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熊果酸的用途的制作方法

文檔序號:11788762閱讀:634來源:國知局
熊果酸的用途的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域,特別涉及熊果酸的用途。



背景技術:

慢性腎小球腎炎,簡稱慢性腎炎(CGN),是一種鏈球菌感染的變態(tài)反應性疾病。慢性腎炎發(fā)病少數(shù)為急性腎炎遷延不愈所致,絕大多數(shù)起病即為慢性。有些慢性腎炎患者過去有急性腎炎史,腎炎癥狀已消失多年,誤認為已經(jīng)痊愈,其實其患腎炎后腎臟受到損傷一直在繼續(xù)緩慢進行,經(jīng)若干年后,腎病受損傷程度越來越重,腎功能逐步下降,其腎炎的癥狀又復出現(xiàn),而成為慢性腎小球腎炎。而多數(shù)人的腎臟炎癥從開始即為隱匿性,病人無明顯急性腎小球腎炎的表現(xiàn),但炎癥呈緩慢發(fā)展,經(jīng)若干年后變成慢性腎小球腎炎。

慢性腎炎臨床主要表現(xiàn)有水腫、高血壓、蛋白尿和血尿等癥狀,由于病理改變各種各樣,癥狀表現(xiàn)不一樣。嚴重者可能出現(xiàn)尿毒癥。

慢性腎炎是由急性腎炎轉(zhuǎn)變而來,是一種常見的慢性腎臟疾患,以男性患者較多,病程持續(xù)1年以上,發(fā)病年齡大多在20-40歲。急性腎炎起病急,以浮腫、血尿癥狀為最多見。

慢性腎炎表現(xiàn)各異,有的無明顯癥狀,有的有明顯血尿、浮腫、高血壓,并有全身乏力、納差腹脹、貧血等兼癥。多數(shù)患者呈進行性加重,但有些患者的癥狀可部分或全部緩解,病程長達20-30年。若血壓持續(xù)升高,可見頭暈、頭痛胸悶、視力模糊等癥。

中醫(yī)學屬“水腫”、“腰痛”、“虛勞”、“血尿”、“淋癥”等范疇,是導致終末期腎衰竭的主要病因,積極預防和治療本病可以有效延緩其進展。目前西醫(yī)治療本病療效不甚理想,中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合治療有望提高療效,改善預后。

目前中醫(yī)治療CGN主要分為以下幾類:1、中醫(yī)證候研究,如王億平等用參地顆粒(紅參、茯苓、熟地黃、五味子、桑螵蛸、雞內(nèi)金等)治療脾腎虧虛證CGN30例。2、辨證治療,李良將臨床CGN病人按照辨證施治方法分別針對脾腎氣虛證用四君子湯、脾腎陽虛證用附桂理中湯、肝腎陰虛證用六味地 黃湯、氣陰兩虛證用生脈湯等,并隨證加減治療。3、中藥復方治療,王黎萍常規(guī)西醫(yī)治療,加用慢腎寧合劑(黃芪、桂枝、淫羊霍、生地黃、阿膠、茯苓等)。劉洪章常規(guī)西醫(yī)治療,加服真武湯(茯苓、芍藥、白術、生姜、附子)。蓋云等將脾腎氣虛證的原發(fā)性CGN患者氯沙坦加用腎四方(炙黃芪、石葦、芡實、衛(wèi)茅、僵蠶)。唐英等常規(guī)西醫(yī)治療,加用黃芪注射液合脈絡寧注射液(牛膝、玄參、石斛、金銀花等)靜脈滴注。4、單味中藥治療,臨床西藥治療基礎上加用中藥單味藥制劑如白芍總苷膠囊、雷公藤多苷、黃葵膠囊等。5、針灸治療,關鑫等對CGN脾腎氣虛證患者分為對照組及治療組各30例,2組均口服施以氯沙坦鉀治療,加用溫針灸(氣海、中極、中脘、陰陵泉等穴)效果良好。6、循證醫(yī)學研究,鄭海生等用系統(tǒng)評價的方法,選擇在西醫(yī)基礎治療之上結(jié)合中醫(yī)川芎為主的活血通絡法治療CGN與單純西醫(yī)治療CGN的隨機對照試驗研究,共納入7篇隨機/半隨機對照臨床試驗并進行Meta分析。結(jié)果顯示,中醫(yī)活血通絡法治療CGN組在總體療效方面優(yōu)于西藥治療組(P<0.01)。

傳統(tǒng)中藥牛膝在治療CGN過程中起到重要作用,多個文獻報道組方中均含有牛膝藥材,未見熊果酸臨床口服治療CGN的報道。



技術實現(xiàn)要素:

有鑒于此,本發(fā)明提供熊果酸的用途。熊果酸具有抑制LPS誘導的MC細胞中NF-κB蛋白表達,影響細胞炎癥相關因子IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1的釋放。實驗表明,熊果酸還能夠用于制備治療慢性腎炎藥物。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供以下技術方案:

本發(fā)明提供了熊果酸在制備NF-κB表達抑制劑中的應用。

Western blot實驗結(jié)果表明熊果酸具有抑制LPS誘導的MC細胞中NF-κB蛋白表達,影響細胞炎癥相關因子IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1的釋放。

本發(fā)明還提供了熊果酸在制備IL-6表達抑制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了熊果酸在制備TNF-α表達抑制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了熊果酸在制備TGF-β表達抑制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了熊果酸在制備MCP-1表達抑制劑中的應用。

本發(fā)明還提供了熊果酸在制備治療/或預防慢性腎炎藥物中的應用。

在本發(fā)明一些具體實施方案中,所述慢性腎炎包括IgA腎病、非IgA系膜增生性腎炎、慢性腎臟病蛋白尿、高血壓型慢性腎炎、混合型慢性腎炎和/或急性發(fā)作型慢性腎炎。

在本發(fā)明一些具體實施方案中,所述藥物以熊果酸計,施藥劑量為1.25~5mg/kg。

在本發(fā)明一些具體實施方案中,所述藥物包括熊果酸及藥學上可接受的輔料。

在本發(fā)明一些具體實施方案中,所述藥物的劑型包括顆粒劑、膠囊劑、片劑、注射劑、口服液、丸劑、散劑。

本發(fā)明公開了熊果酸在制備NF-κB表達抑制劑中的應用。Western blot實驗結(jié)果表明熊果酸具有抑制LPS誘導的MC細胞中NF-κB蛋白表達,影響細胞炎癥相關因子的釋放。影響細胞炎癥相關因子IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1的釋放。實驗表明,熊果酸還能夠用于制備治療慢性腎炎藥物。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案,下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示熊果酸對MC細胞NF-κB蛋白表達的影響;

圖2示熊果酸對慢性腎炎模型大鼠IL-6的影響;

圖3示熊果酸對慢性腎炎模型大鼠TGF-β1的影響;

圖4示熊果酸對慢性腎炎模型大鼠1CAM的影響;

圖5示熊果酸對慢性腎炎模型大鼠MCP-1的影響。

具體實施方式

本發(fā)明公開了熊果酸的用途,本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容,適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述,相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合,來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。

本發(fā)明提供的熊果酸的用途中所用原料及試劑均可由市場購得。本專利獲得國家自然科學基金面上項目(81273723,81473633)、江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目支持。

下面結(jié)合實施例,進一步闡述本發(fā)明:

實施例1

1、試驗材料

1.1實驗儀器

IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1檢測試劑盒(森貝伽,南京),SpectraMax190酶標儀(Molecular devices,美國),奧林巴斯AU-2700全自動生化分析儀

1.2供試樣品

熊果酸,將提取物用0.5%CMCNa溶液配制成相應濃度。

2細胞及動物

腎小球系膜細胞(MC)購自武漢大學典藏細胞庫,成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量(220±20)g(上海斯萊克實驗動物中心)。

阿霉素模型是研究人類早期慢性腎炎的經(jīng)典模型(參見文獻:魏明剛,孫偉,陳繼紅,等雷至膠囊對阿霉素腎病模型基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物的作用,時珍國醫(yī)國藥,2011,22(2):399-401.)病理主要表現(xiàn)為腎小球微小病變?yōu)橹?隨著病情的進展表現(xiàn)為腎小球局灶階段性硬化為主,最終導致腎臟纖維化和腎功能衰竭。病變發(fā)生與足細胞損傷、大量蛋白尿和腎臟實質(zhì)的纖維化息息相關。因此選擇阿霉素慢性腎炎模型研究熊果酸對腎臟病的防治作用。

3試驗方法

3.1細胞培養(yǎng)

腎小球系膜細胞(MC)加入10%FCS的DMEM培養(yǎng)液,放入CO2恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2,飽和濕度)培養(yǎng)。2-3d換1次液。

3.2細胞增殖檢測

取細胞懸液于相差顯微鏡下計數(shù),用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度到7×104/mL轉(zhuǎn)種于96孔培養(yǎng)板中,100μL/孔,則每孔細胞數(shù)為7×103/mL。37℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)24h,各孔均換液,加入不含F(xiàn)CS的DMEM培養(yǎng)液200μL以同步各組細胞于G0期。空白對照組(簡稱 空白組,加入5%正常人血清)、熊果酸組(10μg/mL)、脂多糖(LPS)組(加入LPS10g/L和5%正常血清)、LPS+熊果酸組(加入LPS 10g/L和熊果酸10μg/mL)共4個組,每組設有6個復孔。于培養(yǎng)24h時分別取出相應的培養(yǎng)板,每孔加入MTT20μL(5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4h,小心吸棄各孔培養(yǎng)液,加入100μL DMSO,室溫避光,輕輕振蕩10min,使結(jié)晶充分溶解。選擇490nm波長,在酶標儀上讀出OD值。

3.3ELISA法測定系膜細胞IL-1β

用含10%FCS的DMEM調(diào)整細胞濃度到5×104-5×105/ml轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)24h,各孔均換液,加入不含F(xiàn)CS的DMEM培養(yǎng)液1ml以同步各組細胞于G0期。然后分為:空白對照組(加10%FBS)‘LPS組(LPS10μg/ml);LPS+熊果酸組(10μg/ml+10μg/ml LPS),共3組,每組設復孔4個。5%CO2,飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)24h時分別取出相應的培養(yǎng)板,收集各組上清液,采用ELISA方法,酶標儀測定490nm吸光度,據(jù)標準曲線測定其中IL-1B的濃度。

3.4Western blotting檢測NF-κB表達

使用蛋白裂解液提取培養(yǎng)細胞的總蛋白,BCA方法檢測蛋白濃度,調(diào)整濃度后取30μL加入上樣緩沖液煮沸變性。樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。應用封閉液封閉,一抗室溫2h或4℃過夜后室溫孵育二抗1h,洗膜后進行成像檢測。

3.5熊果酸對阿霉素誘導的腎炎大鼠生化指標及細胞因子表達的影響

成年雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量(220±20)g,購入后適應飼養(yǎng)1周,普通飲食,自由飲水,1周后開始實驗。隨機分為空白對照組、模型組、洛丁新組、熊果酸組。各組一次性尾靜脈注射0.2%阿霉素溶液,每只按照6mg/kg劑量,進行造模,對照組注射等量生理鹽水。第2周確定造模成功后,灌胃熊果酸,按照5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg計算藥物濃度和使用量。分別在第7天、28天、42天和56天應用金屬代謝籠留取大鼠24h尿液,8周后大鼠眼眶靜脈取血后留取血清,應用奧林巴斯AU-2700全自動生化分析儀檢測血清白蛋白、肌酐和血尿素氮。8周后取血液進行IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1含量測定。組織蛋白變性后在10%SDS-PAGE中分離,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2h,加入NF-kB p65Ⅰ抗4℃搖床振蕩孵育過夜, 第2天回收Ⅰ抗,TBST緩沖液洗滌3次,每次10min,加入Ⅱ抗,室溫搖床振蕩孵育2h,ECL化學發(fā)光法顯影,Image J軟件對結(jié)果進行灰度分析。

4試驗結(jié)果

4.1熊果酸對細胞增殖的影響,見表1。

表1 熊果酸對細胞增殖的影響

熊果酸可以抑制腎小球系膜細胞增殖,但與空白組比較沒有顯著差異。LPS誘導條件下腎小球系膜細胞增殖明顯增加(P<0.05),加入熊果酸可以明顯(P<0.05)抑制LPS誘導的腎小球系膜細胞增殖,并且隨著作用時間的增加,抑制效果明顯增加(P<0.05)。

4.2熊果酸對細胞上上清液中IL-1β的影響,見表2。

表2 熊果酸對細胞上上清液中IL-1β的影響

LPS誘導的腎小球系膜細胞中炎癥因子IL-1β表達水平顯著增加(P<0.05),加入熊果酸后炎癥因子IL-1β表達水平明顯下降(P<0.05),且隨著作用時間的增加,抑制效果顯著增強(P<0.05)。

4.3熊果酸對信號通路的影響

如圖1所示,Western blot實驗結(jié)果表明,熊果酸具有抑制LPS誘導的MC細胞中NF-κB蛋白表達,影響細胞炎癥相關因子的釋放。

4.4熊果酸對大鼠腎組織中IL-6、TGF-β1、ICAM-1、MCP-1表達水平的影響,見表3,見圖2、圖3、圖4和圖5所示。

表3 熊果酸對炎癥因子的影響

阿霉素誘導的大鼠生化指標明顯提升,熊果酸高中低劑量組可顯著(P<0.05)降低大鼠腎組織樣本中IL-6、TGF-β1、ICAM-1、MCP-1表達水平,其中高劑量組與陽性藥物組作用相近。

4.5熊果酸對慢性腎臟蛋白尿中的影響,見表4。

表4 大鼠尿蛋白含量的變化(mg/24h)

與模型組比較**P<0.01,***P<0.001

當腎小球、腎小管發(fā)生病變時,如各期腎炎、腎病以及高血壓發(fā)生腎動脈硬化時,均可出現(xiàn)蛋白尿。阿霉素誘導的大鼠腎臟病模型中可以明顯觀察到尿蛋白含量的增加,模型組接受熊果酸治療后,尿蛋白含量明顯降低(P<0.05),其中熊果酸高劑量組大鼠尿蛋白含量與陽性藥物組相比無顯著變化(p>0.01),顯示熊果酸具有良好的抑制慢性腎臟病大鼠尿蛋白含量的效果。

4.6熊果酸對慢性腎炎中肌酐和尿素氮的影響,見表5。

表5 大鼠血肌酐和血尿素氮變化

與模型組比較*P<0.05,**P<0.01

試驗結(jié)果表明,阿霉素造模8周后,大鼠血肌酐含量由正常組38.01增加至50.05,熊果酸中劑量組降低血肌酐含量至42.93(μmol/L),與模型組對比,具有極顯著差異,熊果酸高劑量組降低尿蛋白含量至41.67(μmol/L),與模型組對比,具有極顯著差異。大鼠尿素氮含量由正常組5.09(mmol/L)增加至 10.32(mmol/L),熊果酸中劑量組降低血肌酐含量至7.85(mmol/L),與模型組對比,具有極顯著差異(P<0.01),熊果酸高劑量組降低尿蛋白含量至6.35(mmol/L),與模型組對比,具有極顯著差異(P<0.01)。

實施例2

我院門診和住院患者中資料完整的臨床病歷30例?;颊咧信?2例,男性18例,平均年齡(35.2±8.5)歲,病程(11.5±5.8)月?;颊吲R床癥狀、腎臟病理和實驗室檢查符合慢性腎小球腎炎的臨床診斷,并且排除繼發(fā)性腎炎可能。按照隨機原則分為對照組與治療組,對照組結(jié)合24h尿蛋白定量數(shù)據(jù)使用基礎治療1~3項,治療組在基礎治療基礎上聯(lián)合熊果酸治療。

基礎治療1患者24h尿蛋白定量如果大于1g,西藥應用強的松1mg/(kg·d)(或者靜滴等效劑量甲基強的松龍)。

基礎治療2應用降脂藥、保護胃黏膜藥物和鈣片以及抗血小板聚集藥物等對癥治療。

基礎治療3參考《美國NKF-K/DOQI工作組制定的治療指南》關于慢性腎臟病合并高血壓的臨床用藥指導原則首先選擇貝那普利或者厄貝沙坦,必要時聯(lián)合用藥,使血壓控制達標即等于或者小于130/80mmHg(17.29/10.64kPa)。

治療組,在基礎治療基礎上聯(lián)合熊果酸(1mg/kg·d)。

觀察終點時間及考察指標,規(guī)律治療3個月進行血肌酐和尿素氮對比療效分析。

結(jié)果見表6。

表6 治療前后腎功能指標的比較

與對照組比較*P<0.05

結(jié)果表明,聯(lián)合熊果酸對腎炎患者進行治療3月后,血肌酐和尿素氮水平下降幅度大于對照組(P<0.05),說明熊果酸在臨床治療慢性腎小球腎炎中具有很好的療效。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

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