一種治療腦卒中的藥物組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療腦卒中的藥物組合物及其制備方法，該藥物組合物由葒草花提取物和藥學(xué)上可用的輔料制備而成，所述的葒草花提取物是將葒草花經(jīng)水提后的藥渣在二氯甲烷-甲醇的混合溶液中浸提而得，其能夠激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，增加缺血區(qū)新生血管，改善缺血區(qū)腦供血，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，可開發(fā)成藥物制劑，用于缺血性腦卒中的治療。
【專利說明】一種治療腦卒中的藥物組合物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種治療腦卒中的藥物組合物及其制備 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦卒中疾病是全球第四大致死因素，僅次于心血管疾病、腫瘤和慢性下呼吸道疾 病，也是最主要的導(dǎo)致終生殘疾的致病因素之一。其中，約80%的患者為缺血性腦卒中，主 要發(fā)病原因是大腦血管阻塞或腦出血引起腦組織供血供氧不足。據(jù)預(yù)測，2005年至2050年 美國用于腦卒中治療的費用按2005年購買力評估約為1520億美元，給經(jīng)濟和健康造成了 巨大的負(fù)擔(dān)。在中國，隨著經(jīng)濟發(fā)展、人民生活方式轉(zhuǎn)變和人口老齡化，近年來腦卒中發(fā)病 率逐年升高。我國每年約有160萬人死于腦卒中，死亡率為157/10萬人，已經(jīng)超過心血管 疾病并成為最主要的致死因素和成人致殘因素。與其他國家相似，缺血性腦卒中是我國最 常見的腦卒中類型，約占所有腦卒中的43-79%。因此腦卒中是現(xiàn)在以及將來很長一段時間 內(nèi)人類必須面對的重大公共衛(wèi)生問題之一。
[0003] 多數(shù)研究認(rèn)為，恢復(fù)腦組織供血是治療腦缺血最有效的方法。盡管1996年起組 織纖溶酶原激活劑（tPA)即批準(zhǔn)用于缺血性腦卒中治療，迄今為止其仍然是美國藥監(jiān)局 (FDA)唯一審核通過的溶栓藥物。因為隨時間延長出血風(fēng)險增加，tPA的治療時間窗僅為 4. 5小時；考慮到缺血性和出血性腦卒中在早期影像學(xué)不易鑒別，進一步延誤了患者接受 tPA治療的機會。目前只有小于5%的缺血性腦卒中患者使用tPA溶栓治療。此外，研究發(fā) 現(xiàn)腦組織如果長時間嚴(yán)重缺血缺氧，即使在后期恢復(fù)腦血流仍會對腦組織造成不可逆轉(zhuǎn)的 損傷，因此當(dāng)前仍迫切需要研究針對缺血缺氧和（或）再灌注所致病理生理學(xué)事件的治療 策略。
[0004] 神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell, NSCs)是一類具有分裂潛能和自我更新能力的 母細(xì)胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。長期以來，人們一直認(rèn) 為成年哺乳動物腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞不具備更新能力，一旦受損乃至死亡不能再生。這種觀點對 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的研究受到了很大限制。Tonchev等（Tonchev A B.Yamashima T， Zhao L,etal Proliferation of neural and neuronal progenitors after global brain ischemia in young adult macaque monkeys[J]. Mol Cell Neurosci 2003,23:292-301.) 和 Dempsey(Dempsy R J,Sailor K A,Bowen K K,etal Stroke-induced progenitor cell proliferation in adult spontaneously hypertensive rat brain:effect of exogenous IGF-land⑶NF[J].JN eurochem，2003,87:586-597.)等對成年靈長類動物猴、大鼠進行 研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后DG和側(cè)腦室下區(qū)（SubventricularZone，SVZ)下層的NSCs被激活并 產(chǎn)生新生神經(jīng)元，對損傷結(jié)構(gòu)進行修復(fù)。Guo等模擬大鼠海馬的神經(jīng)血管巢，發(fā)現(xiàn)正常情 況下NSCs受內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)，維持自我更新和增生但分化受抑制。而一旦巢內(nèi)NSCs在炎 癥因子等損傷信號刺激下激活，離巢向損傷灶遷移時其分化速度明顯加快。腦缺血后可以 誘導(dǎo)腦內(nèi)原位神經(jīng)干細(xì)胞的增殖定向遷移及分化，對受損腦組織和結(jié)構(gòu)功能進行修復(fù)和功 能重建，如何促進內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的激活和分化，直接關(guān)系腦梗死的近期預(yù)后和遠(yuǎn)期預(yù) 后。腦梗死后，缺血區(qū)新生血管，可以改善缺血區(qū)腦供血，從而促進缺血區(qū)神經(jīng)功能的修 復(fù)（Zhang R, Zhang Z, Wang L, et a. 1 Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neurobias migration toward the infarct boundary in adult rats[J].J Cereb Blood Flow Metab,2004,24:441-448.)。
[0005] IE草花為寥科植物IE寥Polygonum orientale L.的花序，具有行氣活血、消積止 痛的功效，用于治療頭痛，心胃氣痛，腹中痞積，小兒疳積等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，葒草花 在抗人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用方面效果較好，但沒有文獻(xiàn)報道其具有激活、分化、增殖神經(jīng)干 細(xì)胞的生物活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于通過對祖?zhèn)髅胤竭M行深入研究，提供一種能夠激活內(nèi)源性神經(jīng) 干細(xì)胞，增加缺血區(qū)新生血管，改善缺血區(qū)腦供血，促進神經(jīng)功能恢復(fù)的藥物組合物，該藥 物組合物以葒草花提取物為活性成分，可用于腦卒中（尤其是缺血性腦卒中）的治療。
[0007] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：
[0008] -種治療腦卒中的藥物組合物，該藥物組合物由葒草花提取物和藥學(xué)上可用的輔 料制備而成，所述的葒草花提取物是將葒草花經(jīng)水提后的藥渣在二氯甲烷_甲醇的混合溶 液中浸提而得。
[0009] 優(yōu)選地，如上所述的治療腦卒中的藥物組合物，其中所述的混合溶液中二氯甲烷 和甲醇的體積比為1-4:1。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種上述治療腦卒中的藥物組合物的制備方法，該方法包括如下 步驟：
[0011] (1)將葒草花原料用熱水超聲輔助浸提，過濾，棄掉濾液，濾渣備用；
[0012] (2)步驟（1)所得濾渣用體積比為1_4:1(優(yōu)選體積比2:1)的二氯甲烷-甲醇 溶液在水浴加熱下超聲輔助浸提，過濾收集濾液，減壓蒸餾濃縮得浸膏，冷凍干燥，粉碎，過 篩，得到葒草花提取物；
[0013] (3)將葒草花提取物與藥學(xué)上可用的輔料混勻后制成口服液、丸劑、片劑、膠囊劑 或顆粒劑。
[0014] 作為對上述制備方法浸提步驟的優(yōu)化，其中步驟（1)中所述的浸提條件為：料液 比1 :6-24(優(yōu)選料液比1 :10-15)，熱水溫度60-65°C，超聲頻率38-42HZ，反復(fù)提取1-3次； 步驟（2)中所述的浸提條件為：料液比1 :8-16(優(yōu)選料液比1 :9-12)，水浴溫度63-70°C， 超聲頻率30-35HZ，反復(fù)提取2-4次。
[0015] 本發(fā)明人在以往的試驗中均通過灌胃給藥的方式予以實驗動物相應(yīng)劑量的藥物， 并發(fā)揮了治療腦卒中的藥效，因此將該藥物組合物制備成口服制劑，所述的口服制劑包括 口服液、丸劑、片劑、膠囊劑和顆粒劑。為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時加入 藥學(xué)可接受的輔料，例如：填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐 齊IJ、基質(zhì)等。填充劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等； 崩解劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代 羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括：硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二 氧化硅等；助懸劑包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等； 粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括：糖精鈉、阿斯帕 坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括：甜味劑及各種香精；防腐劑包括：尼泊金類、苯 甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質(zhì)包括：PEG6000， PEG4000 等。
[0016] 另外，本發(fā)明人采用大腦中動脈栓塞模型，以腦梗死預(yù)后相關(guān)的神經(jīng)干細(xì)胞和新 生微血管為研究指標(biāo)，通過本發(fā)明制備的葒草花提取物進行治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠缺血側(cè)齒狀 回顆粒細(xì)胞層邊緣的顆粒細(xì)胞下層的BrdU+細(xì)胞數(shù)和對側(cè)BrdU+細(xì)胞數(shù)較模型對照組有顯 著性增加，梗死灶周圍新生微血管數(shù)也較模型對照組有顯著性增加，這意味著本發(fā)明的葒 草花提取物通過缺血性腦卒中梗死灶周圍微血管和神經(jīng)干細(xì)胞激活、分化、增殖，達(dá)到修復(fù) 神經(jīng)細(xì)胞并進一步治療該病的目的。因此，本發(fā)明的第三個目的在于提供一種制藥用途，即 上述的葒草花提取物在制備治療缺血性腦卒中的藥物中的應(yīng)用。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的葒草花提取物能夠激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，增加 缺血區(qū)新生血管，改善缺血區(qū)腦供血，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，可開發(fā)成藥物制劑，用于缺血性 腦卒中的治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1:免疫組化方法標(biāo)記的BrdU+細(xì)胞（假手術(shù)組）；
[0019] 圖2:免疫組化方法標(biāo)記的BrdU+細(xì)胞（提取物A組）；
[0020] 圖3 :免疫組化方法標(biāo)記的BrdU+細(xì)胞（模型對照組）；
[0021] 圖4:免疫組化方法標(biāo)記的⑶31+細(xì)胞（假手術(shù)組）；
[0022] 圖5 :免疫組化方法標(biāo)記的⑶31+細(xì)胞（提取物A組）；
[0023] 圖6 :免疫組化方法標(biāo)記的⑶31+細(xì)胞（模型對照組）。

【具體實施方式】
[0024] 以下是本發(fā)明所涉及的葒草花提取物及其制劑的具體制備例和效果試驗例，對本 發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果做進一步作描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于該實施例。
[0025] 實施例1葒草花提取物的制備
[0026] 干燥的葒草花原料0.825kg，粉碎至60目左右，先用熱水超聲輔助浸提，浸提條件 為：料液比1 :15 (kg/L)，溫度65°C，超聲頻率40Hz，反復(fù)提取2次；過濾，棄掉濾液，濾渣用 二氯甲烷/甲醇（體積比2:1)超聲輔助浸提，浸提條件為：料液比1 :12(kg/L)，水浴溫度 68°C，超聲頻率35Hz，反復(fù)提取3次；過濾收集濾液，減壓蒸餾濃縮至干得浸膏，冷凍干燥， 粉碎成細(xì)粉，過100目篩，得到連草花提取物。
[0027] 實施例2葒草花提取物的制備
[0028] 干燥的葒草花原料1. 5kg，粉碎，過60目篩，先用熱水超聲輔助浸提，浸提條件為： 料液比1 :10 (kg/L)，溫度62°C，超聲頻率40Hz，反復(fù)提取2次；過濾，棄掉濾液，濾渣用二氯 甲烷/甲醇（體積比2:1)超聲輔助浸提，浸提條件為：料液比1 :9(kg/L)，水浴溫度68°C， 超聲頻率35Hz，反復(fù)提取3次；過濾收集濾液，減壓蒸餾濃縮至干得浸膏，冷凍干燥，粉碎成 細(xì)粉，過100目篩，得到葒草花提取物。
[0029] 實施例3顆粒劑的制備
[0030] 葒草花提取物 l〇g 乳糖 5()g 微晶纖維素 l〇〇g 8%羥丙基甲基纖維素溶液 適量 低取代羥丙基纖維素 30g 硬脂酸鎂 2.5g
[0031] 制備工藝：將實施例2制備的葒草花提取物過100目篩，乳糖、微晶纖維素和低取 代羥丙基纖維素過80目篩，稱取處方量的羅葒草花提取物與乳糖、低取代羥丙基纖維素、 微晶纖維素混合均勻，加入8%羥丙基甲基纖維素溶液適量制粒，60°C干燥，16目篩整粒， 干顆粒中加入處方量的硬脂酸鎂混勻，分裝。
[0032] 實施例4顆粒劑的制備
[0033] 葒草花提取物 20g 預(yù)膠化淀粉 50g 甘露醇 50g 乳糖 40g 6%PVP的95%乙醇溶液 適量 微粉桂膠 5g 硬脂酸鎂 2g
[0034] 制備工藝：將處方中的葒草花提取物、預(yù)膠化淀粉、甘露醇、乳糖和微粉硅膠分別 過100目篩，混和均勻，加入6 % PVP的95%乙醇溶液適量，濕法制粒，60°C烘干，16目篩整 粒，干顆粒中加入處方量的硬脂酸鎂混勻，分裝。
[0035] 實施例5葒草花提取物對腦卒中大鼠的治療試驗研究
[0036] 5月齡健康wistar雄性大鼠45只，體重300±20g。隨機抓取其中的35只大鼠， 用20%烏拉坦腹腔麻醉仰臥固定，做頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動 脈，鉗夾頸外動脈和頸總動脈，于頸內(nèi)和頸外動脈分支處附近作切口，將16mm?17mm長的 尼龍線從切口處沿頸內(nèi)動脈完全插入至大腦中動脈并結(jié)扎頸內(nèi)動脈，阻滯右側(cè)大腦供血， 之后逐層縫合讓其蘇醒，蘇醒后選擇向左側(cè)做轉(zhuǎn)圈運動的成功的缺血性腦卒中動物模型， 隨機再分成兩組，即模型對照組、葒草花提取物A組、葒草花提取物B組，每組10只。尚未 造模的10只大鼠作為假手術(shù)組，同樣20%烏拉坦腹腔麻醉仰臥固定，做頸部正中切口，只 是分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈后就縫合傷口。
[0037] 假手術(shù)組和模型對照組給以0. 9%生理鹽水10ml/kg灌胃，葒草花提取物A組灌 胃葒草花的二氯甲烷/甲醇浸提物（本發(fā)明實施例2制備而得）90mg/kg，葒草花提取物B 組灌胃葒草花水浸提物，劑量為180mg/kg，葒草花水浸提物的制備方法為：干燥的葒草花 原料lkg，粉碎，過60目篩，先用熱水超聲輔助浸提，浸提條件為：料液比1 :10 (kg/L)，溫度 62°C，超聲頻率40Hz，反復(fù)提取2次；過濾收集濾液，減壓濃縮，冷凍干燥，粉碎成細(xì)粉。各 組每日灌胃1次，連續(xù)7d。
[0038] 于末次給藥后的第2d，各組動物腹腔注射BrdU(50mg/kg，連續(xù)給藥3次，給藥間 隔為8h)，最后一次給予BrdU腹腔注射6h后，將動物過量麻醉并使用4%多聚甲醛灌注取 腦留取標(biāo)本進行BrdU免疫組化染色標(biāo)記海馬齒狀回的新生細(xì)胞，CD31標(biāo)記缺血區(qū)周圍的 微血管。將注射了 BrdU標(biāo)記細(xì)胞的大鼠同前制作腦切片，取含海馬齒狀回區(qū)域的腦切片 行BrdU染色觀察原位干細(xì)胞的增殖與分化。取含缺血區(qū)腦片行CD31染色觀察缺血區(qū)周圍 的微血管。切片常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)后免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡觀察，Brdu染色陽性細(xì)胞 (Brdu+細(xì)胞）的細(xì)胞核中有棕黃色顆粒，CD31染色陽性細(xì)胞（CD31+細(xì)胞）的細(xì)胞漿呈棕褐 色，以40X 10倍顯微鏡觀察，每張切片選擇5個相鄰的非重疊視野計數(shù)陽性細(xì)胞和總細(xì)胞 數(shù)。
[0039] 免疫組化方法標(biāo)記的BrdU+細(xì)胞染成棕黃色，形態(tài)呈圓形、橢圓形或梭形，分布于 齒狀回顆粒細(xì)胞層邊緣的顆粒細(xì)胞下層，正常腦細(xì)胞呈藍(lán)色。在假手術(shù)組可見顆粒細(xì)胞 下層少量的BrdU+陽性細(xì)胞，模型對照組缺血側(cè)顆粒細(xì)胞下層的BrdU+陽性細(xì)胞數(shù)和對側(cè) BrdU+細(xì)胞數(shù)均顯著性高于假手術(shù)組（P < 0. 01)。與模型對照組或提取物B組相比，提取物 A組缺血側(cè)顆粒細(xì)胞下層的BrdU+陽性細(xì)胞數(shù)和對側(cè)BrdU+細(xì)胞數(shù)明顯增多，有極顯著性差 異（P < 0.01)，具體見圖1、圖2、圖3和表1。
[0040] 另外，免疫組化方法標(biāo)記的⑶31+細(xì)胞染成棕褐色，形態(tài)呈條狀或桿狀，新生微血 管主要分布于缺血灶周圍，假手術(shù)組及缺血對側(cè)有散在、少量⑶31+細(xì)胞表達(dá)。模型對照組 梗死灶周圍⑶31+細(xì)胞表達(dá)較假手術(shù)組顯著增多（P < 0. 01)，表明腦缺血可誘導(dǎo)梗死灶周 圍新生微血管增加，而提取物A組梗死灶周圍新生微血管數(shù)較模型對照組和提取物B組明 顯增加（P < 0.01)，具體見圖4、圖5、圖6和表1。
[0041] 表1各組BrdU+細(xì)胞數(shù)和CD31+細(xì)胞數(shù)比較

【權(quán)利要求】
1. 一種治療腦卒中的藥物組合物，該藥物組合物由葒草花提取物和藥學(xué)上可用的輔料 制備而成，其特征在于，所述的葒草花提取物是將葒草花經(jīng)水提后的藥渣在二氯甲烷-甲 醇的混合溶液中浸提而得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腦卒中的藥物組合物，其特征在于，所述的混合溶液中 二氯甲烷和甲醇的體積比為1-4:1。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述治療腦卒中的藥物組合物的制備方法，其特征在于，該 方法包括如下步驟： (1) 將葒草花原料用熱水超聲輔助浸提，過濾，棄掉濾液，濾渣備用； (2) 步驟（1)所得濾渣用體積比為1-4:1的二氯甲烷-甲醇溶液在水浴加熱下超聲輔 助浸提，過濾收集濾液，減壓蒸餾濃縮得浸膏，冷凍干燥，粉碎，過篩，得到葒草花提取物； (3) 將葒草花提取物與藥學(xué)上可用的輔料混勻后制成口服液、丸劑、片劑、膠囊劑或顆 粒劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述治療腦卒中的藥物組合物的制備方法，其特征在于，步驟（1) 中所述的浸提條件為：料液比1 :6_24,熱水溫度60-65°C，超聲頻率38-42HZ，反復(fù)提取1-3 次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述治療腦卒中的藥物組合物的制備方法，其特征在于，步驟（2) 中所述的浸提條件為：料液比1 :8_16,水浴溫度63-70°C，超聲頻率30-35HZ，反復(fù)提取2-4 次。
6. 權(quán)利要求1或2所述的葒草花提取物在制備治療缺血性腦卒中的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P9/10GK104383003SQ201410597215
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】孟萍萍, 張樹超, 王強, 劉淑芹, 柏廣濤 申請人:孟萍萍