有的同類產(chǎn)品比較，不僅有效降低了天然葡激酶的免疫原性，也保留了足夠的溶栓活性。

附圖說明

圖1：pcr實驗驗證突變質(zhì)粒，其中，M泳道：蛋白Marker；1-6泳道：PCR驗證。

圖2：突變蛋白SDS-PAGE電泳，其中，M泳道：蛋白Marker；1泳道：破菌液；2泳道：上清液；3泳道：穿透液；4：40mM咪唑濃度的洗脫液；5：500mM咪唑濃度的洗脫液。

圖3：修飾蛋白碘染色與考馬斯藍染色對比結(jié)果，其中，A：聚乙二醇化葡激酶；B：維修時成功的葡激酶；C：游離聚乙二醇；1、6泳道：蛋白Marker；2、4泳道：通過考馬斯蘭復(fù)染的聚乙二醇修飾后的葡激酶蛋白混合液；3、5泳道：通過考馬斯蘭復(fù)染的未修飾的葡激酶蛋白；7、9泳道：通過碘染的聚乙二醇修飾后的葡激酶蛋白混合液；8、10泳道：通過碘染的葡激酶蛋白。

圖4：溶圈實驗驗證活性結(jié)果，其中1號孔：未修飾的葡激酶10ul；2號孔：聚乙二醇化葡激酶10ul；3號孔：未修飾的葡激酶5ul；4號孔：聚乙二醇化葡激酶5ul；5號孔：鏈激酶10ul；6號孔:雙蒸水10ul；7號孔:鏈激酶5ul。

圖5：酶聯(lián)免疫吸附測定實驗結(jié)果。

具體實施方式

一、聚乙二醇化葡激酶

本發(fā)明的聚乙二醇化葡激酶，其結(jié)構(gòu)中包括聚乙二醇和突變葡激酶，所述聚乙二醇和突變葡激酶相偶聯(lián)。

所述聚乙二醇和突變葡激酶的摩爾比例為1：1。所述聚乙二醇和突變葡激酶之間通過硫醚鍵相偶聯(lián)。例如，硫醇與C＝C雙鍵在馬來酰亞胺環(huán)存在時，通過邁克爾加成生成生理穩(wěn)定的鍵合。

在本發(fā)明較佳實施例中，所述突變葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述聚乙二醇偶聯(lián)在所述突變葡激酶的N端第82位半胱氨酸的巰基上。

本發(fā)明，對于所述聚乙二醇的分子量沒有特別的限制，只要不限制本發(fā)明的目的即可。例如，所述聚乙二醇的分子量范圍可以是5～40kDa。在本發(fā)明較佳實施例中，所述聚乙二醇的分子量為10kda。

二、聚乙二醇化葡激酶的制備方法

本發(fā)明的聚乙二醇化葡激酶的制備方法，包括：

(1)提供突變葡激酶；

(2)將突變葡激酶與馬來酰亞胺修飾性聚乙二醇反應(yīng)，獲得聚乙二醇化葡激酶。

本發(fā)明的一較佳實施例中，步驟(1)中，所述突變葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

步驟(1)，包括：構(gòu)建含有突變葡激酶基因序列的表達載體，然后將含突變葡激酶基因序列的表達載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞中誘導(dǎo)表達，從表達產(chǎn)物中分離獲得所述的突變葡激酶。本發(fā)明的一較佳實施例中，所述突變葡激酶基因序列如SEQ ID NO.5所示。

在上述制備方法中，硫醇與C＝C雙鍵在馬來酰亞胺環(huán)存在時，通過邁克爾加成生成生理穩(wěn)定的鍵合。

三、聚乙二醇化葡激酶的用途

本發(fā)明的聚乙二醇化葡激酶可以用于制備抗凝、溶栓藥物。

四、低免疫原性抗凝、溶栓藥物組合物

本發(fā)明的低免疫原性抗凝、溶栓藥物組合物，含有有效劑量的聚乙二醇化葡激酶及至少一種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明所提供的藥物組合物可以多種劑型存在，如用于靜脈注射等的注射劑，用于皮下注射、表皮外敷等的經(jīng)皮吸收劑，用于噴鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的噴霧劑，用于滴鼻、眼、耳等的滴劑，用于肛腸等的栓劑、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式，及肺部給藥制劑及其他非腸道給藥的組合物。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。該藥用組合物還可以加入香味劑、甜味劑等。

如上所述的藥物制劑可對哺乳動物臨床使用，包括人和動物，可以經(jīng)靜脈注射或者口、鼻、皮膚、肺吸入等途徑給藥。上述藥物的優(yōu)選周劑量為0.1-5mg/kg體重，優(yōu)選的療程為10至30天。一次性給藥，或分次給藥。無論采用何種給藥方法，個體人的最佳劑量應(yīng)根據(jù)具體的治療而定。

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實驗材料

DpnI酶、primerStar premix酶、高保真rTaq酶、dNTP、DNA marker、質(zhì)粒純化試劑盒、分子量蛋白Marker、BCA蛋白濃度檢測盒、ECL試劑盒等均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司。PreScission蛋白酶購自上海生物制品公司。凝血酶、纖溶酶原、纖維蛋白原、尿激酶標準品等均購自中國食品藥品檢定院。金屬浴連接儀、水浴箱、PCR儀、溫箱、凝膠成像儀、超聲破碎儀、蛋白濃度檢測儀、鎳離子交換柱、交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱、梯度杯、血栓彈力圖等均系GE公司產(chǎn)品。ELISA試劑盒、I₂、BaCl₂等購自SIGMA公司，動物實驗所用BALB/C小鼠(15只)均購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

實施例1重組葡激酶的表達及純化

一、目的基因的擴增及突變質(zhì)粒的構(gòu)建

1.1引物合成

使用軟件Premier 5設(shè)計SAK的突變引物。引物以全長SAK-PET28a為模板，以第82號基酸位點(表1)為中心雙向擴增，得到突變SAK-PET28a質(zhì)粒序列。引物由北京華大基因科技有限公司合成。

表1突變引物序列

1.2目的基因片段的擴增

SAK-cys-82-F、SAK-cys-82-R為SAK正反向引物，其中SAK-cys-82-F、SAK-cys-82-R中下劃線部分即為SAK半胱氨酸突變位點。用引物對野生型SAK模板PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火1min，72℃延伸8min，進行18個循環(huán)。

1.3PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及陽性菌篩選

將1μL DPN I酶加入PCR產(chǎn)物，并置于37℃恒溫水浴箱中2h。將反應(yīng)后產(chǎn)物加入100μL DH5α感受態(tài)中冰浴20min，于42℃水浴箱中熱擊1min，并再次冰浴5min，涂于卡那霉素抗性的平板上，于37℃孵箱中孵育12h。挑取位于平板中心的單獨菌落，將菌接種至5mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中培養(yǎng)6h，通過質(zhì)粒抽提試劑盒從菌液中提取突變質(zhì)粒，取實驗室通用測序引物(序列為：TAATACGACTCACTATAGGG；SEQ ID NO.3)與(序列為：GCTAGTTATTGCTCAGCGG；SEQ ID NO.4)對突變質(zhì)粒行菌液PCR驗證，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，進行29個循環(huán)，通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物鑒定，結(jié)果如圖1所示，于495bp處擴增出的單一特異性條帶，與S預(yù)期的突變后的SAK片段大小相符。

此外，選取陽性的結(jié)果測序，測序結(jié)果顯示SAK序列的第82號氨基酸已成功突變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

亦即，突變后的SAK的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO.5所示，具體為：

ATG CTG AAA CGC TCT CTG CTG TTC CTG ACG GTG CTG CTG CTG CTG TTC TCA TTC TCC TCC ATT ACC AAC GAA GTC TCC GCC TCC TCA AGT TTC GAT AAA GGC AAA TAC AAA AAA GGT GAT GAC GCC TCC TAT TTC GAA CCG ACC GGC CCG TAC CTG ATG GTT AAC GTC ACG GGC GTG GAC AGC AAG GGT AAT GAA CTG CTG TCT CCG CAT TAT GTT GAA TTT CCG ATT AAA CCG GGT ACC ACG ACA ACC AAA GAA AAA ATC GAA TAT TAC GTC GAA TGG GCA CTG GAT GCG ACG GCC TAC AAA GAA TTC CGT GTG GTT GAA CTG GAT CCG TCT GCT AAA ATCGAA GTT ACC TAC TAC GAC AAA AAC AAG AAA AAA GAA GAA ACC AAA TCA TTT CCG ATC ACG GAA AAA GGC TTC GTC GTG CCG GAT CTG TCG GAA CAC ATT AAA AAC CCG GGC TTC AAC CTG ATT ACG AAA GTG GTC ATC GAA AAG AAA TAA CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA GAT CCG。

1.4突變蛋白的表達

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂至卡那抗性的LB固體培養(yǎng)板上，于37℃孵箱中孵育12h。挑取平板中央的單個菌落轉(zhuǎn)入4mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中120rpm培育，直至菌液的OD值0.6-0.8時將菌液轉(zhuǎn)入300mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)。當菌液的OD值為0.6-0.8時調(diào)節(jié)孵箱溫度至20℃，并向其中加入0.2mM的IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達14h。

1.5突變蛋白的鎳離子親和層析柱純化

將誘導(dǎo)后的菌液倒入離心桶，在4℃，4000rpm條件下低速離心30min，棄掉上清液，加入100mmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，在冰水浴下超聲破菌30min(超聲on：4s，off：6s，振幅30％)至菌液透亮。將破菌液在4℃，12000rpm條件下離心30min，收取上清液，在10s/滴的流速條件下通過鎳離子親和層析柱純化，用300mL Washing buffer(40mmol/L咪唑濃度的磷酸鹽緩沖液)洗脫雜蛋白，以30mL的Elution buffer(500mmol/L咪唑濃度的磷酸鹽緩沖液)洗脫目的蛋白。為盡可能保證蛋白活性，以上步驟均在4℃層析柜中進行。對各個步驟留下的樣品通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度。如圖2所示，破菌液在泳道1中顯示目的蛋白SAK-cys在E.coliBL21中大量表達，分子量為14.4KDa，與預(yù)期相符。

此外，通過測序驗證突變蛋白的氨基酸序列正確。亦即，突變后的SAK的氨基序列如SEQ ID NO.6所示，具體為：

MLKRSLLFLTVLLLLFSFSSITNEVSASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTTTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKK。

1.6突變蛋白的peg修飾與鑒定

本實施例使用分子量為10Kda的聚乙二醇對突變蛋白進行修飾。

將SAK-cys與修飾劑以摩爾比1:5(突變蛋白：聚乙二醇)、溫度20℃、修飾時間10h的條件進行修飾，并取修飾前、修飾后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，用碘染色與考馬斯蘭染色法對比鑒定：將凝膠浸于15％濃度的BaCl₂中浸泡震蕩20min，通過蒸餾水漂洗3次，每次1min；取出漂洗后的凝膠置于I₂-KI溶液中(2％I₂，2.4KI)染色4h，用蒸餾水脫色直至能清晰觀測結(jié)果，對圖片進行保存。將脫色后的凝膠浸入考馬斯亮藍染劑中復(fù)染，再次脫色后通過蛋白Marker比對碘染與考馬斯蘭復(fù)染凝膠電泳圖。通過碘染色法能特異性地將聚乙二醇染色而不會將單純的突變蛋白質(zhì)(SAK-cys)染色，通過碘染試劑染色后凝膠上攜帶peg修飾劑的peg-SAK-cys條帶A與peg聚合物條帶C(圖3，7泳道、9泳道)被染色。而考馬斯亮藍染液復(fù)染后，單獨的聚乙二醇聚合物條帶C無法顯色，而碘染色圖中的被聚乙二醇條帶所掩蓋的未修飾SAK-cys條帶B即顯示出來(圖3，2泳道、4泳道)。但修飾成功后的peg-SAK-cys條帶A仍能保留在考馬斯藍染色圖上，從二種染色的對比可推斷突變蛋白成功得到修飾。

1.7修飾蛋白的分離純化

使用sephadex G75型交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱分離peg-SAK-cys與未修飾成功的SAK-cys。用10MM的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，確保管道內(nèi)無氣泡、紫外吸收值OD為零時將修飾完成的蛋白超濾濃縮至1mL上樣。將儀器調(diào)至收集狀態(tài)，根據(jù)公式：Y＝-0.01712X+6.05667；Y＝logMW(Y為紫外吸收峰值，X為起峰時間)計算修飾蛋白起峰時間，從而收集高純度的修飾蛋白。

1.8溶圈法驗證修飾蛋白活性

用纖維蛋白平板溶圈法鑒定peg-SAK-cys的溶栓活性。配置纖維蛋白平板：將0.35g瓊脂粉加入30mL 10mM的磷酸鹽緩沖液(PH＝7.0),加熱融化至液體清亮無沉淀以及氣泡,冷卻混合液至35℃-40℃,迅速將350μL纖維蛋白原，170μL纖溶酶原，50μL 2M氯化鈣加入混合液并混勻，后將10μL凝血酶加入混勻并倒入平板，將平板封口，并置于-4℃冰箱中靜置1h。將冷凝后的凝膠通過打孔器打孔，將稀釋后的peg-SAK-cys、野生型SAK以及尿激酶標準品加入孔中，置于37℃孵箱中孵育4h，測量比較平板上透明圈直徑大小(圖4)。以尿激酶的濃度與直徑制作標準曲線，計算各樣品的溶栓活性。

用BCA試劑盒測定各蛋白樣品含量，用蛋白溶栓活性除以蛋白樣品濃度計算出各樣品比活性(表2)。比較各蛋白樣品比活性的大小，結(jié)果顯示SAK的溶栓活性為9.4×10⁴IU/mg，與尿激酶標準品活性相當，peg-SAK-cys的活性為8.2×10⁴IU/mg，仍保有相當?shù)幕钚浴?/p>

1.9血栓彈力圖驗證修飾蛋白活性

取正常人空腹靜脈血4ml(用(3.8％(w/v))檸檬酸鈉抗凝)；分別取1ml血液添加稀釋后的樣品(10μl 200nmol/L)并孵育5min；取該混合溶液340μl，倒入含有CaCl2(200mmol/L)的檢測杯內(nèi)，通過血栓彈性圖儀Thrombelastograph Analyzer TEG-5000對各項指標進行測定，包括：a.凝血反應(yīng)時間(reactiontime，R)；b.細胞凝集塊形成時間(kineticsof clot development，K)；c.血細胞凝集塊形成速率(α角)；d.最大血塊強度(MA)；e.血凝塊穩(wěn)定形成后30分鐘內(nèi)血栓溶解的比例(LY30％)。其中LY30％作為直接關(guān)聯(lián)纖溶活性的指標，能較為直觀的反應(yīng)野生型SAK與peg-SAK-cys溶栓活性。

凝血功能相關(guān)指標R、K、angle、MA提示所用人血液凝血功能處于正常水平；LY30％作為檢測樣品溶栓活性的主要指標是血凝塊穩(wěn)定形成后三十分鐘內(nèi)溶解的百分比值，結(jié)果提示野生型SAK在血凝塊穩(wěn)定形成后三十分鐘內(nèi)能夠?qū)⒀ㄈ芙?7.5％，而進行聚乙二醇修飾后的peg-SAK-cys可將血栓溶解41.5％(表2)，這表明了在給予血栓模型等量的樣品條件下，SAK的溶栓活性要高于peg-SAK-cys，但peg-SAK-cys仍保留了相當?shù)娜芩ɑ钚?。亦即，peg-SAK-cys的溶栓活性高達野生型SAK溶栓活性的62％。

表2血栓彈力圖實驗結(jié)果

1.10酶聯(lián)免疫吸附驗證修飾蛋白的免疫原性

取18g-23g雄性BALB/C小鼠15只(IVC級，重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)，隨機分為野生型SAK，peg-SAK-cys組，生理鹽水陰性對照3組，每組5只；于第0天，第4,11,18天，注射樣品300ug/kg，于第20天以眼眶取血的方式收取小鼠血液并4000rpm/10min的條件低速離心，靜止6h收取上清液。將SAK蛋白稀釋至3ug添入酶標版，用ELISA法檢測蛋白免疫原性，每組檢測重復(fù)兩次。

統(tǒng)計學(xué)處理：酶聯(lián)免疫結(jié)果通過SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，其結(jié)果比較通過LSD-t法，檢驗水準α＝0.05。

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定peg-SAK-cys的免疫原性。結(jié)果經(jīng)t檢驗如圖(圖5)顯示，野生型的SAK組在BALB/C小鼠中誘導(dǎo)出較高的抗SAK-igG蛋白水平，而peg-SAK-cys組的抗SAK-igG蛋白相較野生型的SAK組有了明顯下降(1:500稀釋組檢測結(jié)果顯示吸光值均過高，而1:2000、1:4000稀釋組的稀釋比例較大，同樣影響了吸光值的檢測，組間差異過小不明顯，此三組P＞0.05；僅1:1000稀釋組稀釋比例合適，p＝0.0002，檢測結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異)，這表明使用聚乙二醇修飾SAK成功降低了SAK的免疫原性。亦即，使用聚乙二醇修飾SAK，使得SAK的免疫原性大概降低了1.5倍。

綜上所述，本發(fā)明選取了巰基這一反應(yīng)效率高、條件溫和的側(cè)鏈基團作為SAK聚乙二醇修飾的位點。由于野生型SAK蛋白本身不含游離巰基，因此，采用了定點突變技術(shù)，將遠離蛋白功能區(qū)的82號氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，從而成功的對SAK-cys進行了聚乙二醇修飾。修飾完成的peg-SAK-cys通過碘染色時，鋇離子與聚乙二醇分子結(jié)合形成可溶性的氧鎓離子復(fù)合物，然后該復(fù)合物與碘離子結(jié)合形成不溶性沉淀而使條帶染色碘染色結(jié)果顯示，聚乙二醇修飾劑成功與SAK-cys相結(jié)合。采用了纖維蛋白溶圈法以及血栓彈力圖測驗評價了peg-SAK-cys的活性。纖維蛋白溶圈法結(jié)果顯示，經(jīng)計算得出活性8.2×10⁴IU/mg，略低于野生型的SAK，但仍保留有相當?shù)娜芩芰?。血栓彈力圖的LY30％值(30分鐘內(nèi)血栓溶解比例)提示，在同等活性單位下，peg-SAK-cys的溶栓能力(41.7％)要低于野生型的SAK(67.5％)，但仍保留有了相當?shù)娜芩ɑ钚浴?/p>

以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的描述，但應(yīng)當理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶醫(yī)科大學(xué)

<120> 聚乙二醇化葡激酶及其制備與應(yīng)用

<130> 163804

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S-cys-82-F

<400> 1

gttgtcgtgg tacccggttt aatcggaaat tcaacataat g 41

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S-cys-82-R

<400> 2

ccgattaaac cgggtaccac gacaaccaaa gaaaaaatcg 40

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 3

taatacgact cactataggg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 4

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 5

<211> 525

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 突變后的SAK的核苷酸編碼序列

<400> 5

atgctgaaac gctctctgct gttcctgacg gtgctgctgc tgctgttctc attctcctcc 60

attaccaacg aagtctccgc ctcctcaagt ttcgataaag gcaaatacaa aaaaggtgat 120

gacgcctcct atttcgaacc gaccggcccg tacctgatgg ttaacgtcac gggcgtggac 180

agcaagggta atgaactgct gtctccgcat tatgttgaat ttccgattaa accgggtacc 240

acgacaacca aagaaaaaat cgaatattac gtcgaatggg cactggatgc gacggcctac 300

aaagaattcc gtgtggttga actggatccg tctgctaaaa tcgaagttac ctactacgac 360

aaaaacaaga aaaaagaaga aaccaaatca tttccgatca cggaaaaagg cttcgtcgtg 420

ccggatctgt cggaacacat taaaaacccg ggcttcaacc tgattacgaa agtggtcatc 480

gaaaagaaat aactcgagca ccaccaccac caccactgag atccg 525

<210> 6

<211> 163

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 突變后的SAK的氨基序列

<400> 6

Met Leu Lys Arg Ser Leu Leu Phe Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Ser Phe Ser Ser Ile Thr Asn Glu Val Ser Ala Ser Ser Ser Phe Asp

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr

35 40 45

Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Ser Lys Gly Asn

50 55 60

Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr

65 70 75 80

Thr Thr Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp

85 90 95

Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala

100 105 110

Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr

115 120 125

Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser

130 135 140

Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile

145 150 155 160

Glu Lys Lys